PRACTICA DE TECNICAS DE RECUENTO OBJETIVO GENERAL Adquirir las destrezas necesarias en la realizacin de recuentos microbianos para su aplicacin en el ejercicio

profesional farmacutico. OBJETIVOS PARTICULARES Estudiar los principios involucrados en el recuento de microorganismos presentes en una muestra Aprehender diversas tcnicas de recuento (directas e indirectas) de microorganismos Correlacionar las diferentes respuestas de las tcnicas de recuento MICROORGANISMOS Cultivo masivo de Saccharomyces cerevisiae en agar YGC a 30C por 48 horas MATERIALES Erlenmeyer de 250 ml Estril Tubo de ensayo grandes estriles Pipeta de 1 ml estril Pipeta de 5 ml estril Pipeta de 10 ml estril Probeta de 100 ml estril Asas de vidrio estriles Cajas de Petri estriles Cajas de Agar YGC Agar YGC fundido Solucin Salina Isotnica (NaCl al 0,9% p/v) estril Recipiente con alcohol para quemar Cmara de Neubauer Pipeta Pasteur Equipo de Filtracin Membrana de Filtracin 0,45 m de poro y 47 mm de Pinza de acero estril 6 unidades 50 unidades 80 unidades 10 unidades 10 unidades 6 unidades 10 unidades 60 unidades 50 unidades 6 recipientes con 200 ml c/u 6 recipientes con 300 ml c/u 6 unidades 6 unidades 6 unidades 1 unidad 6 unidades 6 unidades

PROCEDIMIENTO PREPARACION DE LAS SUSPENCIONES En seis (6) cajas de agar YGC cultivar por extensin en superficie Saccharomyces cerevisiae e incubar por 48 horas a 30C. Adicionar a la caja 10 ml de Solucin Salina Isotnica (SSI) estril y cosechar el microorganismo con ayuda de un asa de vidrio (Suspensin Stock) En un erlenmeyer estril colocar aproximadamente 150 ml de SSI estril y adicionar una pequea fraccin de la Suspensin Stock. Mezclar muy bien. Determinar el % de Transmitancia medido a 600 nm. Se agregar ms Suspensin Stock de microorganismo o ms SSI segn se el caso para ajustar el valor de %T. De la manera anterior, hacer seis suspensiones con los siguientes valores (aproximados) de % de Transmitancia: 10, 25, 40, 55, 70 y 85 %T. PREPARACION DE DILUCIONES Aliste 7 tubos de ensayo y con ayuda de la pipeta de 10 ml estril coloque 9 ml de SSI estril en cada uno, y mrquelos 10-1, 10-2, y as sucesivamente hasta 10-7. Con ayuda de una pipeta de 1 ml estril tome 1 ml de la suspensin preparada, y colquelo en el tubo mercado 10-1 y homogenice muy bien. De este tubo, con ayuda de otra pipeta estril, tome 1 ml y colquelo en el tubo marcado 10-2 y homogenice muy bien. Repita esto hasta llegar a 10-7.
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7

Suspencin de 10 %T

9 ml de diluente en cada tubo

RECUENTO POR EXTENCIN EN SUPERFICIE Aliste ocho (8) cajas de petri con agar YGC y cuatro (4) pipetas estriles de 1 ml. Para este trabajo dividimos el trabajo en dos grupos, el primero para las suspensiones de 10, 25 y 40%T y el segundo para 55, 70 y 85%T. Para le primer grupo coloque en dos cajas de petri con agar YGC una alcuota de 0,1 ml de las dilucin 10-3 en cada una. Inmediatamente con ayuda de un asa de vidrio extienda la alcuota por toda la caja de manera homognea. Incube las cajas a 30C por 48 horas. Repita el procedimiento para las diluciones 10-4, 10-5 y 10-6. Es importante que cuando coloque la alcuota sobre el agar realice de manera inmediata la extensin de la muestra sobre la caja con el asa de vidrio Para el segundo grupo Realice el anterior procedimiento con las diluciones 10-1, 10-2, 10-3 y 10-4.

0,1 ml

0,1 ml

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7

0,1 ml

0,1 ml

Esparcir la muestra con el asa de vidrio

RECUENTO POR VERTIDO EN PLACA Aliste ocho (8) cajas de petri vacas estriles, Un recipiente con 200 ml de agar YGC fundido y cuatro (4) pipetas estriles de 1 ml. Para este trabajo dividimos el trabajo en dos grupos, el primero para las suspensiones de 10, 25 y 40%T y el segundo para 55, 70 y 85%T. Para le primer grupo coloque en dos cajas de petri con agar YGC una alcuota de 1 ml de las diluciones 10-4, 10-5, 10-6 y 10-7en las respectivas cajas. Luego vierta una pequea porcin de agar YGC funddo, y homogenice la mezcla haciendo movimientos en forma de OCHO (8) de manera suave y continua. Evite los tropezones, pues se riega el contenido de la caja. Incube las cajas a 30C por 48 horas. Para el segundo grupo Realice el anterior procedimiento con las diluciones 10-2, 10-3, 10-4 y 10-5.

1 ml

1 ml

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7

1 ml

1 ml

Homogenizar Haciendo Ochos

RECUENTO POR CAMARA DE NEUBAUER Tome la cmara de Neubauer y colquele la lmina de cuarzo, luego con ayuda de una pipeta Pasteur cargar la cmara con una fraccin de la dilucin 10-1 de la suspensin a evaluar. Colquela en el microscopio y ubique la cuadrcula con el aumento de 10X * 4X, luego use 10X * 10X ubique la cuadrcula superior derecha, y luego con el aumento 10X * 40X ubique el cuadro superior izquierdo de la cuadrcula anterior. Una vez ubicado aqu comience a contar las clulas hasta completar los 16 cuadros de la cuadricula. De Nuevo pase a 10X * 10X y ubique la cuadrcula Superior Derecha y repita el procedimiento. Lo mismo para las cuadrculas Inferior izquierda y derecha. El recuento por mililitro se calcula as: Determine el nmero total de clulas por cuadricula y multiplique este valor por 10.000 que es el factor de dilucin. La cuadricula tiene un rea de 1 mm2 y la lmina de cuarzo crea una profundidad de 0, 1 mm, por lo tanto el volumen de cada cuadricula es de 1 mm3, es decir1*10-4 ml. Saque el promedio de todos los recuentos realizados.

PESO SECO POR FILTRACION DE MEMBRANA Tome una membrana de filtracin de 47 mm de dimetro estril y determine su peso, Colquela en el sistema de filtracin segn lo inca la grfica. Una vez armado el sistema con la membrana coloque 100 ml de la suspensin de microorganismo y filtre con ayuda de una bomba de vaco. Enjuague con 100 ml de SSI . Luego retire la membrana y colquela en una caja de petri y djela en un horno a 50C hasta peso constante. El peso de la biomasa ser igual a la diferencia entre el peso de membrana con la torta y el peso de la membrana vaca.

Filtro de Aire

Copa

Membrana Soporte de Membrana

Reservorio de Filtrado