Formasi Phenoxyl Radikal Bebas selama Oksidasi dari Fluorescent Dye 2 *, * 7-diklorofluoresein oleh horseradish Peroksidase KONSEKUENSI MUNGKIN

UNTUK PENGUKURAN STRES OKSIDATIF Oksidasi pewarna fluorescent 2 * , * 7 - diklorofluoresein ( DCF ) dengan horseradish peroxidase diselidiki dengan penyerapan optik , spin elektron resonansi ( ESR ) , dan pengukuran konsumsi oksigen . spektrofotometri pengukuran menunjukkan bahwa DCF bisa teroksidasi baik oleh horseradish peroksidase - senyawa I atau II - senyawa dengan generasi obligat dari DCF phenoxyl radikal ( DCFz ) . Oksidasi satu elektron ini dikonfirmasi oleh ESR eksperimen spin- perangkap . DCFz mengoksidasi GSH , menghasilkan glutathione thiyl radikal ( GSZ ) , yang terdeteksi oleh ESR spin- perangkap teknik . Dalam hal ini , oksigen dikonsumsi oleh berurutan reaksi diprakarsai oleh GSZ radikal . Demikian pula , DCFz teroksidasi NADH , menghasilkan radikal Nadz yang mengurangi oksigen menjadi superoksida ( O2 . ) , yang juga dideteksi dengan teknik spin- menjebak ESR . superoxide dismutated untuk menghasilkan H2O2 , yang bereaksi dengan horseradish peroksidase , mendirikan sebuah rantai enzimatik Reaksi yang mengarah ke produksi H2O2 dan konsumsi oksigen . Sebaliknya, ketika asam askorbat mengurangi DCF phenoxyl kembali radikal untuk molekul induknya , itu membentuk askorbat anion aktif radikal . jelas, DCF katalis merangsang pembentukan reaktif spesies oksigen dengan cara yang tergantung pada dan dipengaruhi oleh berbagai agen pereduksi biokimia . ini belajar , bersama-sama dengan studi sebelumnya kami , menunjukkan DCFH yang tidak dapat digunakan secara meyakinkan untuk mengukur superoksida atau pembentukan hidrogen peroksida dalam sel yang mengalami stres oksidatif . 29,79-Dichlorofluorescin (DCFH) 1 secara luas digunakan untuk mengukur stres oksidatif dalam sel. Bentuk diasetat dari DCFH memasuki sel dan dihidrolisis oleh esterase intraseluler untuk membebaskan DCFH. Setelah reaksi oksidasi dengan spesies, yang sangat neon senyawa 29,79-diklorofluoresein (DCF) terbentuk. Intensitas fluoresensi dapat diukur dan merupakan dasar dari uji seluler yang populer untuk stres oksidatif (1). Biaya publikasi artikel ini yang dibiayai sebagian oleh pembayaran biaya page. Artikel ini karena itu harus dengan ini ditandai "Iklan" sesuai dengan 18 U.S.C. Bagian 1734 semata-mata untuk menunjukkan fakta ini. Untuk siapa korespondensi harus ditangani: NIH / NIEHS, MD F0-01, P.O. Box 12233, Research Triangle Park, NC 27709. Tel: 919-541-3910, Fax: 919-541-1043, E-mail: mason4@niehs.nih.gov. 1 singkatan yang digunakan adalah: DCFH, 29,79-dichlorofluorescin; DCFHDA, 29,79dichlorofluorohescin diasetat, DCF, 29,79-diklorofluoresein; DCFz, DCF phenoxyl radikal bebas,. DCF, DCF semiquinone radikal; DMPO, 5,5-dimetil-1-N-oksida pyrroline, ESR, spin elektron resonansi; GSZ, glutathione thiyl radikal; MNP, 2-metil-2-nitrosopropane; SOD, superoksida dismutase, HRP, horseradish peroksidase.

Meskipun pengujian ini umumnya digunakan , ada banyak kontroversi mengenai validitas sebenarnya. Tidak jelas yang spesies oksidatif bertanggung jawab untuk oksidasi DCFH . Selain itu, ada beberapa perbedaan pendapat dalam literatur mengenai pengaruh superoksida dismutase pada oksidatif stres dalam sel dipantau oleh assay fluorometric DCF . beberapa penelitian melaporkan efek penghambatan oleh superoksida dismutase ( 2-15 ) , sementara hampir jumlah yang sama penelitian melaporkan tidak ada efek ( 16-26 ) . Sebuah kertas baru-baru ini oleh LeBel et al . ( 27 ) disebutkan bahwa interpretasi spesies oksigen reaktif tertentu yang terlibat dalam oksidasi DCFH ke DCF dalam sistem biologi harus didekati dengan hati-hati . Hal ini juga telah menunjukkan bahwa fotoreduksi hasil DCF dalam formasi dari DCF semiquinone radikal bebas ( DCF. ) , yang , di bawah kondisi aerobik , teroksidasi oleh oksigen ke pewarna induknya , DCF , bersamaan membentuk superoksida radikal ( 28 ) . Selain itu, Dilaporkan bahwa DCFH , setelah bereaksi dengan horseradish peroxidase senyawa I atau II - senyawa , dioksidasi untuk DCF . , yang selanjutnya udara - teroksidasi menjadi DCF dengan bersamaan generasi superoksida radikal ( 29 ) . Pada penelitian ini , reaksi DCF dengan lobak peroksidase di hadapan glutation tereduksi atau NADH dipelajari untuk melanjutkan investigasi kami fluorometric DCF assay . Kami mempekerjakan teknik spin- menjebak ESR dan mengukur konsumsi oksigen untuk mengevaluasi radikal bebas formasi selama reaksi bersama dengan pembentukan senyawa I dan senyawa II dipantau oleh UV -visible spektrofotometri . Hasil penelitian kami menunjukkan bahwa ketika DCF bereaksi dengan senyawa I dan senyawa II , DCF teroksidasi dengan phenoxyl radikal bebas DCFz , mengurangi enzim horseradish peroxidase masing intermediet ( Skema 1 ) . Di hadapan agen mengurangi , seperti GSH atau NADH , DCFz kemudian dikurangi kembali ke DCF dengan pembentukan GSZ atau Nadz , masing-masing, dan selanjutnya generasi superoksida . ditunjukkan pada Gambar . 2 , solusi metanol 25 mM DCF langsung ditambahkan ke sampel . MNP disiapkan dalam metanol dan disimpan dalam gelap selama percobaan . Spin trap 5,5 - dimetil - 1 - N- oksida pyrroline ( DMPO ) dibeli dari Sigma , dimurnikan dengan sublimasi vakum pada suhu lingkungan , dan disimpan pada 270 C sampai digunakan . 29,79 - Dichlorofluorescin Biaya publikasi artikel ini yang dibiayai sebagian oleh pembayaran biaya page. Artikel ini karena itu harus dengan ini ditandai "Iklan" sesuai dengan 18 U.S.C. Bagian 1734 semata-mata untuk menunjukkan fakta ini. Untuk siapa korespondensi harus ditangani: NIH / NIEHS, MD F0-01, P.O. Box 12233, Research Triangle Park, NC 27709. Tel: 919-541-3910, Fax: 919-541-1043, E-mail: mason4@niehs.nih.gov. 1 singkatan yang digunakan adalah: DCFH, 29,79-dichlorofluorescin; DCFHDA, 29,79dichlorofluorohescin diasetat, DCF, 29,79-diklorofluoresein; DCFz, DCF phenoxyl radikal bebas,. DCF, DCF semiquinone radikal; DMPO, 5,5-dimetil-1-N-oksida pyrroline, ESR, spin elektron resonansi; GSZ, glutathione thiyl radikal; MNP, 2-metil-2-nitrosopropane; SOD, superoksida dismutase, HRP, horseradish peroksidase.

diasetat ( juga dikenal sebagai 29,79 - dichlorodihydrofluorescein diasetat , DCFH - DA ) dibeli dari Probe Molekuler , Inc ( Eugene , OR ) . DCFH - DA adalah enzimatis deesterified , yaitu 500 mM DCFH - DA dalam larutan metanol - penyangga bereaksi dengan esterase ( 100 unit ) dalam gelap pada suhu kamar selama 1 jam pada pH netral . konsentrasi peroksidase horseradish ditentukan dengan menggunakan kepunahan Koefisien e 5 102 mM21 cm21 pada 403 nm ( 30 ) . konsentrasi saham H2O2 dalam air deionisasi ditentukan dengan menggunakan kepunahan koefisien e 5 43,6 M21 cm21 pada 240 nm ( 31 ) . DCF dan DCFH disimpan dan disimpan dari cahaya ruangan . contoh persiapan dan percobaan dilakukan dalam gelap . semua reaksi diinisiasi dengan penambahan horseradish peroksidase . Dalam sampel mana DCFH atau DCF dihilangkan , volume setara dengan metanol larutan buffer ditambahkan . Spektrum Resonansi Spin Elektron Percobaan - ESR tercatat pada spektrometer Bruker ECS - 106 ESR ( Boston, MA ) yang beroperasi di 9,77 GHz dengan frekuensi modulasi dari 50 kHz dilengkapi dengan sebuah TM110 rongga . Semua percobaan dilakukan pada suhu kamar dengan 17 - mm kuarsa sel datar . Dalam percobaan yang dijelaskan dalam Gambar . 2 , 3 , dan 8 , sampel disedot ke dalam sel datar dengan akuisisi data ESR dimulai sekitar 15 s setelah persiapan sampel . Analisis Data dan spektral simulasi dilakukan dengan menggunakan program yang dikembangkan di laboratorium kami dan tersedia melalui Internet . Rincian program dijelaskan di tempat lain ( 32 ) . Struktur energi rendah dari MNP - DCF aduk radikal diperoleh dengan menggunakan MOPAC dengan MM2 minimalisasi . Horseradish Peroksidase UV - terlihat Spectra - Semua pengukuran optik dilakukan dengan SLM Aminco DW -2000 UV-tampak ganda beam spektrofotometer ( Urbana , IL ) . Sampel yang telah disiapkan dan direkam dalam air deionisasi ( digunakan di tempat Tris buffer untuk mencegah reduktor dalam larutan ) . Pengukuran konsumsi Konsumsi oksigen Percobaan - Oksigen dibuat menggunakan Clark - jenis elektroda oksigen dipasang ke 1,8 ml Gilson sel sampel dan dipantau oleh YSI Inc Model 53 Monitor oksigen . Data konsumsi oksigen dicatat oleh komputer dihubungkan dengan papan DT2801 data Translation terhubung ke monitor oksigen . Semua percobaan dilakukan pada suhu kamar , dan kondisi inkubasi dijelaskan dalam legenda gambar .

Biaya publikasi artikel ini yang dibiayai sebagian oleh pembayaran biaya page. Artikel ini karena itu harus dengan ini ditandai "Iklan" sesuai dengan 18 U.S.C. Bagian 1734 semata-mata untuk menunjukkan fakta ini. Untuk siapa korespondensi harus ditangani: NIH / NIEHS, MD F0-01, P.O. Box 12233, Research Triangle Park, NC 27709. Tel: 919-541-3910, Fax: 919-541-1043, E-mail: mason4@niehs.nih.gov. 1 singkatan yang digunakan adalah: DCFH, 29,79-dichlorofluorescin; DCFHDA, 29,79dichlorofluorohescin diasetat, DCF, 29,79-diklorofluoresein; DCFz, DCF phenoxyl radikal bebas,. DCF, DCF semiquinone radikal; DMPO, 5,5-dimetil-1-N-oksida pyrroline, ESR, spin elektron resonansi; GSZ, glutathione thiyl radikal; MNP, 2-metil-2-nitrosopropane; SOD, superoksida dismutase, HRP, horseradish peroksidase.

HASIL Terlihat - UV spektrum keadaan istirahat senyawa I dan senyawa II bereaksi dengan DCF ditunjukkan pada Gambar . 1 . itu Spektrum UV-tampak dari keadaan istirahat lobak peroksidase ( 1 mM ) ditandai dengan serapan maksimum pada 403 nm (Gambar 1 , memindai 0 ) . Penambahan DCF dengan horseradish peroksidase solusi menghasilkan peningkatan kecil dalam penyerapan di 403 nm karena fakta bahwa DCF memiliki serapan pada frekuensi ini ( maksimum pada 502 nm) seperti ditunjukkan pada Gambar . 1 , scan 1 . itu penurunan yang signifikan dalam intensitas pada 502 nm ketika H2O2 adalah ditambahkan ke sistem menunjukkan bahwa DCF telah berubah selama reaksi DCF dengan horseradish peroxidase di hadapan H2O2 (Gambar 1 , scan 2 ) . Dalam hal ini , senyawa Aku dibentuk oleh penambahan H2O2 dengan horseradish peroksidase cepat bereaksi dengan DCF untuk membentuk senyawa radikal dan DCFz II , yang ditandai dengan munculnya isosbestic point untuk horseradish peroksidase dan majemuk II di 412 nm ( 33 ) . Memindai 3 pada Gambar . 1 menunjukkan konversi senyawa II kembali ke keadaan istirahat horseradish peroksidase . hasil ini konsisten dengan metabolisme peroksidase - dimediasi DCF ke yang sesuai DCFz radikal seperti yang ditunjukkan dalam Skema 1 . ESR teknik spin -perangkap dipekerjakan untuk mengkarakterisasi radikal bebas yang terbentuk selama omset lobak peroksidase dengan H2O2 dan DCF pada ada atau tidaknya suatu zat pereduksi . Ketika DCF direaksikan dengan lobak peroksidase dan H2O2 dengan adanya perangkap putar MNP , sebuah isotropik tiga baris spektrum dengan konstanta kopling hyperfine 14,9 G terdeteksi (Gambar 2A ) . Tidak adanya hidrogen atau klorin hyperfine kopling dalam spektrum tiga baris dikecualikan atom pada posisi a atau b untuk nitroxide yang nitrogen dan menunjukkan bahwa radikal terletak di tersier karbon ( 34 , 35 ) . Struktur aduk radikal berbasis pada ESR data dan energi minimalisasi kami ditunjukkan pada Gambar . 2 . Pembentukan radikal benar-benar tergantung pada kehadiran DCF (Gambar 2B ) . Ketiadaan baik horseradish peroksidase atau H2O2 menghasilkan sinyal yang sangat lemah (Gambar 2 , C dan D ) terdiri , untuk sebagian besar , dari di- tert - butylnitroxide dari dekomposisi MNP ditandai dengan kopling hyperfine konstan 17 G ( 36 ) . Sinyal lemah ini juga hadir dalam solusi dari MNP dalam buffer (Gambar 2E ) . Berdasarkan karakteristik sinyal ESR dan kesamaan hyperfine yang Biaya publikasi artikel ini yang dibiayai sebagian oleh pembayaran biaya page. Artikel ini karena itu harus dengan ini ditandai "Iklan" sesuai dengan 18 U.S.C. Bagian 1734 semata-mata untuk menunjukkan fakta ini. Untuk siapa korespondensi harus ditangani: NIH / NIEHS, MD F0-01, P.O. Box 12233, Research Triangle Park, NC 27709. Tel: 919-541-3910, Fax: 919-541-1043, E-mail: mason4@niehs.nih.gov. 1 singkatan yang digunakan adalah: DCFH, 29,79-dichlorofluorescin; DCFHDA, 29,79dichlorofluorohescin diasetat, DCF, 29,79-diklorofluoresein; DCFz, DCF phenoxyl radikal bebas,. DCF, DCF semiquinone radikal; DMPO, 5,5-dimetil-1-N-oksida pyrroline, ESR, spin elektron resonansi; GSZ, glutathione thiyl radikal; MNP, 2-metil-2-nitrosopropane; SOD, superoksida dismutase, HRP, horseradish peroksidase.

kopling konstan dibandingkan dengan yang sebelumnya diperoleh dari perangkap dari MNP / tyrosyl radikal ( 37 ) , kami ditugaskan radikal sebagai phenoxyl radikal bebas dari DCF . Ketika DCF diinkubasi dengan larutan GSH , H2O2 , dan horseradish peroksidase di hadapan DMPO perangkap spin, empat -line ESR spektrum aduk DMPO / GSZ terdeteksi (Gambar 3A ) , ditandai dengan konstanta kopling hyperfine aN dari 5 15,15 G dan ab H 5 16.17 G , konsisten dengan dilaporkan sebelumnya ( 38 , 39 ) . The aduk radikal yang sama adalah diperoleh dari sistem di mana DCF dihilangkan , tetapi ESR spektrum adalah intensitas yang lebih rendah (Gambar 3B ) . The aduk radikal tergantung pada keberadaan GSH atau horseradish peroksidase (Gambar 3 , C dan D ) . Penambahan superoksida dismutase tidak memiliki efek ( data tidak ditampilkan ) , menghilangkan kemungkinan tergantung superoksida glutathione thiyl pembentukan radikal . Namun, penambahan katalase dihilangkan Sinyal ESR (Gambar 3E ) , menunjukkan pembentukan aduk radikal adalah H2O2 - dependent . Ketika H2O2 dihilangkan , spektrum lemah hasil adisi DMPO / GSZ terdeteksi (Gambar 3F ) dan benar-benar ditekan dengan penambahan katalase , menunjukkan pembentukan H2O2 melalui oksidasi GSH oleh jejak logam katalisis . Selain itu , molekul oksigen yang dikonsumsi dalam reaksi campuran yang mengandung DCF , H2O2 , dan GSH (Gambar 4a ) . durasi dari tingkat cepat konsumsi oksigen sangat tergantung pada konsentrasi hidrogen peroksida (Gambar 4a , A dan C ) . Ketika DCF direaksikan dengan GSH , horseradish peroksidase , dan H2O2 , tingkat konsumsi oksigen sangat tinggi untuk ; 1 min , dan kemudian menurun (Gambar 4a , A ) . Hal ini disebabkan oleh konsumsi H2O2 di menit pertama ini , seperti yang ditunjukkan oleh fakta bahwa penambahan lebih H2O2 dipulihkan tingkat awal konsumsi oksigen (Gambar 4a , B ) sampai semua oksigen dalam solusi dikonsumsi . Ketika DCF , GSH , atau horseradish peroksidase itu dihilangkan , tidak ada konsumsi oksigen diamati (Gambar 4b , E - G ) . Namun, ketika asam askorbat ( 1 mM ) ditambahkan ke dalam campuran reaksi sebelum atau setelah inisiasi horseradish peroksidase , oksigen konsumsi benar-benar terhambat (Gambar 4b , H dan B , masing-masing) . Penghambatan yang sama diperoleh bahkan ketika 100 mM askorbat digunakan ( data tidak ditampilkan ) . Selain itu, Biaya publikasi artikel ini yang dibiayai sebagian oleh pembayaran biaya page. Artikel ini karena itu harus dengan ini ditandai "Iklan" sesuai dengan 18 U.S.C. Bagian 1734 semata-mata untuk menunjukkan fakta ini. Untuk siapa korespondensi harus ditangani: NIH / NIEHS, MD F0-01, P.O. Box 12233, Research Triangle Park, NC 27709. Tel: 919-541-3910, Fax: 919-541-1043, E-mail: mason4@niehs.nih.gov. 1 singkatan yang digunakan adalah: DCFH, 29,79-dichlorofluorescin; DCFHDA, 29,79dichlorofluorohescin diasetat, DCF, 29,79-diklorofluoresein; DCFz, DCF phenoxyl radikal bebas,. DCF, DCF semiquinone radikal; DMPO, 5,5-dimetil-1-N-oksida pyrroline, ESR, spin elektron resonansi; GSZ, glutathione thiyl radikal; MNP, 2-metil-2-nitrosopropane; SOD, superoksida dismutase, HRP, horseradish peroksidase.

konsumsi oksigen terhambat saat DMPO ( 200 mM ) adalah ditambahkan sebelum atau setelah inisiasi horseradish peroksidase (Gambar 4b , D dan C , masing-masing) . Ketika superoksida dismutase ( 100 mg / ml ) ditambahkan ke dalam campuran reaksi sebelum lobak inisiasi peroksidase (Gambar 4c , A ) , tingkat awal oksigen konsumsi ditemukan menjadi identik dengan lengkap sistem (Gambar 4c , B ) . Namun, di hadapan superoksida dismutase (Gambar 4c , A ) , konsumsi oksigen tidak memperlambat setelah 1 menit , berbeda dengan yang ada pada sistem yang lengkap , namun benar-benar berhenti sekitar 2 menit setelah lobak inisiasi peroksidase (Gambar 4c , A ) . Rupanya , superoksida dismutase , mengkatalisasi disproporsionasi radikal superoksida , difasilitasi pembentukan H2O2 , menjaga tingkat konsumsi tinggi untuk waktu yang lama . Penambahan superoksida dismutase 90 s setelah inisiasi horseradish peroxidase tidak benar-benar menghambat konsumsi oksigen (Gambar 4c , C ) . Dalam hal ini , superoksida dismutase telah ditambahkan H2O2 ketika itu sudah dikonsumsi , dan konsumsi oksigen lambat ini datang hampir sepenuhnya dari radikal bebas reaksi berantai yang benar-benar - superoksida tergantung . Penambahan katalase ( 150 mg / ml ) sebelum atau setelah inisiasi horseradish peroksidase sepenuhnya menghambat konsumsi oksigen (Gambar 4c , D dan E ) . Bila ditambahkan hidrogen peroksida dihilangkan dari lengkap sistem , tingkat konsumsi oksigen jauh lebih lambat (Gambar 5A ) . Penambahan lebih dietilenatriamina pentaacetic acid ( 250-800 mM konsentrasi akhir ) melambat tingkat konsumsi oksigen lebih tanpa berhenti sepenuhnya ( data tidak ditampilkan ) , menunjukkan keterlibatan katalisis logam . Selain itu , penambahan superoksida dismutase ( 100 mg / ml ) ke dalam campuran reaksi tepat sebelum peroksidase lobak benar-benar menghambat konsumsi oksigen (Gambar 5D ) . A penghambatan serupa diperoleh ketika superoksida dismutase ditambahkan 2 menit setelah penambahan horseradish peroksidase (Gambar 5B ) . Hasil ini menunjukkan bahwa , dalam ketiadaan H2O2 , konsumsi oksigen muncul benar-benar dari superoksida - dependent reaksi . Ketika katalase ditambahkan ke reaksi campuran sebelum atau setelah inisiasi horseradish peroksidase , yang konsumsi oksigen benar-benar terhambat (Gambar 5 , C dan E ) , menunjukkan bahwa kehadiran sejumlah kecil hidrogen peroksida dalam sistem juga diperlukan untuk oksigen konsumsi . Biaya publikasi artikel ini yang dibiayai sebagian oleh pembayaran biaya page. Artikel ini karena itu harus dengan ini ditandai "Iklan" sesuai dengan 18 U.S.C. Bagian 1734 semata-mata untuk menunjukkan fakta ini. Untuk siapa korespondensi harus ditangani: NIH / NIEHS, MD F0-01, P.O. Box 12233, Research Triangle Park, NC 27709. Tel: 919-541-3910, Fax: 919-541-1043, E-mail: mason4@niehs.nih.gov. 1 singkatan yang digunakan adalah: DCFH, 29,79-dichlorofluorescin; DCFHDA, 29,79dichlorofluorohescin diasetat, DCF, 29,79-diklorofluoresein; DCFz, DCF phenoxyl radikal bebas,. DCF, DCF semiquinone radikal; DMPO, 5,5-dimetil-1-N-oksida pyrroline, ESR, spin elektron resonansi; GSZ, glutathione thiyl radikal; MNP, 2-metil-2-nitrosopropane; SOD, superoksida dismutase, HRP, horseradish peroksidase.

Ketika DCF diinkubasi dengan NADH dan horseradish peroksidase di hadapan DMPO perangkap spin, komposit ESR spektrum terdeteksi (Gambar 6A ) . Sebuah spektrum ESR yang sama , dengan intensitas yang jauh lebih rendah , diamati dalam sistem yang sama tanpa DCF (Gambar 6B ) . Ketika NADH (Gambar 6D ) atau lobak peroksidase (Gambar 6E ) dihilangkan dari sistem , tidak ada sinyal atau hanya sinyal yang sangat lemah terdeteksi . Penambahan superoksida dismutase benar-benar menghambat pembentukan radikal (Gambar 6F ) , membenarkan keterlibatan radikal superoksida dalam pembentukan adduct radikal DMPO . Penambahan katalase memiliki efek penghambatan yang sama seperti superoxide dismutase (Gambar 6G ) , menunjukkan bahwa kehadiran H2O2 , setidaknya dalam jejak , diperlukan untuk reaksi radikal untuk melanjutkan . itu hidrogen peroksida , penting untuk aktivasi awal lobak peroksidase , mungkin dihasilkan dari autoksidasi dari NADH . Dalam rangka untuk mengkarakterisasi radikal terbentuk selama spintrapping yang studi DCF oksidasi dengan horseradish peroksidase dalam kehadiran NADH , ESR spektrum sistem dengan keluar DCF (Gambar 6B ) telah dikurangi dari yang lengkap sistem (Gambar 6A ) untuk menghasilkan spesies radikal tunggal (Gambar 6C ) . Berdasarkan analisis konstanta kopling hyperfine dan karakteristik radikal , itu ditugaskan sebagai DMPOsuperoxide aduk radikal , DMPO / zOOH , dengan hyperfine kopling konstanta dari aN 5 14.16 G , ab H 5 11,25 G , dan ag H 5 1.2 G , konsisten dengan yang dilaporkan sebelumnya ( 40 ) . Selain itu , konsumsi oksigen diteliti dalam campuran reaksi yang sama yang mengandung DCF , NADH , dan lobak peroksidase dengan penambahan katalase , SOD , atau askorbat . Hasilnya ditunjukkan pada Gambar . 7a . Molekul oksigen di campuran reaksi benar-benar dikonsumsi dalam waktu kurang dari 8 menit (Gambar 7a , A ) . Ketika DCF , NADH , atau horseradish peroxidase adalah dihilangkan dari sistem, tidak ada konsumsi oksigen diamati (Gambar 7a , E , G , dan H , masing-masing) . Ketika asam askorbat ( 1 mM ) ditambahkan sebelum atau setelah inisiasi horseradish peroksidase , konsumsi oksigen benar-benar terhambat (Gambar 7a , F dan D , masing-masing) . Selain itu, penghambatan yang sama diamati ketika 100 mM askorbat ditambahkan sebelum lobak peroxidase atau 250 mM askorbat ditambahkan setelah lobak Biaya publikasi artikel ini yang dibiayai sebagian oleh pembayaran biaya page. Artikel ini karena itu harus dengan ini ditandai "Iklan" sesuai dengan 18 U.S.C. Bagian 1734 semata-mata untuk menunjukkan fakta ini. Untuk siapa korespondensi harus ditangani: NIH / NIEHS, MD F0-01, P.O. Box 12233, Research Triangle Park, NC 27709. Tel: 919-541-3910, Fax: 919-541-1043, E-mail: mason4@niehs.nih.gov. 1 singkatan yang digunakan adalah: DCFH, 29,79-dichlorofluorescin; DCFHDA, 29,79dichlorofluorohescin diasetat, DCF, 29,79-diklorofluoresein; DCFz, DCF phenoxyl radikal bebas,. DCF, DCF semiquinone radikal; DMPO, 5,5-dimetil-1-N-oksida pyrroline, ESR, spin elektron resonansi; GSZ, glutathione thiyl radikal; MNP, 2-metil-2-nitrosopropane; SOD, superoksida dismutase, HRP, horseradish peroksidase.

peroksidase ( data tidak ditampilkan ) . Ketika DMPO perangkap spin ditambahkan setelah atau sebelum horseradish peroksidase inisiasi , yang konsumsi oksigen terhambat (Gambar 7a , B dan C , masing-masing) . Hasil ini konsisten dengan pembentukan radikal selama oksidasi DCF dengan horseradish peroksidase dalam Kehadiran NADH seperti yang ditunjukkan oleh ESR . Penambahan katalase ke sistem yang lengkap juga sangat menghambat oksigen Konsumsi (Gambar 7b , D dan E ) . Ketika superoksida dismutase ditambahkan ke dalam campuran reaksi sebelum horseradish peroksidase inisiasi , tingkat konsumsi oksigen ditemukan sedikit lebih cepat dibandingkan dengan sistem yang lengkap dan benar-benar terhambat setelah 6 menit (Gambar 7b , B ) . Penambahan superoksida dismutase 1 menit setelah penambahan lobak peroksidase mungkin memiliki efek penghambatan lemah (Gambar 7b , C ) . Askorbat diketahui mengalami oksidasi satu elektron untuk menghasilkan relatif stabil askorbat radikal bebas yang dapat dideteksi oleh langsung ESR . Campuran reaksi DCF , H2O2 , dan horseradish peroksidase di hadapan askorbat memberikan sinyal doublet ESR khas askorbat anion radikal bebas seperti ditunjukkan pada Gambar . 8A dengan hyperfine kopling karakteristik konstan aH 5 1,79 G ( 41 ) . Tidak ada perubahan dalam anion askorbat spektrum radikal yang diamati pada penambahan GSH (konsentrasi sama dengan askorbat ) ke dalam campuran reaksi (data tidak ditampilkan ) , menunjukkan bahwa DCFz phenoxyl radikal bereaksi dengan askorbat bukan GSH ( 42 ) . Dalam hal ini , askorbat adalah scavenger radikal lebih baik daripada GSH . Kelalaian DCF , H2O2 , atau horseradish peroksidase menghasilkan sinyal lemah (Gambar 8 , B - D ) . Penambahan katalase ( 50 mg / ml ) untuk reaksi campuran menghambat pembentukan askorbat anion radikal (Gambar 8F ) ke level ditemukan dengan askorbat saja (Gambar 8G ) . itu Kehadiran superoksida dismutase ( 50 mg / ml ) dalam reaksi campuran tidak berpengaruh pada sinyal ESR (Gambar 8E ) , menunjukkan bahwa radikal superoksida tidak terlibat dalam baik askorbat pembentukan radikal atau pembusukan . Dalam rangka untuk lebih memahami kimia yang terlibat antara DCFH dan DCF , kami mengukur konsumsi oksigen dari campuran reaksi yang mengandung senyawa leuco berkurang DCFH dan horseradish peroksidase . Ketika DCFH bereaksi dengan horseradish peroksidase dengan adanya NADH bawah ruangan cahaya , oksigen yang dikonsumsi dalam waktu 12 menit (Gambar 9A ) . Gambar . 9B menunjukkan bahwa selama kurang lebih 12 menit , tingkat konsumsi oksigen dalam gelap itu mirip dengan lengkap Biaya publikasi artikel ini yang dibiayai sebagian oleh pembayaran biaya page. Artikel ini karena itu harus dengan ini ditandai "Iklan" sesuai dengan 18 U.S.C. Bagian 1734 semata-mata untuk menunjukkan fakta ini. Untuk siapa korespondensi harus ditangani: NIH / NIEHS, MD F0-01, P.O. Box 12233, Research Triangle Park, NC 27709. Tel: 919-541-3910, Fax: 919-541-1043, E-mail: mason4@niehs.nih.gov. 1 singkatan yang digunakan adalah: DCFH, 29,79-dichlorofluorescin; DCFHDA, 29,79dichlorofluorohescin diasetat, DCF, 29,79-diklorofluoresein; DCFz, DCF phenoxyl radikal bebas,. DCF, DCF semiquinone radikal; DMPO, 5,5-dimetil-1-N-oksida pyrroline, ESR, spin elektron resonansi; GSZ, glutathione thiyl radikal; MNP, 2-metil-2-nitrosopropane; SOD, superoksida dismutase, HRP, horseradish peroksidase.

sistem tanpa DCFH (Gambar 9C ) . Maka tingkat konsumsi meningkat secara dramatis dan dikonsumsi semua oksigen dalam 5 menit berikutnya . Fase lag 12 - min ini mungkin merupakan waktu yang dibutuhkan untuk mengoksidasi DCFH untuk menghasilkan cukup DCF ( 29 ) ke mendukung oksigen memakan reaksi antara DCF , lobak peroksidase , dan NADH (Gambar 7 , dan b ) . ketika NADH dihilangkan dari sistem dalam gelap , tidak ada oksigen yang dikonsumsi (Gambar 9E ) . Ketika percobaan diulang di bawah cahaya ruangan , ada fase lag terdeteksi , dan tingkat oksigen konsumsi sistem lengkap jauh lebih cepat (Gambar 9A ) . Hasil ini menunjukkan bahwa oksidasi DCFH ke DCF adalah juga dikatalisasi oleh cahaya ruangan . Ketika NADH dihilangkan dari reaksi dilakukan di bawah cahaya ruangan , tidak ada oksigen terdeteksi konsumsi diamati (Gambar 9D ) . PEMBAHASAN Penelitian kami sebelumnya menunjukkan pembentukan DCF semiquinone ( DCF. ) radikal bebas oleh fotoreduksi DCF ( 28 ) atau dengan horseradish peroksidase -katalis oksidasi berkurang leuco senyawa DCFH ( 29 ) . The fotoreduksi DCF untuk DCF . dengan adanya NADH atau GSH dalam kondisi aerobik mengakibatkan pembentukan superoksida radikal yang terdeteksi oleh spin- perangkap teknik ESR ( 28 ) . enzimatik oksidasi DCFH dalam gelap untuk DCF . dengan reaksi horseradish peroksidase pada ada atau tidaknya ditambahkan H2O2 menghasilkan hidroksil dan pembentukan radikal superoksida , dan H2O2 ditunjukkan terbentuk selama deasetilasi yang dari DCFH - DA ( 29 ) . Dalam penelitian ini , kami menganalisis oksidasi neon dye DCF dengan horseradish peroksidase dalam gelap . kami Hasil penelitian ini memberikan bukti kuat untuk pembentukan novel phenoxyl radikal menengah selama peroksidase - dimediasi oksidasi DCF seperti yang ditunjukkan oleh ESR spin- perangkap teknik (Gambar 2 ) . UV-tampak spektrofotometri mengkonfirmasi keberadaan senyawa II selama oksidasi , dan signifikan perubahan dalam pita serapan pada 502 nm DCF diamati (Gambar 1 ) , memberikan bukti untuk satu - elektron peroksida - dimediasi oksidasi DCF ( Skema 1 ) ; yaitu ketika DCF bereaksi dengan lobak peroksidase di hadapan H2O2 , DCF mengalami oksidasi satu elektron , dengan pembentukan obligat dari DCF phenoxyl radikal (Gambar 2 ) . Ini radikal bebas secara struktural dan kimia yang berbeda dari DCF semiquinone DCF .. Dalam Biaya publikasi artikel ini yang dibiayai sebagian oleh pembayaran biaya page. Artikel ini karena itu harus dengan ini ditandai "Iklan" sesuai dengan 18 U.S.C. Bagian 1734 semata-mata untuk menunjukkan fakta ini. Untuk siapa korespondensi harus ditangani: NIH / NIEHS, MD F0-01, P.O. Box 12233, Research Triangle Park, NC 27709. Tel: 919-541-3910, Fax: 919-541-1043, E-mail: mason4@niehs.nih.gov. 1 singkatan yang digunakan adalah: DCFH, 29,79-dichlorofluorescin; DCFHDA, 29,79dichlorofluorohescin diasetat, DCF, 29,79-diklorofluoresein; DCFz, DCF phenoxyl radikal bebas,. DCF, DCF semiquinone radikal; DMPO, 5,5-dimetil-1-N-oksida pyrroline, ESR, spin elektron resonansi; GSZ, glutathione thiyl radikal; MNP, 2-metil-2-nitrosopropane; SOD, superoksida dismutase, HRP, horseradish peroksidase.

Kehadiran pereduksi seperti NADH dan GSH , DCF phenoxyl radikal menurun dan kembali ke induk majemuk DCF dengan formasi seiring Nadz atau GSZ , masing-masing, yang , dengan adanya oksigen , membentuk superoksida radikal . DCF , seperti yang ditunjukkan dalam Skema 2 , katalis merangsang pembentukan GSZ dan konsumsi oksigen dalam glutathione -the Sistem peroksidase H2O2 - lobak (Gambar 3 dan 4b ) . tingkat konsumsi oksigen terdeteksi dalam ketiadaan ditambahkan H2O2 (Gambar 5A ) . Dalam hal ini , konsumsi oksigen dapat terjadi ketika GSZ bereaksi dengan yang lain GSH ( GS2 ) molekul untuk membentuk ( GSSG ) . , Yang bereaksi cepat dengan oksigen untuk menghasilkan superoksida radikal ( 43 ) . Ketika sistem hanya mengandung jejak H2O2 , superoksida dismutase hampir sepenuhnya menghambat Tingkat konsumsi oksigen , menunjukkan bahwa , setidaknya sebagian , superoksida radikal dihasilkan oleh reaksi berantai radikal bebas (Gambar 4c , C , dan 5 , B dan D ) . Tidak ada superoksida terdeteksi oleh ESR dalam sistem ini , mungkin karena prekursor ini radikal , GSZ , sangat efisien memulung oleh DMPO ( k 5 2,6 3 108 M21 S21 ) ( 44 ) , seperti yang ditunjukkan juga oleh penghambatan Total konsumsi oksigen oleh penambahan DMPO (Gambar 4b , C dan D ) . Pada pH 7,8 , superoksida radikal dapat bereaksi dengan GSH dengan tingkat orde kedua konstan k 5 6.7 3 105 M21 S21 , menghasilkan H2O2 dan regenerasi GSZ , sehingga melanjutkan rantai reaksi ( 38 ) . DCF sangat meningkatkan tingkat konsumsi oksigen oleh horseradish peroksidase dan NADH (Gambar 7a ) . Hasil dari paket tersebut superoksida radikal dideteksi oleh ESR berputar perangkap ( Gambar 6). Penghambatan radikal pembentukan dan konsumsi oksigen bebas dengan penambahan katalase menunjukkan bahwa jejak hidrogen peroksida hadir dalam sistem (Gambar 6G dan 7b , D dan E ) . Reaksi yang mengarah pada pembentukan superoksida radikal oleh reaksi DCF dan horseradish peroksidase / H2O2 di hadapan agen mengurangi NADH dan GSH diringkas dalam Skema 2 . Mirip dengan GSH , superoksida radikal dapat mengoksidasi NADH tambahan dengan tingkat orde kedua konstan k 5 9.3 3 104 M21 s1 pada pH 7,4 , menghasilkan H2O2 dan regenerasi Nadz , sehingga melanjutkan reaksi berantai ( 45 ) . Penindasan lengkap konsumsi oksigen oleh penambahan askorbat untuk kedua peroxidase DCF - GSH - lobak (Gambar 4b ) dan peroksidase DCF - NADH lobak Sistem (Gambar 7A ) dan Meningkatkan DCF tergantung dari askorbat Biaya publikasi artikel ini yang dibiayai sebagian oleh pembayaran biaya page. Artikel ini karena itu harus dengan ini ditandai "Iklan" sesuai dengan 18 U.S.C. Bagian 1734 semata-mata untuk menunjukkan fakta ini. Untuk siapa korespondensi harus ditangani: NIH / NIEHS, MD F0-01, P.O. Box 12233, Research Triangle Park, NC 27709. Tel: 919-541-3910, Fax: 919-541-1043, E-mail: mason4@niehs.nih.gov. 1 singkatan yang digunakan adalah: DCFH, 29,79-dichlorofluorescin; DCFHDA, 29,79dichlorofluorohescin diasetat, DCF, 29,79-diklorofluoresein; DCFz, DCF phenoxyl radikal bebas,. DCF, DCF semiquinone radikal; DMPO, 5,5-dimetil-1-N-oksida pyrroline, ESR, spin elektron resonansi; GSZ, glutathione thiyl radikal; MNP, 2-metil-2-nitrosopropane; SOD, superoksida dismutase, HRP, horseradish peroksidase.

pembentukan radikal anion (Gambar 8 ) adalah sama mendukung phenoxyl DCF pembentukan radikal . Askorbat radikal relatif stabil setelah DIBENTUK dan tidak furthe oksidator Apa Biokimia Lainnya reduktor dalam sistem atau mengurangi oksigen . Reaksi senyawa leuco Mengurangi dengan DCFH horseradish peroksidase dalam Kehadiran NADH Dikonsumsi oksigen dalam Manner light - dependent becaus DCFH WAS lebih efisien teroksidasi menjadi DCF di Hadirat of Light (Gambar 9 ) . ini percobaan yang menunjukkan ada Banyak reaksi yang melibatkan DCFH , DCF , dan / atau cahaya dalam Sistem Biologi Anjing berpotensi menyebabkan pembentukan radikal buatan. Beberapa Isu Mengenai pengukuran pembentukan DCF sebagai indeks intraseluler HIDROGEN peroksida ( atau lainnya mengaktifkan spesies ) formasi harus jauh dalam pekerjaan di masa depan . Pertama, Thata spesies yang sama membentuk DCF dari DCFH ( dalam hal ini senyawa peroksidase hampir lobak I dan II ) Mungkin akan oksidator dengan novel DCF DCF phenoxyl radikal DCFz . kedua, Biokimia DCFz oxidizer Banyak pereduksi untuk membebaskan radikal yang mungkin atau mungkin tidak ( tergantung pada kimia theire ) bereaksi dengan molekul oksigen untuk membentuk superoksida dan , pada akhirnya , HIDROGEN peroksida . Akibatnya , potensi DCFz oksidasi membentuk spesies oksigen mengaktifkan akan sangat tergantung pada konsentrasi intraseluler dari Berbagai Biokimia pereduksi . Studi ini , dikombinasikan dengan sebe Studi kami ( 28 , 29 ) , jelas Itu menunjukkan hasil dari DCF Assay fluorometric yang Sulit Menafsirkan dalam sel yang mengalami stres oksidatif .

Biaya publikasi artikel ini yang dibiayai sebagian oleh pembayaran biaya page. Artikel ini karena itu harus dengan ini ditandai "Iklan" sesuai dengan 18 U.S.C. Bagian 1734 semata-mata untuk menunjukkan fakta ini. Untuk siapa korespondensi harus ditangani: NIH / NIEHS, MD F0-01, P.O. Box 12233, Research Triangle Park, NC 27709. Tel: 919-541-3910, Fax: 919-541-1043, E-mail: mason4@niehs.nih.gov. 1 singkatan yang digunakan adalah: DCFH, 29,79-dichlorofluorescin; DCFHDA, 29,79dichlorofluorohescin diasetat, DCF, 29,79-diklorofluoresein; DCFz, DCF phenoxyl radikal bebas,. DCF, DCF semiquinone radikal; DMPO, 5,5-dimetil-1-N-oksida pyrroline, ESR, spin elektron resonansi; GSZ, glutathione thiyl radikal; MNP, 2-metil-2-nitrosopropane; SOD, superoksida dismutase, HRP, horseradish peroksidase.