26/02/2009

Tipos de PCR
Eduardo Paulino Castan

Tipos de PCR

Tipos de PCR

•PCR-RFLP •Competitive

• RAPD • Multiplex

• AFLP • Long

• PCR-colony • Touchdown

• Hot Start • Degenerate

• In situ • RT-PCR *

• Inverse • Real-Time PCR *

• Nested

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PCR--RFLP (Polimorfismo do Tamanho do Fragmento de Restrição)

PCR

Tipos de PCR

PCR--RFLP (Polimorfismo do Tamanho do Fragmento de Restrição)

PCR

Normal Mutante

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PCR--RFLP (Polimorfismo do Tamanho do Fragmento de Restrição)

PCR

• Variabilidade genética
• Identificação de espécies
R. lalandii                R. porosus

Gene mit RNAr 16S

Rhizoprionodon lalandii

Digestão SspI

Rhizoprionodon porosus

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PCR--RFLP (Polimorfismo do Tamanho do Fragmento de Restrição)

PCR

• Mapeamento genômico
• Análise de doenças
ç g genéticas
Fator V Leiden humano

Relação com propensão a

trombose profunda

Raias 2 e 3: pacientes que não apresentaram a mutação analisada; raias 4 e 6: pacientes com a
mutação Fator V Leiden em heterozigose; raia 5: paciente com a mutação Fator V Leiden em
homozigose.

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RAPD (DNA Polimórfico Amplificado Aleatoriamente)

DNA Genômico Primers randômicos

Tipos de PCR

RAPD (DNA Polimórfico Amplificado Aleatoriamente)

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RAPD (DNA Polimórfico Amplificado Aleatoriamente)

• Identificação dos níveis de diversidade genética populacional

Brycon cephalus (matrinchã da Amazônia)

Estação de piscicultura ‐ CEPTA

Rio Amazonas

estoque natural (S) diversidade estoques cultivados diversidade

genética  genética 

Tipos de PCR

AFLP (Polimorfismo do Tamanho de Fragmentos Amplificados)

(a) Preparação de AFLP

Enzimas de 
restrição (EcoR1
e Mse1) e DNA 
ligase

DNA genômico Adaptadores

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AFLP (Polimorfismo do Tamanho de Fragmentos Amplificados)

(b) Restrição e ligação

Tipos de PCR

AFLP (Polimorfismo do Tamanho de Fragmentos Amplificados)

(c) Amplificação seletiva com um nucleotídeo

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AFLP (Polimorfismo do Tamanho de Fragmentos Amplificados)

(c) Amplificação seletiva com três nucleotídeo

Tipos de PCR

AFLP (Polimorfismo do Tamanho de Fragmentos Amplificados)

Alburnus alburnus

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PCR Colony

• Verificar a presença do fragmento de interesse

Tipos de PCR

Hot Start PCR

• DNA polimerases podem demonstrar

uma pequena atividade à temperatura
ambiente durante a montagem do
ambiente,
experimento

• Essa in/eficiente atividade pode catalisar

a extensão de qualquer extremidade 3’
anelada

• Atividade exonuclease 5'-3' degrada

qualquer extremidade 5' parcialmente
anelada, destruindo o primer e o
substrato molde

• Anelamento inespecífico de primers e

templates

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Hot Start PCR

• Técnicas manuais

• Uso de Barreiras físicas

• Inativação reversível da DNA polimerase

- Inibidores de ligação não covalente
1. Polipeptídio
2. Anticorpo
3. Aptamer

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In Situ PCR

• PCR que ocorre dentro da célula em uma lâmina. Pode ser realizada em células
ou tecidos fixados

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PCR Inversa
• Limitação da PCR convencional: as regiões 5' e 3' que flanqueiam seu fragmento
de DNA de interesse devem ser conhecidas

• Inverse PCR permite a PCR quando você possui informação de apenas uma
seqüência interna
EcoR1 Digestão enzimática EcoR1

DNA ligase

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PCR Inversa

• Sequenciamento de uma região desconhecida

– Vários primers de espécies próximas

Região codificadora do gene da MyoD

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Long PCR

• PCR cuja extensão é mais longa que as PCR convencionais (acima de 5 Kb);

• Para obtenção de uma alta precisão → mistura de polimerases específicas:

– Ex: Proficient polymerases + Accurate polymerases (Pfu)

Tipos de PCR

PCR Multiplex

• PCR com dois ou mais conjuntos de primers para amplificar diferentes fragmentos
de uma mesma amostra

• Um tubo
• Um template
• Dois pares de primers
• Dois fragmentos amplificados

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Nested PCR

• Variação da PCR
convencional, na qual são
utilizados dois pares de
primers (ao invés de um),
para amplificar um mesmo
fragmento

Tipos de PCR

Competitive PCR
• Usada para quantificação
• Densitometria de imagem
• Adiciona-se à reação, uma quantidade conhecida de um fragmento de DNA
(competidor). Esse competidor deve conter sequências para os mesmos primers
utilizados para amplificar o alvo

Quantidade de DNA alvo pode ser determinada pela razão Alvo (T) /competidor (C)

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Touchdown PCR
• Modificação da PCR convencional, que pode resultar na diminuição de amplificações não-específicas

• Temperatura de anelamento:

• Inicialmente mais alta que a temperatura ótima dos primers

• Diminuição de 1°C a cada um ou dois ciclos, até atingir temperatura específica

• Após atingir temperatura específica (touchdown), ela é mantida nos ciclos restantes

‐ 95° 30 s
‐ 95
95° 30 s, 60
30 s, 60° 30 s, 72
30 s, 72° 1min (3 ciclos)
1min (3 ciclos)
‐ 95° 30 s, 56° 30 s, 72° 1min (3 ciclos)
‐ 95° 30 s, 53° 30 s, 72° 1min (3 ciclos)
‐ 95° 30 s, 50° 30 s, 72° 1min (25 ciclos)
‐ 72° 5 min
‐ 4° infinito

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Degenerate PCR

O que são primers degenerados?

Primers que possuem um número de opções em várias posições na sequência

Exemplos: A+C+G V
A+C+G+T N
5’-TCG AAT TCV CCY AAY TGR CCN T-3’ A+T+G D
T+C+G B
5’-TCB AAT TCG CHC AAA TKA CCG T-3’ A+T+C H
A+T W
C+G S
T+G K
A+C M
C+T Y
A+G R

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Degenerate PCR

Aplicações:

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