Microbiol. Rev. 1993 Benson 293-319

1993, 57(2):293. Microbiol. Rev.
D R Benson and W B Silvester
symbionts of actinorhizal plants.

Biology of Frankia strains, actinomycete
http://mmbr.asm.org/content/57/2/293
Updated information and services can be found at:
These include:
CONTENT ALERTS
more cite this article),
Receive: RSS Feeds, eTOCs, free email alerts (when new articles
http://journals.asm.org/site/misc/reprints.xhtml Information about commercial reprint orders:
http://journals.asm.org/site/subscriptions/ To subscribe to to another ASM Journal go to:

o
n

A
p
r
i
l

2
9
,

2
0
1
4

b
y

I
O
W
A

S
T
A
T
E

U
N
I
V
E
R
S
I
T
Y
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

o
n

A
p
r
i
l

2
9
,

2
0
1
4

b
y

I
O
W
A

S
T
A
T
E

U
N
I
V
E
R
S
I
T
Y
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

M I C R O B I O L O G I c A L R E V I E W S , J u n e 1 9 9 3 , p . 2 9 3 - 3 1 9
0 1 4 6 - 0 7 4 9 / 9 3 / 0 2 0 2 9 3 - 2 7 $ 0 2 . 0 0 / 0
C o p y r i g h t 1 9 9 3 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y
B i o l o g y o f F r a n k i a S t r a i n s , A c t i n o m y c e t e S y m b i o n t s o f
A c t i n o r h i z a l P l a n t s
DA V I D R . B E N S O N ' * A N D W A R W I C K B . S I L V E S TE R 2
De p a r t m e n t o f M o l e c u l a r a n d C e l l B i o l o g y , U n i v e r s i t y o f C o n n e c t i c u t , S t o r r s , C o n n e c t i c u t 0 6 2 6 9 - 3 0 4 4 , 1 a n d
De p a r t m e n t o f B i o l o g i c a l S c i e n c e s , U n i v e r s i t y o f W a i k a t o , P r i v a t e B a g 3 1 0 5 , H a m i l t o n , N e w Z e a l a n d 2
I N TR O DU C TI O N . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A c t i n o r h i z a l P l a n t s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
DE S C R I P TI O N O F TH E G E N U S A N D TA XO N O M I C C O N S I DE R A TI O N S
V - , m v %, m v . :n "
G r o u p i n g o f F r a n k i a S t r a i n s i n t o S p e c i e s
P h y l o g e n e t i c P o s i t i o n o f F r a n k i * . . . . . . . . . . .
S TR U C TU R E A N D U L TR A S TR U C TU R E .
G e n e r a l S t r u c t u r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
F r e e - l i v i n g F r a n k i a c e l l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
H y p h a e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
S p o r a n g i a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
S p o r a n g i a l s t r u c t u r e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
V e s i c l e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
S y m b i o t i c F r a n k i a C e l l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
l n [r o u u c u o n 1 . . 1
N o d u l e m o r p h o l o g y a n d a n a t o m y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
I n f e c t i o n p r o c e s s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
E C O L O G I C A L A S P E C TS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
E c o l o g y i n t h e S o i l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
I n f e c t i v i t y a n d E f f e c t i v i t y .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
H o s t S p e c i f i c i t y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
C U L TI V A TI O N O F F R E E - L I V I N G F R A N KI A S TR A I N S
I s o l a t i o n o f F r a n i a s t r a i n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
G r o wt h C h a r a c t e r i s t i c s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
P H YS I O L O G Y O F F R E E - L I V I N G F R A N KI A S TR A I N S .
C a r b o n M e t a b o l i s m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
E x t r a c e l l u l a r e n z y m e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
N i t r o g e n M e t a b o l i s m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
N i t r o g e n a s e a n d 0 2 p r o t e c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A m m o n i a a s s i m i l a t i o n a n d a m i n o a c i d m e t a b o l i s m . . . .
H y d r o g e n a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
M E TA B O L I S M I N S YM B I O S I S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
C a r b o n M e t a b o l i s m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
N i t r o g e n M e t a b o l i s m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
O x y g e n P r o t e c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
G E N E TI C S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . 3 0 1
. . 3 0 1
. . 3 0 4
. . 3 0 4
. . 3 0 5
. . 3 0 5
. . 3 0 6
. . 3 0 6
. . 3 0 6
. . 3 0 7
. . 3 0 7
. . 3 0 7
. . 3 0 7
. . 3 0 7
. . 3 0 8
. . 3 0 9
. . 3 0 9
. . 3 0 9
. . 3 0 9
_ 1 n
.* * . . . * . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . * . . . . O - v
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 . . . . . . . . . . . . . . . O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 0
s . 1 I n
I n t r o u u c U o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 U
C h r o m o s o m e C o m p o s i t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 1
E x t r a c h r o m o s o m a l e l e m e n t s . 3 1 1
G e n e s I n v o l v e d i n N i t r o g e n M e t a b o l i s m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 3 1 1
n i f g e n e o r g a n i z a t i o n o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . o o o o o o o o o . 3 1 1
g i n A a n d g n l n I . . . . . . . . o o o o o o o o . o . o . o o . o . o o o . o o o 3 1 1
r R N A G e n e O r g a n i z a t i o n . . . . . . 3 1 2
P R O S P E C TS . . . . 3 1 2
A C KN O W L E DG M E N TS . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 2
R E F E R E N C E S . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1 2
I N TR O DU C TI O N
A c t i n o m y c e t e s t h a t m a k e u p t h e g e n u s F r a n k i a a r e d i s t i n -
g u i s h e d b y
t h e i r
a b i l i t y
t o i n d u c e
N 2 - f i x i n g
r o o t n o d u l e s o n
*
C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .
c e r t a i n n o n l e g u m i n o u s p l a n t s ( 2 6 8 ) . A f t e r m a n y y e a r s o f
e f f o r t , t h e i s o l a t i o n o f t h e f i r s t F r a n k i a s t r a i n wa s r e p o r t e d i n
1 9 7 8 b y To r r e y a n d c o l l e a g u e s ( 6 2 ) . Th i s r e p o r t d e m o n -
s t r a t e d t h a t F r a n k i a s t r a i n s c o n s t i t u t e d a p r e v i o u s l y u n d e -
s c r i b e d g r o u p o f s o i l a c t i n o m y c e t e s t h a t a r e
f a c u l t a t i v e l y
s y m b i o t i c wi t h h i g h e r p l a n t s . To d a t e , s t r a i n s h a v e b e e n
2 9 3
V o l . 5 7 , N o . 2
. 2 9 3
, 2 9 4
. 2 9 4
, . 2 9 4
, . 2 9 7
. 2 9 7
. 2 9 8
- 2 9 9
- 2 9 9
, . 2 9 9
- 2 9 9
, . 3 0 0
. 3 0 0
, . 3 0 1
. 3 0 1
. I I f '
0 . 0 . 0 . 0 0 . . . . . . . * . 0 0 0 . 0 0 0 0 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . 0 . 0 0 0 0 0 0 0 . 0 . . . . . . . . . . 0 . . . . . . . 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . * * . . . * *
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . 0 0 0 . . . . . . . . . . . . 0 0 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 0 . 0 0 . . . .
. . . 0 0 0 0 0 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 . 0 0 0 0 0 0 . . . . . . . . . . 0 0 0 0 0 0 . . . . . . . . . .
. . . . . . 0 . 0 . . . 0 . 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 . . . 0 . 0

o
n

A
p
r
i
l

2
9
,

2
0
1
4

b
y

I
O
W
A

S
T
A
T
E

U
N
I
V
E
R
S
I
T
Y
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

2 9 4 B E N S O N A N D S I L V E S TE R
i s o l a t e d f r o m 2 0 o f 2 4 a c t i n o r h i z a l p l a n t g e n e r a , a l t h o u g h i n
s e v e r a l i n s t a n c e s , r e i n f e c t i o n h a s n o t b e e n a c h i e v e d ( Ta b l e
1 ) . A s a c o n s e qu e n c e , t h e g e n u s F r a n k i a i s n o w r e l a t i v e l y
we l l d e f i n e d , s o m e s p e c i e s h a v e b e e n p r o p o s e d , t h e g r o wt h
c h a r a c t e r i s t i c s a n d p h y s i o l o g y o f c e r t a i n s t r a i n s h a v e b e e n
s t u d i e d i n s o m e d e t a i l , a n d t h e f i r s t s t e p s t o wa r d d e v e l o p i n g
t h e m o l e c u l a r g e n e t i c s o f F r a n k i a s t r a i n s h a v e b e e n t a k e n .
Th e s t r i k i n g g e n e t i c a n d p h e n o t y p i c d i v e r s i t y o f a v a i l a b l e
s t r a i n s a n d t h e c o n s i d e r a b l e n u m b e r o f p l a n t s p e c i e s y e t t o
y i e l d i n f e c t i v e a n d e f f e c t i v e i s o l a t e s m a k e t h e s e s l o w- g r o w-
i n g a c t i n o m y c e t e s i n t r i g u i n g s u b j e c t s f o r s t u d i e s o n t h e
e v o l u t i o n o f p l a n t - m i c r o o r g a n i s m s y m b i o s e s a n d t h e p h y s i -
o l o g i c a l a n d g e n e t i c i n t e r a c t i o n s t h a t t a k e p l a c e i n N 2 - f i x i n g
s y m b i o s e s . I n a d d i t i o n , F r a n k i a s t r a i n s p r o d u c e t h r e e c e l l
t y p e s t h a t p r o v i d e o p p o r t u n i t i e s f o r s t u d y i n g p r o k a r y o t i c
d e v e l o p m e n t .
S e v e r a l e x c e l l e n t r e v i e ws h a v e d e a l t wi t h a c t i n o r h i z a l
p l a n t e c o l o g y a n d p o t e n t i a l u s e s ( 3 0 , 7 2 , 7 3 , 7 6 , 7 7 ) , e v o l u -
t i o n ( 1 7 1 ) , i n f e c t i o n p r o c e s s e s ( 4 9 ) , r o o t n o d u l e p h y s i o l o g y
( 1 1 4 , 2 3 3 , 2 6 1 ) , c y t o l o g y ( 1 8 1 ) , F r a n k i a g e n e t i c s ( 1 7 0 , 1 8 9 ,
2 4 1 ) , m i c r o b i o l o g y ( 4 ) , a n d g e n e r a l a s p e c t s ( 2 3 , 2 2 3 ) ; t h i s
r e v i e w wi l l a d d r e s s r e c e n t i n f o r m a t i o n , i n l i g h t o f p r e v i o u s
wo r k , o n t h e m i c r o b i o l o g y o f F r a n k i a s t r a i n s , wi t h s p e c i a l
e m p h a s i s o n t h e i r t a x o n o m y , e c o l o g y , p h y s i o l o g y , a n d g e -
n e t i c s .
A c t i n o r h i z a l P l a n t s
Th e p l a n t s n o d u l a t e d b y F r a n k i a s t r a i n s a r e k n o wn a s
a c t i n o r h i z a l p l a n t s ( 2 6 8 ) . To d a t e , a b o u t 1 9 4 s p e c i e s a n d 2 4
g e n e r a o f s u c h p l a n t s h a v e b e e n i d e n t i f i e d ( Ta b l e 1 ) . U n l i k e
t h e r h i z o b i u m - l e g u m e s y m b i o s i s , i n wh i c h t h e h o s t p l a n t s ,
wi t h a f e w e x c e p t i o n s , b e l o n g t o a s i n g l e l a r g e f a m i l y ,
a c t i n o r h i z a l p l a n t s a r e d i s t r i b u t e d a m o n g e i g h t f a m i l i e s a n d
s e v e n o r d e r s o f a n g i o s p e r m s . Th e s e p l a n t s h a v e i n c o m m o n
a p r e d i l e c t i o n t o g r o w i n m a r g i n a l l y f e r t i l e s o i l s , a n d t h e y
o f t e n s e r v e a s p i o n e e r s p e c i e s e a r l y i n s u c c e s s i o n a l p l a n t
c o m m u n i t y d e v e l o p m e n t . R e p r e s e n t a t i v e s c a n b e f o u n d i n
m o s t c l i m a t i c z o n e s , a n d t h e y i n h a b i t a v a r i e t y o f e c o s y s -
t e m s i n c l u d i n g a r c t i c t u n d r a ( Dr y a s s p e c i e s ) , c o a s t a l d u n e s
( C a s u a n n a , H i p p o p h a e , M y r i c a , a n d E l a e a g n u s s p e c i e s ) ,
r i p a r i a n ( A l n u s a n d M y r i c a s p e c i e s ) , g l a c i a l t i l l ( A l n u s a n d
Dr y a s s p e c i e s ) , f o r e s t ( A l n u s , C a s u a r i n a , C o r i a r i a , a n d
S h e p h e r d i a s p e c i e s ) , c h a p p a r a l a n d x e r i c ( C a s u a r i n a , P u r -
s h i a , C e a n o t h u s , C e r c o c a r p u s , C o m p t o n i a , a n d C o wa n i a
s p e c i e s ) , a n d a l p i n e ( A l n u s s p e c i e s ) . Th e i n p u t o f f i x e d
n i t r o g e n b y t h e s e p l a n t s c a n b e c o n s i d e r a b l e , e s p e c i a l l y i n
c o l d e r t e m p e r a t e a r e a s wh e r e i n d i g e n o u s l e g u m e s a r e a b s e n t
o r r a r e ( 2 3 1 ) . P o l l e n d i s t r i b u t i o n s i n m a r i n e s e d i m e n t c o r e s
h a v e r e c o r d e d t h e p a s t r o l e s p l a y e d b y a c t i n o r h i z a l p l a n t s i n
c o l o n i z i n g d e g l a c i a t e d s o i l s d u r i n g p e r i o d s o f m a j o r c l i m a t i c
c h a n g e ( 1 0 8 ) . I n t h e p o s t g l a c i a l p e r i o d o f t h e e a r l y H o l o c e n e
( 1 0 , 0 0 0 t o 8 , 0 0 0 B . P . ) , A l n u s b e c a m e t h e d o m i n a n t p l a n t i n
N o r t h A m e r i c a a n d E u r o p e , e v e n t u a l l y a c c o u n t i n g f o r a b o u t
4 0 % o f t h e t r e e p o l l e n i n p o s t g l a c i a l B r i t a i n a n d N o r t h
A m e r i c a ( 2 3 1 ) . I n S c a n d i n a v i a , H i p p o p h a e a n d A l n u s s p e -
c i e s p r e c e d e d t h e p r e s e n t c o n i f e r f o r e s t , a n d S h e p h e r d i a
s p e c i e s a r e c o n s i d e r e d t o h a v e p l a y e d a s i m i l a r r o l e i n
C a n a d a .
B e c a u s e t h e y o f t e n t h r i v e o n m a r g i n a l s o i l s , a c t i n o r h i z a l
p l a n t s h a v e c u r r e n t a n d p o t e n t i a l a p p l i c a t i o n s i n r e c l a i m i n g
a n d c o n d i t i o n i n g s o i l , p r o d u c i n g t i m b e r a n d p u l p , a n d a c t i n g
a s n u r s e , wi n d b r e a k , o r n a m e n t a l , a n d f u e l wo o d p l a n t s ( 7 3 ,
7 6 ) . G l o b a l l y , t h e y h a v e p o t e n t i a l f o r i n t e g r a t i n g i n t o
s c h e m e s f o r a d d r e s s i n g i s s u e s o f p y r o d e n i t r i f i c a t i o n ( 7 0 ) a n d
r e f o r e s t a t i o n ( 1 2 , 7 6 ) .
TA B L E 1 . A c t i n o r h i z a l p l a n t g e n e r a a n d F r a n k i a i s o l a t e s
F a m i l y a n d g e n u s I s o l a t e s a R e f e r e n c e s b
B e t u l a c e a e
A l n u s + , I , E 1 4 , 1 7 , 1 9 - 2 1 , 3 1 , 4 5 , 5 9 , 8 5 ,
9 7 , 1 0 9 , 1 2 8 , 1 8 8 , 1 9 4 , 2 0 1
C a s u a r i n a c e a e
A l l o c a s u a r i n a + , I , E 2 9 4
C a s u a r i n a + , I , E 1 7 , 6 6 , 7 8 , 7 9 , 2 9 3
G y m n o s t o m a + , I , E 2 0 2
C e u t h o s t o m a
C o r i a r i a c e a e
C o r i a r n a + , N 6 6 , 1 6 4 , 1 6 5
Da t i s c a c e a e
Da t i s c a + , N 6 6 , 1 6 5
E l a e a g n a c e a e
E l a e a g n u s
+ , I , E 1 4 , 1 6 , 2 1 , 8 1 , 1 2 8
H i p p o p h a e
+ , I , E 6 6 , 8 5 , 9 4
S h e p h e r d i a + , I , E 1 4 , 8 1
M y r i c a c e a
C o m p t o n i a
+ , I , E 6 2 , 1 4 3
M y r i c a
+ , I , E 1 7 , 5 5 , 5 9 , 1 3 9 , 2 4 9
R h a m n a c e a e
C e a n o t h u s + , N 2 2 , 1 4 3
C o l l e t i a + , N 3 , 6 0 , 6 5 , 9 5
Di s c a r i a + , N 6 3 a , 1 4 9
Ke n t r o t h a m n u s
R e t a n i l l a
+ , N 6 3 a , 1 4 9
Ta l g u e n e a + , ? 6 3 a
Tr e v o a + , N 6 4
R o s a c e a e
C e r c o c a r p u s + , N 2 2
C h a m a e b a t i a
C o wa n i a + , ? 1 7
Dr y a s
P u r s h i a + , N 1 7
a
S y m b o l s : - , i s o l a t e s n o t r e p o r t e d ;
+ ,
i s o l a t e s o b t a i n e d ; I , i n f e c t i v e ; N ,
n o n i n f e c t i v e ; E , e f f e c t i v e i n f i x i n g N 2 ; ? , i n f e c t i v e n e s s u n k n o wn o r u n r e -
p o r t e d .
b N u m e r o u s o t h e r i s o l a t e s h a v e b e e n m a d e f r o m m e m b e r s o f s o m e g e n e r a ;
r e f e r e n c e s p r o v i d e d a r e t h e e a r l i e s t a n d / o r m o s t r e p r e s e n t a t i v e r e p o r t s .
A d d i t i o n a l i s o l a t e s h a v e b e e n o b t a i n e d f r o m s o m e g e n e r a b u t h a v e b e e n
r e p o r t e d i n f o r m a l l y .
DE S C R I P TI O N O F TH E G E N U S A N D TA XO N O M I C
C O N S I DE R A TI O N S
G e n e r a l De s c r i p t i o n
Th e i d e n t i t y o f t h e a c t i n o r h i z a l r o o t n o d u l e i n h a b i t a n t s a s
a c t i n o m y c e t e s wa s e s t a b l i s h e d i n 1 9 6 4 , wh e n e l e c t r o n m i -
c r o s c o p y r e v e a l e d t h e p r o k a r y o t i c s t r u c t u r e o f t h e m i c r o o r -
g a n i s m s i n A l n u s g l u t i n o s a a n d M y r i c a c e r i f e r a r o o t n o d u l e s
( 2 6 , 2 3 0 ) . A m o r e d e t a i l e d d e s c r i p t i o n b e c a m e a v a i l a b l e o n l y
i n 1 9 7 8 , wh e n t h e i s o l a t i o n o f s t r a i n C p l l ( n o w k n o wn a s
H F P C p I 1 ) f r o m C o m p t o n i a p e r e g r i n a n o d u l e s wa s r e p o r t e d
( 6 2 ) a n d t h e a b i l i t y o f t h e o r g a n i s m t o r e i n f e c t t h e h o s t p l a n t
a n d r e e s t a b l i s h t h e s y m b i o s i s wa s c o n f i r m e d ( 1 2 5 ) . O n c e t h e
u n i qu e m o r p h o l o g y o f c u l t u r e d F r a n k i a s t r a i n s h a d b e e n
d e s c r i b e d , i t b e c a m e e v i d e n t t h a t a s t r a i n i s o l a t e d f r o m A .
g l u t i n o s a n o d u l e s b y P o m m e r i n 1 9 5 9 s t r o n g l y r e s e m b l e d
H F P C p I 1 ( 1 9 4 ) . P o m m e r ' s s t r a i n wa s s u b s e qu e n t l y l o s t , b u t
a m o n g t h e m a n y c l a i m s f o r i s o l a t i n g t h e n o n l e g u m i n o u s
s y m b i o n t p r i o r t o 1 9 7 8 , h i s a l o n e h a s b e c o m e a c c e p t e d .
F r a n k i a s t r a i n s a r e r e a d i l y r e c o g n i z e d b y t h e i r a p p e a r a n c e
i n l i qu i d c u l t u r e . Th e y f o r m e x t e n s i v e h y p h a e a n d b e a r
s p o r a n g i o s p o r e s i n m u l t i l o c u l a r s p o r a n g i a l o c a t e d e i t h e r
t e r m i n a l l y o r i n a n i n t e r c a l a r y p o s i t i o n o n t h e h y p h a e ( F i g . 1
M I C R O B I O L . R E V .

o
n

A
p
r
i
l

2
9
,

2
0
1
4

b
y

I
O
W
A

S
T
A
T
E

U
N
I
V
E
R
S
I
T
Y
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

B I O L O G Y O F F R A N KI A S TR A I N S 2 9 5
F I G . 1 . L i g h t - m i c r o s c o p i c v i e ws o f F r a n k i a c u l t u r e s a s t h e y a p p e a r d u r i n g N 2 f i x a t i o n . ( A ) P h a s e - c o n t r a s t p h o t o m i c r o g r a p h o f F . a l n i
H F P C p I 1 d u r i n g N 2 f i x a t i o n . Th e p h a s e - b r i g h t s t r u c t u r e s a r e t h e v e s i c l e s . ( B ) N o m a r s k i o p t i c s p h o t o m i c r o g r a p h o f F r a n k i a s p . s t r a i n C c I 3
d u r i n g N 2 f i x a t i o n . N o t e t h e v e s i c l e s ( v ) f o r m e d o n t h e t i p s o f h y p h a l b r a n c h e s . B a r s , 5 , u m .
a n d 2 ) . A e r i a l h y p h a e a r e n o t p r o d u c e d o n s o l i d m e d i a . A
d i s t i n g u i s h i n g c h a r a c t e r i s t i c o f F r a n k i a s t r a i n s ( wi t h s o m e
e x c e p t i o n s [s e e
r e f e r e n c e 1 6 5 ] ) i s t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f
v e s i c l e s i n c u l t u r e a n d o f t e n i n s y m b i o s i s ( F i g . 1 ) . V e s i c l e s
a r e l i p i d - e n c a p s u l a t e d , r o u g h l y s p h e r i c a l s t r u c t u r e s m e a s u r -
i n g b e t we e n 2 a n d 6 p , m i n d i a m e t e r , a t t a c h e d e i t h e r t e r m i -
n a l l y o r l a t e r a l l y t o h y p h a e b y a s h o r t v e s i c l e s t a l k t h a t i s
a l s o e n c a p s u l a t e d ; t h e y a r e c o m m o n l y m a d e i n r e s p o n s e t o
n i t r o g e n d e p r i v a t i o n . Th e i r d e v e l o p m e n t i n c u l t u r e a n d
s y m b i o s i s a n d t h e i r p a r t i c i p a t i o n i n N 2 f i x a t i o n a r e d i s c u s s e d
i n m o r e d e t a i l b e l o w.
S o m e m e m b e r s o f t h e g e n u s p r o d u c e p i g m e n t s i n c u l t u r e ;
r e d , y e l l o w, o r a n g e , p i n k , b r o wn , g r e e n i s h , a n d b l a c k p i g -
m e n t s h a v e b e e n r e p o r t e d , d e p e n d i n g o n t h e s t r a i n , t h e
m e d i u m u s e d , a n d t h e a g e o f t h e c u l t u r e ( 1 4 2 ) . A c o m m o n
r e d p i g m e n t h a s b e e n i d e n t i f i e d a s 2 - m e t h y l - 4 , 7 , 9 , 1 2 - t e t r a h y -
d r o x y - 5 , 6 - d i h y d r o b e n z o [a J n a p h t h a c e n e - 8 , 1 3 - d i o n e
a n d a
c a r b o x y l a t e d d e r i v a t i v e ( 9 6 ) . S i n c e p i g m e n t a t i o n i s h i g h l y
v a r i a b l e , i t i s a p o o r c r i t e r i o n f o r p l a c e m e n t i n t o t h e g e n u s
b u t m a y p r o v e u s e f u l a s a p h e n o t y p i c t r a i t f o r s p e c i e s
r e c o g n i t i o n .
C h e m o t a x o n o m i c s t u d i e s h a v e r e v e a l e d t h a t a l l F r a n k i a
V O L . 5 7 , 1 9 9 3

o
n

A
p
r
i
l

2
9
,

2
0
1
4

b
y

I
O
W
A

S
T
A
T
E

U
N
I
V
E
R
S
I
T
Y
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

A '
I
_ O
' p
. .
o ' o f
.
. .
- :1 9 1 k
. * -
F I G . 2 . N o m a r s k i o p t i c s ( A ) a n d t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n ( B ) p h o t o m i c r o g r a p h s o f F r a n k i a m u l t i l o c u l a r s p o r a n g i a f r o m C a s u a r i n a s t r a i n
C c I 3 ( p a n e l A ) a n d a n u n c a t a l o g e d C . e qu i s e t i f o l i a s t r a i n ( p a n e l B ) . I n b o t h c a s e s , m o r e m a t u r e s p o r e s a r e a t t h e t o p a n d l e s s m a t u r e s p o r e s
a r e a t t h e b o t t o m . B a r s , 5
p m
( p a n e l A ) a n d 2 p , m ( p a n e l B ) . P a n e l B c o u r t e s y o f R . H . B e r g .
s t r a i n s t e s t e d h a v e a t y p e I I I c e l l wa l l c o n t a i n i n g m e s o -
d i a m i n o p i m e l i c a c i d , a l a n i n e , g l u t a m i c a c i d , m u r a m i c a c i d ,
a n d g l u c o s a m i n e ( 1 4 2 ) . Th i s wa l l t y p e i s c o m m o n a m o n g t h e
a e r o b i c a c t i n o m y c e t e s . W h o l e - c e l l s u g a r s i n c l u d e v a r i a b l e
a m o u n t s o f f u c o s e , r i b o s e , x y l o s e , m a d u r o s e , m a n n o s e ,
g a l a c t o s e , g l u c o s e , r h a m n o s e , a n d 2 - 0 - m e t h y l - D- m a n n o s e
( 1 4 2 , 1 6 8 , 2 4 8 ) . S t . - L a u r e n t e t a l . ( 2 4 8 ) c o n s i d e r e d t h e
p r e s e n c e o f 2 - 0 - m e t h y l - D- m a n n o s e t o b e d i a g n o s t i c f o r t h e
g e n u s F r a n k i a a n d u s e d i t s r e l a t i v e a b u n d a n c e t o d i s c r i m i -
n a t e b e t we e n s t r a i n s b e l o n g i n g t o t h e A l n u s h o s t s p e c i f i c i t y
g r o u p ( i n c l u d i n g M y r i c a a n d C o m p t o n i a s p e c i e s ) a n d s t r a i n s
i n f e c t i v e o n m e m b e r s o f t h e f a m i l y E l a e a g n a c e a e ( E l a e -
a g n u s , H i p p o p h a e , a n d S h e p h e r d i a s p e c i e s ) .
P h o s p h o l i p i d a n a l y s i s p l a c e s F r a n k i a s t r a i n s i n t o g r o u p
P I , c o n t a i n i n g p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l , p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l
m a n n o s i d e s , a n d d i p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l ; n i t r o g e n - c o n t a i n -
i n g p h o s p h o l i p i d s a r e a b s e n t ( 1 4 1 ) . Th i s g r o u p i n g d i s t i n -
g u i s h e s t h e m f r o m m e m b e r s o f t h e g e n u s G e o d e r m a t o p h i l u s
( g r o u p P I I ) , wh i c h a l s o p r o d u c e m u l t i l o c u l a r s p o r a n g i a a n d
a r e c u r r e n t l y t h e c l o s e s t k n o wn r e l a t i v e s o f F r a n k i a s t r a i n s
( 9 9 ) . F a t t y a c i d a n a l y s i s h a s b e e n u s e d b o t h t o c l a s s i f y
"a t y p i c a l " s t r a i n s i n t o t h e g e n u s ( 1 6 5 ) a n d t o d i s c e r n s u b -
g r o u p s a m o n g e x i s t i n g m e m b e r s ( 2 3 7 ) . A l t h o u g h b o t h o f
t h e s e o b j e c t i v e s c a n b e a c h i e v e d b y u s i n g a p p r o p r i a t e c o n -
t r o l s t r a i n s , n o c l e a r t a x o n o m i c m a r k e r t h a t wo u l d p l a c e a n
u n k n o wn s t r a i n wi t h i n t h e g e n u s h a s b e e n i d e n t i f i e d . Th e
d i s c o v e r y o f h o p a n o i d s i n s o m e F r a n k i a s t r a i n s m a y p r o v i d e
a n a d d i t i o n a l c h e m o t a x o n o m i c m a r k e r i n t h e n e a r f u t u r e
( 4 8 ) . I n t h e f e w s t r a i n s t h a t h a v e b e e n a n a l y z e d , a m e n a qu i -
n o n e p a t t e r n c o n s i s t i n g m a i n l y o f M K9 ( H 4 ) ( m e n a qu i n o n e
wi t h n i n e i s o p r e n e u n i t s , f o u r o f wh i c h a r e h y d r o g e n a t e d )
wi t h l e s s e r a m o u n t s o f M K9 ( H 6 ) a n d M K9 ( H 8 ) wa s f o u n d
( 1 3 8 ) . A g a i n , s u c h a p a t t e r n i s c o m m o n a m o n g t h e a e r o b i c
a c t i n o m y c e t e s .
Th e G + C c o n t e n t o f m o r e t h a n 4 5 F r a n k i a s t r a i n s s t u d i e d ,
i s o l a t e d f r o m a v a r i e t y o f p l a n t s , f a l l s i n t h e r e l a t i v e l y n a r r o w
r a n g e o f 6 6 t o 7 5 m o l %. Th i s h i g h m o l % G + C p l a c e s F r a n k i a
s t r a i n s a m o n g t h e e u a c t i n o m y c e t e s a n d c o n s t i t u t e s o n e o f
t h e f u n d a m e n t a l p r e r e qu i s i t e s f o r b e l o n g i n g t o t h e g e n u s ( 1 1 ,
8 7 ) , a l t h o u g h t h e r e l a t i v e u n i f o r m i t y o f t h e v a l u e s r e n d e r s
t h e G + C c o n t e n t o f l i t t l e u s e i n d i s t i n g u i s h i n g s p e c i e s a m o n g
F r a n k i a s t r a i n s .
A s m i n i m u m c r i t e r i a f o r i n c l u d i n g s t r a i n s wi t h i n t h e g e n u s ,
i t i s g e n e r a l l y a g r e e d t h a t t h e c o m b i n a t i o n o f m o r p h o l o g y i n
c u l t u r e a n d i s o l a t i o n f r o m a n a c t i n o r h i z a l r o o t n o d u l e i s
s u f f i c i e n t ( 1 4 2 ) . A h i g h G + C c o n t e n t , c e l l wa l l t y p e I I I , a
p h o s p h o l i p i d p a t t e r n o f P I , a n d , i n c r e a s i n g l y , r R N A s e -
qu e n c e s a r e a l l a d d i t i o n a l c r i t e r i a u s e d t o p l a c e n e w s t r a i n s
i n t h e g e n u s F r a n k i a .

o
n

A
p
r
i
l

2
9
,

2
0
1
4

b
y

I
O
W
A

S
T
A
T
E

U
N
I
V
E
R
S
I
T
Y
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

B I O L O G Y O F F R A N KI S TR A I N S 2 9 7
N o m e n c l a t u r e
Th e d e s c r i p t i o n o f H F P C p I 1 p r o v i d e d i n v e s t i g a t o r s wi t h
t h e k e y i n f o r m a t i o n n e e d e d t o i s o l a t e a n d r e c o g n i z e F r a n k i a
s t r a i n s . A s a r e s u l t , h u n d r e d s o f i s o l a t e s we r e o b t a i n e d f r o m
a v a r i e t y o f p l a n t s i n a r e l a t i v e l y s h o r t t i m e d u r i n g t h e l a t e
1 9 7 0 s a n d e a r l y 1 9 8 0 s . Th i s h a r v e s t o f i s o l a t e s p r o v e d b o t h
b o o n a n d b a n e t o r e s e a r c h e r s i n t h e f i e l d , s i n c e n o f r a m e -
wo r k e x i s t e d f o r n a m i n g , g r o u p i n g , o r i d e n t i f y i n g i s o l a t e s a s
t h e y b e c a m e a v a i l a b l e . Th e o r i g i n a l H F P C p I 1 i s o l a t e wa s s o
n a m e d b e c a u s e i t wa s "C o m p t o n i a p e r e g r i n a i s o l a t e n u m b e r
1 " ( 6 2 ) . A d d i t i o n a l s t r a i n s f r o m o t h e r p l a n t s we r e s i m i l a r l y
n a m e d ( f o r e x a m p l e , A r I 3 f r o m A . r u b r a [4 5 ] , A i r I l a n d
A i r I 2 f r o m A . i n c a n a s u b s p . r u g o s a [1 3 7 ] , a n d
E A N l p C
f r o m E l a e a g n u s a n g u s t i f o l i a [1 2 8 ] ) . M a n y o f t h e f i r s t s t r a i n s
t o b e i s o l a t e d a r e s t i l l r e f e r r e d t o b y t h e s e t r i v i a l d e s i g n a -
t i o n s . H o we v e r , s i n c e a d d i t i o n a l s t r a i n s f r o m a s i n g l e p l a n t
s p e c i e s we r e i s o l a t e d b y d i f f e r e n t l a b o r a t o r i e s , a m o r e c o -
h e r e n t c a t a l o g i n g s y s t e m b e c a m e n e c e s s a r y . I n 1 9 8 3 , a
n u m b e r i n g s y s t e m b a s e d o n t h e l a b o r a t o r y o f o r i g i n , h o s t
g e n u s , h o s t s p e c i e s , a n d a s i x - d i g i t n u m b e r u n i qu e t o t h e
s t r a i n wa s e s t a b l i s h e d t o h e l p b r i n g o r d e r t o t h e p r o l i f e r a t i o n
o f s t r a i n s i n c o l l e c t i o n s a r o u n d t h e wo r l d ( 1 5 , 1 3 5 , 1 3 6 ) . Th i s
c o n s e n s u s c a t a l o g i n g s y s t e m i s s t i l l u s e d f o r o r d e r i n g s t r a i n s
i n c o l l e c t i o n s ( 1 4 1 ) .
Th e g e n u s n a m e F r a n k A i a wa s p r o p o s e d i n 1 8 8 6 b y J .
B r u n c h o r s t t o h o n o r h i s m e n t o r , A . B . F r a n k , a S wi s s
m i c r o b i o l o g i s t ( 1 9 8 ) . S i n c e B r u n c h o r s t a n d F r a n k c o n s i d -
e r e d t h e m i c r o o r g a n i s m t o b e a f u n g u s , t h e n a m e wa s n o t
g e n e r a l l y u s e d u n t i l B e c k i n g , i n 1 9 7 0 , r e v i v e d i t a n d r e d e -
f i n e d t h e g e n u s a s c o n s i s t i n g o f m e m b e r s o f t h e A c t i n o m y c -
e t a l e s i n a n e w f a m i l y , F r a n k i a c e a e ( 2 4 ) . B e c k i n g f u r t h e r
p r o p o s e d t h a t 1 0 s p e c i e s b e e s t a b l i s h e d ( F r a n k i a a l n i , F .
e l a e a g n i , F . b r u n c h o r s t i i , F . d i s c a r i a e , F . c a s u a r i n a e , F .
c e a n o t h i , F . c o r i a r i a e , F . d r y a d i s , F . p u r s h i a e , a n d F .
c e r c o c a r p i ) b a s e d o n t h e s o u r c e p l a n t , a n d , s i n c e n u m e r o u s
a t t e m p t s t o o b t a i n t h e o r g a n i s m s h a d f a i l e d , h e d e s c r i b e d t h e
m e m b e r s a s "o b l i g a t e s y m b i o t i c o r g a n i s m s . "
F r a n k i a s t r a i n s s t i l l c o n s t i t u t e a s e p a r a t e f a m i l y wi t h i n t h e
o r d e r A c t i n o m y c e t a l e s . I n B e r g e y ' s M a n u a l o f S y s t e m a t i c
B a c t e r i o l o g y , v o l . 4 ( 1 9 8 9 ) , t h e y a r e i n c l u d e d a m o n g "a c t i -
n o m y c e t e s wi t h m u l t i l o c u l a r s p o r a n g i a " ( 1 4 1 ) . O t h e r g e n e r a
i n t h i s g r o u p i n c l u d e G e o d e r m a t o p h i l u s a n d De r m a t o p h i l u s .
R e c e n t 1 6 S r R N A s e qu e n c e a n a l y s e s o f r e p r e s e n t a t i v e s o f
t h e s e g e n e r a h a v e r e v e a l e d a r e l a t i v e l y c l o s e p h y l o g e n e t i c
r e l a t i o n s h i p b e t we e n F r a n k i a a n d G e o d e n n a t o p h i l u s b u t n o t
De r m a t o p h i l u s ; a n i n v a l i d l y d e s c r i b e d i s o l a t e f r o m t h e B l a c k
S e a c a l l e d "B l a s t o c o c c u s " a l s o c l u s t e r e d wi t h F r a n k i a ( 9 9 ;
s e e b e l o w) ( F i g . 3 ) . Th u s , f u t u r e d e s c r i p t i o n s o f t h e f a m i l y
F r a n k i a c e a e s h o u l d i n c l u d e m e m b e r s o f t h e s e o t h e r g e n e r a .
Th e f a m i l y De r m a t o p h i l a c e a e wi l l c o n s e qu e n t l y c o n t a i n
o n l y t h e g e n u s De r m a t o p h i l u s ( 9 9 ) .
G r o u p i n g o f F r a n k i a S t r a i n s i n t o S p e c i e s
A l t h o u g h t h e g e n u s d e s i g n a t i o n F r a n k i a a n d t h e c r e a t i o n
o f t h e f a m i l y F r a n k i a c e a e h a v e b e e n u n a n i m o u s l y a c c e p t e d
a s d e s c r i b e d b y L e c h e v a l i e r a n d L e c h e v a l i e r ( 1 4 1 ) , t h e
s p e c i e s a s s i g n a t i o n s a c c o r d i n g t o h o s t p l a n t o f o r i g i n h a v e
p r o v e n m o r e c o n t r o v e r s i a l ( 1 4 1 ) . Th e d i f f i c u l t i e s e n c o u n -
t e r e d i n c l u d e t h e o b s e r v a t i o n s t h a t i n d i v i d u a l s t r a i n s o f t e n
n o d u l a t e p l a n t s f r o m d i f f e r e n t p l a n t o r d e r s ; s t r a i n s f r o m t h e
s a m e "g e n o m i c s p e c i e s " h a v e b e e n i s o l a t e d f r o m m e m b e r s
o f d i f f e r e n t p l a n t f a m i l i e s ; s o m e s t r a i n s c a n n o t r e i n f e c t t h e i r
s o u r c e p l a n t ; a n d u n p r e d i c t a b l e n o d u l a t i n g a b i l i t i e s h a v e
b e e n o b s e r v e d , e s p e c i a l l y a m o n g t h e s o - c a l l e d E l a e a g n u s
I I I I I I
0 5 0 . 6 0 . 7 0 . 8 0 . 9 1 . 0
S A
F I G . 3 . P h y l o g e n e t i c p l a c e m e n t o f t h e g e n u s F r a n k i a . A d a p t e d
f r o m r e f e r e n c e 9 9 wi t h p e r m i s s i o n . S A B , s i m i l a r i t y c o e f f i c i e n t .
s t r a i n s ( 1 0 , 2 2 , 5 7 , 8 7 ) . N e v e r t h e l e s s , a c o n s i d e r a b l e d e g r e e
o f h o s t p l a n t s p e c i f i c i t y d o e s o c c u r , wi t h t h e r e s u l t t h a t t h e
h o s t p l a n t o r i g i n a n d t h e a b i l i t y t o n o d u l a t e wi t h i n c e r t a i n
h o s t s p e c i f i c i t y g r o u p s a r e r e l e v a n t b u t n o t d e t e r m i n a t i v e
c h a r a c t e r i s t i c s f o r s t r a i n i d e n t i f i c a t i o n o r c l a s s i f i c a t i o n .
A r r a n g i n g F r a n k i a s t r a i n s i n t o p h e n o t y p i c a l l y r e l a t e d
g r o u p s h a v e p r o v e n t o b e a d i f f i c u l t t a s k . C l a s s i c a l p h y s i o -
l o g i c a l t e s t i n g i s o f l i t t l e u s e i n g r o u p i n g F r a n k i a s t r a i n s s i n c e
t h e y a l l g r o w s l o wl y ( d o u b l i n g t i m e s o f 1 5 t o 4 8 h o r m o r e )
a n d t h e r e s u l t s o f t e n v a r y d e p e n d i n g o n h o w l o n g t h e s t r a i n s
a r e a l l o we d t o g r o w. C o n s e qu e n t l y , s e v e r a l o t h e r a p -
p r o a c h e s h a v e b e e n t a k e n wi t h v a r i o u s d e g r e e s o f s u c c e s s .
E a r l y a t t e m p t s t o c o r r e l a t e s e r o l o g i c a l g r o u p s wi t h h o s t
r a n g e o r o t h e r p h e n o t y p i c p a r a m e t e r s we r e l a r g e l y a b a n -
d o n e d wh e n s u c h c o r r e l a t i o n s p r o v e d m o r e c o m p l e x t h a n
wa s i n i t i a l l y t h o u g h t ( 1 8 , 1 3 7 ) . A d d i t i o n a l a p p r o a c h e s t o
g r o u p i n g s t r a i n s h a v e i n c l u d e d c o m p a r a t i v e s o d i u m d o d e c y l
s u l f a t e - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f wh o l e - c e l l p r o -
t e i n s ( 3 4 , 3 7 , 9 2 ) , a n a l y s e s o f wh o l e - c e l l s u g a r p a t t e r n s ( 1 6 8 ,
2 4 8 ) , f a t t y a c i d a n a l y s i s ( 1 6 5 , 2 3 7 ) , i s o e n z y m e a n a l y s i s ( 9 1 ,
1 9 7 ) , DN A r e s t r i c t i o n p a t t e r n a n a l y s i s o f t o t a l DN A ( 5 6 ) , n i f
g e n e r e s t r i c t i o n f r a g m e n t l e n g t h p o l y m o r p h i s m a n a l y s i s
( 1 8 2 , 1 9 0 ) , DN A - DN A h o m o l o g y s t u d i e s ( 2 , 1 0 , 5 6 , 8 7 ) , a n d
l o w- f r e qu e n c y r e s t r i c t i o n f r a g m e n t a n a l y s i s ( 5 2 ) . E a c h o f
t h e s e a p p r o a c h e s h a s y i e l d e d p h e n o t y p i c a n d i n s o m e c a s e s
g e n o t y p i c s u b g r o u p s wi t h i n h o s t s p e c i f i c i t y g r o u p s .
N o t a l l a p p r o a c h e s h a v e b e e n t a k e n wi t h c l a s s i f i c a t i o n i n
m i n d ; s o m e h a v e b e e n u s e d p r i m a r i l y t o a s s e s s t h e d i v e r s i t y
o f s t r a i n s i s o l a t e d f r o m a n i n d i v i d u a l p l a n t s p e c i e s o r o f
s t r a i n s o b t a i n e d f r o m a l i m i t e d g e o g r a p h i c a l a r e a ( 3 4 , 3 7 , 5 6 ,
9 2 ) . O f t h e t e c h n i qu e s u s e d , o n l y DN A - DN A h o m o l o g y a n d
p e r h a p s t h e r e c e n t l y d e v e l o p e d r e s t r i c t i o n f r a g m e n t l e n g t h
p o l y m o r p h i s m c a n u n e qu i v o c a l l y p l a c e a n u n k n o wn s t r a i n
wi t h i n a g e n o s p e c i e s . Th e o t h e r t e c h n i qu e s y i e l d we l l -
d e f i n e d g r o u p s i n d e p e n d e n t o f p h y l o g e n e t i c r e l a t i o n s h i p s ,
b u t t h e s e n s i t i v i t y o f t h e m e t h o d s r e m a i n s u n k n o wn . A s
a d d i t i o n a l c h e m o t a x o n o m i c a n d p h y l o g e n e t i c d a t a a c c u m u -
l a t e i n t h e p r e s e n t p o l y p h a s i c a p p r o a c h t o F r a n k i a t a x o n -
o m y , t h e s t r u c t u r e o f t h e g e n u s F r a n k i a wi l l b e c o m e i n c r e a s -
i n g l y c l e a r ( 1 7 2 ) .
Th e a v a i l a b l e b i o c h e m i c a l , p h y s i o l o g i c a l , a n d p h y l o g e -
n e t i c i n f o r m a t i o n o n c e r t a i n we l l - s t u d i e d g r o u p s o f s t r a i n s
h a s r e k i n d l e d t h e d e s i r e t o e s t a b l i s h F r a n k i a s p e c i e s . To d o
s o , i t i s d e s i r a b l e t o s a t i s f y t h e c o n s e n s u s t h a t n e w g e n o -
V O L . 5 7 , 1 9 9 3

o
n

A
p
r
i
l

2
9
,

2
0
1
4

b
y

I
O
W
A

S
T
A
T
E

U
N
I
V
E
R
S
I
T
Y
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

s p e c i e s b e d e f i n e d i n p h y l o g e n e t i c t e r m s o n t h e b a s i s o f
DN A s e qu e n c e d a t a ( 2 8 6 ) . Th u s , DN A - DN A r e a s s o c i a t i o n
k i n e t i c s t h a t a p p r o x i m a t e 7 0 % o r g r e a t e r DN A r e l a t e d n e s s ,
t o g e t h e r wi t h a 5 C o r l e s s A Tm b e t we e n s t r a i n s , wo u l d
s u p p o r t p l a c e m e n t o f t wo s t r a i n s i n t h e s a m e s p e c i e s , wi t h
t h e c a v e a t t h a t a n y g e n o s p e c i e s s o i d e n t i f i e d s h o u l d n o t b e
n a m e d u n t i l i t i s d i s t i n g u i s h a b l e f r o m a n o t h e r g e n o s p e c i e s o n
t h e b a s i s o f p h e n o t y p i c p r o p e r t i e s . F o r F r a n k i a s t r a i n s ,
s u f f i c i e n t i n f o r m a t i o n i s a v a i l a b l e t o s u p p o r t t h e s p e c i e s
i d e n t i f i c a t i o n o f s o m e m e m b e r s o f t h e g e n u s .
L a l o n d e e t a l . p r o p o s e d t h e a c c e p t a n c e o f t h e s p e c i e s F .
a l n i a n d F . e l a e a g n i a n d c r e a t e d F . a l n i s u b s p . p o m m e r i i a n d
F . a l n i s u b s p . v a n d i j k i i ( 1 3 2 ) . Th i s p r o p o s a l wa s b a s e d o n t h e
r e s u l t s o f b i o c h e m i c a l a n d p h y s i o l o g i c a l s t u d i e s d o n e o n
s t r a i n s i s o l a t e d m a i n l y f r o m m e m b e r s o f t h e f a m i l i e s B e t u -
l a c e a e , M y r i c a c e a e , E l a e a g n a c e a e , a n d C a s u a r i n a c e a e .
S i n c e m a n y o f t h e s t u d i e s u s e d t h e s a m e s t r a i n s ( 9 1 , 9 2 , 2 3 7 ,
2 4 8 ) , t h e c o n s i s t e n c y o f t h e r e s u l t i n g g r o u p s c o u l d b e c o m -
p a r e d . H o we v e r , a t t h e t i m e , DN A - DN A r e a s s o c i a t i o n
a n a l y s e s h a d b e e n d o n e o n o n l y a f e w o f t h e s t r a i n s s u b -
j e c t e d t o o t h e r t y p e s o f a n a l y s e s , a n d a c c e p t a n c e o f t h e
p r o p o s e d s p e c i e s d e s i g n a t i o n s wa s n o t u n i v e r s a l . A m o r e
e x t e n s i v e DN A r e l a t e d n e s s s t u d y t h a t i n c l u d e s s t r a i n s
g r o u p e d b y o t h e r m e t h o d s h a s s i n c e b e e n d o n e . F e r n a n d e z
e t a l . ( 8 7 ) i d e n t i f i e d n i n e g e n o m i c s p e c i e s a m o n g 4 3 i s o l a t e s
e x a m i n e d . Th r e e g e n o m i c s p e c i e s we r e f o u n d a m o n g t h e
s t r a i n s t h a t i n f e c t A l n u s s p e c i e s , f i v e we r e f o u n d a m o n g
s t r a i n s t h a t i n f e c t m e m b e r s o f t h e f a m i l y E l a e a g n a c e a e , a n d
o n e c o n t a i n e d 1 1 s t r a i n s i s o l a t e d f r o m m e m b e r s o f t h e
C a s u a r i n a c e a e . N i n e s t r a i n s ( f o u r i s o l a t e d f r o m A l n u s s p e -
c i e s , t wo i s o l a t e d f r o m m e m b e r s o f t h e E l a e a g n a c e a e , a n d
t h r e e i s o l a t e d f r o m m e m b e r s o f t h e C a s u a r i n a c e a e ) we r e n o t
c l a s s i f i e d a n d m a y r e p r e s e n t a d d i t i o n a l g e n o m i c s p e c i e s .
O t h e r DN A - DN A h o m o l o g y s t u d i e s wi t h d i f f e r e n t s t r a i n
c o l l e c t i o n s h a v e a l s o c o n f i r m e d t h e o v e r a l l d i v e r s i t y o f
F r a n k i a s t r a i n s s u g g e s t e d b y o t h e r m e t h o d s ( 2 , 1 0 , 5 6 ) .
Th e l a r g e s t g r o u p o f A l n u s - i n f e c t i n g s t r a i n s , g e n o m i c
s p e c i e s 1 , wa s f i r s t e s t a b l i s h e d a s g e n o g r o u p I b y A n e t a l . i n
t h e i r e a r l y DN A h o m o l o g y wo r k ( 1 0 ) . Th e y e s t a b l i s h e d
g e n o g r o u p I wi t h s e v e n i s o l a t e s f r o m A l n u s s p e c i e s p l u s o n e
f r o m C o m p t o n i a p e r e g r i n a a n d o n e f r o m M y r i c a p e n s y l v a n -
i c a , wi t h DN A f r o m A r I 4 ( f r o m A . r u b r a ) a s a r e f e r e n c e . Th e
c o h e r e n c e o f t h i s g r o u p h a s s i n c e b e e n c o n f i r m e d b y n u m e r -
o u s p h e n o t y p i c a n d g e n e t i c a n a l y s e s a n d t h u s h a s a v a l i d
c l a i m t o t h e s p e c i e s e p i t h e t F . a l n i a s d e s c r i b e d b y L a l o n d e
e t a l . ( 1 3 2 ) wi t h s t r a i n H F P C p I 1 a s t h e t y p e s t r a i n . Th e
p r o p o s a l t h a t t h e s u b s p e c i e s F . a l n i s u b s p . v a n d i j k i i
a n d F .
a l n i s u b s p . p o m m e r i i b e e s t a b l i s h e d h a s g e n e r a t e d s o m e
c o n f u s i o n i n t h e n a m i n g o f s t r a i n s . A s B e y a z o v a a n d L e c h -
e v a l i e r ( 5 2 ) h a v e p o i n t e d o u t , a s u b s p e c i e s o f F . a l n i s h o u l d
b e a l n i . A l s o , s t r a i n A R g P 5 " ( U L Q 0 1 3 2 1 0 5 0 0 9 ) , wh i c h i s
t h e t y p e s t r a i n f o r t h e F . a l n i s u b s p . v a n d i j k i i g r o u p o f
L a l o n d e e t a l . ( 1 3 2 ) , wa s i n g e n o m i c s p e c i e s 3 i n t h e a n a l y s i s
o f F e r n a n d e z e t a l . ( 8 7 ) a n d h a d o n l y a 2 % DN A h o m o l o g y
wi t h m e m b e r s o f g e n o m i c s p e c i e s 1 , wh i c h c o n t a i n e d H F -
P C p I 1 . Th e r e f o r e , t h e p r o p o s a l t h a t v a n d i j k i i b e c o n s i d e r e d
a s u b s p e c i e s o f F . a l n i i s p r o b l e m a t i c a l , s i n c e a s u b s p e c i e s
s h o u l d b e g e n e t i c a l l y c l o s e t o b u t p h e n o t y p i c a l l y d i s t i n c t
f r o m t h e t y p e s p e c i e s ( 2 8 6 ) . B e c a u s e o f t h e r e s u l t s f r o m t h e
DN A - DN A r e a s s o c i a t i o n s t u d i e s , t h e d e f i n i t i o n o f t h e s u b -
s p e c i e s v a n d i j k i i
a n d p o m m e r i i n e e d s t o b e r e c o n c i l e d wi t h
c u r r e n t k n o wl e d g e .
Th e i m p r e s s i o n f r o m e a r l y s t u d i e s t h a t E l a e a g n u s s t r a i n s
a r e h i g h l y d i v e r s e i n t h e i r p h y s i o l o g y , m o r p h o l o g y , a n d
b i o c h e m i s t r y h a s b e e n c o n f i r m e d b y DN A - DN A r e a s s o c i a -
t i o n s t u d i e s ( 1 0 , 8 7 ) . A n e t a l . ( 1 0 ) f o u n d n o g e n o g r o u p
a m o n g 1 0 i s o l a t e s ( 5 f r o m E l a e a g n u s s p e c i e s , t wo f r o m
C a s u a r i n a e qu i s e t i f o l i a a n d o n e e a c h f r o m C e a n o t h u s a m e r -
i c a n u s , P u r s h i a t r i d e n t a t a , a n d A l n u s i n c a n a s u b s p . r u g o s a )
t e s t e d a g a i n s t DN A f r o m E u I l a ( f r o m E l a e a g n u s u m b e l l a t a )
o r A r I 4 . Th e 1 3 E l a e a g n a c e a e s t r a i n s t e s t e d b y F e r n a n d e z e t
a l . ( 8 7 ) c o n s t i t u t e d t h e i r g e n o m i c s p e c i e s
4
t h r o u g h
8 .
G e n o m i c s p e c i e s 4 h a d s i x m e m b e r s , s p e c i e s 5 h a d
t h r e e ,
a n d s p e c i e s 6 , 7 , a n d 8 h a d o n e e a c h . U n f o r t u n a t e l y ,
t h e
t y p e
s p e c i e s p r o p o s e d f o r F . e l a e a g n i i , s t r a i n S C N 1 O a
( U L Q 1 9 0 2 0 1 0 0 1 ) ( 1 3 2 ) , wa s n o t s t u d i e d ,
s o i t s
r e l a t i o n s h i p
t o
o t h e r g e n o m i c s p e c i e s r e m a i n s u n k n o wn .
A s u r p r i s i n g d e g r e e o f s i m i l a r i t y h a s b e e n f o u n d a m o n g
s t r a i n s t h a t we r e o r i g i n a l l y i s o l a t e d f r o m m e m b e r s o f t h e
C a s u a r i n a c e a e . O f t h e 1 1 s t r a i n s t e s t e d b y F e r n a n d e z e t a l .
( 8 7 ) , 8 c o n s t i t u t e d g e n o m i c s p e c i e s 9 , wi t h p e r c e n t
r e a s s o -
c i a t i o n s r a n g i n g f r o m 6 9 t o 1 0 0 %. Th e t h r e e s t r a i n s t h a t
r e m a i n e d u n c l a s s i f i e d we r e "a t y p i c a l , " s i n c e t h e y f a i l e d t o
r e i n f e c t t h e s o u r c e p l a n t b u t c o u l d i n f e c t m e m b e r s o f t h e
E l a e a g n a c e a e . Th e c o h e r e n c e o f t h e g e n o m i c s p e c i e s
9
g r o u p m a y b e s u r p r i s i n g c o n s i d e r i n g t h a t t h e s t r a i n s we r e
i s o l a t e d f r o m n o d u l e s c o l l e c t e d a t g e o g r a p h i c a l l y s e p a r a t e d
l o c a l e s , i n c l u d i n g S e n e g a l , A u s t r a l i a , F l o r i d a , B r a z i l ,
Th a i -
l a n d , a n d M a d a g a s c a r . H o we v e r , a s F e r n a n d e z e t a l . p o i n t e d
o u t ( 8 7 ) , a l l c a s u a r i n a s o r i g i n a t e d
f r o m A u s t r a l i a a n d t h e
S o u t h P a c i f i c I s l a n d s a n d h a v e
o n l y r e c e n t l y
b e e n t r a n s -
p l a n t e d t o o t h e r r e g i o n s f o r v a r i o u s p u r p o s e s ; t h e r e f o r e ,
t h e
r e l a t i v e c o h e r e n c e o f t h e g r o u p m a y r e f l e c t t h e i r l i m i t e d
g e o g r a p h i c a l o r i g i n . A l t e r n a t i v e l y ,
t h e s t r a i n s i n c u l t u r e
s i m p l y m a y b e t h e m o r e e a s i l y
i s o l a t e d o r
f a s t e r - g r o wi n g
s t r a i n s a n d a r e t h e r e f o r e n o t r e p r e s e n t a t i v e
o f t h e t r u e
d i v e r s i t y i n t h e f i e l d . I n
a n y e v e n t ,
t h e s t r a i n s i n
g e n o m i c
s p e c i e s 9 i s o l a t e d f r o m C a s u a r i n a s p e c i e s m a y
b e
s u f f i c i e n t l y
d e f i n e d b o t h g e n e t i c a l l y a n d p h y s i o l o g i c a l l y
t o wa r r a n t t h e
c r e a t i o n o f a n e w s p e c i e s
n a m e .
F r o m t h e wo r k d o n e o n g r o u p i n g
F r a n k i a
s t r a i n s ,
i t i s
c l e a r t h a t t h e t r u e d i v e r s i t y o f t h e
g e n u s
i s
c o n s i d e r a b l y
g r e a t e r t h a n wa s i n i t i a l l y s u s p e c t e d . Th i s f a c t m a y r e qu i r e
t h a t t h e g e n u s u l t i m a t e l y b e s p l i t i n t o t wo o r m o r e
g e n e r a .
I n
a s e n s e , t h e d e f i n i t i o n o f wh a t c o n s t i t u t e s m e m b e r s o f t h e
g e n u s i s b i a s e d b y t h e r e l a t i v e e a s e wi t h wh i c h s o m e i s o l a t e s
c a n b e o b t a i n e d a n d t h e d i f f i c u l t i e s e n c o u n t e r e d i n
i s o l a t i n g
o t h e r s t r a i n s , s o o u r v i e w o f a t y p i c a l F r a n k i a s t r a i n t e n d s t o
c o r r e s p o n d t o c h a r a c t e r i s t i c s e x p e c t e d , f o r e x a m p l e ,
i n a n
i s o l a t e f r o m a n A l n u s o r E l a e a g n u s h o s t . C o n s i d e r i n g t h a t ,
o f t h e e i g h t p l a n t f a m i l i e s wh o s e m e m b e r s a r e i n f e c t e d b y
F r a n k i a s t r a i n s , i n f e c t i v e i s o l a t e s a r e r e a d i l y o b t a i n e d f r o m
m e m b e r s o f o n l y f o u r ( B e t u l a c e a e , C a s u a r i n a c e a e , E l a e -
a g n a c e a e , a n d M y r i c a c e a e ) a n d t h a t o n l y n o n i n f e c t i v e i s o -
l a t e s , a t y p i c a l i s o l a t e s ( u n a b l e t o r e i n f e c t t h e s o u r c e p l a n t
s p e c i e s ) , o r n o i s o l a t e s h a v e b e e n o b t a i n e d f r o m m e m b e r s o f
t h e o t h e r f a m i l i e s , t h e d i v e r s i t y o f F r a n k i a s t r a i n s i s n o
d o u b t g r e a t e r t h a n p r e d i c t e d o n t h e b a s i s o f t h e l i m i t e d
s a m p l i n g d o n e t h u s f a r . N e we r a p p r o a c h e s u s i n g r DN A
a m p l i f i e d d i r e c t l y f r o m t h e n o d u l e , c i r c u m v e n t i n g t h e n e e d
f o r c u l t i v a t i o n , s h o u l d p r o v i d e a c l e a r e r p i c t u r e o f t h e
d i v e r s i t y o f s t r a i n s t h a t r e m a i n u n c u l t u r e d ( 1 6 4 , 1 7 8 ) . H o w-
e v e r , t h e t e m p t a t i o n t o b e s a t i s f i e d wi t h o n l y g e n e t i c o r
p h y l o g e n e t i c m e a n s t o d e s c r i b e t h e s e s l o w- g r o wi n g a c t i n o -
m y c e t e s s h o u l d b e a v o i d e d ; p h y s i o l o g i c a l wo r k m a y p r o c e e d
s l o wl y , b u t i t wi l l s u r e l y t e l l u s m o r e a b o u t t h e b i o l o g y o f t h e
s y m b i o s i s i n t h e l o n g r u n .
P h y l o g e n e t i c P o s i t i o n o f F r a n k i a
O n t h e b a s i s o f s p o r a n g i u m m o r p h o g e n e s i s , L e c h e v a l i e r
a n d L e c h e v a l i e r ( 1 3 9 ) s u g g e s t e d t h a t F r a n k i a s t r a i n s we r e

o
n

A
p
r
i
l

2
9
,

2
0
1
4

b
y

I
O
W
A

S
T
A
T
E

U
N
I
V
E
R
S
I
T
Y
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

l i k e l y t o b e r e l a t e d t o m e m b e r s o f t h e De r m a t o p h i l a c e a e
wi t h i n t h e A c t i n o m y c e t a l e s . Th i s p r o p o s a l h a s p r o v e n t o b e
s u b s t a n t i a l l y c o r r e c t i n s u b s e qu e n t s t u d i e s o n 1 6 S r R N A a n d
r DN A s e qu e n c i n g a n d c a t a l o g i n g ( 8 9 , 9 9 , 1 7 8 ) . S u c h t e c h -
n i qu e s p l a c e F r a n / i a a n d G e o d e r m a t o p h i l u s i n a s e p a r a t e
l i n e o f d e s c e n t wi t h i n t h e a c t i n o m y c e t e l i n e a g e , a m o n g t h e
h i g h m o l % G + C b a c t e r i a ( 8 9 ) ( F i g . 3 ) . Th e r e s u l t s o f a n e a r l y
c o m p l e t e r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e s e qu e n c i n g o f t h e 1 6 S r R N A
f r o m F r a n k i a s t r a i n A g 4 5 / M u t l 5 a g r e e wi t h t h e o l i g o n u c l e -
o t i d e c a t a l o g i n g m e t h o d ( 9 9 ) . A c o m p l e t e s e qu e n c e o f t h e
1 6 S , 2 3 S , a n d 5 S r R N A o p e r o n i n F r a n k i a s t r a i n O R S 0 2 0 6 0 6
f r o m C a s u a r i n a s p e c i e s h a s r e c e n t l y b e e n p u b l i s h e d ; t h e 1 6 S
s e qu e n c e wa s s h o wn t o b e 9 5 % s i m i l a r t o t h e A g 4 5 / M u t 1 5
s e qu e n c e a n d 9 0 % s i m i l a r t o t h e S t r e p t o m y c e s a m b o f a c i e n s
s e qu e n c e ( 1 8 5 ) .
I n a n a t t e m p t t o e s t a b l i s h p h y l o g e n e t i c r e l a t i o n s h i p s b e -
t we e n t h e F r a n k i a g e n o m i c s p e c i e s , N a z a r e t e t a l . ( 1 7 8 )
c o m p a r e d s e qu e n c e s o f a 2 6 8 - b p f r a g m e n t o f 1 6 S r DN A
a m p l i f i e d f r o m 3 5 s t r a i n s , i n c l u d i n g o n e u n i s o l a b l e s t r a i n i n
a n a l d e r n o d u l e . W i t h o n e e x c e p t i o n , s t r a i n s wi t h i n a
g e n o m i c s p e c i e s a s d e f i n e d b y F e r n a n d e z e t a l . ( 8 7 ) h a d a
u n i qu e s e qu e n c e . Th e e x c e p t i o n wa s b e t we e n r e p r e s e n t a -
t i v e s o f
g e n o m i c s p e c i e s 4 a n d 5 , wh i c h h a d i d e n t i c a l r DN A
s e qu e n c e s b u t o n l y 3 8 t o 4 9 % DN A - DN A h o m o l o g y ( 8 7 ) . I n
s t u d i e s o f o t h e r
o r g a n i s m s , 1 6 S r R N A s e qu e n c e s h a v e
s o m e t i m e s
p r e d i c t e d t h a t t wo o r g a n i s m s s h o u l d b e l o n g t o
t h e s a m e
s p e c i e s b u t DN A - DN A h y b r i d i z a t i o n r e s u l t s a n d
p h e n o t y p i c t r a i t s p l a c e d t h e m i n s e p a r a t e s p e c i e s ( 9 0 ) . Th i s
c o n f l i c t
a p p a r e n t l y a r i s e s wh e n s i g n i f i c a n t DN A - DN A h o -
m o l o g y e x i s t s b u t a t a l e v e l s o m e wh a t b e l o w t h e 7 0 %
b e n c h m a r k v a l u e
a c c e p t e d a s d e f i n i n g a s p e c i e s b o u n d a r y ,
a s i n t h e c a s e o f
g e n o m i c s p e c i e s 4 a n d 5 ( 9 0 ) . Th u s , i d e n t i c a l
o r
v e r y
s i m i l a r s h o r t s t r e t c h e s o f r DN A d o n o t a l wa y s r e f l e c t
DN A - DN A
h y b r i d i z a t i o n r e s u l t s ( 9 0 ) . A n a l y s i s o f t h e
F r a n k i a s e qu e n c e s s u g g e s t e d t h a t a l l o f t h e s t r a i n s i s o l a t e d
f r o m
E l a e a g n u s s p e c i e s a n d s o m e o f t h e a t y p i c a l s t r a i n s
i s o l a t e d f r o m C a s u a r i n a s p e c i e s f o r m e d a s e p a r a t e , r e l a -
t i v e l y
we l l - d e f i n e d
g r o u p , wh e r e a s o t h e r a t y p i c a l s t r a i n s
i s o l a t e d f r o m C a s u a r i n a s p e c i e s g r o u p e d wi t h s t r a i n s , f r o m
C a s u a r i n a
s p e c i e s ,
t h a t c o n s t i t u t e g e n o m i c s p e c i e s 9 . Th e s e
l a t t e r
s t r a i n s ,
i n
t u r n , g r o u p e d c l o s e r t o F . a l n i ( g e n o m i c
s p e c i e s 1 )
t h a n t o t h e
s t r a i n s , i s o l a t e d f r o m A l n u s h o s t s , i n
g e n o m i c s p e c i e s
2 a n d 3 .
Th u s ,
t h e
i m p r e s s i o n g a i n e d f r o m
t h e s e s t u d i e s i s t h a t s t r a i n s i s o l a t e d f r o m A l n u s
s p e c i e s
a r e
m o r e
d e e p l y
d i v i d e d t h a n t h o s e f r o m
E l a e a g n u s s p e c i e s .
A g a i n , h o we v e r ,
t h i s r e s u l t m u s t b e
i n t e r p r e t e d
i n
l i g h t o f t h e
s h o r t
s e qu e n c e
u s e d a n d t h e l i m i t e d n u m b e r o f s t r a i n s
t e s t e d . I n
a d d i t i o n ,
t h e s e t o f s t r a i n s f r o m a l d e r wa s s e l e c t e d
f r o m a m u c h
l a r g e r p o o l
o f s t r a i n s t h a n t h e s t r a i n s f r o m
C a s u a r i n a o r
E l a e a g n u s s p e c i e s ;
t h i s
m a y
h a v e l e d t o t h e
s e l e c t i o n o f a wi d e r
d i v e r s i t y
o f s t r a i n s f r o m a l d e r . F u r t h e r
s t u d i e s wi l l b e
n e c e s s a r y
a s m o r e s t r a i n s b e c o m e a v a i l a b l e .
O t h e r s e m a n t i d e s u s e d t o
p l a c e F r a n k i a i n
p h y l o g e n e t i c
s c h e m e s i n c l u d e t h e
F e - p r o t e i n ( n i H )
a n d t h e a s u b u n i t o f
t h e M o F e
p r o t e i n ( n i f D)
o f t h e
n i t r o g e n a s e c o m p l e x ,
a n d
g l u t a m i n e s y n t h e t a s e s
I
( g l n A )
a n d I I
( g l n I I ) ( 1 2 2 , 1 8 4 , 1 8 7 ,
1 9 0 , 2 7 1 ) .
S t u d i e s o n t h e
n i f H g e n e s
a n d t h e i r a m i n o a c i d
s e qu e n c e s p l a c e d F r a n k i a c l o s e r t o A n a b a e n a a n d t h e
g r a m - n e g a t i v e p r o t e o b a c t e r i a
t h a n t o t h e l o w- G + C
g r a m -
p o s i t i v e o r g a n i s m s
s u c h a s C l o s t r i d i u m
( 1 8 4 ) .
S i n c e t h i s
p l a c e m e n t
wa s a t o d d s wi t h 1 6 S r R N A
s t u d i e s ,
t h e r e s u l t s
we r e
a s
p o s s i b l y r e f l e c t i n g
a r e c e n t l a t e r a l
g e n e
t r a n s f e r f r o m a n a n c e s t r a l
g r a m - n e g a t i v e o r g a n i s m
t o b o t h
A n a b a e n a a n d t h e
p r o g e n i t o r
o f F r a n k i a . S u b s e qu e n t
a n a l -
y s i s
o f t h e F . a l n i A r I 3 n i f D
g e n e g a v e
a s i m i l a r
r e l a t i o n s h i p
wi t h i n s t a t i s t i c a l f l u c t u a t i o n a n d wa s
a s ". . . e v -
i d e n c e o f t h e s u r v i v a l o f d i f f e r e n t g e n e d u p l i c a t e s i n t wo
l i n e a g e s o f G r a m p o s i t i v e b a c t e r i a : F r a n / a a n d C l o s t r i d i -
u m " ( 1 8 7 ) , t h u s o n l y g i v i n g t h e i m p r e s s i o n o f a p h y l o g e n e t i c
s p l i t i n t h e g r a m - p o s i t i v e b a c t e r i a . R e c e n t s t u d i e s o n g l u -
t a m i n e s y n t h e t a s e g e n e s
( g l n A
a n d g l n I I ) f r o m H F P C p I l
h a v e r e v e a l e d t h a t t h e F r a n k i a g l n A s e qu e n c e i s c l o s e s t t o
S t r e p t o m y c e s , t h e n t o A n a b a e n a , a n d t h e n t o g r a m - n e g a t i v e
o r g a n i s m s b u t a g a i n r e l a t i v e l y f a r r e m o v e d f r o m t h e l o w-
G + C c l o s t r i d i a a n d b a c i l l i ( 1 2 2 ) . Th u s , a p o s s i b i l i t y t o
c o n s i d e r i s t h a t a c t i n o m y c e t e s m a y h a v e m o r e o f a n a f f i n i t y
wi t h c y a n o b a c t e r i a t h a n i s r e v e a l e d b y t h e d e e p b r a n c h e s
wi t h i n t h e e u b a c t e r i a l p h y l o g e n e t i c t r e e s c r e a t e d b y 1 6 S
r R N A c a t a l o g i n g m e t h o d s ( 8 9 ) .
S TR U C TU R E A N D U L TR A S TR U C TU R E
G e n e r a l S t r u c t u r e
W h e n g r o wn o n m o s t m e d i a , f r a n k i a e a r e c h a r a c t e r i z e d b y
t h r e e s t r u c t u r a l f o r m s , h y p h a e , s p o r a n g i a , a n d v e s i c l e s ( F i g .
1 a n d 2 ) . Th e h y p h a e a r e s e p t a t e a n d o f t e n t i g h t l y i n t e r wo -
v e n i n c u l t u r e ; i n a l l s t r a i n s s t u d i e d , t h e y p r o d u c e e i t h e r
t e r m i n a l o r i n t e r c a l a r y m u l t i l o c u l a r s p o r a n g i a . V e s i c l e s a r e
n o r m a l l y p r o d u c e d i n c u l t u r e o n n i t r o g e n - f r e e o r n i t r o g e n -
p o o r m e d i a ( 2 5 9 , 2 9 2 ) a n d a r e t h e s i t e s o f n i t r o g e n a s e . I n
s y m b i o s i s , t h e h o s t p l a n t o b v i o u s l y p l a y s a s i g n i f i c a n t r o l e i n
m o d i f y i n g F r a n / i a m o r p h o l o g y s i n c e t h e r e i s a l a r g e v a r i a -
t i o n i n t h e p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f s p o r a n g i a a n d i n t h e s i z e ,
s h a p e , o r p r e s e n c e o f v e s i c l e s .
Th e s t r u c t u r e o f F r a n / i a c e l l s b o t h i n v i t r o a n d i n s y m b i -
o s i s wa s e x t e n s i v e l y r e v i e we d b y N e wc o m b a n d W o o d i n
1 9 8 7 ( 1 8 1 ) ; s i n c e t h e n , t h e r e h a v e b e e n s o m e s i g n i f i c a n t
d e v e l o p m e n t s , p a r t i c u l a r l y i n o u r u n d e r s t a n d i n g o f v e s i c l e
s t r u c t u r e . F r a n k i a c e l l s h a v e b e e n d i f f i c u l t t o s t u d y wi t h t h e
e l e c t r o n m i c r o s c o p e b e c a u s e o f t h e d e l i c a t e n a t u r e o f s o m e
c o m p o n e n t s o f t h e c e l l s , i n p a r t i c u l a r t h e e x t r a c e l l u l a r e n v e -
l o p e o f v e s i c l e s . S o m e o f t h e d i f f i c u l t i e s h a v e b e e n r e s o l v e d
b y f r e e z e s u b s t i t u t i o n a n d f r e e z e f r a c t u r e t e c h n i qu e s , b u t
t h e r e s t i l l r e m a i n s o m e e l u s i v e p r o b l e m s i n a n a l y z i n g s t r u c -
t u r e f r o m c h e m i c a l l y f i x e d s p e c i m e n s ( 1 8 1 ) .
F r e e - l i v i n g F r a n k i a c e l l s
H y p h a e . F r e e - l i v i n g c e l l s u n d e r t h e l i g h t m i c r o s c o p e s h o w
b r a n c h e d s e p t a t e h y p h a e r a n g i n g i n wi d t h f r o m 0 . 5 t o 1 . 5 , u m
wi t h a l a r g e n u m b e r o f b r i g h t a r e a s wh e n s e e n u n d e r
p h a s e - c o n t r a s t a n d d a r k - f i e l d o p t i c s . C e l l wa l l s i n c h e m i c a l l y
f i x e d ( C F ) m a t e r i a l a p p e a r t o b e c o m p o s e d o f t wo l a y e r s o f
e l e c t r o n - d e n s e m a t e r i a l , a b a s e l a y e r a n d a n o u t e r l a y e r ( 1 6 ,
1 1 0 , 1 2 6 , 1 3 4 ) . C r o s s - wa l l s o r i g i n a t e f r o m t h e b a s e l a y e r .
M e m b r a n o u s l a y e r s a r e s o m e t i m e s v i s u a l i z e d o u t s i d e t h e
o u t e r wa l l l a y e r ( 1 1 0 , 1 8 0 , 1 8 1 ) , a n d t h e c e l l wa l l m a y a l s o
c o n t a i n s p h e r i c a l o r o v o i d i n c l u s i o n s i n b o t h C F a n d f r e e z e -
s u b s t i t u t e d ( F S ) m a t e r i a l ( 1 3 4 ) .
I n t e r n a l l y , h y p h a l c e l l s c o n t a i n n u m e r o u s r o s e t t e - s h a p e d
g r a n u l e s , wh i c h a r e p r e s u m e d t o b e g l y c o g e n ( 3 6 , 1 3 4 ) a n d
l i p i d d r o p l e t s . S m a l l , r o u n d , c l e a r a r e a s a r e s e e n i n F S c e l l s ,
a n d t h e r e i s n o i n d i c a t i o n o f a c o n d e n s e d n u c l e o i d r e g i o n ,
wh i c h i s o b s e r v e d i n C F c e l l s ( 1 3 4 ) . Th e c l e a r a r e a s s e e n i n
F S c e l l s m a y h a v e c o n t a i n e d l i p i d , s i n c e t h i s i s n o t r e t a i n e d
i n F S c e l l s ( 1 3 4 ) . I n d i v i d u a l r i b o s o m e s a n d p o l y r i b o s o m e s
a r e s e e n i n F S h y p h a l c e l l s a s r e l a t i v e l y l a r g e ( 3 0 0 - n m )
g r a n u l a r b o d i e s ( 1 3 4 ) . A r o u n d t h e p e r i p h e r y o f t h e F S h y p h a l
c e l l c y t o p l a s m a r e l a r g e n u m b e r s o f c y t o p l a s m i c t u b u l e s ,
c i r c u l a r i n c r o s s s e c t i o n a n d a v e r a g i n g 4 5 n m i n d i a m e t e r .
Th e s e s t r u c t u r e s u n d e r l i e t h e c e l l m e m b r a n e b o t h a t t h e c e l l
s e p t u m a n d a t t h e o u t s i d e wa l l ( 1 3 4 ) .
V O L . 5 7 , 1 9 9 3

o
n

A
p
r
i
l

2
9
,

2
0
1
4

b
y

I
O
W
A

S
T
A
T
E

U
N
I
V
E
R
S
I
T
Y
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

A n e x t r a c e l l u l a r m u l t i l a y e r e d e n v e l o p e wa s f i r s t i d e n t i f i e d
i n h y p h a e o f f r e e - l i v i n g F . a l n i H F P C p I l ( 1 8 0 ) . Th i s e n v e -
l o p e h a s b e e n m u c h s t u d i e d o n v e s i c l e s ( s e e b e l o w) , b u t i t s
p r e s e n c e o n h y p h a e i s s t i l l t h e s u b j e c t o f d e b a t e . Th e
e n v e l o p e i s r e m o v e d b y n o r m a l c h e m i c a l f i x a t i o n ( 1 8 1 ) a n d
b y f r e e z e s u b s t i t u t i o n t e c h n i qu e s ( 1 3 4 ) , b u t t h e f a c t t h a t
m u l t i l a y e r e d e n v e l o p e s h a v e b e e n s e e n o n h y p h a e o f s y m -
b i o t i c F r a n k i a c e l l s ( 1 , 4 1 , 1 3 1 ) i n d i c a t e s t h a t l i p i d e n v e l o p e d
h y p h a e m a y b e c o m m o n a m o n g t h e f r a n k i a e .
S p o r a n g i a . B e f o r e e m b a r k i n g o n a d e s c r i p t i o n o f t h e
s t r u c t u r e o f s p o r e s a n d s p o r a n g i a , i t i s n e c e s s a r y t o d e s c r i b e
s p o r u l a t i o n b o t h i n c u l t u r e a n d i n s y m b i o s i s . S p o r a n g i a we r e
f i r s t i d e n t i f i e d u n e qu i v o c a l l y i n t h e n o d u l e s o f A l n u s g l u t i -
n o s a , b e f o r e F r a n k i a s t r a i n s b e c a m e a v a i l a b l e a n d d e s p i t e . a
we a l t h o f p r i o r o b s e r v a t i o n s a n d m i s i d e n t i f i c a t i o n s ( 2 8 0 ) .
C o n f u s i o n o v e r t h e n a t u r e o f t h e s p o r e - l i k e s t r u c t u r e s i n r o o t
n o d u l e s wa s p u t t o r e s t wi t h t h e i s o l a t i o n o f F r a n k i a s t r a i n
H F P C p I 1 , wh i c h p r o d u c e d m u l t i l o c u l a r s p o r a n g i a t h a t a p -
p e a r e d u n i qu e t o t h e F r a n k i a g r o u p .
S p o r a n g i a a r e p r o d u c e d r e a d i l y i n c u l t u r e b y a l l F r a n k i a
s t r a i n s i s o l a t e d , a n d s p o r e s a s i n f e c t i v e p r o p a g u l e s a r e 1 , 0 0 0
t i m e s m o r e e f f e c t i v e a t n o d u l e p r o d u c t i o n t h a n a r e e qu a l
v o l u m e s o f h y p h a e ( 6 1 ) . Th e e n i g m a o f s p o r u l a t i o n i s n o t d u e
t o t h e b e h a v i o r o f F r a n k i a i n c u l t u r e , wh i c h i s c o n s i s t e n t ,
b u t i s d u e t o t h e f a c t t h a t i n s y m b i o s i s n o d u l e s m a y b e s p +
( c o n t a i n s p o r e s ) o r s p - ( l a c k s p o r e s ) a p p a r e n t l y i n d e p e n d e n t
o f t h e i r p e r f o r m a n c e i n c u l t u r e . R e c e n t r e v i e ws o f t h i s
s u b j e c t c o v e r t h e h i s t o r y o f o u r u n d e r s t a n d i n g o f t h e p h e -
n o m e n o n , a n d o n l y a s h o r t s u m m a r y wi l l b e g i v e n h e r e ( 2 2 2 ,
2 6 5 ) .
S p o r u l a t i o n i n n o d u l e s i s we l l d o c u m e n t e d o n l y f o r M y n c a
a n d A l n u s s p e c i e s a n d , e v e n i n t h e s e , i s s p o r a d i c a n d
s o m e wh a t s i t e s p e c i f i c ( 2 2 2 , 2 6 5 ) . S p o r u l a t i o n i n n o d u l e s o f
o t h e r g e n e r a i s n o t we l l s t u d i e d . E v i d e n c e f o r a g e n e t i c , a s
c o n t r a s t e d wi t h a n e n v i r o n m e n t a l , b a s i s f o r s p o r u l a t i o n i n
n o d u l e s i s p r o v i d e d b y t h e o b s e r v a t i o n t h a t n o d u l e s u s p e n -
s i o n s f r o m s p + a n d s p - n o d u l e s , wh e n u s e d a s i n o c u l a ,
p r o d u c e s p + a n d s p - n o d u l e s , r e s p e c t i v e l y , i n c u l t u r e d
p l a n t s ( 1 1 5 , 1 6 6 , 2 7 4 - 2 7 6 ) . Th e s e r e s u l t s s u p p o r t t h e c o n -
c e p t , d e v e l o p e d b y V a n Di j k ( 2 7 7 , 2 7 8 ) , t h a t t h e r e a r e t wo
g e n e t i c a l l y d i s t i n c t b a c t e r i a l t y p e s b a s e d o n t h e i r e x p r e s s i o n
o f s p o r u l a t i o n i n r o o t n o d u l e s , wh i c h i s i n d e p e n d e n t o f t h e i r
s p o r u l a t i o n a b i l i t y i n c u l t u r e .
W h e t h e r g e n e t i c a l l y d i s t i n c t s p + s t r a i n s a c t u a l l y e x i s t i s
s t i l l m a t t e r f o r d e b a t e , s i n c e i t i s wi d e l y b e l i e v e d t h a t n o s p +
s t r a i n s a r e c u r r e n t l y i n c u l t u r e . S t r a i n s t h a t h a v e b e e n
c u l t u r e d f r o m s p + n o d u l e s a r e v e r y d i f f i c u l t t o g r o w ( 1 8 8 )
a n d a r e o f t e n i n e f f e c t i v e o n t h e h o s t f r o m wh i c h t h e y h a d
b e e n i s o l a t e d ( 1 6 , 1 0 0 ) . I n o n e c a s e ( 1 6 ) a c u l t u r e ( E u I l b )
wa s o b t a i n e d f r o m a n E l a e a g n u s s p + h o s t a n d p r o d u c e d
c o p i o u s s p o r a n g i a i n c u l t u r e a n d i n s y m b i o s i s wi t h E l a e -
a g n u s s p e c i e s b u t f a i l e d t o p r o d u c e v e s i c l e s i n t h e n o d u l e s
a n d wa s t h u s i n e f f e c t i v e f o r N 2 f i x a t i o n .
Th e e n i g m a o f s p o r u l a t i o n i n n o d u l e s i s u n r e s o l v e d . O n
t h e o n e h a n d t h e r e i s s t r o n g e v i d e n c e t o s u p p o r t t h e t h e o r y
t h a t t wo d i s t i n c t r a c e s o f F r a n k i a e x i s t wh i c h c o n t r o l t h e i r
s p o r u l a t i o n i n s y m b i o s i s b u t n o t i n c u l t u r e ( 1 1 5 , 1 8 8 , 2 7 9 ) .
O n t h e o t h e r h a n d , t h e h o s t a n d t h e e n v i r o n m e n t i n wh i c h
t h e h o s t l i v e s h a v e a s t r o n g e f f e c t o n s p o r u l a t i o n , b o t h o n t h e
p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f s p o r a n g i a a n d o n t h e s e a s o n a l
p e r i o d i c i t y o f s p o r e p r o d u c t i o n ( 2 7 4 - 2 7 6 ) . A r e c e n t a t t e m p t
t o r e s o l v e t h i s d i l e m m a l e d t o t h e p o s t u l a t e t h a t i f s t a b l e
s t r a i n s c o u l d b e c u l t u r e d f r o m s p + n o d u l e s a n d r e i n f e c t e d t o
p r o d u c e e f f e c t i v e n o d u l e s , a d d e d we i g h t wo u l d b e g i v e n t o
t h e e x i s t e n c e o f s p + s t r a i n s ( 2 0 4 ) . S t r a i n s r e c e n t l y i s o l a t e d
f r o m C a s u a r i n a a n d M y r i c a s p + n o d u l e s d o s h o w t h i s
p o t e n t i a l , a l t h o u g h t h e s p o r a n g i a a r e s p a r s e a n d n o r m a l l y
s e e n o n l y u n d e r t h e e l e c t r o n m i c r o s c o p e ( 2 0 4 ) . I t a p p e a r s
l i k e l y t h a t a s f u r t h e r s t r a i n s a r e i s o l a t e d f r o m s p + n o d u l e s , o r
p e r h a p s a s p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( P C R ) a m p l i f i c a t i o n o f
r R N A g e n e s f r o m wh o l e n o d u l e s b e c o m e s m o r e wi d e l y
u s e d , t h e d i f f e r e n c e s b e t we e n s p o r u l a t i o n a b i l i t y m a y b e
r e s o l v e d i n t o a g e n e t i c d i v e r g e n c e . I t i s a l s o t o o e a r l y t o r u l e
o u t t h e p o s s i b i l i t y t h a t g e n e t i c a l l y s p + s t r a i n s e x i s t a n d t h a t
o t h e r s t r a i n s r e s p o n d t o e n v i r o n m e n t a l s i g n a l s t o e x p r e s s t h e
s p +
p h e n o t y p e i n s y m b i o s i s .
I n a d d i t i o n t o t h e p o t e n t i a l o f d i f f e r e n t s t r a i n s t o s p o r u l a t e
i n n o d u l e s , t h e r e i s a g r o wi n g b o d y o f e v i d e n c e t o s u g g e s t
t h a t s p + a n d s p - n o d u l e s h a v e d i s t i n c t p h y s i o l o g i c a l d i f f e r -
e n c e s . W o r k o n A l n u s ( 1 5 5 , 1 8 8 , 2 3 8 , 2 8 7 ) , C o m p t o n i a ( 2 7 5 ) ,
a n d M y r i c a ( 1 6 6 ) s p e c i e s i n d i c a t e s t h a t p l a n t s i n o c u l a t e d
wi t h s p - c u l t u r e s p r o d u c e s i g n i f i c a n t l y m o r e b i o m a s s t h a n
t h o s e i n o c u l a t e d wi t h s p + n o d u l e s u s p e n s i o n s d o . F u r t h e r ,
t h e wo r k o n M y n i c a s p e c i e s s h o ws t h a t a s we l l a s p r o d u c i n g
m o r e b i o m a s s o n h o s t p l a n t s , s p - n o d u l e s h a v e h i g h e r
s p e c i f i c a c t i v i t y a n d l o we r e n e r g y c o s t o f n i t r o g e n a s e ( 1 6 6 ) .
Th e r e a r e m a n y r e p o r t s wh i c h s h o w t h a t s p + n o d u l e
s u s p e n s i o n s a n d s p o r e s p r o d u c e d i n c u l t u r e a r e m u c h m o r e
i n f e c t i v e t h a n n o d u l e s o r c u l t u r e s wi t h o u t s p o r e s ( 6 1 , 2 7 7 ) .
Th e c o n d i t i o n s f o r s p o r e g e r m i n a t i o n h a v e b e e n i n v e s t i g a t e d
( 2 7 3 ) ; t h e y s h o w t h a t m a n y s t r a i n s h a v e l o w s p o r e g e r m i n a -
t i o n p o t e n t i a l a n d t h a t t h i s i s c o r r e l a t e d wi t h f a i l u r e t o
r e l e a s e s p o r e s f r o m s p o r a n g i a i n c u l t u r e . S t r a i n s wh i c h
r e l e a s e s p o r e s s h o w g o o d g e r m i n a t i o n i n c u l t u r e ( 2 7 3 ) a n d ,
c o i n c i d e n t a l l y p e r h a p s , a l s o s h o w l o w l e v e l s o f s p o r u l a t i o n
i n h o s t p l a n t s ( 2 0 4 ) . R e c e n t s t u d i e s h a v e s h e d s o m e l i g h t o n
t h e p r o b l e m o f s p o r e g e r m i n a t i o n i n c u l t u r e , wi t h t h e o b s e r -
v a t i o n t h a t c e r t a i n t y p e s o f a g a r i n h i b i t g e r m i n a t i o n ( 1 4 3 a ) .
Th e p r o b l e m o f s p o r e s , s p o r u l a t i o n , a n d i n f e c t i o n i s f a r
f r o m r e s o l v e d . Th e r o l e o f s p o r e s i n i n f e c t i o n i s , a s y e t ,
d e t e r m i n e d o n l y f r o m i n d i r e c t e x p e r i m e n t a t i o n , a n d t h e
p o s s i b l e s t i m u l u s o f s p o r e g e r m i n a t i o n b y h o s t p l a n t s i s a
m a t t e r v e r y m u c h o p e n t o d i r e c t s t u d y ( 2 7 3 ) .
S p o r a n g i a l s t r u c t u r e . S p o r a n g i a d e v e l o p a s t e r m i n a l o r
i n t e r c a l a r y s t r u c t u r e s ( 1 8 0 ) . S e g m e n t a t i o n wi t h i n t h e e n l a r g -
i n g s p o r a n g i a p r o d u c e s a m u l t i l o c u l a r s p o r a n g i u m c o n t a i n i n g
m a n y s p o r e s ( F i g . 2 ) . C F m a t e r i a l s h o ws t h e d e v e l o p i n g
s p o r e s wi t h e l e c t r o n - t r a n s l u c e n t n u c l e o i d r e g i o n s wi t h d i s -
p e r s e d f i b r i l s a n d n u m e r o u s l i p i d d r o p l e t s . L i k e t h e h y p h a e ,
C F e x t e r n a l wa l l s o f t e n s h o w t h e r e s i d u e o f a l a m i n a t e
e n v e l o p e ( 1 3 4 ) . A s wi t h h y p h a e , t h e n u c l e o i d r e g i o n i s n o t
e v i d e n t a f t e r F S p r e p a r a t i o n ( 1 3 4 ) , wi t h t h e c y t o p l a s m o f t h e
d e v e l o p i n g s p o r a n g i a d i s p e r s e d l i k e t h a t o f t h e h y p h a e ( 1 3 4 ) .
Th e m a t u r e s p o r e s s h o w e v e n l y d i s p e r s e d c y t o p l a s m , b u t
t h e t u b u l e s , wh i c h a r e s u c h a p r o m i n e n t f e a t u r e o f h y p h a e ,
a r e n o t p r e s e n t i n t h e d e v e l o p e d s p o r e s ( 1 3 4 ) .
I n t h e f e w s t r a i n s s t u d i e d , i n c l u d i n g s t r a i n A i r I 2 i s o l a t e d
f r o m A l n u s i n c a n a s u b s p . r u g o s a ( 1 1 0 ) , s t r a i n A r I 3 f r o m
A l n u s r u b r a ( 1 1 0 ) , s t r a i n H F P C c I 3 f r o m C a s u a r i n a s p e c i e s
( 1 3 4 ) , s t r a i n E u l l f r o m E l a e a g n u s s p e c i e s ( 1 6 ) , a n d s t r a i n
H F P C p I 1 f r o m C o m p t o n i a p e r e g r i n a ( 1 8 0 ) , s p o r a n g i a d e -
v e l o p b y h y p h a l t h i c k e n i n g a n d t h e n b y s e g m e n t a t i o n b y
s e p t a o r i g i n a t i n g f r o m t h e i n n e r l a y e r o f a d o u b l e - l a y e r e d
s p o r a n g i a l c e l l wa l l ( 1 1 0 ) ; t h i s t y p e o f s p o r o g e n e s i s h a s b e e n
t e r m e d e n t e r o t h a l l i c b y a n a l o g y wi t h s p o r e d e v e l o p m e n t i n
f u n g i ( 1 4 8 ) . Th e r e s u l t o f s u c h a p a t t e r n o f d e v e l o p m e n t i s
t h a t o l d e r , m o r e l o o s e l y p a c k e d s p o r e s a r e d i s t a l t o y o u n g e r ,
m o r e d e n s e l y p a c k e d , d e v e l o p i n g s p o r e s . Th e i n t e r s p o r a l
m a t r i x a p p e a r s t o o r i g i n a t e f r o m t h e i n n e r l a y e r o f t h e c e l l
wa l l . Th e y o u n g e r s p o r e s a r e s o m e wh a t i r r e g u l a r l y s h a p e d ,
a n d o l d e r s p o r e s a r e s p h e r i c a l t o o v o i d a n d m e a s u r e a b o u t 1
t o 5 , u m i n d i a m e t e r . Th e y a r e n o n m o t i l e , u n l i k e t h o s e f o u n d

o
n

A
p
r
i
l

2
9
,

2
0
1
4

b
y

I
O
W
A

S
T
A
T
E

U
N
I
V
E
R
S
I
T
Y
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

B I O L O G Y O F F R A N KL A S TR A I N S 3 0 1
i n t h e m u l t i l o c u l a r s p o r a n g i a f r o m t h e r e l a t e d g e n u s G e o d e r -
m a t o p h i l u s a n d t h e l e s s r e l a t e d De r m a t o p h i l u s , wh o s e m e m -
b e r s p r o d u c e s p o r e s t h a t m a y b e a r t u f t s o f f l a g e l l a e . Th e
n u m b e r o f s p o r e s p e r s p o r a n g i u m r a n g e s f r o m a f e w t o
s e v e r a l h u n d r e d d e p e n d i n g o n t h e a g e a n d n u t r i t i o n o f
p a r t i c u l a r s t r a i n s .
V e s i c l e s . Th e v e s i c l e s a r e , wi t h o u t d o u b t , t h e m o s t d e f i n -
i t i v e s t r u c t u r e c h a r a c t e r i z i n g t h e g e n u s ( F i g . 1 ) . A l t h o u g h
f u n c t i o n a l l y a n a l o g o u s i n m a n y wa y s t o h e t e r o c y s t s o f
c y a n o b a c t e r i a , t h e v e s i c l e i s a u n i qu e d e v e l o p m e n t a l s t r u c -
t u r e d e s i g n e d f o r p h y s i o l o g i c a l c o m p a r t m e n t a t i o n a n d h a s
n o t b e e n d e s c r i b e d f o r a n y o t h e r p r o k a r y o t i c g r o u p . V e s i c l e s
a r e n o r m a l l y i n i t i a t e d o n l y wh e n t h e n i t r o g e n s o u r c e i n t h e
m e d i u m i s wi t h d r a wn o r d u r i n g g r o wt h o n c e r t a i n n i t r o g e n
s o u r c e s , s u c h a s s o m e a m i n o a c i d s , t h a t c a n n o t b e d e g r a d e d
t o a m m o n i a ( s e e b e l o w) ; t h e y i n i t i a l l y d e v e l o p a s t e r m i n a l
s we l l i n g s o n h y p h a e o r o n s h o r t s i d e b r a n c h e s . Th e s e e a r l y
s t r u c t u r e s a r e s e p a r a t e d b y a s e p t u m n e a r t h e b a s e a n d a r e
t e r m e d p r o v e s i c l e s ( 8 8 ) . P r o v e s i c l e s a r e s p h e r i c a l , p h a s e -
d a r k c e l l s , 1 . 5 t o 2 . 0 p . m i n d i a m e t e r , wi t h d e n s e c y t o p l a s m ,
a n d t h e y m a y s h o w t h e i n i t i a t i o n o f i n t e r n a l c o m p a r t m e n t a -
t i o n ; n o n i t r o g e n a s e a c t i v i t y i s a s s o c i a t e d wi t h p r o v e s i c l e s
( 8 8 ) . A l t h o u g h v e s i c l e f o r m a t i o n i s c o n t r o l l e d l a r g e l y b y
n i t r o g e n s u p p l y , s o m e F r a n k i a s t r a i n s c o n t i n u e t o f o r m
v e s i c l e s e v e n i n t h e p r e s e n c e o f N H 4 + , a l t h o u g h s u c h s t r a i n s
a r e c e r t a i n l y t h e e x c e p t i o n s ( 9 3 , 1 5 8 ) .
P r o v e s i c l e s r a p i d l y d e v e l o p i n t o m a t u r e v e s i c l e s ( 2 t o 4
, u m i n d i a m e t e r ) , wh i c h a r e d i s t i n c t l y p h a s e b r i g h t ( 8 8 ) a n d
a l s o s h o w b i r e f r i n g e n c e u n d e r p o l a r i z e d - l i g h t m i c r o s c o p y
( 2 6 6 ) a n d a b r i g h t h a l o u n d e r d a r k - f i e l d m i c r o s c o p y ( 1 9 2 ) .
Th e d e v e l o p m e n t i n t o a m a t u r e v e s i c l e i s a c c o m p a n i e d b y a
n u m b e r o f c o m p l e x s t r u c t u r a l c h a n g e s wh i c h c o r r e l a t e v e r y
s t r o n g l y wi t h t h e a p p e a r a n c e o f n i t r o g e n a s e a c t i v i t y ( 8 8 ) .
M a t u r e v e s i c l e s a r e c h a r a c t e r i z e d b y t wo i m p o r t a n t s t r u c -
t u r a l e l e m e n t s , t h e v e s i c l e e n v e l o p e a n d i n t e r n a l s e p t a t i o n ,
b o t h o f wh i c h a p p e a r t o b e n e c e s s a r y p r e r e qu i s i t e s f o r
n i t r o g e n a s e a c t i v i t y i n c u l t u r e d F r a n k i a c e l l s b u t n e i t h e r o f
wh i c h a p p e a r s e s s e n t i a l i n s y m b i o s e s .
Th e v e s i c l e e n v e l o p e wa s f i r s t a n a l y z e d i n d e t a i l i n 1 9 8 2 b y
To r r e y a n d C a l l a h a m ( 2 6 6 ) , wh o o b s e r v e d t h a t e n v e l o p e d
v e s i c l e s s h o we d a m a r k e d b i r e f r i n g e n c e u n d e r p o l a r i z e d
l i g h t . Th e y i n t e r p r e t e d t h i s r e s u l t t o i m p l y t h e p r e s e n c e o f a
h i g h l y s t r u c t u r e d l a m i n a t e d l a y e r , wh i c h t h e y s h o we d b y
e l e g a n t f r e e z e - f r a c t u r e t e c h n i qu e s t o b e a l a m i n a t e o f l i p i d
m o n o l a y e r s . Th e s e l a y e r s a p p e a r t o b e t o t a l l y l o s t i n n o r m a l
f i x a t i o n p r o c e d u r e s , l e a v i n g a s p a c e a r o u n d t h e v e s i c l e ( a
"v o i d a r e a " [1 3 1 ] [s e e F i g . 6 ] ) wh e r e , p r e s u m a b l y , t h e l i p i d
l a y e r s h a v e b e e n s o l u b i l i z e d . E a c h l a y e r wa s e s t i m a t e d t o b e
a b o u t 4 n m t h i c k ( 2 6 6 ) . Th e l i p i d n a t u r e o f t h e e n v e l o p e h a s
b e e n c o n f i r m e d b y t h e u s e o f t h e f l u o r e s c e n t d y e N i l e r e d
( 1 3 3 ) . F u r t h e r s t r u c t u r a l s t u d i e s o f t h e e n v e l o p e h a v e b e e n
f a c i l i t a t e d b y t h e d e v e l o p m e n t o f t e c h n i qu e s t o i s o l a t e i n t a c t
v e s i c l e s ( 1 8 3 , 2 2 0 ) a n d v e s i c l e e n v e l o p e s ( 1 0 4 ) f r o m N 2 - f i x i n g
F r a n k i a c e l l s . Th e m u l t i l a y e r e d e n v e l o p e c a n b e s t r i p p e d o f f
b y s o n i c a t i o n a n d s t a i n e d wi t h p e r m a n g a n a t e t o v i s u a l i z e t h e
d i s t i n c t m u l t i l a m i n a t e s t r u c t u r e ( F i g . 4 ) . Th e e n v e l o p e
i s n o t
u n i f o r m l y d i s t r i b u t e d a r o u n d t h e v e s i c l e , wi t h m o r e l a m i n a -
t i o n s a p p e a r i n g i n t h e v e s i c l e s t e m r e g i o n t h a n i n t h e d i s t a l
r e g i o n s . I n a d d i t i o n , t h e n u m b e r o f l a y e r s i s c o r r e l a t e d wi t h
t h e P 0 2 o f t h e s u r r o u n d i n g m e d i u m ( 1 9 2 ; a l s o s e e
b e l o w) .
Th e r e l a t i v e l i p i d c o n t e n t o f v e s i c l e s a n d h y p h a e
wa s
a n a l y z e d b y c o m p a r i n g t h e l i p i d s o f i s o l a t e d v e s i c l e s wi t h
t h o s e o f h y p h a l c u l t u r e s ( 2 7 0 ) . Th i s a n a l y s i s
s h o we d t h a t
v e s i c l e s h a v e a h i g h e r p r o p o r t i o n o f n e u t r a l l i p i d s
a n d
g l y c o l i p i d s b u t l o we r l e v e l s o f p o l a r l i p i d s
t h a n
v e g e t a t i v e
c e l l s . A n a l y s i s o f t h e n e u t r a l - l i p i d f r a c t i o n r e v e a l e d t h e
p r e s e n c e o f a b u n d a n t u n i d e n t i f i e d c o m p o u n d s wh i c h we r e
s u g g e s t e d t o b e l o n g - c h a i n f a t t y a c i d s o r a l c o h o l s . I t n o w
b e c o m e s e v i d e n t t h a t F r a n k i a c e l l s c o n t a i n a v e r y h i g h
c o n c e n t r a t i o n o f t h e p e n t a c y c l i c h o p a n o i d l i p i d b a c t e r i o -
h o p a n e t e t r o l ( 4 8 ) . F u r t h e r wo r k o n i s o l a t e d v e s i c l e e n v e -
l o p e s f r o m F . a l n i H F P C p I 1 i n d i c a t e s t h a t t h e y c o n s i s t
m a i n l y o f b a c t e r i o h o p a n e t e t r o l a n d b a c t e r i o h o p a n e t e t r o l
p h e n y l a c e t a t e m o n o e s t e r i n a p p r o x i m a t e l y e qu a l a m o u n t s
( F i g . 5 ) ( 4 6 ) . B a c t e r i o h o p a n e s a r e c o m m o n i n m a n y b a c t e r i a l
g r o u p s ( 2 1 3 ) a n d h a v e b e e n p r o p o s e d t o p l a y a d i r e c t r o l e i n
m e m b r a n e s t a b i l i t y a n d f l u i d i t y ( 7 5 , 1 2 1 ) . Th e i r p r e s e n c e
i n
t h e v e s i c l e e n v e l o p e s h a s a n u m b e r o f i n t e r e s t i n g i m p l i c a -
t i o n s f o r 0 2 p r o t e c t i o n , d i s c u s s e d m o r e f u l l y b e l o w.
Th e o u t e r l a m i n a t e e n v e l o p e e x t e n d s d o wn t h e s t a l k o f t h e
v e s i c l e p a s t t h e b a s a l s e p t u m wh i c h s e p a r a t e s
t h e v e s i c l e
f r o m t h e h y p h a ( 1 3 4 ) . Th e t r u e wa l l i s s e p a r a t e d
f r o m t h e
e n v e l o p e b y a s m a l l g a p
i n F S m a t e r i a l a n d
b y
a
l a r g e s p a c e
a r t i f a c t i n C F m a t e r i a l ( 1 3 4 ) .
Th e i n t e r n a l s t r u c t u r e o f
v e s i c l e s i s c h a r a c t e r i z e d b y a n u m b e r o f i n t e r n a l s e p t a t i o n s ,
wh i c h s u b d i v i d e t h e m a t u r e c e l l . R i b o s o m e s a r e f r e qu e n t ,
a s
a r e t h e v e r y s t r i k i n g b u n d l e s o f m i c r o f i l a m e n t s e x c l u s i v e t o
v e s i c l e s , wh i c h a r e c l o s e l y a s s o c i a t e d wi t h t h e
s e p t a ( 1 3 4 ) .
V e s i c l e s a p p e a r t o h a v e a l i m i t e d l i f e
( 8 8 ) , a l t h o u g h
t h i s
h a s n o t b e e n c a r e f u l l y i n v e s t i g a t e d b y u s i n g
c o n t i n u o u s o r
s e m i c o n t i n u o u s c u l t u r e t e c h n i qu e s . Du r i n g s e n e s c e n c e ,
i n -
t e r n a l s e p t a b e g i n t o b e c o m e i r r e g u l a r , n i t r o g e n a s e a c t i v i t y
i s
l o s t , a n d t h e y b e c o m e g h o s t s wh i c h a r e
r e c o g n i z a b l e
i n
c u l t u r e a s d e f o r m e d , t h i n - wa l l e d , n o n f u n c t i o n i n g
c e l l s
( 6 0 ,
8 8 ) . A l t h o u g h t h e m a i n
p h y s i o l o g i c a l s i g n i f i c a n c e
o f v e s i c l e s
i s t h e i r n i t r o g e n a s e f u n c t i o n , a p r o p o r t i o n o f v e s i c l e s h a v e
a l s o b e e n o b s e r v e d t o "g e r m i n a t e "
a n d
p r o d u c e h y p h a e
i n
c u l t u r e ( 2 1 9 ) . B o t h i s o l a t e d v e s i c l e s a n d t h o s e s t i l l a t t a c h e d
t o p a r e n t a l h y p h a e c a n g r o w t h r o u g h t h e v e s i c l e
e n v e l o p e
o r
f r o m t h e v e s i c l e s t e m . Th e p o t e n t i a l
t o
r e g r o w m a y
h a v e
s o m e s i g n i f i c a n c e
a f t e r l i b e r a t i o n f r o m
v e s i c l e - c o n t a i n i n g
n o d u l e s i n t h e f i e l d .
S y m b i o t i c
F r a n k i a C e l l s
I n t r o d u c t i o n . Th e s t r u c t u r e o f a c t i n o r h i z a l n o d u l e s a n d
s y m b i o t i c F r a n k i a c e l l s h a s b e e n r e v i e we d i n d e t a i l
( 1 8 1 ) ,
a n d r e a d e r s a r e r e f e r r e d t o r e f e r e n c e 1 8 1 f o r a n
a n a l y s i s
o f
s y m b i o t i c
s t r u c t u r e . W h a t f o l l o ws i s a b r i e f
d e s c r i p t i o n
o f
t h e d i v e r s i t y
o f f o r m s t h a t F r a n k i a c e l l s a n d t h e h o s t
p l a n t
m a y a s s u m e i n
s y m b i o s i s .
N o d u l e m o r p h o l o g y
a n d
a n a t o m y .
Th e n o d u l e s
p r o d u c e d
b y F r a n k i a s t r a i n s o n a c t i n o r h i z a l
p l a n t s
d i f f e r
m a r k e d l y
f r o m t h o s e i n i t i a t e d b y R h i z o b i u m s t r a i n s o n
l e g u m e s .
Th e s e
d i f f e r e n c e s o c c u r b e c a u s e t h e b a c t e r i a l
s y m b i o n t s ,
a n d t h e
h o s t p l a n t s t h e m s e l v e s ,
a r e
e x t r e m e l y
d i v e r s e
( 2 3 3 ) .
Th e
i n f e c t e d z o n e o f
l e g u m e
n o d u l e s i s c e n t r a l a n d i s
n o r m a l l y
c o n t a i n e d wi t h i n a n e n d o d e r m i s a n d a n i n n e r c o r t i c a l
l a y e r
o f t i g h t l y p a c k e d c e l l s ,
wi t h t h e v a s c u l a r t i s s u e
l y i n g
o u t s i d e
t h e s e t i s s u e s . I n
c o n t r a s t ,
a c t i n o r h i z a l n o d u l e s
n o r m a l l y
h a v e a c e n t r a l s t e l e t h a t h a s i n f e c t e d t i s s u e
a d j a c e n t
t o i t o r
a r o u n d i t .
I n f e c t i o n p r o c e s s .
F r a n k i a c e l l s e n t e r
s y m b i o s i s b y
r o o t
h a i r i n f e c t i o n
( f o r A l n u s , C a s u a n i n a , C o m p t o n i a ,
a n d
M y r i c a
s p e c i e s [5 1 , 6 3 , 2 6 4 ] )
o r
b y
a
p r o c e s s
o f i n t e r c e l l u l a r
p e n e -
t r a t i o n o f r o o t
e p i d e r m i s
a n d c o r t e x
( f o r C e a n o t h u s ,
E l a e -
a g n u s ,
a n d
S h e p h e r d i a s p e c i e s [1 4 6 ,
1 6 1 ,
2 0 3 ] ) .
R o o t h a i r i n f e c t i o n i s c h a r a c t e r i z e d
b y
r o o t h a i r
b r a n c h i n g
a n d
c u r l i n g . O n l y
o n e r o o t h a i r i n f e c t i o n i s
r e qu i r e d
f o r
n o d u l a t i o n
( 4 7 ) ,
a n d wh e r e
m u l t i p l e
r o o t h a i r s a r e
i n f e c t e d ,
c o r t i c a l i n f e c t i o n i s r e l a t e d t o
o n l y
o n e r o o t h a i r i n f e c t i o n
( 6 3 ) .
C e l l s o f t h e
h y p o d e r m i s
a n d c o r t e x d i v i d e i n
r e s p o n s e
V O L . 5 7 , 1 9 9 3

o
n

A
p
r
i
l

2
9
,

2
0
1
4

b
y

I
O
W
A

S
T
A
T
E

U
N
I
V
E
R
S
I
T
Y
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

F I G . 4 . Tr a n s m i s s i o n e l e c t r o n p h o t o m i c r o g r a p h s o f t h e F r a n k i a e n v e l o p e v i s u a l i z e d b y p e r m a n g a n a t e f i x a t i o n ( p a n e l A ) a n d f r e e z e -
f r a c t u r e ( p a n e l B ) . ( A ) V i e w t h r o u g h t h e s t e m r e g i o n o f a v e s i c l e a f t e r p r e p a r a t i o n b y s o n i c a t i o n a n d p e r m a n g a n a t e f i x a t i o n . N o t e t h e
l a m i n a t e d l a y e r s c o r r e s p o n d i n g t o t h e l a m i n a e v i s u a l i z e d b y f r e e z e f r a c t u r e i n p a n e l B . ( B ) A p p e a r a n c e o f t h e l i p i d m o n o l a y e r s o n t h e s u r f a c e
o f a v e s i c l e i n d u c e d u n d e r 4 0 % 0 2 a n d p r e p a r e d b y f r e e z e f r a c t u r e . A r r o ws i n d i c a t e l i p i d l a m i n a e . B a r s , 0 . 1 p . m . P a n e l A r e p r o d u c e d f r o m
r e f e r e n c e 1 0 4 wi t h p e r m i s s i o n .

o
n

A
p
r
i
l

2
9
,

2
0
1
4

b
y

I
O
W
A

S
T
A
T
E

U
N
I
V
E
R
S
I
T
Y
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

0
R =
- -
H
- H
F I G . 5 . S t r u c t u r e o f b a c t e r i o h o p a n e t e t r o l a n d i t s p h e n y l a c e t a t e
m o n o e s t e r a s i d e n t i f i e d i n r e f e r e n c e 4 6 .
t o t h e i n v a s i o n t o f o r m a p r e n o d u l e ( 2 5 ) , a n d t h e F r a n k i a
h y p h a e p e n e t r a t e t h r o u g h t h e p r e n o d u l e t i s s u e i n t o t h e i n n e r
c o r t e x o f t h e r o o t . Th e n o d u l e i t s e l f d e v e l o p s i n t h e s a m e
m a n n e r a s a l a t e r a l r o o t , wi t h p r i m a r y n o d u l e l o b e p r i m o r d i a
a r i s i n g i n t h e p e r i c y c l e , e n d o d e r m i s , o r c o r t e x a t t h e s a m e
t i m e a s p r e n o d u l e d e v e l o p m e n t . Th e F r a n k i a h y p h a e p e n e -
t r a t e c e l l s o f t h e d e v e l o p i n g n o d u l e l o b e p r i m o r d i a t o f o r m
t h e i n f e c t e d n o d u l e .
U n l i k e m o s t s p e c i e s , E l a e a g n u s , S h e p h e r d i a , a n d C e a n -
o t h u s s p e c i e s a r e i n f e c t e d b y i n t e r c e l l u l a r p e n e t r a t i o n o f t h e
e p i d e r m i s . I n C e a n o t h u s s p e c i e s t h i s o c c u r s i n t h e p r e s e n c e
o f r o o t h a i r s wh i c h a r e n o t i n f e c t e d , wh e r e a s i n E l a e a g n u s
a n d S h e p h e r d i a s p e c i e s i n f e c t i o n o c c u r s i n t h e a b s e n c e o f
r o o t h a i r s . I n t h i s m o d e o f i n f e c t i o n , t h e F r a n k i a h y p h a e
h a v e a n e x t e n s i v e i n t e r c e l l u l a r e x i s t e n c e b u t a r e s t i l l e n c a p -
s u l a t e d i n a p e c t i c c a p s u l e ( 1 4 7 ) wh i c h e x t e n d s t h r o u g h t h e
i n t e r c e l l u l a r s p a c e s . F r a n k i a s t r a i n s t h a t i n f e c t b o t h E l a e -
a g n u s a n d M y r i c a s p e c i e s ( 1 6 2 ) o r b o t h S h e p h e r d i a a n d
G y m n o s t o m a s p e c i e s ( 2 0 3 ) h a v e b e e n s h o wn t o e n t e r e i t h e r
b y i n t e r c e l l u l a r p e n e t r a t i o n o r b y r o o t h a i r i n f e c t i o n d e p e n d -
i n g o n t h e h o s t . Th u s , t h e i n f e c t i o n r o u t e i s d e t e r m i n e d b y
t h e h o s t p l a n t , a n d t h e m i c r o o r g a n i s m , i f c o m p a t i b l e , f o l l o ws
t h e a p p r o p r i a t e r o u t e .
Th e i n f e c t i v e h y p h a e o f F r a n k i a s t r a i n s , a s t h e y e n t e r t h e
r o o t h a i r , b e c o m e e n c a p s u l a t e d wi t h a l a y e r o f p l a n t c e l l
wa l l - l i k e m a t e r i a l s u r r o u n d e d b y h o s t p l a s m a l e m m a . Th i s
e n c a p s u l a t i o n i s a p p a r e n t l y c o n t i n u o u s wi t h t h e h o s t c e l l
wa l l s a n d s u r r o u n d s a l l i n f e c t i v e s t a g e s b o t h d u r i n g i n v a s i o n
a n d i n t h e m a t u r e n o d u l e ( F i g . 6 ) ( 1 2 4 , 1 2 9 , 1 3 0 ) . Th e
e n c a p s u l a t i o n wa s o r i g i n a l l y s h o wn t o b e p e c t i n a c e o u s i n
A l n u s s p e c i e s ( 1 3 0 ) . M o r e r e c e n t l y , t h e F r a n k i a c a p s u l e h a s
b e e n s t u d i e d b y u s i n g i m m u n o g o l d l o c a l i z a t i o n a n d f l u o r e s -
c e i n - c o n j u g a t e d a l g i n a t e a n d p e c t a t e p r o b e s ( 4 0 , 1 4 7 ) , wh i c h
h a v e d e m o n s t r a t e d t h e p r e s e n c e o f c e l l u l o s e , h e m i c e l l u l o s e
( x y l a n s ) , a n d p e c t i n s ( F i g . 6 A ) . I t i s c o n c l u d e d , a t l e a s t f o r
A l n u s a n d C a s u a r i n a s p e c i e s , "t h a t t h e c a p s u l e i s e s s e n t i a l l y
a t h i n i n t e r n a l t u b u l a r p l a n t c e l l wa l l " ( 4 0 ) . I n C e a n o t h u s
s p e c i e s t h e c a p s u l e h a s a v e r y h i g h c o n c e n t r a t i o n o f p o l y -
g a l a c t u r o n a n s a n d a p p e a r s t o b e s o m e wh a t d i s t i n c t f r o m t h e
c e l l wa l l i n t h i s r e s p e c t ( 1 4 7 ) .
Th e i n v a s i v e p h a s e o f n o d u l e d e v e l o p m e n t i s c h a r a c t e r -
i z e d b y h y p h a e wh i c h p a s s t h r o u g h b o t h t h e m i d d l e l a m e l l a
- ~ ~ ~ ~ A
F I G . 6 . Tr a n s m i s s i o n e l e c t r o n p h o t o m i c r o g r a p h s i l l u s t r a t i n g t h e e x t r e m e s o f v e s i c l e d e v e l o p m e n t
i n
s y m b i o s i s . ( A )
Tr a n s m i s s i o n e l e c t r o n
m i c r o g r a p h o f C F A l n u s r u b r a n o d u l e s , s h o wi n g f u l l y d e v e l o p e d v e s i c l e s ( v ) s u r r o u n d e d b y
a v o i d a r e a f r o m wh i c h v e s i c l e
e n v e l o p e
m a t e r i a l
h a s b e e n e x t r a c t e d ( l a r g e a r r o ws ) , a n d a p l a n t c e l l wa l l - d e r i v e d c a p s u l e ( s m a l l a r r o ws ) t h a t h a s r e t a i n e d c o l l o i d a l
g o l d - l a b e l e d
c e l l u l a s e u s e d
t o l o c a l i z e c e l l u l o s e p o l y m e r s . ( B ) Tr a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f F S C a s u a r i n a
c u n n i n g h a m i a n a n o d u l e s , s h o wi n g
t h e
p r o l i f e r a t i o n o f
F r a n k i a h y p h a e wi t h o u t v e s i c l e f o m a t i o n . B a r s , 2 . 0 p L m .
P h o t o m i c r o g r a p h s c o u r t e s y
o f R . H .
B e r g .
V O L . 5 7 , 1 9 9 3

o
n

A
p
r
i
l

2
9
,

2
0
1
4

b
y

I
O
W
A

S
T
A
T
E

U
N
I
V
E
R
S
I
T
Y
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

o f c e l l wa l l s a n d t h e h o s t c y t o p l a s m . Th e h y p h a e d i f f e r e n t i -
a t e i n t o c o l o n i z i n g h y p h a e , wh i c h p e n e t r a t e c e l l wa l l s , a n d
p r o l i f e r a t i n g h y p h a e , wh i c h g r o w a n d b r a n c h i n t h e c e n t e r o f
h o s t c e l l s ( 1 8 1 ) .
Th e m a t u r e e f f e c t i v e f o r m o f F r a n k i a s t r a i n s i n i n f e c t e d
c e l l s i s o f t e n b u t n o t e x c l u s i v e l y a s s o c i a t e d wi t h s y m b i o t i c
v e s i c l e f o r m a t i o n . A t o n e e n d o f t h e s t r u c t u r a l s p e c t r u m , t h e
A l n u s a n d E l a e a g n u s n o d u l e s h a v e l a r g e , s p h e r i c a l , m u l i t -
s e p t a t e v e s i c l e s ( F i g . 6 A ) a n d m e m b e r s o f t h e R o s a c e a e
( C e r c o c a r p u s a n d Dr y a s s p e c i e s ) h a v e n o n s e p t a t e e l l i p t i c a l
v e s i c l e s . A t t h e o t h e r e n d o f t h e s p e c t r u m , C o r i a r i a , M y r i c a ,
a n d C o m p t o n i a s p e c i e s h a v e s i m p l e c l u b - s h a p e d h y p h a l
e n d i n g s a n d C a s u a r i n a s p e c i e s h a v e a n e n t i r e l y f i l a m e n t o u s
m a t u r e s t r u c t u r e ( F i g . 6 B ) ( 1 8 1 ) . S i n c e a l l e f f e c t i v e F r a n k i a
s t r a i n s d e s c r i b e d t o d a t e f o r m v e s i c l e s i n c u l t u r e , i t i s
a p p a r e n t t h a t t h e v e s i c l e m o r p h o l o g y i n s y m b i o s i s i s
s t r o n g l y c o n t r o l l e d b y t h e h o s t p l a n t . Th e f i r s t e v i d e n c e t h a t
t h e p l a n t c o n t r o l s t h e s y m b i o t i c f o r m wa s o b t a i n e d wh e n i t
wa s f o u n d t h a t F . a l n i H F P C p I 1 , wh i c h h a s c l u b - s h a p e d
s we l l i n g s i n C o m p t o n i a s p e c i e s , h a d s p h e r i c a l v e s i c l e s i n
A l n u s s p e c i e s a n d a l s o i n c u l t u r e ( 1 2 6 , 2 6 0 ) .
F r e e z e f r a c t u r e e l e c t r o n m i c r o s c o p y h a s r e s o l v e d t h a t t h e
v e s i c l e s i n s y m b i o s i s c o n t a i n t h e m u l t i l a y e r e d e n v e l o p e a s
t h e y d o i n v i t r o ( 1 , 1 3 1 , 1 7 9 ) . Th i s wo r k a l s o d e m o n s t r a t e d
t h a t t h e s o - c a l l e d v o i d s p a c e , o f t e n s h o wn a r o u n d s y m b i o t i c
v e s i c l e s , c o n t a i n s t h e l i p i d e n v e l o p e , wh i c h , u n d e r s t a n d a r d
p r o c e d u r e s , i s d i s s o l v e d o u t b y d e h y d r a t i n g a g e n t s . E v i -
d e n c e t h a t t h e l i p i d e n v e l o p e f u n c t i o n s a s a n o x y g e n b a r r i e r
i n t h e s y m b i o t i c s t a t e wa s o b t a i n e d b y d a r k - f i e l d o b s e r v a t i o n
o f A l n u s v e s i c l e s i n n o d u l e s o f p l a n t s g r o wn a t v a r i o u s P 0 2
v a l u e s ( 2 3 4 ) . H o we v e r , wh e n t h i s wo r k wa s r e p e a t e d a n d
v e s i c l e s we r e o b s e r v e d b y f r e e z e f r a c t u r e t e c h n i qu e s , t h e r e
wa s l i t t l e d i f f e r e n c e i n t h e n u m b e r o f l i p i d l a m e l l a e o t h e r
t h a n a t t h e t i p s o f t h e v e s i c l e s ( 1 ) . G i v e n t h e d i f f i c u l t y o f
c o u n t i n g l a y e r s p r o d u c e d b y f r e e z e f r a c t u r e e l e c t r o n m i c r o s -
c o p y a n d g i v e n t h e v a r i o u s a g e s o f v e s i c l e s wi t h i n a n o d u l e ,
f u r t h e r s t u d y o n t h e a d a p t a b i l i t y o f F r a n k i a c e l l s t o P 0 2 i n
s y m b i o s i s i s wa r r a n t e d .
E C O L O G I C A L A S P E C TS
E c o l o g y i n t h e S o i l
F r a n k i a s t r a i n s o c c u p y t wo d i s t i n c t e c o l o g i c a l n i c h e s , t h e
r o o t n o d u l e a n d s o i l . A l t h o u g h a c o n s i d e r a b l e a m o u n t o f
i n f o r m a t i o n i s a v a i l a b l e o n s t r a i n s i s o l a t e d f r o m n o d u l e s a n d
o n t h e p h y s i o l o g y o f s t r a i n s wi t h i n n o d u l e s , t h e n a t u r e a n d
e x t e n t o f t h e i r f r e e - l i v i n g e x i s t e n c e a r e s t i l l u n c l e a r .
Th e p r e s e n c e o f s o i l - b o r n e m i c r o o r g a n i s m s c a p a b l e o f
f o r m i n g r o o t n o d u l e s o n p l a n t s o t h e r t h a n l e g u m e s h a s b e e n
k n o wn s i n c e t h e l a s t c e n t u r y ( s e e r e f e r e n c e 1 9 8 f o r a h i s t o r y
o f F r a n k i a i s o l a t i o n ) . A n e a r l y d e f i n i t i o n o f F r a n k i a s p e c i e s
wa s s u b s e qu e n t l y m a d e o n t h e b a s i s o f c r o s s - i n o c u l a t i o n s
wi t h c r u s h e d n o d u l e s . To t a l f a i l u r e t o o b t a i n F r a n k i a i s o l a t e s
f r o m n o d u l e s l e d B e c k i n g ( 2 4 ) t o t h e c o n c l u s i o n t h a t F r a n k i a
s t r a i n s we r e o b l i g a t e s y m b i o n t s a n d t o e s t a b l i s h F r a n k i a
s p e c i e s o n t h e b a s i s o f h o s t r a n g e . Th e i s o l a t i o n o f v i a b l e
F r a n k i a s t r a i n s f r o m n o d u l e s ( 6 2 ) a n d f r o m s o i l ( 1 7 ) a n d t h e i r
s u c c e s s f u l c u l t u r e i n s i m p l e m e d i a l e a d t o t h e c o n c l u s i o n t h a t
t h e y h a v e a f r e e - l i v i n g s a p r o p h y t i c e x i s t e n c e i n s o i l . A s y e t ,
t h e r e i s n o d i r e c t e v i d e n c e f o r t h i s v i e w s i n c e i s o l a t i o n
t e c h n i qu e s d o n o t d i f f e r e n t i a t e b e t we e n s p o r e s a n d h y p h a e ;
t h e e v i d e n c e f o r t h e g r o wt h , p e r s i s t e n c e , p r o l i f e r a t i o n , a n d
s u r v i v a l o f F r a n k i a s t r a i n s i n s o i l c o m e s f r o m a r a n g e o f
i n d i r e c t o b s e r v a t i o n s a n d e x p e r i m e n t s .
M a n y o b s e r v a t i o n s s h o w F r a n k i a s t r a i n s t o b e p r e s e n t i n
s o i l s we l l o u t s i d e t h e n o r m a l g e o g r a p h i c r a n g e o f a p p r o p r i a t e
h o s t p l a n t s ( 2 8 ) o r l o n g a f t e r h o s t p l a n t s h a v e d i s a p p e a r e d
f r o m a s i t e ( 2 1 0 , 2 4 5 , 2 7 9 , 2 9 0 ) . A n e x a m p l e o f t h i s o b s e r -
v a t i o n i s t h e r e l i a b l e n o d u l a t i o n o f b o t h A l n u s a n d E l a e a g n u s
s p e c i e s i n N e w Z e a l a n d a t e v e r y s i t e wh e r e t h e y g r o w f r o m
s e a l e v e l t o 1 , 7 0 0 m e v e n t h o u g h b o t h g e n e r a a r e r e c e n t
a r r i v a l s t o t h e c o u n t r y . L i k e wi s e , C a s u a n n a s p e c i e s , wh i c h
o r i g i n a t e d i n A u s t r a l i a , a r e n o d u l a t e d wh e n g r o wn i n F l o r i d a
( 2 7 2 ) . I n c o n t r a s t , n e i t h e r C a s u a r i n a ( f r o m A u s t r a l i a ) n o r
C e a n o t h u s ( f r o m N o r t h A m e r i c a ) s p e c i e s a r e n o d u l a t e d
n a t u r a l l y i n N e w Z e a l a n d ( 2 3 0 a ) . A l t h o u g h s o m e o f t h e s e
o b s e r v a t i o n s m a y r e f l e c t F r a n k i a p o p u l a t i o n s t h a t p e r s i s t i n
t h e a b s e n c e o f t h e a p p r o p r i a t e h o s t , t h e y m a y a l s o r e f l e c t t h e
b r o a d h o s t r a n g e e x h i b i t e d b y s o m e s t r a i n s o r t h e p r o m i s c u -
o u s n a t u r e o f s o m e o f t h e h o s t p l a n t s . F o r e x a m p l e , a s t u d y
o f 1 0 0 s o i l s a m p l e s t a k e n f r o m d i f f e r e n t s i t e s i n S p a i n
s h o we d t h a t a l l b u t 7 o f t h e 8 4 s o i l s c a p a b l e o f n o d u l a t i n g
a l d e r a l s o n o d u l a t e d M y r i c a g a l e d e s p i t e t h e a b s e n c e o f M .
g a l e f r o m a l l b u t o n e o f t h e s a m p l i n g s i t e s ( 4 4 ) . I t i s n o w
k n o wn t h a t A l n u s a n d M y r i c a s p e c i e s b e l o n g t o t h e s a m e
h o s t s p e c i f i c i t y g r o u p ; m o r e o v e r , M . g a l e i s k n o wn t o b e a
"p r o m i s c u o u s h o s t , " wh i c h e n t e r s i n t o s y m b i o s i s wi t h a
b r o a d r a n g e o f F r a n k i a s t r a i n s .
S u r v i v a l a n d p e r s i s t e n c e i n s o i l h a v e g e n e r a l l y b e e n s t u d -
i e d b y u s i n g h o s t p l a n t s a s b i o a s s a y a g e n t s f o r F r a n k i a
s t r a i n s ( 2 4 3 , 2 7 9 ) . U s i n g t h e s e t e c h n i qu e s , i t h a s b e e n s h o wn
t h a t t h e n o d u l a t i o n c a p a c i t y o f s o i l u n d e r A l n u s s p e c i e s a n d
u n d e r n o n h o s t p l a n t s v a r i e d b e t we e n 1 0 1 a n d 1 0 5 a n d b e -
t we e n 0 a n d 3 . 1 x 1 0 3 n o d u l a t i o n u n i t s ( n u ) c m o f s o i l - 3 ,
r e s p e c t i v e l y ( 2 4 5 , 2 7 8 , 2 7 9 , 2 8 1 ) . U s i n g 2 0 - f o l d s o i l d i l u t i o n s ,
i t i s p o s s i b l e t o d e t e c t 0 . 0 7 n u c m - 3 ( 1 0 t o 1 0 0 F r a n k i a c e l l s
c m - ) i n s o i l ( 2 4 3 ) . Th e s e t e c h n i qu e s a l l c o n f i r m t h e wi d e -
s p r e a d p r e s e n c e o f F r a n k i a s t r a i n s i n m a n y s o i l s wi t h a n d
wi t h o u t h o s t p l a n t s ( 1 1 7 , 2 4 3 ) .
A m o n g t h e m o s t i m p o r t a n t v a r i a b l e s c o n t r o l l i n g F r a n k i a
s o i l p o p u l a t i o n s i s t h e p H . W o r k o n t h e n o d u l a t i o n o f p l a n t s
i n wa t e r c u l t u r e ( 8 6 ) a n d i n s o i l ( 2 1 0 , 2 4 6 ) h a s s h o wn t h a t p H
i s i m p o r t a n t , a l t h o u g h wh e t h e r p H a f f e c t s t h e n o d u l a t i o n
p r o c e s s , o r F r a n k i a s u r v i v a l , i s n o t k n o wn . F o r m o s t p l a n t s
t h e r e i s a n a r r o w p H o p t i m u m n e a r n e u t r a l i t y a t wh i c h
n o d u l a t i o n i s o p t i m a l , a n d t h i s c o i n c i d e s wi t h t h e o p t i m u m
g r o wt h p H o f F r a n k i a c e l l s i n c u l t u r e . Th e n u m b e r o f
n o d u l a t i o n u n i t s i n s o i l , a s m e a s u r e d b y m o s t - p r o b a b l e -
n u m b e r n o d u l a t i o n t e s t s o n A l n u s s p e c i e s , i s s t r o n g l y c o r r e -
l a t e d wi t h s o i l p H u p t o p H 8 . 0 b u t n o t wi t h a n y o t h e r
c o m m o n s o i l p r o p e r t y ( 2 4 5 ) . De s p i t e t h e s e o b s e r v a t i o n s ,
n o d u l a t i o n c a n o c c u r i n s o i l s wi t h p H d o wn t o 3 . 5 , p o s s i b l y
b e c a u s e o f h i g h e r - p H m i c r o s i t e s o r a c i d r e s i s t a n c e o f s p o r e s
( 2 4 5 ) .
Th e p r e s e n c e o f h o s t p l a n t s i s o b v i o u s l y t h e m a j o r f a c t o r
i n m a i n t a i n i n g a n d a m p l i f y i n g F r a n k i a p o p u l a t i o n s . I n s o m e
i n s t a n c e s , d e n s i t i e s o f F r a n k i a c e l l s i n s o i l c a n b e c o m i p l e t e l y
e x p l a i n e d b y r e l e a s e o f e n d o p h y t e f r o m n o d u l e t u r n o v e r ,
a s s u m i n g a s u r v i v a l t i m e o f 1 y e a r i n s o i l ( 9 , 2 7 8 ) . G r o wt h i n
t h e h o s t r o o t r h i z o s p h e r e h a s a l s o b e e n p o s t u l a t e d ( 7 9 ) .
R e m o v a l o f h o s t p l a n t s o r a r t i f i c i a l i n o c u l a t i o n i n t h e a b s e n c e
o f h o s t p l a n t s u s u a l l y r e s u l t s i n a r a p i d d r o p i n i n f e c t i v e u n i t s
t o a l o w l e v e l wh i c h c a n b e m a i n t a i n e d o v e r a l o n g t i m e . A
s i g n i f i c a n t e x c e p t i o n t o t h i s s t e e p d r o p i n i n f e c t i v i t y i s t h e
a p p a r e n t a m p l i f i c a t i o n o f F r a n k i a c e l l s i n t h e p r e s e n c e o f a
B e t u l a s p e c i e s , a n o n h o s t t r e e i n t h e s a m e f a m i l y ( B e t u -
l a c e a e ) a s A l n u s ( 2 4 3 , 2 4 5 , 2 7 9 ) . S o m e v e r y e l e g a n t s c a n n i n g
e l e c t r o n m i c r o g r a p h s h a v e s h o wn l u x u r i a n t g r o wt h o f
F r a n k i a c e l l s o n t h e r o o t s o f B e t u l a a n d A l n u s t r e e s ( 2 4 4 ) . I t
i s s i g n i f i c a n t t h a t , i n a d d i t i o n t o h y p h a e , b o t h s p o r a n g i a a n d
v e s i c l e s a r e f o r m e d i n t h e a b s e n c e o f a d d e d c a r b o h y d r a t e ,

o
n

A
p
r
i
l

2
9
,

2
0
1
4

b
y

I
O
W
A

S
T
A
T
E

U
N
I
V
E
R
S
I
T
Y
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

s u g g e s t i n g t h a t F r a n k i a c e l l s c a n b o t h p r o l i f e r a t e ( s p o r u l a t e )
a n d p r e s u m a b l y f i x N 2 , a s we l l a s g r o w o u t s i d e r o o t n o d u l e s
i n s o i l ( 2 4 4 ) . Th e s e p r e l i m i n a r y f i n d i n g s l e a d t o t h e h y p o t h -
e s i s t h a t F r a n k i a p r o l i f e r a t i o n i s p r i m a r i l y i n t h e n o d u l e s o f
h o s t p l a n t s a n d s e c o n d a r i l y i n t h e r h i z o s p h e r e o f b o t h h o s t
a n d r e l a t e d s p e c i e s ; i n a d d i t i o n , s o m e g r o wt h m u s t o c c u r i n
s o i l s t o s u s t a i n t h e n u m b e r s o f F r a n k i a c e l l s t h a t o c c u r i n t h e
a b s e n c e o f h o s t p l a n t s .
A l t h o u g h n o d u l a t i o n t e c h n i qu e s a r e s e n s i t i v e a s b i o a s s a y s
f o r F r a n k i a s t r a i n s i n s o i l , t h e y a r e v e r y t i m e - c o n s u m i n g , d o
n o t d i s c r i m i n a t e b e t we e n d i f f e r e n t s t r a i n s , e x c l u d e n o n i n f e c -
t i v e s t r a i n s , a n d n e g l e c t t h e e f f e c t s o f c o m p e t i t i o n b e t we e n
s t r a i n s ( 5 ) . R e c e n t a t t e m p t s t o i d e n t i f y F r a n k i a s t r a i n s i n s o i l
a n d i n n o d u l e s b y d e t e c t i o n o f s p e c i f i c DN A f r a g m e n t s a f t e r
P C R a m p l i f i c a t i o n p r o v i d e t h e o p p o r t u n i t y f o r f a s t e r , m o r e
s p e c i f i c , a n d m o r e d i r e c t a n a l y s e s o f F r a n k i a e c o l o g y ( 1 7 7 ,
1 9 3 ) . B y u s i n g a l a b e l l e d n i f H DK p r o b e a n d a m p l i f y i n g t h e
n i f H g e n e , F r a n k i a s t r a i n A r I 6 wa s d e t e c t e d d o wn t o 2 0 9 n u
g o f s o i l - 1 , a n d , wi t h m o d i f i c a t i o n s o f t h e t e c h n i qu e , i t wa s
s u g g e s t e d t h a t a s e n s i t i v i t y o f a t l e a s t 2 n u g - c o u l d b e
a c h i e v e d . r R N A h a s a l s o b e e n u s e d f o r o l i g o n u c l e o t i d e
d e t e c t i o n a n d h a s p r o v e n t o b e u s e f u l i n s t u d i e s o f n o d u l e s
( 1 0 1 ) , b u t t h e s e n s i t i v i t y o f t h e t e c h n i qu e r e l a t i v e t o P C R a n d
p r o b l e m s wi t h t h e qu a n t i f i c a t i o n o f r e s u l t s m a k e i t d i f f i c u l t t o
a p p l y t h i s t e c h n i qu e t o e c o l o g i c a l s t u d i e s wi t h s o i l ( 5 , 9 8 ) .
R e c e n t wo r k i n v o l v i n g P C R o f v a r i a b l e r e g i o n s i n F r a n k i a
r R N A g e n e s h a s g i v e n e s t i m a t e s o f 0 . 2 x 1 0 5 g e n o m e s o f
F r a n k i a p e r g o f s o i l i n a n e s t a b l i s h e d a l d e r s t a n d , wh i c h
c o r r e s p o n d s we l l t o p r e v i o u s e s t i m a t e s b a s e d o n b i o a s s a y s
( 1 9 3 ) .
I n f e c t i v i t y a n d E f f e c t i v i t y
V a r i o u s e c o l o g i c a l a n d f u n c t i o n a l g r o u p s o f F r a n k i a h a v e
b e e n r e c o g n i z e d o v e r a n d a b o v e t h e n o r m a l t a x o n o m i c
d i v i s i o n s a n d c o m p a t i b i l i t y g r o u p i n g s . Th e g r o u p s "i n f e c -
t i v e " ( a b l e t o f o r m n o d u l e s ) a n d "e f f e c t i v e " ( c a p a b l e o f
s y m b i o t i c N 2 f i x a t i o n ) a r e f u n c t i o n a l g r o u p s wh i c h h a v e
i m p o r t a n t e c o l o g i c a l a n d p h y s i o l o g i c a l i m p l i c a t i o n s .
B y f a r t h e m a j o r i t y o f F r a n k i a s t r a i n s a r e i n f e c t i v e . Th e y
h a v e n o r m a l l y b e e n i s o l a t e d f r o m n o d u l e s , a n d , u n t i l t h e
a d v e n t o f m o r e s o p h i s t i c a t e d t e c h n i qu e s , i n f e c t i o n h a s b e e n
a m a j o r d e f i n i t i o n o f t h e g r o u p . H o we v e r , a n u m b e r o f
s t r a i n s wh i c h a p p e a r t o b e n o n i n f e c t i v e h a v e b e e n i s o l a t e d
( 1 6 , 1 0 0 , 1 3 7 ) . I d e n t i f i c a t i o n o f t h e s e i s o l a t e s a s a u t h e n t i c
F r a n k i a s t r a i n s h a s g e n e r a l l y b e e n c o n f i r m e d b y m o r p h o l o g -
i c a l c r i t e r i a a n d b y c h e m i c a l o r g e n e t i c p r o b e s . A r e c e n t
s t u d y h a s h i g h l i g h t e d t h e p r o b l e m s i n h e r e n t i n d e a l i n g wi t h
o n e o f t h e m o r e r e c a l c i t r a n t g e n e r a , C o r i a r i a ( 1 6 4 ) . N i n e
i s o l a t e s f r o m C . n e p a l e n s i s a l l f a i l e d t o e x p r e s s n i t r o g e n a s e
i n c u l t u r e a n d d i d n o t f o r m v e s i c l e s . Th e i s o l a t e s we r e a l l
c o n f i r m e d a s F r a n k i a s t r a i n s b y h y b r i d i z a t i o n wi t h a 1 6 S
r R N A - t a r g e t e d o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e a n d b y c l u s t e r a n a l y s i s
o f f a t t y a c i d p r o f i l e s ( 1 6 5 ) . S i n c e t h e i s o l a t e s c a m e f r o m t h e
C o n a n a n o d u l e s , t h e d e s i g n a t i o n o f t h e i s o l a t e s a s n o n i n -
f e c t i v e i s o b v i o u s l y t e n t a t i v e a n d a wa i t s m o r e k n o wl e d g e o f
t h e c o n d i t i o n s u n d e r wh i c h n o d u l e s m a y b e f o r m e d i n g e n e r a
s u c h a s C o r i a r i a .
M u c h m o r e i s k n o wn a b o u t a r a n g e o f i n f e c t i v e b u t
i n e f f e c t i v e s t r a i n s . Th e y o c c u r c o m m o n l y i n n a t u r a l h a b i t a t s
( 1 0 0 , 1 3 7 ) a n d r e p r e s e n t g e n e t i c a l l y d i s t i n c t g r o u p i n g s o f
s t r a i n s wh i c h a r e qu i t e s e p a r a t e f r o m e f f e c t i v e t y p e s . S o m e
s t r a i n s m a y b e i n e f f e c t i v e o n o n e h o s t g e n u s o r s p e c i e s b u t
e f f e c t i v e o n a n o t h e r ( 5 7 , 1 1 5 ) . I n e f f e c t i v e s t r a i n s a r e g e n e r -
a l l y i n c a p a b l e o f f o r m i n g v e s i c l e s i n s y m b i o s i s ( 1 6 , 2 8 2 ) a n d
t h e r e f o r e l a c k t h e a b i l i t y t o f i x N 2 . L i t t l e i s k n o wn o f t h e
c o m p e t i t i v e a b i l i t y o f t h e t wo g r o u p s i f b o t h a r e p r e s e n t i n a
g i v e n s o i l , b u t i t s e e m s l i k e l y t h a t i f h i g h l e v e l s o f i n e f f e c t i v e
s t r a i n s o c c u r , t h e y wo u l d c o m p e t e f o r i n f e c t i o n s i t e s wi t h
e f f e c t i v e s t r a i n s ( 2 8 2 ) .
H o s t S p e c i f i c i t y
F r a n k i a s t r a i n s e x h i b i t v a r i o u s d e g r e e s o f h o s t s p e c i f i c i t y ,
b u t t h e r u l e s f o r p r e d i c t i n g s p e c i f i c i t y h a v e p r o v e n s o m e -
t h i n g o f a G o r d i a n k n o t . A s a s t a r t i n g p o i n t , B a k e r d e f i n e d
t h r e e o r f o u r h o s t s p e c i f i c i t y g r o u p s ( H S G s ) a m o n g F r a n k i a
s t r a i n s m a i n l y o n t h e b a s i s o f t h e r e s u l t s o f c r o s s - i n f e c t i v i t y
s t u d i e s c o n d u c t e d i n wa t e r c u l t u r e o n m e m b e r s o f t h e
B e t u l a c e a e , M y r i c a c e a e , E l a e a g n a c e a e , a n d C a s u a r i n a c e a e
( 2 2 ) . H S G 1 i s c o m p o s e d o f s t r a i n s t h a t i n f e c t A l n u s ( B e t u -
l a c e a e ) a n d C o m p t o n i a ( M y r i c a c e a e ) s p e c i e s ; H S G 2 s t r a i n s
i n f e c t m e m b e r s o f t h e C a s u a r i n a c e a e ( C a s u a r i n a , A l l o c a s u a -
n n a , a n d G y m n o s t o m a s p e c i e s ) ; a n d H S G 3 s t r a i n s i n f e c t
m e m b e r s o f t h e E l a e a g n a c e a e ( E l a e a g n u s , H i p p o p h a e , a n d
S h e p h e r d i a s p e c i e s ) . M e m b e r s o f H S G 1 , H S G 2 , a n d H S G
3 a l s o n o d u l a t e p r o m i s c u o u s h o s t s f r o m t h e g e n e r a M y r i c a
( M y r i c a c e a e ) a n d G y m n o s t o m a ( C a s u a r i n a c e a e ) , wh i c h a p -
p e a r t o b e l e s s s e l e c t i v e t h a n o t h e r p l a n t s i n c h o o s i n g a
s y m b i o t i c p a r t n e r . A f o u r t h H S G d e f i n e d b y B a k e r ( 2 2 )
c o n t a i n e d s t r a i n s t h a t n o d u l a t e m e m b e r s o f t h e E l a e -
a g n a c e a e b u t n o t t h e p r o m i s c u o u s h o s t s .
A l t h o u g h t h e s e g r o u p s a r e r e l a t i v e l y s t r a i g h t f o r wa r d i n
p r i n c i p l e , t h e s i t u a t i o n i s c o m p l i c a t e d b y t h e o b s e r v a t i o n
t h a t a s t r a i n f r o m o n e H S G c a n s o m e t i m e s b e i s o l a t e d f r o m
a p l a n t n o r m a l l y i n f e c t e d o n l y b y m e m b e r s o f a n o t h e r H S G .
S o m e o f t h e s e i s o l a t e s t h e n f a i l t o n o d u l a t e t h e s o u r c e p l a n t ,
o r t h e y n o d u l a t e t h e s o u r c e p l a n t i n e f f e c t i v e l y ( 1 6 , 7 9 , 1 0 0 ,
1 6 4 ) . S u c h s t r a i n s h a v e b e e n r e f e r r e d t o a s a t y p i c a l . I n
a d d i t i o n , r e c e n t s t u d i e s h a v e d e m o n s t r a t e d t h e e x i s t e n c e o f
s t r a i n s t h a t h a v e b e e n i s o l a t e d f r o m E l a e a g n u s s p e c i e s a n d
t h a t f o r m i n e f f e c t i v e n o d u l e s o n A l n u s s p e c i e s ( 5 7 ) . I n t h e
l a t t e r c a s e , t h e s t r a i n s i s o l a t e d f r o m t h e E l a e a g n u s s p e c i e s
c a n a l s o b e c o n s i d e r e d f l e x i b l e i n t h e s e n s e t h a t i n f e c t i o n i s
a c h i e v e d v i a r o o t h a i r p e n e t r a t i o n i n A l n u s s p e c i e s a n d b y
i n t e r c e l l u l a r p e n e t r a t i o n i n E l a e a g n u s s p e c i e s ( 1 6 2 ) .
I n m o s t c a s e s , i s o l a t e s f r o m A l n u s s p e c i e s o r m e m b e r s o f
t h e E l a e a g n a c e a e g e n e r a l l y wi l l e f f e c t i v e l y n o d u l a t e t h e i r
s o u r c e p l a n t . H o we v e r , l e s s p r e d i c t a b i l i t y i s e v i d e n t a m o n g
s t r a i n s i s o l a t e d f r o m m e m b e r s o f t h e C a s u a r i n a c e a e o r
M y r i c a c e a e a n d r e c e n t l y i s o l a t e d s t r a i n s f r o m m e m b e r s o f
t h e C o r i a r i a c e a e o r R h a m n a c e a e ( 6 4 , 6 5 , 1 6 5 ) . I n a s t u d y o f
2 2 i s o l a t e s f r o m m e m b e r s o f t h e C a s u a r i n a c e a e , 9 f a i l e d t o
n o d u l a t e t h e i r o r i g i n a l h o s t s a n d 2 a d d i t i o n a l s t r a i n s n o d u -
l a t e d l e s s t h a n h a l f o f t h e s o u r c e h o s t s e e d l i n g s t e s t e d ( 2 6 7 ) .
F o u r o f t h e n o n i n f e c t i v e s t r a i n s we r e t e s t e d o n E l a e a g n u s
s e e d l i n g s , a n d a l l p r o d u c e d n o d u l e s . O f t h e s e f o u r s t r a i n s ,
t wo ( Dl l a n d C c I 2 ) h a v e s i n c e b e e n i n c l u d e d i n 1 6 S r R N A
a n a l y s e s a n d DN A - DN A h o m o l o g y s t u d i e s ( 8 7 , 1 7 8 ) . S t r a i n
Dl l c l u s t e r e d wi t h s t r a i n s i s o l a t e d f r o m E l a e a g n u s s p e c i e s
b y r DN A a n a l y s i s a n d h a d n o d e t e c t a b l e DN A h o m o l o g y
wi t h o t h e r s t r a i n s f r o m C a s u a r i n a s p e c i e s ( g e n o m i c s p e c i e s
9 ) ; C c I 2 c l u s t e r e d wi t h t y p i c a l s t r a i n s i s o l a t e d f r o m C a s u a -
r i n a s p e c i e s b e l o n g i n g t o g e n o m i c s p e c i e s 9 b y r DN A
a n a l y s i s a n d h a d 3 8 % DN A h o m o l o g y wi t h g e n o m i c s p e c i e s
9 . Th u s , c o n s i d e r a b l e d i v e r s i t y c a n b e f o u n d a m o n g a t y p i c a l
i s o l a t e s .
Th e s i m p l e s t e x p l a n a t i o n f o r t h e c o m m o n i s o l a t i o n o f
a t y p i c a l F r a n k i a s t r a i n s i s t h a t a t y p i c a l s t r a i n s i n f e c t p r i m a -
r i l y o t h e r a c t i n o r h i z a l p l a n t s a n d i n d u c e r o o t n o d u l e s o n
s e c o n d a r y h o s t s wh e n c e r t a i n e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s a r e
m e t . Th e p r o m i s c u o u s h o s t s , M y r i c a a n d G y m n o s t o m a
V O L . 5 7 , 1 9 9 3

o
n

A
p
r
i
l

2
9
,

2
0
1
4

b
y

I
O
W
A

S
T
A
T
E

U
N
I
V
E
R
S
I
T
Y
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

s p e c i e s , wh i c h a r e i n f e c t e d b y m e m b e r s o f H S G 1 , H S G 2 ,
a n d H S G 3 ( a t l e a s t ) a n d t h u s y i e l d a v a r i e t y o f s t r a i n s , m a y
s i m p l y r e p r e s e n t t h e e x t r e m e c a s e a l o n g a s p e c t r u m o f
c o m p e t e n c e . A s m e n t i o n e d a b o v e , s o m e s t r a i n s i s o l a t e d
f r o m E l a e a g n u s s p e c i e s c a n i n e f f e c t i v e l y n o d u l a t e A l n u s
s p e c i e s a t l o w f r e qu e n c y ( 5 7 ) , a n d s o m e s t r a i n s i s o l a t e d f r o m
A l n u s s p e c i e s r e p o r t e d l y n o d u l a t e C o n i a r i a s p e c i e s ( 2 1 1 ) ;
t h e r e f o r e , f i n d i n g s u c h s t r a i n s i n f i e l d n o d u l e s s h o u l d n o t b e
s u r p r i s i n g . O t h e r e x p l a n a t i o n s a d v a n c e d t o e x p l a i n t h i s
p h e n o m e n o n i n c l u d e ( i ) t h e p r e s e n c e o f m o r e t h a n o n e s t r a i n
i n a n o d u l e a n d ( i i ) l o s s o f t h e g e n e t i c i n f o r m a t i o n f o r p l a n t
n o d u l a t i o n o n p a s s a g e t h r o u g h c u l t u r e . M o r e t h a n o n e s t r a i n
h a s b e e n i s o l a t e d f r o m a s i n g l e n o d u l e i n t h e p a s t ( 3 7 , 8 1 ) ;
t h e r e f o r e d u a l i n f e c t i o n i s p o s s i b l e , a n d a d e qu a t e c a r e
s h o u l d b e t a k e n t o o b t a i n m o n o c u l t u r e s . H o we v e r , g e n o -
t y p i c c h a n g e s o f t h e m a g n i t u d e r e qu i r e d t o c o n v e r t a n a l d e r -
o r c a s u a r i n a - i s o l a t e d s t r a i n t o a n e l a e a g n u s - i s o l a t e d s t r a i n
s e e m u n l i k e l y . F i n a l l y , t h e e x i s t e n c e o f p r o m i s c u o u s
F r a n k i a s t r a i n s , wh i c h h a v e f e w s c r u p l e s i n t h e i r c h o i c e o f
p a r t n e r , h a s n o t y e t b e e n r u l e d o u t .
Th e h o s t s p e c i f i c i t y p i c t u r e wi l l n o d o u b t b e c o m e m o r e
c o m p l e x a s a d d i t i o n a l s t r a i n s a r e i s o l a t e d f r o m o t h e r m e m -
b e r s o f we l l - s t u d i e d p l a n t f a m i l i e s a n d f r o m p l a n t f a m i l i e s
t h a t h a v e y e t t o y i e l d i s o l a t e s t h a t r e i n f e c t t h e i r s o u r c e p l a n t
s p e c i e s ( m e m b e r s o f t h e C o r i a r i a c e a e , Da t i s c a c e a e , R h a m -
n a c e a e , a n d R o s a c e a e ) . P r a c t i c a l c o n c e r n s t h a t m u s t b e
a d d r e s s e d i n c l u d e t h e e f f e c t o f p l a n t c u l t i v a t i o n m e t h o d s o n
a p p a r e n t c o m p e t e n c e , t h e i n c i d e n c e o f m u l t i p l e s t r a i n s
wi t h i n a n o d u l e , a n d t h e e f f e c t o f i n t r a - a n d i n t e r s p e c i e s p l a n t
d i f f e r e n c e s t h a t m a y d e t e r m i n e s u s c e p t i b i l i t y . I n t h i s r e g a r d ,
s o m e s t u d i e s h a v e s h o wn t h a t d i f f e r e n t p l a n t s p e c i e s wi t h i n
a g e n u s o r d i f f e r e n t e c o t y p e s o r c l o n e s o f t h e s a m e h o s t p l a n t
c a n r e s p o n d d i f f e r e n t l y t o n o d u l a t i o n b y a g i v e n F r a n k i a
i s o l a t e ( 5 7 , 1 0 0 , 1 1 2 , 2 3 8 ) . I n a g e n e r a l s e n s e , t h e r e l a t i v e l y
b r o a d s p e c t r u m o f p l a n t s i n f e c t e d b y i n d i v i d u a l F r a n k i a
s t r a i n s i m p l i e s t h a t t h e p l a n t - b a c t e r i u m i n t e r a c t i o n s n e e d e d
t o e s t a b l i s h a s y m b i o s i s m a y b e l e s s c o m p l e x , o r a t l e a s t
m o r e g e n e r a l , t h a n t h o s e i n t h e r h i z o b i u m - l e g u m e s y m b i o s i s .
C U L TI V A TI O N O F F R E E - L I V I N G F R A N KL 4 S TR A I N S
I s o l a t i o n o f F r a n k i a s t r a i n s
W h e n d e s i g n i n g p r o t o c o l s f o r i s o l a t i n g F r a n k i a s t r a i n s , t h e
t wo m a j o r f a c t o r s l i m i t i n g s u c c e s s a r e t h e s l o w g r o wt h o f
F r a n k i a s t r a i n s a n d t h e p r e s e n c e o f c o n t a m i n a n t s . L i t t l e c a n
b e d o n e t o i m p r o v e t h e g r o wt h r a t e , b u t i t i s p o s s i b l e t o
m i n i m i z e a n d e v e n e l i m i n a t e n o d u l e s u r f a c e c o n t a m i n a t i o n .
A n u m b e r o f s u r f a c e d i s i n f e c t a n t s h a v e b e e n u s e d f o r t h i s
p u r p o s e , m o s t c o m m o n l y d i l u t e s o d i u m h y p o c h l o r i t e a n d
o s m i u m t e t r o x i d e ( 1 4 2 ) . I n s o m e m e t h o d s , wa s h e d n o d u l e
p i e c e s c a n b e e m b e d d e d i n s o l i d m e d i a o r i n c u b a t e d i n l i qu i d
m e d i a f o r p r o l o n g e d p e r i o d s ( 1 2 8 ) . A d r a wb a c k t o t h i s
a p p r o a c h i s t h a t t h e c l o n a l n a t u r e o f t h e s u b s e qu e n t c u l t u r e s
i s n o t e n s u r e d . A b e t t e r a p p r o a c h u s e d i n s o m e t e c h n i qu e s i s
t o f r a g m e n t t h e s u r f a c e - s t e r i l i z e d n o d u l e l o b e s a n d p l a t e
d i l u t i o n s o f t h e r e s u l t i n g v e s i c l e c l u s t e r s u s p e n s i o n s i n o r o n
s o l i d m e d i a o r d i l u t e t o e x t i n c t i o n i n l i qu i d m e d i a ( 3 1 , 7 9 ) .
V e s i c l e c l u s t e r s c o n s i s t o f a h y p h a l m a s s p l u s v e s i c l e s a n d
p l a n t c e l l c y t o p l a s m i c d e b r i s , a n d s o m e t i m e s F r a n k i a s p o -
r a n g i a , t h a t o c c u p y a s i n g l e i n f e c t e d p l a n t c e l l i n s y m b i o s i s .
Th e a d v a n t a g e s o f u s i n g a d i l u t i o n p l a t i n g t e c h n i qu e a r e t h a t
t h e o u t g r o wt h o f h y p h a e f r o m v e s i c l e c l u s t e r s c a n b e m o n -
i t o r e d m i c r o s c o p i c a l l y , wi t h t h e c h a n c e s o f o b t a i n i n g a
m o n o c u l t u r e i m p r o v e d a c c o r d i n g l y , a n d a n y c o n t a m i n a n t s
t h a t a r i s e a r e s p a t i a l l y r e m o v e d f r o m t h e s l o we r - g r o wi n g
F r a n k i a c o l o n y . A p p r o a c h e s i n v o l v i n g d i f f e r e n t i a l f i l t r a t i o n
( 3 1 , 5 5 ) o r s u c r o s e d e n s i t y g r a d i e n t c e n t r i f u g a t i o n ( 1 7 , 2 1 ) t o
c o n c e n t r a t e a n d wa s h v e s i c l e c l u s t e r s a p p e a r t o b e t h e m o s t
s u c c e s s f u l ( 1 4 2 ) .
Th e m e d i u m u s e d i n i s o l a t i n g n e w F r a n k i a s t r a i n s i s
c r i t i c a l f o r s u c c e s s , b u t n o u n i v e r s a l o r s e l e c t i v e m e d i u m h a s
y e t b e e n d e v i s e d . S e v e r a l g e n e r a l m e d i a f o r i s o l a t i o n a n d
g r o wt h h a v e b e e n r e p o r t e d ( 1 4 2 ) . Th o s e t h a t h a v e p r o v e n
e f f e c t i v e r a n g e f r o m s i m p l e t a p wa t e r a g a r t o d e f i n e d p r o p i -
o n a t e m e d i a ( 1 7 ) t o t h e c o m p l e x Q M o d m e d i u m o f L a l o n d e
a n d C a l v e r t ( 1 2 7 ) . R i c h e r m e d i a t e n d t o f a v o r t h e g r o wt h o f
c o n t a m i n a n t s . A n t i f u n g a l a g e n t s , s u c h a s c y c l o h e x i m i d e o r
n y s t a t i n , a r e o f t e n i n c o r p o r a t e d t o m i n i m i z e f u n g a l c o n t a m -
i n a t i o n . S o m e s t r a i n s r e qu i r e t h e a d d i t i o n o f a r o o t - l i p i d
e x t r a c t t o s t i m u l a t e t h e i r i n i t i a l g r o wt h d u r i n g i s o l a t i o n ( 1 9 9 ) .
Th e a c t i v e s u b s t a n c e i n t h e r o o t e x t r a c t s h a s b e e n i d e n t i f i e d
a s t h e s t e r o i d h y d r o x y d a m m a r e n o n e I I ( d i p t e r o c a r p o l ) ( 2 0 0 ) .
S u c h a r e qu i r e m e n t h a s s o f a r b e e n r e p o r t e d i n r e l a t i v e l y f e w
c a s e s . H o we v e r , t h e i n a b i l i t y t o i s o l a t e F r a n k i a s t r a i n s f r o m
s o m e p l a n t f a m i l i e s m a y r e f l e c t s p e c i a l r e qu i r e m e n t s t h a t
h a v e n o t y e t b e e n i d e n t i f i e d . F u r t h e r m o r e , s t r u c t u r a l e f f e c t s
o r t o x i c p r o p e r t i e s o f s o m e t y p e s o f n o d u l e s m a y p r e e m p t
i s o l a t i o n . F o r e x a m p l e , i t h a s b e e n o b s e r v e d t h a t , a l t h o u g h
s o m e s t r a i n s t h a t a r e r e a d i l y r e i s o l a t e d f r o m a l d e r n o d u l e s
c a n i n f e c t C o r i a r i a s p e c i e s , t h e y c o u l d n o t b e r e i s o l a t e d f r o m
C o r i a n a n o d u l e s ( 2 1 1 ) . I n g e n e r a l , i t i s b e s t t o u s e a r a n g e o f
m e d i a i n i n i t i a l i s o l a t i o n t r i a l s , p a r t i c u l a r l y s i n c e t h e e m e r -
g e n c e o f i d e n t i f i a b l e F r a n k i a c o l o n i e s m a y t a k e f r o m 1 0 d a y s
t o 1 y e a r a f t e r p l a t i n g ( 1 4 2 ) . O n c e F r a n k i a s t r a i n s h a v e b e e n
i s o l a t e d , i t i s e s s e n t i a l t o e n s u r e t h a t c o c u l t u r e s h a v e n o t
b e e n o b t a i n e d . U s u a l l y , t h i s i s a c c o m p l i s h e d b y t h e s u b c u l -
t u r i n g o f s i n g l e - s p o r e i s o l a t e s t h r o u g h s e v e r a l r o u n d s o f
p l a t i n g a n d g r o wt h .
G r o wt h C h a r a c t e r i s t i c s
A l l F r a n k i a s t r a i n s i s o l a t e d t o d a t e a r e o b l i g a t e h e t e r o t r o -
p h i c a e r o b e s t h a t g r o w s l o wl y , wi t h d o u b l i n g t i m e s o f 1 5 h o r
m o r e . S o m e s t r a i n s p r e f e r l o we r 0 2 l e v e l s t h a n o t h e r s a n d
g r o w p o o r l y i n v i g o r o u s l y a e r a t e d m e d i a , p a r t i c u l a r l y i f a
s p a r s e i n o c u l u m h a s b e e n u s e d . A s a c o n s e qu e n c e o f t h e i r
f i l a m e n t o u s g r o wt h h a b i t a n d t h e o f t e n a b u n d a n t s p o r a n g i a
f o r m e d i n l i qu i d c u l t u r e , g r o wt h k i n e t i c s o f F r a n k i a s t r a i n s
a r e c o m p l e x , g e n e r a l l y c o n s i s t i n g o f a s t a t i o n a r y p h a s e a f t e r
h o m o g e n i z a t i o n a n d t r a n s f e r , f o l l o we d b y a s h o r t e x p o n e n -
t i a l p h a s e a n d t h e n b y a s l o we r i n c r e a s e i n b i o m a s s o v e r
t i m e . Th i s p a t t e r n o f g r o wt h v a r i e s wi t h t h e i n o c u l u m
d e n s i t y , m e d i u m , a n d d e g r e e o f a g i t a t i o n . Th e u s u a l p r o b -
l e m s i n d e a l i n g wi t h a m y c e l i a l o r g a n i s m a p p l y t o F r a n k i a
s t r a i n s , i n c l u d i n g t h e d e v e l o p m e n t o f n u t r i e n t a n d wa s t e
g r a d i e n t s t h r o u g h m y c e l i a , t h e a b s e n c e o f t r u e b a l a n c e d
g r o wt h , a n d a t e n d e n c y t o f o r m f l o c s d u r i n g i n c u b a t i o n
( r e v i e we d i n r e f e r e n c e 3 8 ) . A n u n d e r s t a n d i n g o f t h e s e p r o b -
l e m s h a s l e d t o i m p r o v e d s h o r t - t e r m c u l t i v a t i o n m e t h o d s t h a t
y i e l d c o n s i s t e n t r e s u l t s ( 1 0 5 , 1 6 9 , 1 7 4 , 1 8 3 , 2 1 8 , 2 2 0 , 2 2 1 ,
2 9 2 ) . I n a d d i t i o n , p r o g r e s s h a s b e e n m a d e i n c o n t i n u o u s l y
c u l t i v a t i n g N 2 - f i x i n g F r a n k i a c e l l s b y u s i n g a s e m i c o n t i n u o u s
a p p r o a c h ( 1 0 5 ) .
G r o wt h a n d m a i n t e n a n c e m e d i a r a n g e f r o m s i m p l e b a s a l -
s a l t s m e d i a c o n t a i n i n g a s u i t a b l e c a r b o n s o u r c e t o c o m p l e x
m e d i a c o n t a i n i n g , i n a d d i t i o n t o b a s a l s a l t s , y e a s t e x t r a c t ,
b o v i n e s e r u m a l b u m i n , m a l t e x t r a c t , b e e f e x t r a c t , N Z A m i n e
A , C a s a m i n o A c i d s , v i t a m i n s u p p l e m e n t s , o r Twe e n s ( 1 4 2 ) .
V i r t u a l l y a l l F r a n k i a s t r a i n s i s o l a t e d t o d a t e a r e p r o t o t r o p h s
t h a t r e qu i r e n o i d e n t i f i e d g r o wt h f a c t o r s a n d t h e r e f o r e g r o w
we l l i n m i n i m a l m e d i a . S o m e s t r a i n s a r e i n h i b i t e d b y y e a s t

o
n

A
p
r
i
l

2
9
,

2
0
1
4

b
y

I
O
W
A

S
T
A
T
E

U
N
I
V
E
R
S
I
T
Y
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

B I O L O G Y O F F R A N KL 4 S TR A I N S 3 0 7
e x t r a c t o r o t h e r u n d e f i n e d m e d i a a d d i t i v e s ( 1 4 2 ) . Th e b e s t
a p p r o x i m a t i o n
o f a g e n e r a l m e d i u m f o r F r a n k i a i s t h e DP M
( d e f i n e d p r o p i o n a t e m i n i m a l ) m e d i u m o f B a k e r a n d O ' Ke e f e
( 1 7 ) .
M o s t F r a n k i a s t r a i n s a r e g r o wn a n d m a i n t a i n e d i n l i qu i d
c u l t u r e a n d
g e n e r a l l y g r o w s l o wl y o n s o l i d m e d i a , wh i c h a r e
u s e d
m a i n l y f o r p u r i f y i n g c u l t u r e s , f o r a s s e s s i n g s p o r e g e r -
m i n a t i o n , o r f o r i d e n t i f y i n g m u t a n t s ( 1 9 6 , 2 7 3 ) . C o l o n i e s
f r o m
s p o r e s o r m y c e l i a l f r a g m e n t s b e c o m e v i s i b l e t o t h e
u n a i d e d
e y e
a b o u t 7 t o 1 0 d a y s , o r l o n g e r , a f t e r p l a t i n g ,
u n d e r t h e b e s t o f c o n d i t i o n s ( 1 4 3 a ) . I n o u r e x p e r i e n c e , s o m e
t y p e s
o f
a g a r a r e i n h i b i t o r y , wh e r e a s g e l l a n g u m , a s o l i d i f y -
i n g a g e n t d e r i v e d f r o m P s e u d o m o n a s e l o d e a c a p s u l a r p o -
l y s a c c h a r i d e , h a s p r o v e n t o b e a s u i t a b l e s u b s t i t u t e , e s p e -
c i a l l y
f o r
s p o r e g e r m i n a t i o n s t u d i e s .
P H YS I O L O G Y O F F R E E - L I V I N G F R A N KJ A S TR A I N S
C a r b o n M e t a b o l i s m
I n a c c o r d a n c e wi t h t h e i r g e n e t i c d i v e r s i t y , F r a n k i a s t r a i n s
d i f f e r i n t h e
r a n g e
o f s u b s t r a t e s t h e y u s e f o r g r o wt h . F . a l n i
( g e n o m i c s p e c i e s 1 ) s t r a i n s a r e t h e b e s t d e f i n e d . Th e y
g e n e r a l l y g r o w
we l l o n s h o r t - c h a i n f a t t y a c i d s ( a c e t a t e ,
p r o p i o n a t e ) ; v a r i a b l y o n s u c c i n a t e o r m a l a t e , Twe e n 8 0 , a n d
p y r u v a t e ; a n d p o o r l y , i f a t a l l , o n a r a n g e o f s u g a r s t e s t e d .
Th i s n a r r o w r a n g e c o n t r a s t s wi t h s o m e s t r a i n s f r o m g e n o m i c
s p e c i e s
t h a t i n f e c t t h e m e m b e r s o f t h e E l a e a g n a c e a e a n d
C a s u a r i n a c e a e ;
t h e s e s t r a i n s
g r o w o n s u g a r s a s we l l a s
o r g a n i c
a c i d s
( 3 8 ) . Th e o r i g i n a l p h y s i o l o g i c a l g r o u p s p r o -
p o s e d b y
L e c h e v a l i e r a n d L e c h e v a l i e r - g r o u p s A a n d
B - a r e s t i l l
l a r g e l y i n t a c t ( 1 4 0 ) . Th u s , F . a l n i s t r a i n s c o n s t i -
t u t e
p h y s i o l o g i c a l g r o u p B , a n d m o s t s t r a i n s t h a t i n f e c t
m e m b e r s o f t h e
E l a e a g n a c e a e o r C a s u a r i n a c e a e g e n e r a l l y
b e l o n g
t o
g r o u p A . S i n c e m o s t o f t h e c a r b o n s o u r c e u t i l i z a -
t i o n
e x p e r i m e n t s
we r e d o n e s o o n a f t e r F r a n k i a s t r a i n s
b e c a m e a v a i l a b l e b u t b e f o r e g e n o m i c g r o u p s we r e e s t a b -
l i s h e d ,
m u c h wo r k r e m a i n s t o b e d o n e o n d e t e r m i n i n g t h e
d e g r e e
t o wh i c h
s i m p l e p h y s i o l o g i c a l t r a i t s c o r r e l a t e wi t h
m o r e
r e c e n t l y e s t a b l i s h e d g e n o m i c s p e c i e s .
G e n e r a l
p a t h wa y s
o f c a r b o n m e t a b o l i s m h a v e b e e n d e -
s c r i b e d f o r a f e w F r a n k i a s t r a i n s . I n d i v i d u a l e n z y m e s i n -
v o l v e d i n t h e
E m b d e n - M e y e r h o f - P a r n a s g l y c o l y t i c p a t h wa y ,
p e n t o s e p h o s p h a t e p a t h wa y , t r i c a r b o x y l i c a c i d c y c l e , g l y o x -
y l a t e c y c l e ,
a n d
g l u c o n e o g e n e s i s
h a v e b e e n d e t e c t e d p r i m a -
r i l y
i n F . a l n i A v c I l a n d H F P A r I 3 ( g e n o m i c s p e c i e s 1 ) a n d i n
H F P C c I 3
( g e n o m i c s p e c i e s 9 ) ( 5 3 , 1 5 1 , 2 5 0 ) . F r o m 1 4 C -
l a b e l i n g e x p e r i m e n t s , p r o p i o n a t e a s s i m i l a t i o n a n d m e t a b o -
l i s m h a v e b e e n
p r o p o s e d
t o
p r o c e e d v i a a c t i v e t r a n s p o r t
f o l l o we d
b y
a c t i v a t i o n t o
p r o p i o n y l c o e n z y m e A , b i o t i n -
d e p e n d e n t c a r b o x y l a t i o n
t o
m e t h y l - m a l o n y l c o e n z y m e A ,
a n d t h e n r a c e m i z a t i o n t o
s u c c i n y l c o e n z y m e A ,
wh i c h e n t e r s
t h e
t r i c a r b o x y l i c
a c i d
c y c l e p o o l s ( 2 5 0 ) .
G l y c o g e n
a n d t r e h a l o s e h a v e b e e n i d e n t i f i e d a s
m a j o r
s t o r a g e c o m p o u n d s
i n s o m e F r a n k i a s t r a i n s
( 1 5 0 ) ,
wi t h
g l y c o g e n d e p o s i t s
v i s i b l e i n t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o -
g r a p h s
o f c u l t u r e d a n d m o s t
s y m b i o t i c
F r a n k i a s t r a i n s e x -
c e p t
f o r f r a n k i a e i n Di s c a r i a a n d
Dr y a s
n o d u l e s
( 1 8 1 ) .
V e s i c l e s t h a t a r e
a c t i v e l y
i n v o l v e d i n
N 2
f i x a t i o n
g e n e r a l l y
a p p e a r
t o h a v e f e we r
g l y c o g e n g r a n u l e s
t h a n d o
y o u n g
d e v e l o p i n g
v e s i c l e s o r o l d e r v e s i c l e s n o
l o n g e r
i n v o l v e d i n
f i x i n g N 2
i n
s y m b i o s i s ( 3 6 , 8 8 ) .
Th e s e o b s e r v a t i o n s m o s t
p r o b a b l y
r e f l e c t t h e
h i g h - e n e r g y r e qu i r e m e n t
f o r
N 2
f i x a t i o n
i n
v e s i c l e s ,
wh e r e m u c h o f t h e
i n c o m i n g
s u b s t r a t e wo u l d b e
n e e d e d f o r
e n e r g y g e n e r a t i o n
r a t h e r t h a n
s t o r a g e c o m p o u n d
s y n t h e s i s .
Th e
a v a i l a b i l i t y
o f
t e c h n i qu e s
f o r
i s o l a t i n g
v e s i -
c l e s h a s o p e n e d t h e p o s s i b i l i t y o f s t u d y i n g v e s i c l e c a r b o n
m e t a b o l i s m i n b o t h c u l t u r e a n d s y m b i o s i s ( 1 8 3 , 2 2 0 ) , a l -
t h o u g h o n l y o n e s t u d y t o d a t e h a s t a k e n a d v a n t a g e o f t h i s
a p p r o a c h f o r s t u d i e s o n s y m b i o t i c f r a n k i a e ( 2 8 4 ) .
E x t r a c e l l u l a r e n z y m e s . F r a n k i a s t r a i n s h a v e b e e n r e p o r t e d
t o p r o d u c e e x t r a c e l l u l a r c e l l u l a s e , p e c t i n a s e , a n d p r o t e i n a s e
a c t i v i t y i n p u r e c u l t u r e ( 1 6 9 , 2 1 5 , 2 2 4 ) . C e l l u l a s e s h a v e b e e n
d e t e c t e d i n s t r a i n s H F P C c I 3 , H F P C c I 2 , a n d H F P G p I 1 ,
wh i c h a r e d e r i v e d f r o m m e m b e r s o f t h e C a s u a r i n a c e a e , a n d
i n F . a l n i H F P C p I 1 a n d H F P A r I 3 , b u t n o g r o wt h o n c e l l u -
l o s e wa s o b s e r v e d ( 2 1 5 ) . O f t h e s e s t r a i n s , H F P C p I 1 e x h i b -
i t e d t h e h i g h e s t c a r b o x y m e t h y l c e l l u l o s e - h y d r o l y z i n g a c t i v -
i t y a n d H F P C c I 3 c o m p l e t e l y d e g r a d e d f i l t e r p a p e r s t r i p s .
G i v e n t h e f a c t t h a t H F P C p I 1 a n d o t h e r F . a l n i s t r a i n s d o n o t
g r o w, o r g r o w p o o r l y , o n s i m p l e s u g a r s , t h e p r e s e n c e o f
c e l l u l a s e i n t h e s e s t r a i n s m a y s u g g e s t t h a t a p p r o p r i a t e c o n -
d i t i o n s f o r g r o wt h o n s u g a r s h a v e n o t b e e n i d e n t i f i e d o r t h a t
t h e c e l l u l a s e h a s b e e n m a i n t a i n e d i n s o m e F r a n k i a s t r a i n s f o r
p l a n t i n f e c t i o n o r o t h e r p u r p o s e s .
L o w l e v e l s o f p e c t i n a s e a c t i v i t y h a v e b e e n d e t e c t e d b y a
c u p - p l a t e p e c t i n a g a r a s s a y i n F . a l n i A C N 1 A G a n d
H F P C p I 1 , a n d p o s s i b l e p e l g e n e s h a v e b e e n d e t e c t e d b y
S o u t h e r n b l o t t i n g wi t h t h e E r wi n i a c h r y s a n t h e m i p e l B DA
g e n e s a s a p r o b e i n A C N 1 A G a n d o t h e r s t r a i n s . P r o t e o l y t i c
e n z y m e s h a v e b e e n i d e n t i f i e d i n c u l t u r e s u p e r n a t a n t s o f
F r a n k i a s t r a i n B R ( g e n o m i c s p e c i e s 9 o f t h e s t r a i n s i n f e c t i n g
m e m b e r s o f t h e C a s u a r i n a c e a e [8 7 ] ) , s o m e i n t h e f o r m o f
h i g h - m o l e c u l a r - m a s s p r o t e o s o m e s ( 2 9 , 1 6 9 ) .
Th e v a r i o u s h y d r o l y t i c e n z y m e s i n c u l t u r e s u p e r n a t a n t s
m a y p l a y s o m e r o l e s i n t h e i n f e c t i o n p r o c e s s , o r i n t h e
m a i n t e n a n c e o f F r a n k i a s t r a i n s i n s y m b i o s i s . C e l l u l o s e ,
c e l l u l o s e m i c r o f i b r i l s , x y l a n s , a n d p e c t i n s h a v e b e e n f o u n d
a s s o c i a t e d wi t h t h e p l a n t - d e r i v e d c a p s u l e s s u r r o u n d i n g
f r a n k i a e i n s e v e r a l a c t i n o r h i z a l p l a n t s ( 1 , 4 0 , 1 3 0 , 1 4 6 , 1 4 7 ,
1 8 1 ) ; t h e c a p s u l e h a s b e e n l i k e n e d t o a n i n t r a c e l l u l a r , a n d
t u b u l a r , p r i m a r y p l a n t c e l l wa l l ( 4 0 ) , a n d c a p s u l a r p o l y m e r s
h a v e b e e n p r o p o s e d t o s e r v e a s s o u r c e s o f e n e r g y i n s y m b i -
o s i s ( 4 0 , 1 3 0 , 2 5 1 ) , a l t h o u g h n o s t u d i e s h a v e b e e n d o n e o n
t h e k i n e t i c s o f d e p o s i t i o n v e r s u s d e g r a d a t i o n o f c a p s u l a r
m a t e r i a l . I n a d d i t i o n , t h e a m i n o a c i d s e qu e n c e s c l e a v e d b y
e x t r a c e l l u l a r p r o t e i n a s e s p r o d u c e d b y F r a n A k i a s t r a i n B R
r e s e m b l e e x t e n s i n s f o u n d i n p l a n t c e l l wa l l s ; o n t h e b a s i s o f
t h i s s p e c i f i c i t y , a r o l e i n t h e i n f e c t i o n p r o c e s s wa s p r o p o s e d
( 2 9 ) . Th u s , t h e h y p o t h e s i s t h a t F r a n k i a s t r a i n s d e g r a d e p l a n t
c e l l wa l l p o l y m e r s d u r i n g t h e i r t r a v e r s a l o f c e l l wa l l s a n d
d u r i n g f i x a t i o n o f N 2 i n m a t u r e i n f e c t e d c e l l s i s a t t r a c t i v e b u t
u n p r o v e n a t p r e s e n t .
N i t r o g e n M e t a b o l i s m
F r a n k i a s t r a i n s c a n u s e a v a r i e t y o f o r g a n i c a n d i n o r g a n i c
s o u r c e s o f n i t r o g e n f o r g r o wt h , i n c l u d i n g a m i n o a c i d s , u r e a ,
n i t r a t e , a m m o n i a , a n d N 2 . S u r v e y s o f s u c h c o m p o u n d s h a v e
n o t b e e n e x t e n s i v e , s o t h e v a r i a b i l i t y o f N s o u r c e u t i l i z a t i o n
a m o n g g e n o m i c s p e c i e s i s n o t c l e a r . L i k e s t u d i e s o n C
m e t a b o l i s m , m o s t i n f o r m a t i o n c o n c e r n i n g t h e p h y s i o l o g y o f
N 2 f i x a t i o n , a m m o n i a a s s i m i l a t i o n , a n d a m i n o a c i d m e t a b o -
l i s m h a s b e e n o b t a i n e d f r o m s t u d i e s o n s t r a i n s o f F . a l n i a n d
t h e C a s u a r i n a - i n f e c t i n g s t r a i n H F P C c I 3 .
N i t r o g e n a s e a n d 0 2 p r o t e c t i o n . I n a c c o r d wi t h t h e h i g h l y
c o n s e r v e d n a t u r e o f n i t r o g e n a s e a n d a s s o c i a t e d p r o t e i n s i n
p r o k a r y o t e s , F r a n A k i a n i t r o g e n a s e i s 0 2 l a b i l e , r e qu i r e s
M g A TP a n d r e d u c i n g p o we r , a n d p r o d u c e s N H 4 ' a n d H 2
g a s i n a n A TP - d e p e n d e n t f a s h i o n ( 3 2 ) . N u c l e o t i d e a n d a m i n o
a c i d s e qu e n c e a n a l y s e s o f n i f H , n i f D, a n d o t h e r n i f g e n e s
c o n f i r m t h e s i m i l a r i t y o f F r a n A c i a n i t r o g e n a s e wi t h t h e c l a s -
V O L . 5 7 , 1 9 9 3

o
n

A
p
r
i
l

2
9
,

2
0
1
4

b
y

I
O
W
A

S
T
A
T
E

U
N
I
V
E
R
S
I
T
Y
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

s i c a l M o F e - p r o t e i n - b a s e d s y s t e m s ( 1 0 3 , 1 8 4 , 1 9 0 , 2 3 9 ) . N o
a l t e r n a t i v e N 2 - f i x i n g s y s t e m s a k i n t o t h e v a n a d i u m - o r i r o n -
b a s e d n i t r o g e n a s e s h a v e y e t b e e n r e p o r t e d f r o m f r a n k i a e .
S i n c e f r a n k i a e g r o w a n d r e s p i r e s l o wl y , t h e d e l i v e r y o f
s u b s t r a t e s t o n i t r o g e n a s e a n d t h e m a i n t e n a n c e o f a l o w 0 2
l e v e l i n t h e p r o x i m i t y o f n i t r o g e n a s e a r e i m p o r t a n t p r o b l e m s
e n c o u n t e r e d b y F r a n k i a s t r a i n s .
A c h a r a c t e r i s t i c o f n e a r l y a l l F r a n k i a s t r a i n s t e s t e d , a n d i n
s t r i c t c o n t r a s t t o R h i z o b i u m s t r a i n s , i s t h e a b i l i t y o f a e r o b i -
c a l l y g r o wn c e l l s t o f i x N 2 ( 9 3 , 2 5 9 , 2 6 0 ) . A n u m b e r o f
s t u d i e s , b o t h i n s y m b i o s i s ( 1 1 6 , 1 6 0 , 2 1 6 ) a n d i n c u l t u r e ( 1 5 8 ,
1 5 9 , 1 7 4 , 1 8 3 , 2 5 3 , 2 5 4 , 2 6 0 ) , d e m o n s t r a t e t h a t n i t r o g e n a s e
a c t i v i t y i s c o r r e l a t e d wi t h t h e p r e s e n c e o f v e s i c l e s a n d t h a t
n i t r o g e n a s e i s l o c a l i z e d wi t h i n t h e v e s i c l e s . Th e s e s t u d i e s
i n v o l v e d a v a r i e t y o f a p p r o a c h e s , i n c l u d i n g d i r e c t a s s a y o f
n i t r o g e n a s e i n i s o l a t e d v e s i c l e s ( 1 8 3 , 2 5 4 ) , i m m u n o l o c a l i z a -
t i o n ( 1 1 6 , 1 5 7 , 1 5 9 , 2 1 6 ) , a n d c o r r e l a t i v e wo r k o n v e s i c l e
d e v e l o p m e n t a n d n i t r o g e n a s e i n d u c t i o n ( 1 7 4 , 2 5 3 , 2 6 0 ) .
H o we v e r , a t v e r y l o w P 0 2 ( 0 . 1 t o 0 . 3 k P a i n t h e a t m o s p h e r e ) ,
H F P C c I 3 c e l l s a r e a b l e t o e x p r e s s n i t r o g e n a s e i n t h e a b s e n c e
o f v e s i c l e s ( 1 7 6 ) . Th e wo r k o f M u r r y e t a l . ( 1 7 3 ) a n d P a r s o n s
e t a l . ( 1 9 2 ) h a s l e d t o t h e c o n c l u s i o n t h a t t h e v e s i c l e s p r o v i d e
t h e d i f f u s i o n r e s i s t a n c e t o o x y g e n t h a t i s r e qu i r e d t o m a i n t a i n
a l o w i n t e r n a l P O 2 . Th u s , u n d e r n o r m a l c o n d i t i o n s , n i t r o g e -
n a s e i s l o c a l i z e d i n v e s i c l e s , wh e r e i t i s p r o t e c t e d b y a n
o x y g e n - l i m i t i n g e x t e r n a l l i p i d e n v e l o p e . U n d e r e x t r e m e 0 2
l i m i t a t i o n i n c u l t u r e o r i n s y m b i o s i s , v e s i c l e s a r e n o t f o r m e d
a n d n i t r o g e n a s e i s f o u n d i n t h e h y p h a e .
A u n i qu e f e a t u r e o f F r a n k i a v e s i c l e s i s t h e i r a b i l i t y t o
a d a p t t o v a r i o u s a m b i e n t P O 2 . F r a n k i a c e l l s g r o wn a t P O 2
l e v e l s f r o m 2 t o 7 0 k P a a d a p t t o t h o s e l e v e l s a n d s h o w
o p t i m u m n i t r o g e n a s e a c t i v i t y a t o r n e a r t h e P 0 2 l e v e l a t
wh i c h t h e y we r e g r o wn ( 1 9 2 ) . To r r e y a n d C a l l a h a m ( 2 6 6 )
we r e t h e f i r s t t o i d e n t i f y t h e l a m i n a t e d wa l l s t r u c t u r e o f t h e
v e s i c l e a n d t o p o s t u l a t e t h a t t h i s m a y b e t h e s i t e O f 0 2
p r o t e c t i o n i n F r a n k i a c e l l s . V e s i c l e s s h o w d i s t i n c t i v e
c h a n g e s i n t h e i r b r i g h t n e s s u n d e r d a r k - f i e l d m i c r o s c o p y ,
wi t h l o w- p 0 2 v e s i c l e s a p p e a r i n g v e r y t h i n a n d t h o s e g r o wi n g
u n d e r h i g h P O 2 a p p e a r i n g t h i c k wa l l e d a n d b r i g h t ( 1 0 6 , 1 9 2 ) .
Th e s e m i c r o s c o p i c o b s e r v a t i o n s c o r r e l a t e we l l wi t h t h e
n u m b e r o f l i p i d l a y e r s i n t h e v e s i c l e e n v e l o p e , v a r y i n g f r o m
1 7 a t 4 k P a o f 0 2 t o a n a v e r a g e o f 4 0 a t 4 0 k P a o f 0 2 ( 1 9 2 ) .
Th e r e s e e m s l i t t l e d o u b t t h a t t h e p h y s i o l o g y o f o x y g e n
p r o t e c t i o n i n F r a n k i a c e l l s i s d e t e r m i n e d p a r t l y b y e n v e l o p e
t h i c k n e s s , a n d i t h a s b e e n c o n f i r m e d i n s t e a d y - s t a t e g r o wt h
s t u d i e s t h a t t h e v e s i c l e e n v e l o p e t h i c k n e s s i s m a i n t a i n e d b y ,
a n d i s v e r y r e s p o n s i v e t o , a m b i e n t P 0 2 ( 1 0 6 ) .
Th e a b u n d a n c e o f h o p a n o i d s i n t h e F r a n k i a v e s i c l e e n v e -
l o p e s ( s e e a b o v e ) a n d t h e i r r o l e i n m e m b r a n e s t a b i l i z a t i o n
p r o v i d e f o r c e f u l a r g u m e n t s f o r t h e i r i n v o l v e m e n t i n l i m i t i n g
0 2 d i f f u s i o n t o t h e v e s i c l e i n t e r i o r , i n a m a n n e r s i m i l a r t o t h a t
p r o p o s e d f o r g l y c o l i p i d s i n c y a n o b a c t e r i a l h e t e r o c y s t e n v e -
l o p e s ( 1 0 7 ) . Th u s , a c o m b i n a t i o n o f r e s p i r a t i o n f o r i n t e r n a l
r e m o v a l o f 0 2 c o u p l e d wi t h a d i f f u s i o n b a r r i e r a c r o s s t h e
v e s i c l e e n v e l o p e m a y b e s u f f i c i e n t t o p r o v i d e a n a n a e r o b i c
e n v i r o n m e n t f o r n i t r o g e n a s e t o f u n c t i o n .
I t i s i m p o r t a n t t o n o t e t h a t t h i c k e n i n g o f t h e v e s i c l e
e n v e l o p e b y l a y i n g d o wn e x t r a l i p i d l a y e r s i s a d e v e l o p m e n -
t a l p r o c e s s t h a t i s s p e c i f i c a l l y u n d e r o x y g e n c o n t r o l a n d i s
e s s e n t i a l t o n i t r o g e n a s e f u n c t i o n i n g . Th e i n d u c t i o n o f v e s i -
c l e s i s i n d e p e n d e n t o f a m b i e n t P O 2 , a b o v e a c e r t a i n l e v e l ,
b u t t h e i n d u c t i o n o f n i t r o g e n a s e a c t i v i t y wi t h i n v e s i c l e s i s
e n t i r e l y c o i n c i d e n t wi t h t h e e n v e l o p e t h i c k e n i n g ( 1 0 6 ) . Th u s ,
H F P C c I 3 v e s i c l e s i n d u c e d u n d e r 5 k P a o f 0 2 s h o we d n i t r o -
g e n a s e a c t i v i t y 9 1 h a f t e r i n d u c t i o n , wh e r e a s t h o s e g r o wn a t
4 0 k P a o f 0 2 d i d n o t d i s p l a y n i t r o g e n a s e u n t i l 1 7 0 h a f t e r
i n d u c t i o n ( 1 0 6 ) .
A m m o n i a a s s i m i l a t i o n a n d a m i n o a c i d m e t a b o l i s m . A m m o -
n i a i s a s s i m i l a t e d b y f r e e - l i v i n g F . a l n i H F P C p I 1 v i a t h e
g l u t a m i n e s y n t h e t a s e - g l u t a m a t e s y n t h a s e ( G S - G O G A T)
p a t h wa y , l e a d i n g t o t h e p r o d u c t i o n o f g l u t a m a t e a n d g l u -
t a m i n e ( 3 8 ) . A l a n i n e d e h y d r o g e n a s e a n d g l u t a m a t e d e h y d r o -
g e n a s e h a v e b e e n d e t e c t e d b u t a r e p r o b a b l y n o t i n v o l v e d i n
p r i m a r y a m m o n i a a s s i m i l a t i o n s i n c e t h e i r l e v e l s r e m a i n l o w
a n d u n r e s p o n s i v e t o c h a n g e s i n a m m o n i a l e v e l s ( 2 2 0 ) . Th i s
c o n c l u s i o n i s s u p p o r t e d b y s t u d i e s i n v o l v i n g [' 3 N ] a m m o n i a
l a b e l i n g o f n i t r o g e n - s t a r v e d H F P A r I 3 c e l l s . L a b e l a c c u m u -
l a t e d p r i m a r i l y i n g l u t a m i n e , wi t h m u c h l o we r l a b e l i n g o f
g l u t a m a t e , a l a n i n e , a n d s e r i n e ( 5 0 ) .
W h e n t h e c e l l s a r e g r o wi n g o n h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f
a m m o n i a ( > 0 . 5 m M ) , a m m o n i a a p p a r e n t l y e n t e r s t h e c e l l s
v i a p a s s i v e d i f f u s i o n o f t h e u n p r o t o n a t e d f o r m ( 1 5 6 ) . A t l o w
c o n c e n t r a t i o n s o f a m m o n i a , o r i n c o m b i n e d - n i t r o g e n - f r e e
m e d i a , a s p e c i f i c a m m o n i u m p e r m e a s e i s i n d u c e d , a l l o wi n g
H F P C p I 1 t o s c a v e n g e a m m o n i u m d o wn t o u n d e t e c t a b l e
l e v e l s b y a n a c t i v e - t r a n s p o r t m e c h a n i s m ( 1 5 6 ) . O n e n t r y i n t o
n i t r o g e n - s t a r v e d c e l l s , a m m o n i a ( o r i t s t r a n s p o r t a n a l o g
m e t h y l a m m o n i u m ) i s r a p i d l y a s s i m i l a t e d b y G S t o g l u t a m i n e
( o r y - N - m e t h y l g l u t a m i n e ) ( 1 5 6 ) . G i v e n t h e h i g h a f f i n i t y o f t h e
t r a n s p o r t s y s t e m a n d t h e a b i l i t y o f G S t o r a p i d l y a s s i m i l a t e
a m m o n i a i n f r e e - l i v i n g F r a n k i a c e l l s , a s u b s t a n t i a l m o d i f i c a -
t i o n o f t h e s e s y s t e m s m u s t o c c u r d u r i n g t h e t r a n s i t i o n t o t h e
s y m b i o t i c s t a t e i n wh i c h a m m o n i a i s t h o u g h t t o b e r e l e a s e d
b y t h e v e s i c l e s .
S t u d i e s o f t h e r e g u l a t i o n o f G S i n F r a n k i a s t r a i n s a r e
c o m p l i c a t e d b y t h e p r e s e n c e o f a t l e a s t t wo G S s , d e s i g n a t e d
G S I a n d G S I I . Th e f o r m e r i s b i o c h e m i c a l l y a n d g e n e t i c a l l y
s i m i l a r t o c l a s s i c a l p r o k a r y o t i c G S s ; i t i s a d o d e c a m e r o f
i d e n t i c a l s u b u n i t s , r e g u l a t e d b y a d e n y l y l a t i o n - d e a d e n y l y l a -
t i o n a n d i s p r o d u c e d a t r e l a t i v e l y c o n s t a n t l e v e l s i n a l l
g r o wt h m e d i a t e s t e d ( 8 4 , 2 6 9 , 2 9 2 ) . Th e l a t t e r i s a n o c t a m e r
o f i d e n t i c a l s u b u n i t s , i s n o t a d e n y l y l a t e d , a n d i s s i m i l a r i n
s t r u c t u r e a n d a m i n o a c i d s e qu e n c e t o e u k a r y o t i c G S s ( 2 0 9 ) ;
i t i s p r o d u c e d i n r e s p o n s e t o g r o wt h o n N 2 , g l u t a m a t e , o r
a m i n o a c i d s t h a t a r e d e g r a d e d t o g l u t a m a t e , s u c h a s h i s t i -
d i n e , a s p a r t a t e , a n d p r o l i n e ( 2 6 9 , 2 9 2 ) . E s s e n t i a l l y t h e s a m e
c o n d i t i o n s t h a t l e a d t o a n i n d u c t i o n o f v e s i c l e s a n d n i t r o g e -
n a s e a r e s u f f i c i e n t f o r G S I I i n d u c t i o n . N i t r o g e n s o u r c e s
c a t a b o l i z e d a s a m m o n i a o r g l u t a m i n e , s u c h a s g l u t a m i n e , d o
n o t l e a d t o G S I I s y n t h e s i s o r t o v e s i c l e d i f f e r e n t i a t i o n . Th e
b e h a v i o r o f G S I , G S I I , a n d n i t r o g e n a s e i n f r e e - l i v i n g
F r a n k i a c e l l s r e s e m b l e s t h e b e h a v i o r o f a n a l o g o u s n i t r o g e n -
r e g u l a t e d s y s t e m s i n e n t e r i c b a c t e r i a a n d r h i z o b i a a n d a r g u e s
f o r t h e p r e s e n c e o f s i m i l a r r e g u l a t o r y m e c h a n i s m s i n F r a n k i a
c e l l s .
I n c u l t u r e , G S I I i s f o u n d i n b o t h v e s i c l e s a n d h y p h a e ( 2 2 0 ,
2 6 9 , 2 9 2 ) . Th e r e l a t i o n s h i p o f t h e d u a l - G S s y s t e m t o N 2
f i x a t i o n a n d s y m b i o s i s i s p r o b a b l y n o t d i r e c t , s i n c e o t h e r
a c t i n o m y c e t e s ( 2 7 , 1 2 3 ) a n d m e m b e r s o f t h e f a m i l y R h i z o b i -
a c e a e ( 7 1 ) h a v e p h y s i o l o g i c a l l y a n d g e n e t i c a l l y s i m i l a r m u l -
t i p l e G S s .
B e y o n d t h e i n i t i a l s t e p s o f a m m o n i a a s s i m i l a t i o n , f e w
p u b l i s h e d p a p e r s h a v e a d d r e s s e d a m i n o a c i d m e t a b o l i s m i n
F r a n k i a s t r a i n s . I n a n e a r l y s t u d y o f F . a l n i A v c I l , G S a n d
g l u t a m a t e o x a l o a c e t a t e t r a n s a m i n a s e ( G O T) we r e d e t e c t e d
b u t G O G A T, g l u t a m a t e d e h y d r o g e n a s e , a l a n i n e d e h y d r o g e -
n a s e , a s p a r t a t e d e h y d r o g e n a s e , t y r o s i n e , l e u c i n e a n d a l a n i n e
a m i n o t r a n s f e r a s e s , a s p a r t a s e , a c e t y l o r n i t h i n e g l u t a m a t e
t r a n s a c e t y l a s e , a n d L - a m i n o a c i d o x i d a s e we r e n o t d e t e c t e d
( 8 ) . F . a l n i H F P C p I l h a s G O G A T, a l a n i n e d e h y d r o g e n a s e ,
a n d g l u t a m a t e d e h y d r o g e n a s e a c t i v i t i e s a s we l l a s G S a n d

o
n

A
p
r
i
l

2
9
,

2
0
1
4

b
y

I
O
W
A

S
T
A
T
E

U
N
I
V
E
R
S
I
T
Y
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

G O T
( 2 2 0 ) .
I n
y o u n g
c u l t u r e s o f
H F P C p I 1 t r a n s f e r r e d t o
f r e s h m e d i u m
c o n t a i n i n g [1 4 C ] a s p a r t a t e , l a b e l wa s r a p i d l y
a c c u m u l a t e d i n
g l u t a m a t e
f o l l o we d
b y g l u t a m i n e / a s p a r a g i n e
( 2 9 2 ) .
I n o l d e r
c u l t u r e s ,
l a b e l a c c u m u l a t e d
m a i n l y i n a s p a r -
t a t e a n d m o r e
s l o wl y
a s
g l u t a m a t e . Th u s , a s p a r t a t e
i s m o s t
p r o b a b l y
c a t a b o l i z e d
b y
G O T t o
o x a l o a c e t a t e , wh i c h e n t e r s
t h e
t r i c a r b o x y l i c
a c i d
c y c l e ,
t o
a - k e t o g l u t a r a t e a n d t h e n t o
g l u t a m a t e
v i a G O G A T. Th e
r a p i d f i l l i n g
o f
g l u t a m a t e p o o l s
a p p e a r s
t o b e a
p r i o r i t y
f o r
n e wl y
t r a n s f e r r e d
c e l l s ;
t h i s i s n o t
s u r p r i s i n g g i v e n
t h e c e n t r a l r o l e o f
g l u t a m a t e
i n a m i n o a c i d
m e t a b o l i s m i n
b a c t e r i a , i n c l u d i n g
F r a n k i a s t r a i n s
( 5 0 ) . A s -
p a r t a s e ,
wh i c h wo u l d c o n v e r t
a s p a r t a t e
t o a m m o n i a a n d
f u m a r a t e a n d
p r e s u m a b l y
wo u l d
r e p r e s s
v e s i c l e
f o r m a t i o n ,
wa s n o t d e t e c t e d i n
H F P C p I 1 ( 2 9 2 ) . I n t e r e s t i n g l y , c e l l s
g r o wi n g
o n 1 0 m M
a s p a r t a t e
f o r m e d v e s i c l e s a n d h a d a b o u t
t h r e e f o l d
h i g h e r n i t r o g e n a s e a c t i v i t y
t h a n d i d c e l l s
g r o wi n g
o n
N 2
o r o n 1 m M
a s p a r t a t e .
Th i s s t i m u l a t i o n
m a y b e
s i g n i f i c a n t
i n
s y m b i o s i s , d u r i n g
wh i c h F r a n k i a c e l l s a r e
e x p o s e d
t o a m i n o a c i d
p o o l s
o f t h e
p l a n t . A s p a r t a t e h a s
r e c e n t l y
b e e n
s u g g e s t e d
t o b e a n e s s e n t i a l s u b s t r a t e f o r
r h i z o b i a l
b a c t e r o i d s ,
s i n c e
a s p a r t a t e a m i n o t r a n s f e r a s e m u -
t a n t s f a i l t o f o r m a n e f f e c t i v e
s y m b i o s i s ( 2 0 5 ) .
V e s i c l e s i s o l a t e d f r o m
N 2 - g r o wn
c u l t u r e s o f
H F P C p I 1
c o n t a i n ,
i n a d d i t i o n t o
n i t r o g e n a s e ,
b o t h f o r m s o f
g l u t a m i n e
s y n t h e t a s e ( G S I
a n d
G S I I )
a n d G O T b u t n o t G O G A T
( 2 1 8 ,
2 1 9 , 2 9 2 ) .
Th e
p r e s e n c e
o f G S
a c t i v i t y
a n d t h e a b s e n c e o f
G O G A T
a c t i v i t y s u g g e s t
t h a t v e s i c l e s
m a y
b e
c a p a b l e
o f
f o r m i n g g l u t a m i n e
f r o m a m m o n i a a n d
g l u t a m a t e
b u t
m a y n o t
b e
c a p a b l e
o f
c o n v e r t i n g g l u t a m i n e
t o
g l u t a m a t e .
I f t h i s i s
c o r r e c t ,
F r a n k i a v e s i c l e s
m a y
b e
p h y s i o l o g i c a l l y a n a l o g o u s
t o
c y a n o b a c t e r i a l h e t e r o c y s t s ,
wh i c h f i x
N 2
a n d
t r a n s p o r t
g l u t a m i n e
t o
a d j a c e n t v e g e t a t i v e
c e l l s
( 1 0 7 ) . A l s o ,
t h i s m o d e l
i m p l i e s
t h a t G S
s y n t h e s e s
i n v e s i c l e s a n d
h y p h a e
a r e
r e g u -
l a t e d
d i f f e r e n t l y ,
s u c h t h a t G S I I
s y n t h e s i s
wo u l d c o n t i n u e i n
t h e
p r e s e n c e
o f
g l u t a m i n e
i n t h e v e s i c l e s .
H y d r o g e n a s e .
I t h a s b e e n k n o wn f o r
m a n y y e a r s
t h a t
a c t i n o r h i z a l
n o d u l e s ,
wi t h a f e w
e x c e p t i o n s ( 2 1 2 , 2 2 5 ) ,
e m i t
l i t t l e
n i t r o g e n a s e - g e n e r a t e d H 2 g a s ( 1 6 7 , 2 1 7 ) .
Th i s o b s e r v a -
t i o n c o n t r a s t s wi t h t h e
h i g h l y
v a r i a b l e
p r o d u c t i o n
o f
H 2 b y
r h i z o b i u m - i n d u c e d r o o t n o d u l e s o n
l e g u m e s ( 2 1 7 ) . U p t a k e
h y d r o g e n a s e s
h a v e b e e n d e m o n s t r a t e d i n
s y m b i o t i c
F r a n k i a
c e l l s
( 3 3 , 1 6 3 , 2 1 2 ) ,
a n d i n
f r e e - l i v i n g
F . a l n i s t r a i n s
( 1 4 5 ,
1 7 5 ) .
I n b o t h
c a s e s ,
e l e c t r o n s f r o m
h y d r o g e n
o x i d a t i o n a r e
e v e n t u a l l y
d o n a t e d t o
0 2 ( 3 3 , 1 7 5 ) . Th u s ,
t h e
p o s s i b i l i t y
e x i s t s t h a t
h y d r o g e n a s e
c a n
h e l p p r o t e c t n i t r o g e n a s e
f r o m
0 2
i n a c t i v a t i o n
t h r o u g h
t h e
o x y h y d r o g e n
r e a c t i o n a n d c a n
h e l p
r e g e n e r a t e
A TP
b y r e c y c l i n g
e l e c t r o n s
t h r o u g h
e l e c t r o n
t r a n s p o r t
r e a c t i o n s . E v i d e n c e f o r t h e s e r o l e s h a s b e e n
p r o -
v i d e d
b y
s t u d i e s
i n v o l v i n g
t h e i n c u b a t i o n o f
N 2 - f i x i n g
c u l -
t u r e s i n t h e
p r e s e n c e
o f
u n u s u a l l y h i g h
l e v e l s o f
0 2 p l u s H 2
( 1 7 5 ) .
U n d e r t h e s e
c o n d i t i o n s ,
e n h a n c e d
n i t r o g e n a s e a c t i v i t y
wa s
d e t e c t e d , s u g g e s t i n g
t h a t t h e
p r e s e n c e
o f a
s y s t e m
a m e l i o r a t e d t h e d e s t r u c t i v e e f f e c t s o f
2
o r
r e c y c l e d
e l e c t r o n s t o
p r o v i d e
a d d i t i o n a l
e n e r g y . I m m u n o g o l d
l o c a l -
i z a t i o n s t u d i e s
s u g g e s t
t h a t
i s
p r e s e n t
i n v e s i -
c l e s
a n d
h y p h a e
o f
N 2 - g r o wn
c e l l s a n d i n t h e
h y p h a e
o f
a m m o n i a - g r o wn c e l l s ,
wh e n c u l t u r e s a r e i n c u b a t e d i n a n
H 2 - c o n t a i n i n g a t m o s p h e r e
f o r 1 6 h
p r i o r
t o h a r v e s t
( 1 4 5 ) .
I n
t h e
o n l y s y m b i o t i c s y s t e m s t u d i e d ,
A l n u s
i n c a n a ,
i m m u -
n o g o l d l a b e l i n g
i d e n t i f i e d
i n b o t h
h y p h a e
a n d
v e s i c l e s , a l t h o u g h
n o
h y d r o g e n a s e a c t i v i t y
c o u l d b e d e t e c t e d
( 2 2 6 ) .
A n
i n t e r e s t i n g qu e s t i o n
i s wh e t h e r
i s
p r e s e n t
i n v e s i c l e s o r
h y p h a e
t h a t we r e n o t
e x p o s e d
t o
H 2
b e f o r e h a r v e s t . I f
i s i n d e e d i n d u c i b l e i n a m m o -
n i a - g r o wn c e l l s , F r a n k i a s t r a i n s ,
l i k e s o m e r h i z o b i a
( 1 0 2 ) ,
m a y
b e a b l e t o
g r o w a u t o t r o p h i c a l l y .
M E TA B O L I S M I N S YM B I O S I S
C a r b o n M e t a b o l i s m
I n s y m b i o s i s , v e s i c l e c l u s t e r s u s p e n s i o n s f r o m A l n u s
s p e c i e s r e s p i r e wh e n p r o v i d e d wi t h N A DH ( 7 ) , s u c c i n a t e
( 8 ) , p h o s p h o r y l a t e d h e x o s e s p l u s p y r i d i n e n u c l e o t i d e s i n
v a r i o u s c o m b i n a t i o n s ( 2 8 4 ) , t r e h a l o s e a n d o t h e r s u g a r s ( 1 5 2 ) ,
o r a c o m b i n a t i o n o f m a l a t e , g l u t a m a t e , a n d N A D+ ( 6 , 1 1 8 ) .
A m a l a t e - a s p a r t a t e s h u t t l e wa s p r o p o s e d a s a p o s s i b l e e x -
p l a n a t i o n f o r t h e o b s e r v e d r e s p i r a t i o n o n m a l a t e , g l u t a m a t e ,
a n d N A D+ , s i n c e m a l a t e d e h y d r o g e n a s e a n d g l u t a m a t e -
o x a l o a c e t a t e a m i n o t r a n s f e r a s e we r e a l s o d e t e c t e d i n v e s i c l e
c l u s t e r s . P r o v i d i n g e v i d e n c e f o r t h e e x i s t e n c e o f s u c h a
s y s t e m i s p r o b l e m a t i c a l wh e n u s i n g s y m b i o t i c F r a n k i a
s t r a i n s , s i n c e v e s i c l e c l u s t e r s a p p e a r t o b e p e r m e a b l e t o
m a n y l o w- m o l e c u l a r - we i g h t m o l e c u l e s i n c l u d i n g p h o s p h o r y -
l a t e d h e x o s e s , N A D+ , a n d A TP ( 2 8 4 ) . Th i s p e r m e a b i l i t y
m a y r e f l e c t i n t r i n s i c m e m b r a n e i n s t a b i l i t y i n s y m b i o t i c
F r a n k i a s t r a i n s o r a d i f f e r e n c e b e t we e n s y m b i o t i c h y p h a l
a n d v e s i c l e c e l l t y p e s , o r i t m a y b e a c o n s e qu e n c e o f t h e
p h y s i c a l d i s r u p t i o n o f n o d u l e t i s s u e . I n a d d i t i o n , t h e p r e s -
e n c e o f p l a n t o r g a n e l l e s e m b e d d e d i n v e s i c l e c l u s t e r s p r e -
s e n t s a p r o b l e m f o r r e s p i r a t i o n s t u d i e s s i n c e p l a n t m i t o c h o n -
d r i a a n d m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s c a n p a r t i c i p a t e i n 0 2
u p t a k e r e a c t i o n s wi t h s o m e o f t h e s u b s t r a t e s p r o v i d e d ( 8 ) .
Th u s , d e s p i t e i m p r o v e m e n t s i n m e t h o d s o f v e s i c l e c l u s t e r
i s o l a t i o n ( 2 8 5 ) , p h y s i o l o g i c a l s t u d i e s o n v e s i c l e c l u s t e r s a r e
s t i l l s u b j e c t t o d i f f i c u l t i e s e n c o u n t e r e d i n p r e p a r i n g m a t e r i a l .
A t p r e s e n t , t h e c a r b o n s u b s t r a t e s d o n a t e d b y t h e p l a n t t o t h e
m i c r o o r g a n i s m r e m a i n u n k n o wn . S t u d i e s wi t h we l l - d e f i n e d
m u t a n t s wo u l d g r e a t l y a c c e l e r a t e p r o g r e s s i n t h i s a r e a .
To d a t e , v e s i c l e c l u s t e r s t h a t a r e c a p a b l e o f f i x i n g N 2 o n
t h e i r o wn o r wh e n s u p p l i e d wi t h a n o x i d i z a b l e c a r b o n s o u r c e
h a v e n o t b e e n o b t a i n e d , a l t h o u g h n i t r o g e n a s e c a n b e a s s a y e d
d i r e c t l y i n a n a e r o b i c a l l y p r e p a r e d v e s i c l e c l u s t e r s b y u s i n g
s o d i u m d i t h i o n i t e a s a r e d u c t a n t a n d a d d e d M g 2 ' a n d A TP
( 3 5 , 2 8 3 ) . S i n c e n i t r o g e n a s e r e m a i n s i n t a c t , t h e a b i l i t y o f
i s o l a t e d v e s i c l e c l u s t e r s t o g e n e r a t e r e d u c i n g p o we r a n d A TP
m u s t b e g r e a t l y d i m i n i s h e d f r o m t h e s y m b i o t i c s t a t e a n d m a y
r e f l e c t a g e n e r a l d i s r u p t i o n o f i o n g r a d i e n t s a n d o t h e r c e l l u l a r
c o m p o n e n t s .
A s i n f r e e - l i v i n g c u l t u r e s , n i t r o g e n a s e a p p e a r s t o b e l i m -
i t e d t o v e s i c l e s i n s y m b i o s i s , a s j u d g e d i n i t i a l l y f r o m s t u d i e s
o n A l n u s n o d u l e s , i n wh i c h t h e o n s e t o f n i t r o g e n a s e a c t i v i t y
c o r r e l a t e s wi t h v e s i c l e a p p e a r a n c e ( 1 6 0 ) a n d t h e l o s s o f
n i t r o g e n a s e a c t i v i t y i n wi n t e r c o i n c i d e s wi t h n o d u l e a n d
v e s i c l e d e g e n e r a t i o n ( 2 8 8 ) . M o r e d i r e c t e v i d e n c e b y wa y o f
i m m u n o l o c a l i z a t i o n s t u d i e s o n A l n u s a n d E l a e a g n u s n o d u l e s
( 1 1 6 , 2 1 6 ) c o n f i r m t h a t t h e v e s i c l e i s t h e m a i n s i t e o f
n i t r o g e n a s e p r o t e i n s . I n a c t i n o r h i z a l p l a n t s i n wh i c h t h e
v e s i c l e i s c l u b s h a p e d a n d v e s i c l e e n v e l o p e s a r e l e s s d e v e l -
o p e d , a s i n M y r i c a o r C o m p t o n i a s p e c i e s , o r t h o s e i n wh i c h
o b v i o u s v e s i c l e s a r e a b s e n t , a s i n n o d u l e s o f C a s u a r i n a a n d
A l l o c a s u a r i n a s p e c i e s , o r i n C o r i a r i a n o d u l e s , i n wh i c h
f i l a m e n t o u s s y m b i o t i c v e s i c l e s a r e e v i d e n t , t h e l o c a t i o n o f
n i t r o g e n a s e i s o n l y s p e c u l a t i v e a t p r e s e n t .
A m m o n i a - a s s i m i l a t o r y e n z y m e s o f F r a n k i a c e l l s i n s y m -
b i o s i s a p p e a r t o b e r e g u l a t e d d i f f e r e n t l y f r o m t h o s e i n
f r e e - l i v i n g c e l l s . S t u d i e s wi t h p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s r a i s e d
a g a i n s t R h o d o s p i r i l l u m r u b r u m G S I a n d R h i z o b i u m m e l i l o t i
G S I I i n d i c a t e t h a t t h e a n a l o g o u s F r a n k i a G S s i n s y m b i o t i c
H F P C p I 1 a r e a b s e n t o r a r e p r e s e n t i n v e r y l o w a b u n d a n c e
( 1 5 4 ) a n d s u p p o r t p r e v i o u s r e p o r t s o f l o w G S a c t i v i t y o f
V O L . 5 7 , 1 9 9 3

o
n

A
p
r
i
l

2
9
,

2
0
1
4

b
y

I
O
W
A

S
T
A
T
E

U
N
I
V
E
R
S
I
T
Y
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

v e s i c l e c l u s t e r s i n s y m b i o s i s ( 5 4 ) . Th e p r o b a b l e r e s u l t o f l o w
l e v e l s o f G S i s t h a t f i x e d n i t r o g e n , i n t h e f o r m o f
N H 4 + ,
r e m a i n s u n a s s i m i l a t e d i n t h e b a c t e r i u m a n d i s r e n d e r e d
a v a i l a b l e t o t h e p l a n t e i t h e r t h r o u g h s i m p l e d i f f u s i o n o f N H 3
o r b y a n o t h e r u n i d e n t i f i e d m e c h a n i s m . Th e s y m b i o t i c a b -
s e n c e , o r l o we r i n g , o f G S a c t i v i t y i s a t h e m e r e p e a t e d i n
c e r t a i n c y a n o b a c t e r i a l ( 4 3 , 1 2 0 , 1 4 4 ) a n d r h i z o b i a l ( 2 2 8 )
s y m b i o s e s , s o t h a t t h e F r a n k i a s y m b i o s i s i s n o t u n u s u a l i n
t h i s r e s p e c t , a l t h o u g h t h e c o n v e r g e n c e o f p h y s i o l o g i c a l
s t r a t e g i e s i n N 2 - f i x i n g s y m b i o s e s i s r e m a r k a b l e .
O x y g e n P r o t e c t i o n
E v i d e n c e f r o m s t r u c t u r a l a n d p h y s i o l o g i c a l s t u d i e s i n d i -
c a t e s t h a t a v a r i e t y o f m e c h a n i s m s f o r l i m i t i n g 0 2 d i f f u s i o n t o
n i t r o g e n a s e e x i s t i n s y m b i o s i s . I t i s i n f o r m a t i v e t o c o m p a r e
t h e s t r u c t u r e o f l e g u m e n o d u l e s wi t h t h a t o f a c t i n o r h i z a s .
W h e r e a s t h e l e g u m e n o d u l e h a s a c o n s i s t e n t s t r u c t u r e i n
wh i c h t h e i n f e c t e d z o n e l i e s wi t h i n a d i f f u s i o n - r e s i s t a n t
b a r r i e r , s e v e r a l s t r u c t u r a l m o t i f s a r e e v i d e n t i n a c t i n o r h i z a l
n o d u l e s ( 2 3 3 , 2 6 3 ) . M o s t n o d u l e s h a v e l a r g e n u m b e r s o f a i r
s p a c e s , a n d t h e s t e l e i s p r e s e n t i n s i d e t h e i n f e c t e d z o n e ,
s u g g e s t i n g t h a t t h e r e i s o n l y l i m i t e d r e s i s t a n c e t o g a s d i f f u -
s i o n t o t h e o u t e r s u r f a c e o f i n f e c t e d c e l l s . M i c r o e l e c t r o d e
s t u d i e s ( 2 5 5 ) a n d s e v e r a l s t u d i e s i n v o l v i n g I n d i a i n k p e n e t r a -
t i o n o f g a s - e v a c u a t e d a c t i n o r h i z a l n o d u l e s ( 2 3 2 , 2 5 5 , 2 6 2 ) a l l
i n d i c a t e t h a t a i r c a n p e n e t r a t e r e a d i l y t o t h e s u r f a c e s o f
i n f e c t e d c e l l s o r a t l e a s t t o t h e o u t e r s i d e s o f c l u m p s o f
i n f e c t e d c e l l s i n C a s u a r i n a s p e c i e s ( 2 9 1 ) .
Two o t h e r e l e m e n t s i n t h e o x y g e n p r o t e c t i o n n e t wo r k o f
n o d u l e s , v e s i c l e s a n d h e m o g l o b i n , a l s o s h o w g r e a t v a r i a t i o n
i n a c t i n o r h i z a l n o d u l e s , b u t t h e y v a r y i n c o n s i s t e n t l y . A t o n e
e n d o f t h e s p e c t r u m o f v a r i a t i o n , C a s u a n i n a a n d M y n i c a
n o d u l e s d o n o t c o n t a i n s p h e r i c a l v e s i c l e s b u t d o c o n t a i n
h e m o g l o b i n ( 2 3 3 , 2 5 6 , 2 5 7 ) , a n d t h i s i s c o n s i s t e n t wi t h a l o w
m e a s u r e d P 0 2 wi t h i n t h e i n f e c t e d - c e l l a r e a s , wh e r e o n e m a y
e x p e c t t o f i n d h e m o g l o b i n t o a c t a s a n o x y g e n t r a n s p o r t e r
( 2 5 5 ) . A t t h e o t h e r e n d o f t h e s p e c t r u m , A l n u s n o d u l e s h a v e
v e r y we l l - f o r m e d v e s i c l e s a n d a m u c h l o we r l e v e l o f C O -
r e a c t i v e h e m e c o m p o u n d s ( 2 5 6 ) . A l t h o u g h t h e r e i s s o m e
e v i d e n c e t h a t v e s i c l e s i n A l n u s s p e c i e s m a y p l a y a c e n t r a l
r o l e i n o x y g e n p r o t e c t i o n ( 2 3 4 ) , t h e e v i d e n c e f r o m e l e c t r o n -
m i c r o s c o p i c wo r k o n t h e v e s i c l e e n v e l o p e s h o ws o n l y m a r -
g i n a l c h a n g e s i n t h e n u m b e r o f l i p i d l a y e r s i n A l n u s n o d u l e s
g r o wn a t d i f f e r e n t P 0 2 ( 1 ) . Th e p i c t u r e i s c o n f u s e d s o m e wh a t
b y C o r i a n a n o d u l e s , wh i c h h a v e v e r y i l l - d e f i n e d v e s i c l e s ,
l a c k h e m o g l o b i n , a r e v e r y we l l a e r a t e d , b u t s h o w m u c h o f
t h e p h y s i o l o g y o f l e g u m e n o d u l e s ( 2 3 2 ) .
Th e r e i s a s t r o n g t e m p t a t i o n t o s e a r c h f o r a s i n g l e u n i f y i n g
m e c h a n i s m o f 0 2 p r o t e c t i o n i n t h e a c t i n o r h i z a l n o d u l e s .
H o we v e r , t h e e n o r m o u s d i v e r s i t y o f h o s t p l a n t s a n d o f
F r a n k i a s t r u c t u r e wi t h i n n o d u l e s h a s r e s u l t e d i n a v e r y
v a r i a b l e p h y s i o l o g y . Th e r e i s e v i d e n c e t h a t t h e v e s i c l e ( 2 3 4 ) ,
t h e h o s t c y t o p l a s m ( 2 9 1 ) , m o d i f i e d c e l l wa l l s o f i n f e c t e d c e l l s
( 3 9 , 4 2 ) , a n d s o m e c o m p o n e n t s o f t h e n o d u l e ( 2 5 8 ) m a y a c t
s i n g l y o r i n c o n c e r t i n p r o v i d i n g t h e d e l i c a t e o x y g e n b a l a n c e
r e qu i r e d i n a c t i n o r h i z a l n o d u l e s .
A c t i n o r h i z a l n o d u l e s g e n e r a l l y s h o w a n o p t i m u m n i t r o g e -
n a s e a c t i v i t y a t a r o u n d 2 0 k P a o f 0 2 , wi t h s i g n i f i c a n t
i n h i b i t i o n a b o v e 2 5 k P a o f 0 2 ( 2 1 4 , 2 3 4 , 2 3 5 , 2 5 8 , 2 8 9 ) . I n
m o s t c a s e s s t u d i e d , t h e r e i s n o a p p a r e n t a d a p t a t i o n t o P O 2
l e v e l s a b o v e a m b i e n t . Th e e x c e p t i o n s a r e C o r i a n a a r b o r e a
n o d u l e s , wh i c h h a v e m a n y o f t h e r e s p o n s e s d i s p l a y e d b y
l e g u m e n o d u l e s ( 2 3 2 ) . N i t r o g e n a s e a c t i v i t y a p p e a r s t o a d a p t
a t 0 2 c o n c e n t r a t i o n s a b o v e a m b i e n t l e v e l s , a n d n o d u l e s
g r o wn a t 5 k P a o f 0 2 h a v e r a t e s o f n i t r o g e n a s e a c t i v i t y
s i m i l a r t o r a t e s a t 3 0 k P a o f 0 2 ( 2 3 2 ) . I t t h u s a p p e a r s t h a t
s o m e a c t i n o r h i z a l n o d u l e s c a n c h a n g e t h e r e s i s t a n c e o f s o m e
c o m p o n e n t o f t h e d i f f u s i o n b a r r i e r t o a c c o m m o d a t e a wi d e
r a n g e o f
P 0 2 -
A c t i n o r h i z a l n o d u l e s s h o w a v e r y r a p i d s wi t c h - o f f a n d
r e c o v e r y o f n i t r o g e n a s e a c t i v i t y i n r e s p o n s e t o s m a l l i n c r e -
m e n t s i n 0 2 i n t h e g a s s t r e a m ( 2 1 4 , 2 3 2 , 2 3 4 , 2 3 5 ) , wh i c h
h a v e b e e n c a l l e d o x y g e n t r a n s i e n t s ( 2 3 6 ) . Th e e f f e c t i s a l s o
s e e n i n f r e e - l i v i n g F r a n k i a c e l l s a n d i s t h e r e f o r e n o t a n o d u l e
e f f e c t ( 2 3 6 ) . A n i n t e r p r e t a t i o n o f t h i s e f f e c t i s t h a t a r a p i d
c h a n g e i n P 0 2 wi t h i n t h e n o d u l e , o r i n F r a n k i a v e s i c l e s i n
c u l t u r e , r e s u l t s i n a n i n s t a n t a n e o u s s wi t c h - o f f o f n i t r o g e n a s e
( c o n f o r m a t i o n a l p r o t e c t i o n ) . Th e o x y g e n i s t h e n r e m o v e d b y
r e s p i r a t i o n , wh i c h a l l o ws t h e n o d u l e o r v e s i c l e t o r e t u r n t o
n o r m a l a c t i v i t y . A l t e r n a t i v e l y , t h e o x y g e n t r a n s i e n t m a y
r e f l e c t a t e m p o r a r y s h i f t o f e l e c t r o n a l l o c a t i o n f r o m n i t r o g e -
n a s e t o 0 2 a s t h e e l e c t r o n a c c e p t o r b e c o m e s a v a i l a b l e . Th e
f a c t t h a t t h e s e t r a n s i e n t s a r e s u c h a f e a t u r e o f a c t i n o r h i z a l
n o d u l e s a n d a r e s o i n s i g n i f i c a n t i n l e g u m e n o d u l e s ( 1 1 3 )
l e n d s f u r t h e r s u p p o r t t o t h e h y p o t h e s i s t h a t a n y o x y g e n
p r o t e c t i o n m e c h a n i s m i s c l o s e t o t h e s i t e o f n i t r o g e n a s e i n
a c t i n o r h i z a l n o d u l e s .
G E N E TI C S
I n t r o d u c t i o n
R e v i e ws o f F r a n k i a g e n e t i c s ( 1 7 0 , 1 8 9 , 2 4 1 ) a r e a v a i l a b l e ,
s o o n l y a b r i e f o v e r v i e w wi l l b e g i v e n h e r e . A t p r e s e n t , i t i s
c l e a r t h a t t h i s a r e a o f F r a n k i a b i o l o g y i s b r i m m i n g wi t h t h e
o p p o r t u n i t y f o r t h e s t u d y o f p l a n t - m i c r o o r g a n i s m i n t e r a c -
t i o n s a n d i s r i p e f o r e x p l o r a t i o n b y n e w a n d i n n o v a t i v e
a p p r o a c h e s . S t u d i e s o f F r a n k i a g e n e t i c s h a v e b e e n d i f f i c u l t
f o r a v a r i e t y o f r e a s o n s , i n c l u d i n g r e l a t i v e l y l o w g r o wt h
r a t e s , p o o r s p o r e g e r m i n a t i o n i n m o s t s t r a i n s , l a c k o f u s e f u l
v e c t o r s , a n d t h e d i f f i c u l t y i n a t t r a c t i n g f u n d i n g f o r p r o j e c t s
t h a t h a v e t o b e g i n wi t h t h e d e v e l o p m e n t o f a n e w s e t o f
g e n e t i c t o o l s . To d a t e , p h a g e s , c o n j u g a t i v e p l a s m i d s , t r a n s -
p o s a b l e e l e m e n t s , R - p l a s m i d s , a n d s t a n d a r d i z e d m u t a g e n e -
s i s p r o t o c o l s h a v e n o t b e e n i d e n t i f i e d . S o m e p r o g r e s s h a s
b e e n m a d e , b u t t h e g e n e t i c m a n i p u l a t i o n o f F r a n k i a s t r a i n s i s
p r e s e n t l y f a r f r o m r o u t i n e .
M a n y o f t h e a p p r o a c h e s u s e d t o d a t e , a n d qu e s t i o n s
a s k e d , h a v e t h e i r i n t e l l e c t u a l r o o t s i n S t r e p t o m y c e s a n d
r h i z o b i a l g e n e t i c s , wh i c h f l o u r i s h e d d u r i n g t h e 1 9 8 0 s . Th u s ,
a t t e m p t s h a v e b e e n m a d e t o u s e S t r e p t o m y c e s p l a s m i d s a n d
p h a g e s a s v e c t o r s , wi t h n o s u c c e s s t o d a t e ( 1 8 6 , 2 4 1 ) ;
p r o t o p l a s t t e c h n o l o g i e s h a v e b e e n d e v e l o p e d b u t h a v e n o t
y i e l d e d s u c c e s s f u l f u s i o n p r o d u c t s e i t h e r b e t we e n F r a n k i a
s t r a i n s o r b e t we e n F r a n k i a a n d S t r e p t o m y c e s s t r a i n s ( r e -
v i e we d i n r e f e r e n c e 2 4 1 ) . O n e e x c e p t i o n i s t h e wo r k o f
P r a k a s h a n d C u m m i n g s ( 1 9 5 ) , wh o r e p o r t e d p r o t o p l a s t f u -
s i o n o f t h e A l n u s r u b r a - i s o l a t e d F r a n k i a s t r a i n N P 1 0 1 3 6 0 1 0
a n d S t r e p t o m y c e s g r i v e o f u s c u s . Th e f u s a n t s h a d a n u m b e r o f
i n t e r e s t i n g c h i m e r i c p r o p e r t i e s ; o n e p r o d u c e d N 2 - f i x i n g r o o t
n o d u l e s wi t h o u t v e s i c l e s . U n f o r t u n a t e l y , t h e s t r a i n s o b -
t a i n e d h a v e b e e n s u b s e qu e n t l y l o s t ( N P I , p e r s o n a l c o m m u -
n i c a t i o n ) .
A f e w s t u d i e s h a v e r e p o r t e d t h e p r e s e n c e o f s e qu e n c e s
t h a t h y b r i d i z e d t o o r c o m p l e m e n t e d a m u t a t i o n i n t h e
c o m m o n n o d g e n e s a s s o c i a t e d wi t h t h e i n f e c t i o n p r o c e s s i n
r h i z o b i a ( 6 7 , 8 3 , 2 0 7 ) . H o we v e r , s t u d i e s o f n o d h y b r i d i z a b l e
DN A a n d f u n c t i o n a l c o m p l e m e n t a t i o n o f n o d A ::Tn S m u t a n t s
o f R h i z o b i u m m e l i l o t i h a v e n o t p r o v e n f r u i t f u l a f t e r f u r t h e r
c h a r a c t e r i z a t i o n ( 2 0 6 ) . A m o r e r e c e n t r e p o r t o f
n o d D::Tn S - c o m p l e m e n t i n g a c t i v i t y i n R l e g u m i n o s a r u m b y

o
n

A
p
r
i
l

2
9
,

2
0
1
4

b
y

I
O
W
A

S
T
A
T
E

U
N
I
V
E
R
S
I
T
Y
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

a p l a s m i d c o n t a i n i n g F r a n k i a DN A ( 6 7 ) m u s t b e c o n f i r m e d
b y s e qu e n c e a n a l y s i s o f t h e p u t a t i v e f r a n k i a l n o d D a n d b y
t h e d e m o n s t r a t i o n o f Tn S i n t h e r h i z o b i a l n o d D.
S e v e r a l g r o u p s h a v e a t t e m p t e d t o u s e i n d i g e n o u s F r a n k i a
p l a s m i d s a s t r a n s f o r m a t i o n v e c t o r s e i t h e r i n t a c t o r m o d i f i e d
a s s h u t t l e v e c t o r s wi t h E s c h e n i c h i a c o l i r e p l i c o n s , p a r t i c u -
l a r l y u s i n g a n 8 . 3 - k b p H F P C p I 1 ( A r I 3 ) p l a s m i d d e s i g n a t e d
p F Q 3 1 ( 6 8 , 6 9 , 2 4 1 , 2 4 7 ) . M a r g i n a l s u c c e s s h a s b e e n
a c h i e v e d i n i n t r o d u c i n g DN A a n d o t h e r m a c r o m o l e c u l e s i n t o
F r a n k i a c e l l s , b u t c o n s t r a i n t s i m p o s e d b y t h e l o w g r o w r a t e
o f s t r a i n s a n d d i f f i c u l t i e s i n d e m o n s t r a t i n g p l a s m i d m a i n t e -
n a n c e h a v e s l o we d p r o g r e s s i n t h i s a r e a ( 6 8 , 6 9 ) . Th e m o s t
f r u i t f u l a r e a s o f s t u d y h a v e i n v o l v e d g e n o m e d e s c r i p t i o n a n d
t h e c l o n i n g a n d s e qu e n c i n g o f g e n e s o b t a i n a b l e t h r o u g h
h e t e r o l o g o u s h y b r i d i z a t i o n .
C h r o m o s o m e C o m p o s i t i o n
Th e g e n o m e m o l e c u l a r we i g h t s o f F r a n k i a s t r a i n s A r I 4
a n d E u I l we r e d e t e r m i n e d t o b e 8 . 3 x 1 0 9 a n d 6 . 0 x 1 0 9 ,
r e s p e c t i v e l y , b y r e a s s o c i a t i o n k i n e t i c s a n a l y s i s ( 1 0 ) . Th e s e
m o l e c u l a r we i g h t s c o r r e s p o n d t o g e n o m e s i z e s o f a b o u t
1 2 , 0 0 0 t o 8 , 7 0 0 k b p , s i m i l a r t o t h e r e p o r t e d g e n o m e s i z e o f
S t r e p t o m y c e s s p p . ( 5 8 ) a n d a b o u t t wi c e a s l a r g e a s t h e
g e n o m e o f E . c o l i ( 4 , 7 0 0 k b p ) ( 1 5 3 ) . Th e DN A i s 6 6 t o 7 5
m o l % G + C ( 1 1 , 8 7 ) , r e f l e c t i n g , a s i n m a n y h i g h - m o l % G + C
o r g a n i s m s , a s t r o n g b i a s t o wa r d a G o r C r e s i d u e i n t h e f i r s t
c o d o n p o s i t i o n f o r A r g a n d L e u a n d i n t h e t h i r d p o s i t i o n f o r
a l l a m i n o a c i d s . Th i s b a s e c o m p o s i t i o n m a k e s DN A s e -
qu e n c i n g s o m e wh a t m o r e d i f f i c u l t t h a n f o r l o we r - m o l % G + C
o r g a n i s m s b u t r e n d e r s t h e i d e n t i f i c a t i o n o f t h e r e a d i n g f r a m e
r e l a t i v e l y e a s y .
E x t r a c h r o m o s o m a l e l e m e n t s . L i k e m o s t b a c t e r i a , s e v e r a l
F r a n k i a s t r a i n s h a v e b e e n s h o wn t o h a r b o r p l a s m i d s ( 5 6 , 8 0 ,
1 8 9 , 1 9 1 , 2 4 0 , 2 4 2 ) . E s t i m a t e s o f t h e p r o p o r t i o n o f s t r a i n s
c a r r y i n g p l a s m i d s o f v a r i o u s s i z e s h a v e r a n g e d f r o m 1 0 % o r
l e s s ( 1 9 1 , 2 4 0 ) t o 6 2 % i n a s c r e e n o f 1 6 i s o l a t e s f r o m M y n c a
p e n s y l v a n i c a ( 5 6 ) . N o f u n c t i o n s h a v e b e e n a s c r i b e d t o a n y o f
t h e p l a s m i d s , e x c e p t i n t wo i n s t a n c e s i n wh i c h n i f h y b r i d i z -
a b l e DN A wa s f o u n d a s s o c i a t e d wi t h p l a s m i d b a n d s ( 8 2 ,
2 3 9 ) . S o m e o f t h e s m a l l e r p l a s m i d s a r e c a n d i d a t e s t o f o r m
t h e b a s i s o f c l o n i n g v e c t o r s , b u t , i n t h e a b s e n c e o f a s e l e c t i o n
t e c h n i qu e , l i t t l e s u c c e s s h a s b e e n a c h i e v e d i n i n t r o d u c i n g
p l a s m i d s i n t o o t h e r F r a n k i a s t r a i n s .
G e n e s I n v o l v e d i n
S i n c e t r a d i t i o n a l
a p p r o a c h e s a r e n o t
y e t a v a i l a b l e f o r
s t u d y i n g
F r a n k i a
g e n e t i c s ,
m o s t wo r k h a s
p r o c e e d e d
t h r o u g h
t h e
c l o n i n g
o f
g e n e s
v i a
h e t e r o l o g o u s h y b r i d i z a t i o n
t o
g e n e s
f r o m o t h e r
o r g a n i s m s ,
m o s t
n o t a b l y
t h o s e i n v o l v e d
i n
n i t r o g e n m e t a b o l i s m . Th e s e
g e n e s
i n c l u d e t h e
c l o n i n g
a n d
s e qu e n c i n g
o f n i f H ( 1 8 4 , 1 9 0 ) ,
n i / D
( 1 8 7 , 2 7 1 ) , p a r t
o f n i / K
( 2 7 1 ) , n i / B , n i f X, n i f W ,
a n d
n i f Z , o p e n r e a d i n g
f r a m e s t h a t
c o r r e s p o n d t o t h e A z o t o b a c t e r v i n e l a n d i i o r f 3 a n d A z o r h i z o -
b i u m c a u l i n o d a n s o r f l ( 1 3 ) r e g i o n s ( 1 0 3 ) , g l n A ( 1 1 1 ) ,
a n d
g l n I I ( 2 0 9 ) .
n i f g e n e o r g a n i z a t i o n .
A t l e a s t 2 0
n i f g e n e s
a r e i n v o l v e d i n
N 2 f i x a t i o n i n t h e we l l - c h a r a c t e r i z e d Ki e b s i e l l a
p n e u m o n i a e ,
a n d
m a n y
o f t h e s e
g e n e s
h a v e
h o m o l o g s
i n o t h e r
d i a z o t r o p h s
( 7 4 ) . Th e s t r u c t u r a l g e n e s f o r t h e F e
p r o t e i n ,
a n d t h e M o F e
p r o t e i n
o f
n i t r o g e n a s e
a r e e n c o d e d
b y
t h e n i / H a n d t h e n i / D
a n d n i / K
g e n e s , r e s p e c t i v e l y . H y b r i d i z a t i o n
r e s u l t s h a v e
i n d i c a t e d t h a t n i / I H DK i n s o m e F r a n k i a s t r a i n s a r e c l u s t e r e d
o n t h e c h r o m o s o m e
( 1 7 0 ) ,
a s
t h e y
a r e i n m o s t
N 2 - f i x i n g
b a c t e r i a
( 7 4 ) .
F . a l n i H F P A r I 3 a n d t h e
c l o s e l y
r e l a t e d
( i f
n o t
TA B L E 2 . C o m p a r i s o n o f S h i n e - Da l g a r n o r e g i o n s o f
F r a n k i a g e n e s
S t r a i n G e n e S e qu e n c e a R e f e r e n c e
H F P C p I 1 g l n A G A C G O C TG A G TC G A 1 1 1
H F P C p I 1 g l n I I C A C G G C G A . TA TTG A 2 0 9
H F P A r I 3
n i f H - A %. A _ G C A C C G C 1 9 0
H R N 1 8 a n i f H
C A 9 9 A @ A G A A A G C A 1 8 4
H R N 1 8 a n i f l D
G A TO A J M TC M C G A TC 1 8 4
H F P A r I 3 n i f D G A TO A @ TC C C G A C C 1 8 7
H F P C p I 1 n i f B G A M A A C O Q TC G A C G 1 0 3
H F P C p I 1 n i f W
A A M 9 A Q A C C G TC G C G 1 0 3
H F P C p I 1 n i f Z G A C G G A G G A G G C C C G 1 0 3
H F P C p I 1 o r f l
G C O A Q Q TC G C C C G C G 1 0 3
H F P C p I 1 o r f 3 G A A O G G A Q A C G C G G C 1 0 3
a
S h o wn i s t h e r e g i o n f r o m - 1 5 t o - 1 b e f o r e t h e i n f e r r e d t r a n s l a t i o n a l s t a r t
s i t e . Th e r e g i o n s h a v i n g s e qu e n c e c o m p l e m e n t a r i t y t o t h e 3 ' e n d o f t h e
F r a n k i a
s t r a i n O R S 0 2 0 6 0 6
( 1 8 4 )
1 6 S r R N A a r e u n d e r l i n e d .
i d e n t i c a l ) s t r a i n H F P C p I 1 h a v e b e e n s t u d i e d wi t h r e g a r d t o
n i f g e n e o r g a n i z a t i o n . I n H F P A r I 3 ,
n i f H D a n d
n i f K a r e
l o c a t e d i n a r e g i o n t h a t c o n t a i n s s e qu e n c e s t h a t h y b r i d i z e t o
o t h e r n i f g e n e s , i n c l u d i n g n i f A a n d n i / B ( 2 4 1 ) . Th e n i f r e g i o n
o f F . a l n i H F P C p I 1 e x h i b i t s a r e s t r i c t i o n m a p a n d g e n e
o r g a n i z a t i o n i d e n t i c a l t o t h a t d e s c r i b e d f o r A r I 3 ( 1 0 3 ) . I n
H F P C p I 1 , f i v e g e n e s a b o u t 4 k b p d o wn s t r e a m f r o m n i f H DK
h a v e b e e n s e qu e n c e d , f o u r o f wh i c h b e l o n g t o a s i n g l e
o p e r o n c o n s i s t i n g o f a t l e a s t o r f 3 o r f l n i f W , a n d n i f Z ; n i / B i s
l o c a t e d i m m e d i a t e l y d o wn s t r e a m f r o m n i f Z a n d m a y b e
t r a n s c r i b e d a s p a r t o f a n o t h e r o p e r o n ( 1 0 3 ) . N i f B , N i f W , a n d
N i f Z a r e a l l i n v o l v e d i n F e M o - c o f a c t o r b i o s y n t h e s i s ( 7 4 ) .
Th e o p e n r e a d i n g f r a m e s o r f 3 a n d o r f l h a v e b e e n i d e n t i f i e d
b y s i m i l a r i t y t o o p e n r e a d i n g f r a m e s wi t h u n k n o wn f u n c t i o n s
i n A . v i n e l a n d i i a n d A . c a u l i n o d a n s , r e s p e c t i v e l y .
A l l o f t h e n i f g e n e s c h a r a c t e r i z e d t h u s f a r h a v e b e e n
i d e n t i f i e d b y s e qu e n c e s i m i l a r i t y t o n i f g e n e s f r o m o t h e r
b a c t e r i a , a n d t h e i r c o d i n g r e g i o n s h a v e b e e n c i r c u m s c r i b e d
b y t h e f i n d i n g o f r i b o s o m a l b i n d i n g s i t e s ( Ta b l e 2 ) , A TG o r
G TG s t a r t c o d o n s , a n d s t o p c o d o n s . B e c a u s e o f a l a c k o f
t e c h n i qu e s f o r g e n e t i c m a n i p u l a t i o n , t h e f u n c t i o n a l i t y o f a l l
F r a n k i a n i f g e n e s i s n o t c e r t a i n . H o we v e r , m u l t i p l e c o p i e s o f
F r a n k i a n i f g e n e s h a v e n o t b e e n d e t e c t e d b y h y b r i d i z a t i o n
m e t h o d s , e x c e p t i n a s i n g l e c a s e wh e r e s t r a i n A R g P 5 5 A G wa s
f o u n d t o h a v e
n i f - h y b r i d i z a b l e
DN A o n a l a r g e p l a s m i d a s
we l l a s o n t h e c h r o m o s o m e . Th u s , t h e c h a n c e s a r e h i g h t h a t
f u n c t i o n a l n i f g e n e s h a v e b e e n i d e n t i f i e d . W i t h t h e a v a i l a b i l -
i t y o f c o s m i d s c o n t a i n i n g m o s t o f t h e n i f g e n e s , i t i s n o w
p o s s i b l e t o d e v e l o p a m a p o f t h e n i f r e g i o n o f H F P C p I 1
( H F P A r I 3 ) c o m p a r a b l e t o wh a t h a s b e e n c o n s t r u c t e d f o r
o t h e r o r g a n i s m s . Th e c h a r a c t e r i s t i c s o f F r a n k i a n i f g e n e s
t h a t m a k e t h e m wo r t h wh i l e t o p u r s u e a r e t h a t F r a n k i a i s t h e
o n l y h i g h - m o l % G + C g r a m - p o s i t i v e g e n u s wh o s e n i f s e -
qu e n c e s a r e c u r r e n t l y a v a i l a b l e f o r p h y l o g e n e t i c s t u d i e s o f
g e n e o r g a n i z a t i o n , a n d t h e i r e x p r e s s i o n i s i n t i m a t e l y t i e d t o
t h e d e v e l o p m e n t a l c y c l e o f F r a n k i a v e s i c l e s .
g i n A a n d g i n I I . G e n e s e n c o d i n g t wo G S s ( g l n A a n d g l n I I )
h a v e r e c e n t l y b e e n c l o n e d a n d s e qu e n c e d f r o m F . a l n i
H F P C p I l ( 1 1 1 , 2 0 8 , 2 0 9 ) . U n l i k e o t h e r o r g a n i s m s t h a t h a v e
t wo G S s a n d t h a t h a v e b e e n s t u d i e d , i n t h i s c a s e t h e t wo G S
g e n e s a r e l i n k e d a n d a r e s e p a r a t e d b y 4 4 9 b p ( 1 1 1 ) . P r i m e r
e x t e n s i o n a n a l y s i s o f t h e g l n A t r a n s c r i p t r e v e a l e d t h e p r e s -
e n c e o f a s i n g l e p r o m o t e r , d e s i g n a t e d g l n A p l ( 1 1 1 ) . Tr a n -
s c r i p t s o r i g i n a t e d a t t wo a d j a c e n t n u c l e o t i d e s , wh i c h i s a
c o m m o n o c c u r r e n c e f o r t h e r e l a t e d S t r e p t o m y c e s s p e c i e s
( 2 5 2 ) . A c o m p a r i s o n o f t h e F r a n k i a g l n A p r o m o t e r r e g i o n
V O L . 5 7 , 1 9 9 3

o
n

A
p
r
i
l

2
9
,

2
0
1
4

b
y

I
O
W
A

S
T
A
T
E

U
N
I
V
E
R
S
I
T
Y
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

wi t h t h e g l n A p r o m o t e r f r o m S . c o e l i c o l o r r e v e a l e d t wo
a r e a s o f s e qu e n c e s i m i l a r i t y t h a t c o r r e s p o n d e d t o t h e
- 1 0 , - 3 5 r e g i o n o f b o t h s e qu e n c e s . I n a d d i t i o n , a s e r i e s o f
d i r e c t r e p e a t s we r e c l u s t e r e d a r o u n d t h e p u t a t i v e p r o m o t e r ,
a s i s c o m m o n i n S t r e p t o m y c e s p r o m o t e r r e g i o n s . Th u s , i t
a p p e a r s l i k e l y t h a t a p r o m o t e r f o r a c o n s t i t u t i v e g e n e i n
F r a n k i a s t r a i n s h a s b e e n i d e n t i f i e d . L i m i t e d s i m i l a r i t y wa s
f o u n d b e t we e n t h e g l n A p r o m o t e r a n d E . c o l i o r S t r e p t o m y -
c e s - E . c o l i - l i k e p r o m o t e r s ( 1 1 9 ) , wh i c h e x p l a i n s wh y t h e
c l o n e d F r a n k i a g l n A f a i l e d t o c o m p l e m e n t a n E . c o l i g l n A
d e l e t i o n m u t a n t u n t i l p l a c e d u n d e r t h e c o n t r o l o f t h e l a c
p r o m o t e r ( 1 1 1 ) .
P r i m e r e x t e n s i o n a n a l y s i s o f t h e H F P C p I 1 g i n I I g e n e ,
e n c o d i n g G S I I , r e v e a l e d a p r o m o t e r r e g i o n , d e s i g n a t e d
g i n I I p l , t h a t h a s l i t t l e s e qu e n c e s i m i l a r i t y t o N t r A ( c r 4 ) -
b i n d i n g s i t e s f o u n d i n g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a ( 1 1 1 ) . A c o m -
p a r i s o n o f s e qu e n c e s u p s t r e a m o f g i n I I f r o m F r a n k i a s t r a i n s
wi t h t h e u p s t r e a m s e qu e n c e o f g l n I I f r o m S . v i n i d o c h r o m o -
g e n e s , f o r wh i c h a p r o m o t e r h a s n o t y e t b e e n p u b l i s h e d ,
r e v e a l e d o n e r e g i o n o f s i m i l a r i t y t h a t c o r r e s p o n d e d t o t h e
g i n I I p I o f H F P C p I 1 g l n I I , p r o v i d i n g s u p p o r t f o r t h e i d e n t i -
f i c a t i o n o f g l n I I p l a s a n i t r o g e n - r e g u l a t e d p r o m o t e r i n
F r a n k i a s t r a i n s . I n t e r e s t i n g l y , d i r e c t r e p e a t s we r e n o t f o u n d
o v e r l a p p i n g g l n I I p l , s u g g e s t i n g t h a t t h e r e g u l a t i o n o f g l n I I
d i f f e r s i n k i n d f r o m t h a t o f g i n A .
r R N A G e n e O r g a n i z a t i o n
M u c h o f t h e wo r k i n v o l v i n g s e qu e n c i n g F r a n k i a r R N A
g e n e s h a s b e e n d i r e c t e d a t c l a r i f y i n g p h y l o g e n e t i c r e l a t i o n -
s h i p s o f F r a n k i a s t r a i n s wi t h e a c h o t h e r a n d wi t h o t h e r
b a c t e r i a ( 9 9 , 1 7 8 ) . A s t u d y o f r R N A g e n e o r g a n i z a t i o n i n t h e
C a s u a r i n a - i s o l a t e d F r a n k i a s t r a i n O R S 0 2 0 6 0 6 r e v e a l e d t h e
p r e s e n c e o f t wo c o p i e s t h e 1 6 S - 2 3 S - 5 S r R N A g e n e c l u s t e r
t h a t h a d i d e n t i c a l r e s t r i c t i o n m a p s ( 1 8 5 ) . Th e r R N A g e n e s
d i d n o t d i f f e r m a r k e d l y f r o m p r e v i o u s l y d e s c r i b e d p r o k a r y -
o t i c r R N A g e n e s i n t h e i r o r g a n i z a t i o n , b u t t h e wo r k c o n -
f i r m e d t h e p h y l o g e n e t i c p o s i t i o n o f F r a n k i a s t r a i n s e s t a b -
l i s h e d i n p r e v i o u s s t u d i e s . Two p o s s i b l e p r o m o t e r s we r e
i d e n t i f i e d t h r o u g h t h e i r s i m i l a r i t y wi t h o t h e r r R N A p r o m o t -
e r s ; t h e c o n s e n s u s d e r i v e d f r o m t h e p r o m o t e r s wa s
TJ G A C A f o r t h e - 3 5 r e g i o n a n d TA A YYT f o r t h e - 1 0
r e g i o n . Th e m R N A a t t a c h m e n t r e g i o n h a d t h e s e qu e n c e
5 ' - G G A U C A C C U . KC C U U U C U - 3 ' ( 1 8 5 ) . Th i s s e qu e n c e c o r -
r e s p o n d s e x a c t l y t o t h a t f o u n d i n S . l i v i d a n s b u t d i f f e r s i n t h e
l a s t t h r e e p o s i t i o n s f r o m t h a t o f E . c o l i ( 2 2 7 ) . R i b o s o m e -
b i n d i n g s e qu e n c e s f r o m t h e f e w g e n e s t h a t h a v e b e e n s e -
qu e n c e d s h o w t y p i c a l S h i n e - Da l g a r n o s i t e s t h a t m a t c h t h e 3 '
e n d o f t h e 1 6 S r R N A i n f o u r o r m o r e p o s i t i o n s ( Ta b l e 2 )
( 2 2 9 ) .
P R O S P E C TS
S t u d i e s o n t h e m i c r o b i o l o g i c a l a s p e c t s o f F r a n k i a s p e c i e s
b e g a n i n e a r n e s t wh e n t h e i s o l a t i o n o f t h e f i r s t s t r a i n wa s
a n n o u n c e d o n l y 1 5 y e a r s a g o . M u c h o f t h e i n t e r v e n i n g t i m e
h a s b e e n s p e n t e s t a b l i s h i n g t e c h n i qu e s f o r g r o wi n g F r a n k i a
s t r a i n s a n d p u r s u i n g h y p o t h e s e s c o n c e r n i n g t h e n a t u r e o f t h e
o r g a n i s m , v e s i c l e s , s p o r e s , a n d p h y s i o l o g y , d e v e l o p e d f r o m
s t r u c t u r a l s t u d i e s d a t i n g b a c k t o p r e v i o u s d e c a d e s . Th u s , a
f a i r a m o u n t i s n o w k n o wn a b o u t t h e p h y l o g e n e t i c p o s i t i o n o f
F r a n k i a s t r a i n s , t h e s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f s p o r e s a n d
v e s i c l e s , t h e p h y s i o l o g y o f c a r b o n a n d n i t r o g e n m e t a b o l i s m ,
e c o l o g y i n t h e s o i l a n d n o d u l e , a n d t h e s t r u c t u r a l f e a t u r e s o f
t h e i n f e c t i o n p r o c e s s ; a l s o , s o m e d e t a i l s a r e b e g i n n i n g t o
e m e r g e a b o u t t h e g e n e t i c s o f t h e m i c r o o r g a n i s m .
M a n y o p p o r t u n i t i e s f o r s t u d i e s o n t h e a c t i n o r h i z a l s y m b i -
o s i s a r e a v a i l a b l e . Th e r e s e a r c h a r e a s h o l d i n g t h e m o s t
p o t e n t i a l f o r f u t u r e wo r k i n c l u d e s t u d i e s o n t h e g e n e t i c s a n d
m o l e c u l a r g e n e t i c s o f h o s t p l a n t i n f e c t i o n a n d s y m b i o t i c
i n t e r a c t i o n s , p h y l o g e n e t i c a n d t a x o n o m i c s t u d i e s o f F r a n k i a
s t r a i n s f r o m h o s t s t h a t h a v e y e t t o y i e l d i n f e c t i v e s t r a i n s , a n d
p h y s i o l o g i c a l s t u d i e s d i r e c t e d a t u n d e r s t a n d i n g t h e b a s i s f o r
s y m b i o s i s . P l a n t wo r k i s s o m e wh a t m o r e d i f f i c u l t a n d t i m e -
c o n s u m i n g , b u t s t u d i e s d i r e c t e d a t t h e c o m p l e m e n t a r y p h y s -
i o l o g y o f t h e p l a n t a n d i d e n t i f y i n g g e n e s i n v o l v e d i n n o d u l e
f o r m a t i o n wo u l d h e l p l a y t h e f o u n d a t i o n f o r a u n i f y i n g
h y p o t h e s i s t o e x p l a i n wh y a c t i n o r h i z a l n o d u l e s f o r m o n
c e r t a i n , r e l a t i v e l y d i s t a n t l y r e l a t e d p l a n t s b u t n o t o n o t h e r
p l a n t s wi t h i n t h e s a m e p l a n t f a m i l y . Th e i d e n t i f i c a t i o n o f
s h a r e d c h a r a c t e r i s t i c s m a y p r o v i d e i n s i g h t i n t o t h e c o e v o l u -
t i o n o f t h e t wo s y m b i o n t s .
I n a b r o a d e r s e n s e , t h e p r a c t i c a l r o l e s p l a y e d b y a c t i -
n o r h i z a l p l a n t s i n m a n y n a t u r a l e n v i r o n m e n t s , e s p e c i a l l y i n
t h e c o n t e x t o f g l o b a l c h a n g e s p r o p o s e d t o o c c u r i n t h e n e x t
f e w d e c a d e s , a r e i m p o r t a n t t o i d e n t i f y a n d p e r h a p s e x p l o i t i f
n e c e s s a r y . M a n y a c t i n o r h i z a l p l a n t s g r o w i n s o i l s t h a t h a v e
l o s t v e g e t a t i o n o r n u t r i e n t s , a n d t h e y s e r v e t o a m e l i o r a t e t h e
e f f e c t s o f s u c h l o s s e s . Th u s , p r a c t i c a l i s s u e s o f t h e a c t i -
n o r h i z a l s y m b i o s i s m u s t b e a d d r e s s e d a s p a r t o f a n o v e r a l l
s t u d y o f t h e b i o l o g y o f a c t i n o r h i z a l s y m b i o s e s .
A C KN O W L E DG M E N TS
W o r k o n F r a n k i a s t r a i n s a n d a c t i n o r h i z a l p l a n t s h a s b e e n s u p -
p o r t e d b y g r a n t s f r o m t h e U S DA C o m p e t i t i v e R e s e a r c h G r a n t s
O f f i c e a n d t h e N a t i o n a l S c i e n c e F o u n d a t i o n ( t o D. R . B . ) .
W e t h a n k s e v e r a l c o l l e a g u e s wh o s u p p l i e d u n p u b l i s h e d r e s u l t s
a n d d i s c u s s i o n s , e s p e c i a l l y A . D. L . A k k e r m a n s , D. B a k e r , A .
C a r r a s c o , K. H u s s - Da n e l l , B . M u l l i n , P . N o r m a n d , a n d P . S i m o n e t .
Th e p r o v i s i o n o f t h e e l e c t r o n m i c r o g r a p h s i n F i g . 2 a n d 6 b y R .
H o wa r d B e r g i s g r a t e f u l l y a c k n o wl e d g e d .
R E F E R E N C E S
1 . A b e y s e k e r a , R . M . , W . N e wc o m b , W . B . S i l v e s t e r , a n d J . G .
To r r e y . 1 9 9 0 . A f r e e z e - f r a c t u r e e l e c t r o n m i c r o s c o p i c s t u d y o f
F r a n k i a i n r o o t n o d u l e s o f A l n u s i n c a n a g r o wn a t t h r e e o x y g e n
t e n s i o n s . C a n . J . M i c r o b i o l . 3 6 :9 7 - 1 0 8 .
2 . A k i m o v , V . N . , S . V . Do b r i t s a , a n d 0 . S . S t u p a r . 1 9 9 1 .
G r o u p i n g o f F r a n k i a s t r a i n s b y DN A - DN A h o m o l o g y : H o w
m a n y g e n o s p e c i e s a r e i n t h e g e n u s F r a n k i a ? p . 6 3 5 - 6 3 6 , I n M .
P o l s i n e l l i , R . M a t e r a s s i , a n d M . V i n c e n z i n i ( e d . ) , N i t r o g e n
f i x a t i o n . Kl u we r A c a d e m i c P u b l i s h e r s , Do r d r e c h t , Th e N e t h -
e r l a n d s .
3 . A k k e r m a n s , A . D. L . , F . H a f e e z , W . R o e l o f s e n , A . H . C h a u d -
h a r y , a n d R . B a a s . 1 9 8 4 . U l t r a s t r u c t u r e a n d n i t r o g e n a s e a c t i v -
i t y o f F r a n k i a g r o wn i n p u r e c u l t u r e a n d i n a c t i n o r r h i z a e o f
A l n u s , C o l l e t i a , a n d Da t i s c a s p p , p . 3 1 1 - 3 1 9 . I n C . V e e g e r a n d
W . E . N e wt o n ( e d . ) , A d v a n c e s i n n i t r o g e n f i x a t i o n r e s e a r c h .
N y h o f f / J u n k P u b l i s h e r s , Th e H a g u e , Th e N e t h e r l a n d s .
4 . A k k e r m a n s , A . D. L . , D. H a h n , a n d D. B a k e r . 1 9 9 2 . Th e f a m i l y
F r a n k i a c e a e , p . 1 0 6 9 - 1 0 8 4 . I n A . B a l o ws , H . G . Tr u p e r , M .
Dwo r k i n , W . H a r d e r , a n d K. S c h l e i f e r ( e d . ) , Th e p r o k a r y o t e s .
S p r i n g e r - V e r l a g , N e w Yo r k .
5 . A k k e r m a n s , A . D. L . , D. H a h n , a n d M . S . M i r z a . 1 9 9 1 .
M o l e c u l a r e c o l o g y o f F r a n k i a : a d v a n t a g e s a n d d i s a d v a n t a g e s
o f t h e u s e o f DN A p r o b e s . P l a n t S o i l 1 3 7 :4 9 - 5 4 .
6 . A k k e r m a n s , A . D. L . , K. H u s s - Da n e l l , a n d W . R o e l o f s e n . 1 9 8 1 .
E n z y m e s o f t h e t r i c a r b o x y l i c a c i d c y c l e a n d t h e m a l a t e -
a s p a r t a t e s h u t t l e i n t h e N 2 - f i x i n g e n d o p h y t e o f A l n u s g l u t i n o s a .
P h y s i o l . P l a n t . 5 3 :2 8 9 - 2 9 4 .
7 . A k k e r m a n s , A . D. L . , a n d W . R o e l o f s e n . 1 9 8 0 . S y m b i o t i c
n i t r o g e n f i x a t i o n b y a c t i n o m y c e t e s i n A l n u s - t y p e r o o t n o d u l e s ,
p . 2 7 9 - 2 9 9 , I n W . D. P . S t e wa r t a n d J . R . G a l l o n ( e d . ) ,
N i t r o g e n f i x a t i o n . A c a d e m i c P r e s s , I n c . , N e w Yo r k .
8 . A k k e r m a n s , A . D. L . , W . R o e l o f s e n , J . B l o m , K. H u s s - Da n e l l ,

o
n

A
p
r
i
l

2
9
,

2
0
1
4

b
y

I
O
W
A

S
T
A
T
E

U
N
I
V
E
R
S
I
T
Y
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

a n d R . H a r k i n k . 1 9 8 3 . U t i l i z a t i o n o f c a r b o n a n d n i t r o g e n
c o m p o u n d s b y F r a n A c i a i n s y n t h e t i c m e d i a a n d i n r o o t n o d u l e s
o f A l n u s g l u t i n o s a , H i p p o p h a e r h a m n o i d e s , a n d Da t i s c a c a n -
n a b i n a . C a n . J . B o t . 6 1 :2 7 9 3 - 2 8 0 0 .
9 . A k k e r m a n s , A . D. L . , a n d C . V a n
DU k .
1 9 8 1 . N o n - l e g u m i n o u s
r o o t - n o d u l e s y m b i o s e s wi t h a c t i n o m y c e t e s a n d R h i z o b i u m , p .
5 7 - 1 0 3 . I n J . W . B r o u g h t o n ( e d . ) , N i t r o g e n f i x a t i o n . A c a d e m i c
P r e s s L t d . , L o n d o n .
1 0 . A n , C . S . , W . S . R i g g s b y , a n d B . C . M u l l i n . 1 9 8 5 . R e l a t i o n s h i p s
o f F r a n k i a i s o l a t e s b a s e d o n d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d h o m o l o g y
s t u d i e s . I n t . J . S y s t . B a c t e r i o l . 3 5 :1 4 0 - 1 4 6 .
1 1 . A n , C . S . , J . W . W i l l s , W . S . R i g g s b y , a n d B . C . M u l l i n . 1 9 8 3 .
De o x y r i b o n u c l e i c a c i d b a s e c o m p o s i t i o n o f 1 2 F r a n k i a i s o -
l a t e s . C a n . J . B o t . 6 1 :2 8 5 9 - 2 8 6 2 .
1 2 . A n o n y m o u s . 1 9 8 4 . C a s u a r i n a s : n i t r o g e n - f i x i n g t r e e s f o r a d v e r s e
s i t e s . N a t i o n a l A c a d e m y P r e s s , W a s h i n g t o n , D. C .
1 3 . A r i g o n i , F . , P . A . Ka m i n s k i , H . H e n n e c k e , a n d C . E l m e r i c h .
1 9 9 1 . N u c l e o t i d e s e qu e n c e o f t h e f i x A B C r e g i o n o f A z o r h i z o -
b i u m c a u l i n o d a n s O R S 5 7 1 : s i m i l a r i t y o f t h e f i x B p r o d u c t wi t h
e u k a r y o t i c f l a v o p r o t e i n s , c h a r a c t e r i z a t i o n o f f i x X, a n d i d e n t i -
f i c a t i o n o f n i f W .
M o l . G e n . G e n e t . 2 2 5 :5 1 4 - 5 2 0 .
1 4 . B a k e r , D. 1 9 8 2 . A c u m u l a t i v e l i s t i n g o f i s o l a t e d f r a n k i a e , t h e
s y m b i o t i c , n i t r o g e n - f i x i n g a c t i n o m y c e t e s . A c t i n o m y c e t e s 1 7 :
3 5 - 4 2 .
1 5 . B a k e r , D. 1 9 8 7 - 1 9 8 8 . M o d i f i c a t i o n o f c a t a l o g n u m b e r i n g s y s -
t e m f o r F r a n / c i a s t r a i n s a n d r e v i s i o n o f s t r a i n n u m b e r s f o r DDB
F r a n k i a c o l l e c t i o n . A c t i n o m y c e t e s 2 0 :8 5 - 8 8 .
1 6 . B a k e r , D. , W . N e wc o m b , a n d J . G . To r r e y . 1 9 8 0 . C h a r a c t e r -
i z a t i o n o f a n i n e f f e c t i v e a c t i n o r h i z a l m i c r o s y m b i o n t , F r a n k i a
s p . E u I l . C a n . J . M i c r o b i o l . 2 6 :1 0 7 2 - 1 0 8 9 .
1 7 . B a k e r , D. , a n d D. O ' Ke e f e . 1 9 8 4 . A m o d i f i e d s u c r o s e f r a c t i o n -
a t i o n p r o c e d u r e f o r t h e i s o l a t i o n o f f r a n k i a e f r o m a c t i n o r h i z a l
r o o t n o d u l e s a n d s o i l s a m p l e s . P l a n t S o i l 7 8 :2 3 - 2 8 .
1 8 . B a k e r , D. , W . P e n g e l l y , a n d J . G . To r r e y . 1 9 8 1 . I m m u n o c h e m -
i c a l a n a l y s i s o f r e l a t i o n s h i p s a m o n g i s o l a t e d f r a n k i a e ( A c t i n o -
m y c e t a l e s ) . I n t . J . S y s t . B a c t e r i o l . 3 1 :1 4 8 - 1 5 1 .
1 9 . B a k e r , D. , a n d J . G . To r r e y . 1 9 7 9 . Th e i s o l a t i o n a n d c u l t i v a t i o n
o f a c t i n o m y c e t o u s r o o t n o d u l e e n d o p h y t e s , p . 3 8 - 5 6 . I n J . C .
G o r d o n , C . T. W h e e l e r , a n d D. A . P e r r y ( e d . ) , S y m b i o t i c
n i t r o g e n f i x a t i o n i n t h e m a n a g e m e n t o f t e m p e r a t e f o r e s t s .
O r e g o n S t a t e U n i v e r s i t y P r e s s , C o r v a l l i s .
2 0 . B a k e r , D. , a n d J . G . To r r e y . 1 9 8 0 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f a n
e f f e c t i v e a c t i n o r h i z a l m i c r o s y m b i o n t , F r a n k i a s p . A v c I l ( A c -
t i n o m y c e t a l e s ) . C a n . J . M i c r o b i o l . 2 6 :1 0 6 6 - 1 0 7 1 .
2 1 . B a k e r , D. , J . G . To r r e y , a n d G . H . Ki d d . 1 9 7 9 . I s o l a t i o n b y
s u c r o s e - d e n s i t y f r a c t i o n a t i o n a n d c u l t i v a t i o n i n v i t r o o f a c t i n o -
m y c e t e s f r o m n i t r o g e n - f i x i n g r o o t n o d u l e s . N a t u r e ( L o n d o n )
2 8 1 :7 6 - 7 8 .
2 2 . B a k e r , D. D. 1 9 8 7 . R e l a t i o n s h i p s a m o n g p u r e c u l t u r e d s t r a i n s
o f F r a n A c i a b a s e d o n h o s t s p e c i f i c i t y . P h y s i o l . P l a n t . 7 0 :2 4 5 -
2 4 8 .
2 3 . B a k e r , D. D. , a n d B . C . M u l l i n . 1 9 9 2 . A c t i n o r h i z a l s y m b i o s e s ,
p . 2 5 9 - 2 9 2 . I n G . S t a c e y , R . H . B u r r i s a n d H . J . E v a n s ( e d . ) ,
B i o l o g i c a l n i t r o g e n f i x a t i o n . R o u t e l a n d , C h a p m a n & H a l l , N e w
Yo r k .
2 4 . B e c k i n g , J . H . 1 9 7 0 . F r a n k i a c e a e f a m . n o v . ( A c t i n o m y c e t a l e s )
wi t h o n e n e w c o m b i n a t i o n a n d s i x n e w s p e c i e s o f t h e g e n u s
F r a n / i a B r u n c h o r s t 1 8 8 6 , 1 7 4 . I n t . J . S y s t . B a c t e r i o l . 2 0 :2 0 1 -
2 2 0 .
2 5 . B e c k i n g , J . H . 1 9 7 5 . R o o t n o d u l e s i n n o n l e g u m e s , p . 5 0 8 - 5 6 6 .
I n J . G . To r r e y a n d D. T. C l a r k s o n ( e d . ) , De v e l o p m e n t a n d
f u n c t i o n o f r o o t s . A c a d e m i c P r e s s L t d . , L o n d o n .
2 6 . B e c k i n g , J . H . , W . E . De B o e r , a n d A . L . H o u wi n k . 1 9 6 4 .
E l e c t r o n m i c r o s c o p y o f t h e e n d o p h y t e o f A l n u s g l u t i n o s a .
A n t o n i e L e e u we n h o e k J . M i c r o b i o l . S e r o l . 3 0 :3 4 3 - 3 7 6 .
2 7 . B e h r m a n n , I . , D. H i l l e m a n n , A . P u h l e r , E . S t r a u c h , a n d W .
W o h l l e b e n . 1 9 9 0 . O v e r e x p r e s s i o n o f a S t r e p t o m y c e s v i r i d o c h -
r o m o g e n e s g e n e ( g l n I I ) e n c o d i n g a g l u t a m i n e s y n t h e t a s e s i m -
i l a r t o t h o s e o f e u c a r y o t e s c o n f e r s r e s i s t a n c e a g a i n s t t h e
a n t i b i o t i c p h o s p h i n o t h r i c y l - a l a n y l - a l a n i n e . J . B a c t e r i o l . 1 7 2 :
5 3 2 6 - 5 3 3 4 .
2 8 . B e n e c k e , U . 1 9 6 9 . S y m b i o n t s o f a l d e r n o d u l e s i n N e w Z e a l a n d .
P l a n t S o i l 3 0 :1 4 5 - 1 4 9 .
2 9 . B e n o i s t , P . , A . M u l l e r , H . G . Di e m , a n d J . S c h we n c k e . 1 9 9 2 .
H i g h - m o l e c u l a r - m a s s m u l t i c a t a l y t i c p r o t e i n a s e c o m p l e x e s p r o -
d u c e d b y t h e n i t r o g e n - f i x i n g a c t i n o m y c e t e F r a n k i a s t r a i n
B R . J . B a c t e r i o l . 1 7 4 :1 4 9 5 - 1 5 0 4 .
3 0 . B e n o i t , L . F . , a n d A . M . B e r r y . 1 9 9 0 . M e t h o d s f o r p r o d u c t i o n
a n d u s e o f a c t i n o r h i z a l p l a n t s i n f o r e s t r y , l o w m a i n t e n a n c e
l a n d s c a p e s , a n d r e v e g e t a t i o n , p . 2 8 1 - 2 9 7 . I n C . R . S c h wi n t z e r
a n d J . D. Tj e p k e m a ( e d . ) , Th e b i o l o g y o f F r a n k i a a n d a c t i -
n o r h i z a l p l a n t s . A c a d e m i c P r e s s , I n c . , N e w Yo r k .
3 1 . B e n s o n , D. R . 1 9 8 2 . I s o l a t i o n o f F r a n k i a s t r a i n s f r o m a l d e r
a c t i n o r h i z a l r o o t n o d u l e s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 4 :4 6 1 -
4 6 5 .
3 2 . B e n s o n , D. R . , D. J . A r p , a n d R . H . B u m s . 1 9 7 9 . C e l l - f r e e
n i t r o g e n a s e a n d h y d r o g e n a s e f r o m a c t i n o r h i z a l r o o t n o d u l e s .
S c i e n c e 2 0 5 :6 8 8 - 6 8 9 .
3 3 . B e n s o n , D. R . , D. J . A r p , a n d R . H . B u m s . 1 9 8 0 . H y d r o g e n a s e
i n a c t i n o r h i z a l r o o t n o d u l e s a n d r o o t n o d u l e h o m o g e n a t e s . J .
B a c t e r i o l . 1 4 2 :1 3 8 - 1 4 4 .
3 4 . B e n s o n , D. R . , S . E . B u c h h o l z , a n d D. G . H a n n a . 1 9 8 4 .
I d e n t i f i c a t i o n o f F r a n A i a s t r a i n s b y t wo - d i m e n s i o n a l p o l y a c r y l -
a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 7 :4 8 9 -
4 9 4 .
3 5 . B e n s o n , D. R . , a n d D. E . E v e l e i g h . 1 9 7 9 . N i t r o g e n - f i x i n g
h o m o g e n a t e s o f M y r i c a p e n s y l v a n i c a ( B a y b e r r y ) n o n - l e g u m e
r o o t n o d u l e s . S o i l B i o l . B i o c h e m . 1 1 :3 3 1 - 3 3 4 .
3 6 . B e n s o n , D. R . , a n d D. E . E v e l e i g h . 1 9 7 9 . U l t r a s t r u c t u r e o f t h e
n i t r o g e n - f i x i n g s y m b i o n t o f M y r i c a p e n s y l v a n i c a L . ( B a y b e r r y )
r o o t n o d u l e s . B o t . G a z . 1 4 0 ( S u p p l . ) :S 1 5 - S 2 1 .
3 7 . B e n s o n , D. R . , a n d D. H a n n a h . 1 9 8 3 . F r a n k i a d i v e r s i t y i n a n
a l d e r s t a n d a s e s t i m a t e d b y s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e - p o l y a c r y l -
a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f wh o l e - c e l l p r o t e i n s . C a n . J . B o t .
6 1 :2 9 1 9 - 2 9 2 3 .
3 8 . B e n s o n , D. R . , a n d N . A . S c h u l t z . 1 9 9 0 . P h y s i o l o g y a n d
b i o c h e m i s t r y o f F r a n k i a i n c u l t u r e , p . 1 0 7 - 1 2 7 . I n C . R .
S c h wi n t z e r a n d J . D. Tj e p k e m a ( e d . ) , Th e b i o l o g y o f F r a n k i a
a n d a c t i n o r h i z a l p l a n t s . A c a d e m i c P r e s s , I n c . , N e w Yo r k .
3 9 . B e r g , R . H . 1 9 8 3 . P r e l i m i n a r y e v i d e n c e f o r t h e i n v o l v e m e n t o f
s u b e r i z a t i o n i n i n f e c t i o n o f C a s u a r i n a . C a n . J . B o t . 6 1 :2 9 1 0 -
2 9 1 8 .
4 0 . B e r g , R . H . 1 9 9 0 . C e l l u l o s e a n d x y l a n s i n t h e i n t e r f a c e c a p s u l e
i n s y m b i o t i c c e l l s o f a c t i n o r h i z a e . P r o t o p l a s m a 1 5 9 :3 5 - 4 3 .
4 1 . B e r g , R . H . , a n d L . M c Do we l l . 1 9 8 7 . E n d o p h y t e d i f f e r e n t i a t i o n
i n C a s u a r i n a a c t i n o r h i z a e . P r o t o p l a s m a 1 3 6 :1 0 4 - 1 1 7 .
4 2 . B e r g , R . H . , a n d L . M c Do we l l . 1 9 8 8 . C y t o c h e m i s t r y o f t h e wa l l
o f i n f e c t e d C a s u a r i n a a c t i n o r h i z a e . C a n . J . B o t . 6 6 :2 0 3 8 - 2 0 4 7 .
4 3 . B e r g m a n , B . , a n d A . R a i . 1 9 8 9 . Th e N o s t o c - N e p h r o m a s y m -
b i o s i s : l o c a l i z a t i o n , d i s t r i b u t i o n p a t t e r n a n d l e v e l s o f k e y
p r o t e i n s i n v o l v e d i n n i t r o g e n a n d c a r b o n m e t a b o l i s m o f t h e
c y a n o b i o n t . P h y s i o l . P l a n t . 7 7 :2 1 6 - 2 2 4 .
4 4 . B e r m u d e z d e C a s t r o , F . , C . M i g u e l , a n d C . R o d r i g u e z - B a r r u e c o .
1 9 7 6 . A s t u d y o f t h e c a p a c i t y o f s o i l s t o i n d u c e n o d u l e s i n
A l n u s g l u t i n o s a ( L . ) G a e r t n . a n d M y r i c a g a l e L . , wi t h s p e c i a l
r e f e r e n c e t o t h e s p e c i f i c i t y o f t h e e n d o p h y t e s . A n n . I n s t .
P a s t e u r M i c r o b i o l . 1 2 7 A :3 0 7 - 3 1 5 .
4 5 . B e r r y , A . , a n d J . G . To r r e y . 1 9 7 9 . I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a -
t i o n i n v i v o a n d i n v i t r o o f a n a c t i n o m y c e t o u s e n d o p h y t e f r o m
A l n u s r u b r a B o n g , p . 6 9 - 8 3 . I n J . C . G o r d o n , C . T. W h e e l e r ,
a n d D. A . P e r r y ( e d . ) , S y m b i o t i c n i t r o g e n f i x a t i o n i n t h e
m a n a g e m e n t o f t e m p e r a t e f o r e s t s . O r e g o n S t a t e U n i v e r s i t y
P r e s s , C o r v a l l i s .
4 6 . B e r r y , A . M . , 0 . T. H a r r i o t t , R . A . M o r e a u , S . O s m a n , D. R .
B e n s o n , a n d A . D. J o n e s . H o p a n o i d l i p i d s c o m p r i s e t h e F r a n k i a
v e s i c l e e n v e l o p e : p o t e n t i a l b a r r i e r o f o x y g e n d i f f u s i o n t o
n i t r o g e n a s e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A , i n p r e s s .
4 7 .
B e r r y ,
A . M . , L . M c I n t y r e , a n d M . E . M c C u l l y . 1 9 8 6 . F i n e
s t r u c t u r e o f r o o t h a i r i n f e c t i o n l e a d i n g t o n o d u l a t i o n i n t h e
F r a n k i a - A l n u s s y m b i o s i s . C a n . J . B o t . 6 4 :2 9 2 - 3 0 5 .
4 8 . B e r r y , A . M . , R . A . M o r e a u , a n d A . D. J o n e s . 1 9 9 1 . B a c t e r i o -
h o p a n e t e t r o l : a b u n d a n t l i p i d i n F r a n k i a c e l l s a n d i n n i t r o g e n -
f i x i n g n o d u l e t i s s u e . P l a n t P h y s i o l . 9 5 :1 1 1 - 1 1 5 .
4 9 .
B e r r y ,
A . M . , a n d L . A . S u n e l l . 1 9 9 0 . Th e i n f e c t i o n p r o c e s s a n d
n o d u l e d e v e l o p m e n t , p . 6 1 - 8 1 , I n C . R . S c h wi n t z e r a n d J . D.
Tj e p k e m a ( e d . ) , Th e b i o l o g y o f F r a n / c i a a n d a c t i n o r h i z a l
V O L . 5 7 , 1 9 9 3

o
n

A
p
r
i
l

2
9
,

2
0
1
4

b
y

I
O
W
A

S
T
A
T
E

U
N
I
V
E
R
S
I
T
Y
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

p l a n t s . A c a d e m i c P r e s s , I n c . , S a n Di e g o , C a l i f .
5 0 . B e r r y , A . M . , J . R . Th a y e r , C . S . E n d e r l i n , a n d A . D. J o n e s .
1 9 9 0 . P a t t e r n s o f [' 3 N ] a m m o n i u m u p t a k e a n d a s s i m i l a t i o n b y
F r a n k i a H F P A r I 3 . A r c h . M i c r o b i o l . 1 5 4 :5 1 0 - 5 1 3 .
5 1 . B e r r y , A . M . , a n d J . G . To r r e y . 1 9 8 3 . R o o t h a i r d e f o r m a t i o n i n
t h e i n f e c t i o n p r o c e s s o f A l n u s r u b r a . C a n . J . M i c r o b i o l .
6 1 :2 8 6 3 - 2 9 7 6 .
5 2 . B e y a z o v a , M . , a n d M . P . L e c h e v a l i e r . 1 9 9 2 . L o w- f r e qu e n c y
r e s t r i c t i o n f r a g m e n t a n a l y s i s o f F r a n k i a s t r a i n s ( A c t i n o m y c e -
t a l e s ) . I n t . J . S y s t . B a c t e r i o l . 4 2 :4 2 2 4 3 3 .
5 3 . B l o m , J . , a n d R . H a r k i k d 1 9 8 1 . M e t a b o l i c p a t h wa y s f o r
g l u c o n e o g e n e s i s a n d e n e r g y g e n e r a t i o n i n F r a n k i a A v c I l .
F E M S M i c r o b i o l . L e t t . 1 1 :2 2 1 - 2 2 4 .
5 4 . B l o m , J . , W . R o e l o f s e n , a n d A . D. L . A k k e r m a n s . 1 9 8 1 .
A s s i m i l a t i o n o f n i t r o g e n i n r o o t n o d u l e s o f a l d e r ( A l n u s g l u t i -
n o s a ) . N e w P h y t o l . 8 9 :3 2 1 - 3 2 6 .
5 5 . B l o o m , R . A . , M . P . L e c h e v a l i e r , a n d R . L . Ta t e I I I . 1 9 8 9 .
P h y s i o l o g i c a l , c h e m i c a l , m o r p h o l o g i c a l , a n d p l a n t i n f e c t i v i t y
c h a r a c t e r i s t i c s o f F r a n k i a i s o l a t e s f r o m M y n i c a p e n s y l v a n i c a :
c o r r e l a t i o n t o DN A r e s t r i c t i o n p a t t e r n s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o -
b i o l . 5 5 :2 1 6 1 - 2 1 6 6 .
5 6 . B l o o m , R . A . , B . C . M u l l i n , a n d R . L . Ta t e I I I . 1 9 8 9 . DN A
r e s t r i c t i o n p a t t e r n s a n d DN A - DN A s o l u t i o n h y b r i d i z a t i o n
s t u d i e s o f F r a n k i a i s o l a t e s f r o m M y r i c a p e n s y l v a n i c a ( b a y b e r -
r y ) . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 5 :2 1 5 5 - 2 1 6 0 .
5 7 . B o s c o , M . , M . P . F e r n a n d e z , P . S i m o n e t , R . M a t e r a s s i , a n d P .
N o r m a n d . 1 9 9 2 . E v i d e n c e t h a t s o m e F r a n k i a s p . s t r a i n s a r e
a b l e t o c r o s s b o u n d a r i e s b e t we e n A l n u s a n d E l a e a g n u s h o s t
s p e c i f i c i t y g r o u p s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 8 :1 5 6 9 - 1 5 7 6 .
5 8 . B r a d l e y , S . G . , L . W . E n qu i s t , a n d H . E . S c h r i b n e r H I . 1 9 7 8 .
H e t e r o g e n e i t y a m o n g d e o x y r i b o n u c l e o t i d e s e qu e n c e s o f A c t i -
n o m y c e t a l e s , p . 2 0 7 - 2 2 4 . I n E . F r e e r k s e n , I . Ta r n o k a n d J . H .
Th u m i n ( e d . ) , G e n e t i c s o f t h e A c t i n o m y c e t a l e s . G u s t a v F i s -
c h e r V e r l a g , S t u t t g a r t , G e r m a n y .
5 9 . B u r g g r a a f , A . J . P . , A . Q u i s p e l , T. Ta k , a n d J . V a l s t a r . 1 9 8 1 .
M e t h o d s o f i s o l a t i o n , a n d c u l t i v a t i o n o f F r a n k i a s p e c i e s f r o m
a c t i n o r h i z a s . P l a n t S o i l 6 1 :1 5 7 - 1 6 8 .
6 0 . B u r g g r a a f , A . J . P . , a n d W . A . S h i p t o n . 1 9 8 3 . S t u d i e s o n t h e
g r o wt h o f F r a n k i a i s o l a t e s i n r e l a t i o n t o i n f e c t i v i t y a n d n i t r o -
g e n f i x a t i o n ( a c e t y l e n e r e d u c t i o n ) . C a n . J . B o t . 6 1 :2 7 7 4 - 2 7 8 2 .
6 1 . B u r l e i g h , S . , a n d J . G . To r r e y . 1 9 9 0 . E f f e c t i v e n e s s o f d i f f e r e n t
F r a n k i a c e l l t y p e s a s i n o c u l a f o r t h e a c t i n o r h i z a l p l a n t C a s u a -
n n a . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 6 :2 5 6 5 - 2 5 6 7 .
6 2 . C a l l a h a m , D. , P . De l Tr e d i c i , a n d J . G . To r r e y . 1 9 7 8 . I s o l a t i o n
a n d c u l t i v a t i o n i n v i t r o o f t h e a c t i n o m y c e t e c a u s i n g r o o t
n o d u l a t i o n i n C o m p t o n i a . S c i e n c e 1 9 9 :8 9 9 - 9 0 2 .
6 3 . C a l l a h a m , D. , W . N e wc o m b , J . G . To r r e y , a n d R . L . P e t e r s o n .
1 9 7 9 . R o o t h a i r i n f e c t i o n i n a c t i n o m y c e t e - i n d u c e d r o o t n o d u l e
i n i t i a t i o n i n C a s u a r i n a , M y r i c a , a n d C o m p t o n i a . B o t . G a z .
1 4 0 ( S u p p l . ) :S 1 - S 9 .
6 3 a . C a r r a s c o , A . P e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n .
6 4 . C a r r a s c o , A . , J . S c h we n c k e , a n d M . C a r u . 1 9 9 2 . I s o l a t i o n o f
F r a n k i a f r o m n o d u l e s o f Tr e v o a t r i n e r v i s : u l t r a s t r u c t u r a l c h a r -
a c t e r i z a t i o n . C a n . J . M i c r o b i o l . 3 8 :1 7 4 - 1 8 0 .
6 5 . C a r u , M . , M . A b a r z u a , a n d A . C a r r a s c o . 1 9 9 0 . E s t r u c t u r a f i n a
d e F r a n k i a c e p a s C s I l y C s I 2 a i s l a d a s d e C o l l e t i a h y s t r i x
( C l o s ) . A c t a M i c r o b i o l . 3 ( 1 - 2 ) :5 5 - 6 2 .
6 6 . C h a u d h a r y , A . H . , a n d M . S a j j a d M i r z a . 1 9 8 7 . I s o l a t i o n a n d
c h a r a c t e r i z a t i o n o f F r a n k i a f r o m n o d u l e s o f a c t i n o r h i z a l p l a n t s
o f P a k i s t a n . P h y s i o l . P l a n t . 7 0 :2 5 5 - 2 5 8 .
6 7 . C h e n , L . , Y. C u i , M . Q i n , Y. W a n g , X. B a i , a n d Q . M a . 1 9 9 1 .
I d e n t i f i c a t i o n o f a n o d D- l i k e g e n e i n F r a n k i a b y d i r e c t c o m p l e -
m e n t a t i o n o f a R h i z o b i u m n o d D- m u t a n t . M o l . G e n . G e n e t .
2 3 3 :3 1 1 - 3 1 4 .
6 8 . C o u r n o y e r , B . , a n d P . N o r m a n d . 1 9 9 0 . U p t a k e o f m a c r o m o l e -
c u l e s b y F r a n k i a , p . 5 2 6 . I n P . M . G r e s s h o f f , L . E . R o t h , G .
S t a c e y , a n d W . E . N e wt o n ( e d . ) , N i t r o g e n f i x a t i o n : a c h i e v e -
m e n t s a n d o b j e c t i v e s . C h a p m a n & H a l l , N e w Yo r k .
6 9 . C o u r n o y e r , B . , a n d P . N o r m a n d . 1 9 9 2 . R e l a t i o n s h i p b e t we e n
e l e c t r o p o r a t i o n c o n d i t i o n s , e l e c t r o p e r m e a b i l i t y a n d r e s p i r a -
t o r y a c t i v i t y f o r F r a n k i a s t r a i n A C N 1 4 a . F E M S M i c r o b i o l .
L e t t . 9 4 :9 5 - 1 0 0 .
7 0 . C r u t z e n , P . J . , a n d M . 0 . A n d r e a e . 1 9 9 0 . B i o m a s s b u r n i n g i n
t h e t r o p i c s : i m p a c t o n a t m o s p h e r i c c h e m i s t r y a n d b i o g e o c h e m -
i c a l c y c l e s . S c i e n c e 2 5 0 :1 6 6 9 - 1 6 7 8 .
7 1 . Da r r o w, R . A . , a n d R . R . Kn o t t s . 1 9 7 7 . Two f o r m s o f g l u t a m i n e
s y n t h e t a s e i n f r e e - l i v i n g r o o t - n o d u l e b a c t e r i a . B i o c h e m . B i o -
p h y s . R e s . C o m m u n . 7 8 :5 5 4 - 5 5 9 .
7 2 . Da ws o n , J . 0 . 1 9 8 6 . A c t i n o r h i z a l p l a n t s : t h e i r u s e i n f o r e s t r y
a n d a g r i c u l t u r e . O u t l o o k A g r i c . 1 5 :2 0 2 - 2 0 8 .
7 3 . Da ws o n , J . 0 . 1 9 9 0 . I n t e r a c t i o n s a m o n g a c t i n o r h i z a l a n d
a s s o c i a t e d p l a n t s p e c i e s , p . 2 9 9 - 3 1 6 . I n C . R . S c h wi n t z e r a n d
J . D. Tj e p k e m a ( e d . ) , Th e b i o l o g y o f F r a n k i a a n d a c t i n o r h i z a l
p l a n t s . A c a d e m i c P r e s s , I n c . S a n Di e g o , C a l i f .
7 4 . De a n , D. R . , a n d M . R . J a c o b s o n . 1 9 9 2 . B i o c h e m i c a l g e n e t i c s
o f n i t r o g e n a s e , p . 7 6 3 - 8 3 4 . I n G . S t a c e y , R . H . B u r r i s a n d H . J .
E v a n s ( e d . ) , B i o l o g i c a l n i t r o g e n f i x a t i o n . C h a p m a n & H a l l ,
N e w Yo r k .
7 5 . De m e l , R . A . , a n d B . d e Kr u y f f . 1 9 7 6 . Th e f u n c t i o n o f s t e r o l s i n
m e m b r a n e s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 4 5 7 :1 0 9 - 1 3 2 .
7 6 . Di e m , H . G . , a n d Y. R . Do m m e r g u e s . 1 9 9 0 . C u r r e n t a n d
p o t e n t i a l u s e s a n d m a n a g e m e n t o f C a s u a r i n a c e a e i n t h e t r o p i c s
a n d s u b t r o p i c s , p . 3 1 7 - 3 4 2 . I n C . R . S c h wi n t z e r a n d J . D.
Tj e p k e m a ( e d . ) , Th e b i o l o g y o f F r a n k i a a n d a c t i n o r h i z a l
p l a n t s . A c a d e m i c P r e s s , I n c . S a n Di e g o , C a l i f .
7 7 . Di e m , H . G . , E . Du h o u x , P . S i m o n e t , a n d Y. R . Do m m e r g u e s .
1 9 9 0 . A c t i n o r h i z a l s y m b i o s i s b i o t e c h n o l o g y : t h e p r e s e n t a n d
t h e f u t u r e , p . 9 8 4 - 9 8 5 . I n G . Du r a n d , L . B o b i c h o n , a n d J .
F l o r e n t ( e d . ) , P r o c e e d i n g s o f t h e 8 t h I n t e r n a t i o n a l B i o t e c h n o l -
o g y S y m p o s i u m . S o c i e t e F r a n c a i s e d e M i c r o b i o l o g i e , P a r i s .
7 8 . Di e m , H . G . , D. G a u t h i e r , a n d Y. Do m m e r g u e s . 1 9 8 3 . A n
e f f e c t i v e s t r a i n o f F r a n k i a f r o m C a s u a r i n a s p . C a n . J . B o t .
6 1 :2 8 1 5 - 2 8 2 1 .
7 9 . Di e m , H . G . , D. G a u t h i e r , a n d Y. R . Do m m e r g u e s . 1 9 8 2 .
I s o l a t i o n o f F r a n k i a f r o m n o d u l e s o f C a s u a r i n a e qu i s e t i f o l i a .
C a n . J . M i c r o b i o l . 2 8 :5 2 6 - 5 3 0 .
8 0 . Do b r i t s a , S . V . 1 9 8 2 . E x t r a c h r o m o s o m a l c i r c u l a r DN A s i n
e n d o s y m b i o n t v e s i c l e s f r o m A l n u s g l u t i n o s a n o d u l e s . F E M S
M i c r o b i o l . L e t t . 1 5 :8 7 - 9 1 .
8 1 . Do b r i t s a , S . V . , a n d 0 . S . S t u p a r . 1 9 8 9 . G e n e t i c h e t e r o g e n e i t y
a m o n g F r a n k i a i s o l a t e s f r o m r o o t n o d u l e s o f i n d i v i d u a l a c t i -
n o r h i z a l p l a n t s . F E M S M i c r o b i o l . L e t t . 5 8 :2 8 7 - 2 9 2 .
8 2 . Do b r i t s a , S . V . , a n d A . Y. To m a s h e v s k y . 1 9 8 9 . H o m o l o g y
b e t we e n s t r u c t u r a l n i t r o g e n a s e g e n e s ( n i f H DK) f r o m Ki e b -
s i e l l a p n e u m o n i a e a n d e x t r a c h r o m o s o m a l DN A s f r o m m i -
c r o s y m b i o n t v e s i c l e s o f A . g l u t i n o s a . B i o p o l y m . C e l l 4 :4 4 .
8 3 . Dr a k e , D. , J . T. L e o n a r d , a n d A . M . H i r s c h . 1 9 8 5 . S y m b i o t i c
g e n e s i n F r a n k i a , p . 1 4 7 . I n H . J . E v a n s , P . J . B o t t o m l e y , a n d
W . E . N e wt o n ( e d . ) , N i t r o g e n f i x a t i o n r e s e a r c h p r o g r e s s .
M a r t i n u s N i j h o f f , Do r d r e c h t .
8 4 . E d m a n d s , J . , N o r i d g e , N . A . , B e n s o n , D. R . 1 9 8 7 . Th e a c t i -
n o r h i z a l r o o t - n o d u l e s y m b i o n t F r a n k i a s p . s t r a i n C p I l h a s t wo
g l u t a m i n e s y n t h e t a s e s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 8 4 :6 1 2 6 -
6 1 3 0 .
8 5 . F a u r e - R a y n a u d , M . , a n d A . M o i r o u d . 1 9 8 3 . S y m b i o s e F r a n k i a -
A u l n e : c u l t u r e i n v i t r o d e F r a n k i a s p . s u r d i f f e r e n t e s s o u c e s d e
c a r b o n e e t d ' z a z o t e . C . R . A c a d . S c i . P a r i s S e r . I I I 2 9 6 :7 5 7 -
7 6 0 .
8 6 . F e r g u s o n , T. P . , a n d G . B o n d . 1 9 5 3 . O b s e r v a t i o n s o n t h e
f o r m a t i o n a n d f u n c t i o n o f t h e r o o t n o d u l e s o f A l n u s g l u t i n o s a
( L . ) G a e r t n . A n n . B o t . N . S . 1 7 :1 7 5 - 1 8 8 .
8 7 . F e r n a n d e z , M . P . , H . M e u g n i e r , P . A . D. G r i m o n t , a n d R .
B a r d i n . 1 9 8 9 . De o x y r i b o n u c l e i c a c i d r e l a t e d n e s s a m o n g m e m -
b e r s o f t h e g e n u s F r a n k i a . I n t . J . S y s t . B a c t e r i o l . 3 9 :4 2 4 4 2 9 .
8 8 . F o n t a i n e , M . F . , S . A . L a n c e l l e , a n d J . G . To r r e y . 1 9 8 4 .
I n i t i a t i o n a n d o n t o g e n y o f v e s i c l e s i n c u l t u r e d F r a n k i a
s p .
s t r a i n H F P A r I 3 . J . B a c t e r i o l . 1 6 0 :9 2 1 - 9 2 7 .
8 9 . F o x , G . E . , a n d E . S t a c k e b r a n d t . 1 9 8 7 . Th e a p p l i c a t i o n o f 1 6 S
r R N A c a t a l o g u i n g a n d S S r R N A s e qu e n c i n g i n b a c t e r i a l s y s -
t e m a t i c s . M e t h o d s M i c r o b i o l . 1 9 :4 0 5 4 5 8 .
9 0 . F o x , G . E . , J . D. W i s o t z k e y , a n d P . J u r t s h u k , J r . 1 9 9 2 . H o w
c l o s e i s c l o s e : 1 6 S r R N A s e qu e n c e i d e n t i t y m a y n o t b e
s u f f i c i e n t t o g u a r a n t e e s p e c i e s i d e n t i t y . I n t . J . S y s t . B a c t e r i o l .
4 2 :1 6 6 - 1 7 0 .
9 1 . G a r d e s , M . , J . B o u s qu e t , a n d M . L a l o n d e . 1 9 8 7 .
I s o z y m e
v a r i a t i o n a m o n g 4 0 F r a n k i a s t r a i n s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l .

o
n

A
p
r
i
l

2
9
,

2
0
1
4

b
y

I
O
W
A

S
T
A
T
E

U
N
I
V
E
R
S
I
T
Y
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

5 3 :1 5 9 6 - 1 6 0 3 .
9 2 . G a r d e s , M . , a n d M . L a l o n d e . 1 9 8 7 . I d e n t i f i c a t i o n a n d s u b -
g r o u p i n g o f F r a n k i a s t r a i n s u s i n g s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e -
p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s . P h y s i o l . P l a n t . 7 0 :2 3 7 -
2 4 4 .
9 3 . G a u t h i e r , D. , H . G . Di e m , a n d Y. Do m m e r g u e s . 1 9 8 1 . I n v i t r o
n i t r o g e n f i x a t i o n b y t wo a c t i n o m y c e t e s t r a i n s i s o l a t e d f r o m
C a s u a r i n a n o d u l e s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 1 :3 0 6 - 3 0 8 .
9 4 . G a u t h i e r , D. , H . G . Di e m , a n d Y. Do m m e r g u e s . 1 9 8 1 . I n f e c -
t i v i t e e t e f f e c t i v i t e d e s o u c h e s d e F r a n k i a i s o l a e e s d e n o d u l e s
d e C a s u a r i n a e qu i s e t i f o l i a e t d ' H i p p o p h a e r h a m n o i d e s . C . R .
A c a d . S c . P a r i s S e r . I I I 2 9 3 :4 8 9 - 4 9 1 .
9 5 . G a u t h i e r , D. L . , H . G . Di e m , a n d Y. R . Do m m e r g u e s . 1 9 8 4 .
Tr o p i c a l a n d s u b t r o p i c a l a c t i n o r h i z a l p l a n t s . P e s qu i .
A g r o p e c u . B r a s . 1 9 9 :1 1 9 - 1 3 6 .
9 6 . G e r b e r , N . N . , a n d M . P . L e c h e v a l i e r . 1 9 8 4 . N o v e l b e n -
z o ( a ) n a p h a c e n e qu i n o n e , f r o m a n a c t i n o m y c e t e : F r a n k i a G 2
( O R S 0 2 0 6 0 4 ) . C a n . J . C h e m . 6 2 :2 8 1 8 - 2 8 2 1 .
9 7 . H a f e e z , F . , A . D. L . A k k e r m a n s , a n d A . H . C h a u d h a r y . 1 9 8 4 .
M o r p h o l o g y , p h y s i o l o g y a n d i n f e c t i v i t y o f t wo F r a n k i a i s o l a t e s
A n l a n d A n 2 f r o m r o o t n o d u l e s o f A l n u s n i t i d a . P l a n t S o i l
7 8 :4 5 - 5 9 .
9 8 . H a h n , D. , R . Ke s t e r , M . J . C . S t a r r e n b u r g , a n d A . D. L .
A k k e r m a n s . 1 9 9 0 . E x t r a c t i o n o f r i b o s o m a l R N A f r o m s o i l f o r
d e t e c t i o n o f F r a n k i a wi t h o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s . A r c h . M i -
c r o b i o l . 1 5 4 :3 2 9 - 3 3 5 .
9 9 . H a h n , D. , M . P . L e c h e v a l i e r , A . F i s c h e r , a n d E . S t a c k e b r a n d t .
1 9 8 9 . E v i d e n c e f o r a c l o s e p h y l o g e n e t i c r e l a t i o n s h i p b e t we e n
m e m b e r s o f t h e g e n e r a F r a n k i a , G e o d e r m a t o p h i l u s , a n d
"B l a s t o c o c c u s " a n d e m d e n d a t i o n o f t h e f a m i l y F r a n k i a c e a e .
S y s t . A p p l . M i c r o b i o l . 1 1 :2 3 6 - 2 4 2 .
1 0 0 . H a h n , D. , M . J . C . S t a r r e n b u r g , a n d A . D. L . A k k e r m a n s .
1 9 8 8 . V a r i a b l e c o m p a t i b i l i t y o f c l o n e d A l n u s g l u t i n o s a
e c o t y p e s a g a i n s t i n e f f e c t i v e F r a n k i a s t r a i n s . P l a n t S o i l 1 0 7 :
2 3 3 - 2 4 3 .
1 0 1 . H a h n , D. , M . J . C . S t a r r e n b u r g , a n d A . D. L . A k k e r m a n s .
1 9 9 0 . O l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s t h a t h y b r i d i z e wi t h r R N A a s a
t o o l t o s t u d y F r a n k i a s t r a i n s i n r o o t n o d u l e s . A p p l . E n v i r o n .
M i c r o b i o l . 5 6 :1 3 4 2 - 1 3 4 6 .
1 0 2 . H a n u s , F . J . , R . J . M a i e r , a n d H . J . E v a n s . 1 9 7 9 . A u t o t r o p h i c
g r o wt h o f H 2 - u p t a k e p o s i t i v e s t r a i n s o f R h i z o b i u m j a p o n i c u m
i n a n a t m o s p h e r e s u p p l i e d wi t h h y d r o g e n g a s . P r o c . N a t l .
A c a d . S c i . U S A 7 6 :1 7 8 8 - 1 7 9 2 .
1 0 3 . H a r r i o t t , 0 . T. , a n d D. R . B e n s o n . 1 9 9 2 . U n p u b l i s h e d o b s e r -
v a t i o n .
1 0 4 . H a r r i o t t , 0 . T. , L . Kh a i r a l l a h , a n d D. R . B e n s o n . 1 9 9 1 .
I s o l a t i o n a n d s t r u c t u r e o f t h e l i p i d e n v e l o p e s f r o m t h e n i t r o g e n -
f i x i n g v e s i c l e s o f F r a n k i a s p . s t r a i n C p I l . J . B a c t e r i o l . 1 7 3 :
2 0 6 1 - 2 0 6 7 .
1 0 5 . H a r r i s , S . , a n d W . S i l v e s t e r . 1 9 9 2 . N i t r o g e n a s e a c t i v i t y a n d
g r o wt h o f F r a n k i a i n b a t c h a n d c o n t i n u o u s c u l t u r e . C a n . J .
M i c r o b i o l . 3 8 :2 9 6 - 3 0 2 .
1 0 6 . H a r r i s , S . L . , a n d W . B . S i l v e s t e r . 1 9 9 2 . O x y g e n c o n t r o l s t h e
d e v e l o p m e n t o f F r a n k i a v e s i c l e s i n c o n t i n u o u s c u l t u r e . N e w
P h y t o l . 1 2 1 :4 3 - 4 8 .
1 0 7 . H a s e l k o r n , R . 1 9 7 8 . H e t e r o c y s t s . A n n u . R e v . P l a n t P h y s i o l .
2 9 :3 1 9 - 3 4 4 .
1 0 8 . H e u s s e r , L . E . , a n d N . J . S h a c k l e t o n . 1 9 7 9 . Di r e c t m a r i n e -
c o n t i n e n t a l c o r r e l a t i o n : 1 5 0 , 0 0 0 - y e a r o x y g e n i s o t o p e - p o l l e n
r e c o r d f r o m t h e N o r t h P a c i f i c . S c i e n c e 2 0 4 :8 3 7 - 8 3 8 .
1 0 9 . H o r r i e r e , F . 1 9 8 4 . I n v i t r o p h y s i o l o g i c a l a p p r o a c h t o c l a s s i f i -
c a t i o n o f F r a n k i a i s o l a t e s o f ' t h e A l n u s g r o u p ' b a s e d o n u r e a s e ,
p r o t e a s e a n d 3 - g l u c o s i d a s e a c t i v i t i e s . P l a n t S o i l 7 8 :7 - 1 3 .
1 1 0 . H o r r i e r e , F . , M . P . L e c h e v a l i e r , a n d H . A . L e c h a v a l i e r . 1 9 8 3 . I n
v i t r o m o r p h o g e n e s i s a n d u l t r a s t r u c t u r e o f a F r a n k i a s p . A r I 3
( A c t i n o m y c e t a l e s ) f r o m A l n u s r u b r a a n d a m o r p h o l o g i c a l l y
s i m i l a r i s o l a t e ( A i r I 2 ) f r o m A l n u s i n c a n a s u b s p . r u g o s a . C a n .
J . B o t . 6 1 :2 8 4 3 - 2 8 5 4 .
1 1 1 . H o s t e d , T. J . 1 9 9 2 . S t u d i e s o n F r a n k i a s y m b i o t i c g e n e s . P h . D.
t h e s i s . U n i v e r s i t y o f C o n n e c t i c u t , S t o r r s .
1 1 2 . H u a n g , J . - B . , Z . - Y. Z h a o , G . C h e n , a n d H . - C . L i u . 1 9 8 5 . H o s t
r a n g e o f F r a n k i a e n d o p h y t e s . P l a n t S o i l 8 7 :6 1 - 6 5 .
1 1 3 . H u n t , S . , B . J . Ki n g , D. J . C a n v i n , a n d D. B . L a y z e l l . 1 9 8 7 .
S t e a d y a n d n o n s t e a d y s t a t e g a s e x c h a n g e c h a r a c t e r i s t i c s o f
s o y b e a n n o d u l e s i n r e l a t i o n t o t h e o x y g e n d i f f u s i o n b a r r i e r .
P l a n t P h y s i o l . 8 4 :1 6 4 - 1 7 2 .
1 1 4 . H u s s - Da n e l l , K. 1 9 9 0 . Th e p h y s i o l o g y o f a c t i n o r h i z a l n o d u l e s ,
p . 1 2 9 - 1 5 6 . I n C . R . S c h wi n t z e r a n d J . D. Tj e p k e m a ( e d . ) , Th e
b i o l o g y o f F r a n k i a a n d a c t i n o r h i z a l p l a n t s . A c a d e m i c P r e s s ,
I n c . , N e w Yo r k .
1 1 5 . H u s s - Da n e l l , K. 1 9 9 1 . I n f l u e n c e o f h o s t ( A l n u s a n d M y r i c a )
g e n o t y p e o n i n f e c t i v i t y , N 2 f i x a t i o n , s p o r e f o r m a t i o n a n d
h y d r o g e n a s e a c t i v i t y i n F r a n k i a . N e w P h y t o l . 1 1 9 :1 2 1 - 1 2 7 .
1 1 6 . H u s s - Da n e l l , K. , a n d B . B e r g m a n . 1 9 9 0 . N i t r o g e n a s e i n
F r a n k i a f r o m r o o t n o d u l e s o f A l n u s i n c a n a ( L . ) M o e n c h :
i m m u n o l o c a l i z a t i o n o f t h e F e - a n d M o F e - p r o t e i n s d u r i n g
v e s i c l e d i f f e r e n t i a t i o n . N e w P h y t o l . 1 1 6 :4 4 3 - 4 5 5 .
1 1 7 . H u s s - Da n e l l , K. , a n d A . F r e j . 1 9 8 6 . Di s t r i b u t i o n o f F r a n k i a
s t r a i n s i n f o r e s t a n d a f f o r e s t a t i o n s i t e s i n N o r t h e r n S we d e n .
P l a n t S o i l 9 0 :4 0 7 - 4 1 8 .
1 1 8 . H u s s - Da n e l l , K. , W . R o e l o f s e n , A . D. L . A k k e r m a n s , a n d P .
M e i e r . 1 9 8 2 . C a r b o n m e t a b o l i s m o f F r a n k i a s p p . i n r o o t
n o d u l e s o f A l n u s g l u t i n o s a a n d H i p p o p h a e r h a m n o i d e s . P h y s -
i o l . P l a n t . 5 4 :4 6 1 - 4 6 6 .
1 1 9 . J a u r i n , B . , a n d S . N . C o h e n . 1 9 8 5 . S t r e p t o m y c e s c o n t a i n
E s c h e r i c h i a c o l i - t y p e A + T- r i c h p r o m o t e r s h a v i n g n o v e l s t r u c -
t u r a l f e a t u r e s . G e n e 3 9 :1 9 1 - 2 0 1 .
1 2 0 . J o s e p h , C . M . , a n d J . C . M e e k s . 1 9 8 7 . R e g u l a t i o n o f e x p r e s s i o n
o f g l u t a m i n e s y n t h e t a s e i n a s y m b i o t i c N o s t o c s t r a i n a s s o c i -
a t e d wi t h A n t h o c e r o s p u n c t a t u s . J . B a c t e r i o l . 1 6 9 :2 4 7 1 - 2 4 7 5 .
1 2 1 . Ka n n e n b e r g , E . , K. P o r a l l a , a n d A . B l u m e . 1 9 8 0 . A h o p a n o i d
f r o m t h e t h e r m o a c i d o p h i l e B a c i l l u s a c i d o c a l d a r i u s c o n d e n s e s
m e m b r a n e s . N a t u r wi s s e n s c h a f t e n 6 7 :4 5 8 - 4 5 9 .
1 2 2 . Ku m a d a , Y. , D. R . B e n s o n , D. H i l l e m a n n , T. J . H o s t e d , D. A .
R o c h e f o r t , C . Th o m p s o n , W . W o h l l e b e n , a n d Y. Ta t e n o . E v o -
l u t i o n o f t h e g l u t a m i n e s y n t h e t a s e g e n e : o n e o f t h e o l d e s t g e n e s
e v e r s t u d i e d . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A , i n p r e s s .
1 2 3 . Ku m a d a , Y. , E . Ta k a n o , K. N a g a o k a , a n d C . J . Th o m p s o n .
1 9 9 0 . S t r e p t o m y c e s h y g r o s c o p i c u s h a s t wo g l u t a m i n e s y n -
t h e t a s e g e n e s . J . B a c t e r i o l . 1 7 2 :5 3 4 3 - 5 3 5 1 .
1 2 4 . L a l o n d e , M . 1 9 7 7 . Th e i n f e c t i o n p r o c e s s o f t h e A l n u s r o o t
n o d u l e s y m b i o s i s , p . 5 6 9 - 5 8 9 . I n W . E . N e wt o n , J . R . P o s t -
g a t e , a n d C . R o d r i g u e z - B a r r u e c o ( e d . ) , R e c e n t d e v e l o p m e n t s
i n n i t r o g e n f i x a t i o n . A c a d e m i c P r e s s , I n c . , N e w Yo r k .
1 2 5 . L a l o n d e , M . 1 9 7 8 . C o n f i r m a t i o n o f t h e i n f e c t i v i t y o f a f r e e -
l i v i n g a c t i n o m y c e t e i s o l a t e d f r o m C o m p t o n i a p e r e g r i n a r o o t
n o d u l e s b y i m m u n o l o g i c a l a n d u l t r a s t r u c t u r a l s t u d i e s . C a n . J .
B o t . 5 6 :2 6 2 1 - 2 6 3 5 .
1 2 6 . L a l o n d e , M . 1 9 7 9 . I m m u n o l o g i c a l a n d u l t r a s t r u c t u r a l d e m o n -
s t r a t i o n o f n o d u l a t i o n o f t h e E u r o p e a n A l n u s g l u t i n o s a ( L . )
G a e r t n . h o s t p l a n t b y a n a c t i n o m y c e t a l i s o l a t e f r o m t h e N o r t h
A m e r i c a n C o m p t o n i a p e r e g r i n a ( L . ) C o u l t . r o o t n o d u l e . B o t .
G a z . 1 4 0 ( S u p p l . ) :S 3 5 - S 4 3 .
1 2 7 . L a l o n d e , M . , a n d H . E . C a l v e r t . 1 9 7 9 . P r o d u c t i o n o f F r a n k i a
h y p h a e a n d s p o r e s a s a n i n f e c t i v e i n o c u l a n t f o r A l n u s s p e c i e s ,
p . 9 5 - 1 1 0 . I n J . C . G o r d o n , C . T. W h e e l e r , a n d D. A . P e r r y
( e d . ) , S y m b i o t i c n i t r o g e n f i x a t i o n i n t h e m a n a g e m e n t o f t e m -
p e r a t e f o r e s t s . F o r e s t R e s e a r c h L a b o r a t o r y , O r e g o n S t a t e
U n i v e r s i t y , C o r v a l l i s .
1 2 8 . L a l o n d e , M . , H . E . C a l v e r t , a n d S . P i n e . 1 9 8 1 . I s o l a t i o n a n d u s e
o f F r a n k i a s t r a i n s i n a c t i n o r h i z a e f o r m a t i o n , p . 2 9 6 - 2 9 9 . I n
A . H . G i b s o n a n d W . E . N e wt o n ( e d . ) , C u r r e n t p e r s p e c t i v e s i n
n i t r o g e n f i x a t i o n . A u s t r a l i a n A c a d e m y o f S c i e n c e s , C a n b e r r a .
1 2 9 . L a l o n d e , M . , a n d R . Kn o wl e s . 1 9 7 5 . U l t r a s t r u c t u r e o f t h e A l n u s
c r i s p a v a r . m o l l i s F e r n . r o o t n o d u l e e n d o p h y t e . C a n . J . M i c r o -
b i o l . 2 1 :1 0 5 8 - 1 0 8 0 .
1 3 0 . L a l o n d e , M . , a n d R . Kn o wl e s . 1 9 7 5 . U l t r a s t r u c t u r e , c o m p o s i -
t i o n , a n d b i o g e n e s i s o f t h e e n c a p s u l a t i o n m a t e r i a l s u r r o u n d i n g
t h e e n d o p h y t e i n A l n u s c r i s p a v a r . m o l l i s r o o t n o d u l e s . C a n . J .
B o t . 5 3 :1 9 5 1 - 1 9 7 1 .
1 3 1 . L a l o n d e , M . , R . Kn o wl e s , a n d I . W . De v o e . 1 9 7 6 . A b s e n c e o f
"v o i d a r e a " i n f r e e z e - e t c h e d v e s i c l e s o f t h e A l n u s c r i s p a v a r .
m o l l i s F e r n . r o o t n o d u l e e n d o p h y t e . A r c h . M i c r o b i o l . 1 0 7 :2 6 3 -
2 6 7 .
1 3 2 . L a l o n d e , M . , L . S i m o n , J . B o u s qu e t , a n d A . S e g u i n . 1 9 8 8 .
A d v a n c e s i n t h e t a x o n o m y o f F r a n k i a : r e c o g n i t i o n o f s p e c i e s
V O L . 5 7 , 1 9 9 3

o
n

A
p
r
i
l

2
9
,

2
0
1
4

b
y

I
O
W
A

S
T
A
T
E

U
N
I
V
E
R
S
I
T
Y
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

a l n i a n d
e l a e a g n i
a n d n o v e l
s u b s p e c i e s p o m m e r i i a n d v a n d i j k i i ,
p .
6 7 1 - 6 8 0 . I n H .
B o t h e ,
F . J .
De B r u i j n , a n d W . E . N e wt o n
( e d . ) , N i t r o g e n
f i x a t i o n : h u n d r e d
y e a r s
a f t e r . G u s t a v
F i s c h e r ,
N e w Yo r k .
1 3 3 .
L a m o n t ,
H .
C . ,
W . B .
S i l v e s t e r ,
a n d J . G .
To r r e y .
1 9 8 8 . N i l e
r e d f l u o r e s c e n c e d e m o n s t r a t e s
l i p i d
i n t h e
e n v e l o p e
o f v e s i c l e s
f r o m
N 2 - f i x i n g
c u l t u r e s o f F r a n k i a . C a n . J . M i c r o b i o l . 3 4 :6 5 6 -
6 6 0 .
1 3 4 .
L a n c e l l e ,
S .
A . , J . G .
To r r e y ,
P . K.
H e p l e r ,
a n d D. A .
C a l l a h a m . 1 9 8 5 . U l t r a s t r u c t u r e o f f r e e z e - s u b s t i t u t e d F r a n k i a
s t r a i n
H F P C c I 3 ,
t h e
a c t i n o m y c e t e
i s o l a t e d f r o m r o o t n o d u l e s
o f C a s u a r i n a c u n n i n g h a m i a n a . P r o t o p l a s m a 1 2 7 :6 4 - 7 2 .
1 3 5 .
L e c h e v a l i e r ,
M . P . 1 9 8 3 .
C a t a l o g i n g
F r a n k i a s t r a i n s . C a n . J .
M i c r o b i o l . 6 1 :2 9 6 4 - 2 9 6 7 .
1 3 6 .
M . P . 1 9 8 5 .
C a t a l o g
o f F r a n k i a
s t r a i n s , s e c o n d
e d i t i o n .
A c t i n o m y c e t e s
1 9 :1 3 1 - 1 6 2 .
1 3 7 .
M .
P . ,
D.
B a k e r ,
a n d F .
H o r r i e r e .
1 9 8 3 .
P h y s i o l -
o g y , c h e m i s t r y , s e r o l o g y ,
a n d
i n f e c t i v i t y
o f t wo F r a n k i a i s o -
l a t e s f r o m A l n u s i n c a n a
s u b s p . r u g o s a .
C a n . J . B o t . 6 1 :2 8 2 6 -
2 8 3 3 .
1 3 8 .
M .
P . ,
D. P .
L a b e d a ,
a n d J . R u a n . 1 9 8 7 . S t u d i e s
o n F r a n k i a
s p . L L R 0 2 0 2 2 f r o m C a s u a r i n a
c u n n i n g h a m i a n a
a n d i t s m u t a n t L L R 0 2 0 2 3 . P h y s i o l .
P l a n t . 7 0 :2 4 9 - 2 5 4 .
1 3 9 .
M .
P . ,
a n d H . A . L e c h e v a l i e r . 1 9 7 9 . Th e t a x o -
n o m i c
p o s i t i o n
o f t h e
a c t i n o m y c e t i c e n d o p h y t e s , p . 1 1 1 - 1 2 2 . I n
J . C .
G o r d o n ,
C . T.
W h e e l e r ,
a n d D. A .
P e r r y ( e d . ) , S y m b i o t i c
n i t r o g e n
f i x a t i o n i n t h e
m a n a g e m e n t
o f
t e m p e r a t e f o r e s t s .
F o r e s t R e s e a r c h
L a b o r a t o r y , O r e g o n S t a t e U n i v e r s i t y , C o r v a l -
l i s .
1 4 0 .
M .
P . ,
a n d H . A . L e c h e v a l i e r . 1 9 8 4 . Ta x o n o m y o f
F r a n k i a , p .
5 7 5 - 5 8 2 . I n L .
O r t i z - O r t i z ,
L . F . B o j a l i l , a n d V .
Ya k o l e f f
( e d . ) , B i o l o g i c a l , b i o c h e m i c a l , a n d b i o m e d i c a l a s p e c t s
o f
A c t i n o m y c e t e s .
A c a d e m i c
P r e s s , I n c . , N e w Yo r k .
1 4 1 .
M .
P . , a n d H . A . L e c h e v a l i e r . 1 9 8 9 . G e n u s F r a n k i a
B r u n c h o r s t
1 8 8 6 , 1 7 4 A L , p . 2 4 1 0 - 2 4 1 7 . I n S . T. W i l l i a m s , M . E .
S h a r p e ,
a n d J . G . H o l t
( e d . ) , B e r g e y ' s m a n u a l o f s y s t e m a t i c
b a c t e r i o l o g y ,
v o l . 4 . Th e W i l l i a m s & W i l k i n s C o . , B a l t i m o r e .
1 4 2 .
M .
P . , a n d H . A . L e c h e v a l i e r . 1 9 9 0 . S y s t e m a t i c s ,
i s o l a t i o n ,
a n d c u l t u r e o f F r a n k i a , p . 3 5 - 6 0 . I n C . R . S c h wi n t z e r
a n d J . D.
Tj e p k e m a ( e d . ) , Th e b i o l o g y o f F r a n k i a a n d a c t i -
n o r h i z a l
p l a n t s . A c a d e m i c P r e s s , I n c . , N e w Yo r k .
1 4 3 .
M .
P . ,
a n d J . S . R u a n . 1 9 8 4 .
P h y s i o l o g y a n d
c h e m i c a l
d i v e r s i t y
o f F r a n k i a
s p p . i s o l a t e d f r o m n o d u l e s o f
C o m p t o n i a p e r e g r i n a ( L . )
C o u l t . a n d C e a n o t h u s a m e n c a n u s
L . P l a n t S o i l 7 8 :1 5 - 2 2 .
1 4 3 a . L e o n a r d , J . T. P e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n .
1 4 4 .
L i n d b l a d , P . , a n d B . B e r g m a n . 1 9 8 6 . G l u t a m i n e s y n t h e t a s e :
a c t i v i t y
a n d l o c a l i z a t i o n i n c y a n o b a c t e r i a o f t h e c y c a d s C y c a s
r e v o l u t a a n d Z a m i a s k i n n e r i . P l a n t a 1 6 9 :1 - 7 .
1 4 5 .
L i n d b l a d , P . ,
a n d A . S e l l s t e d t . 1 9 8 9 . I m m u n o g o l d l o c a l i z a t i o n
o f
i n
f r e e - l i v i n g
F r a n k i a
C p l l . F E M S M i c r o b i o l .
L e t t . 6 0 :3 1 1 - 3 1 6 .
1 4 6 .
L i u , Q . ,
a n d A . M . B e r r y . 1 9 9 1 . Th e i n f e c t i o n p r o c e s s a n d
n o d u l e i n i t i a t i o n i n t h e F r a n k i a - C e a n o t h u s r o o t n o d u l e s y m b i -
o s i s .
P r o t o p l a s m a 1 6 3 :8 2 - 9 2 .
1 4 7 .
L i u , Q . ,
a n d A . M . B e r r y . 1 9 9 1 . L o c a l i z a t i o n a n d c h a r a c t e r -
i z a t i o n o f
p e c t i c p o l y s a c c h a r i d e s i n r o o t s a n d r o o t n o d u l e s o f
C e a n o t h u s
s p p . d u r i n g i n t e r c e l l u l a r i n f e c t i o n b y F r a n k i a . P r o -
t o p l a s m a
1 6 3 :9 3 - 1 0 1 .
1 4 8 .
L o c c i , R . ,
a n d G . P . S h a r p l e s . 1 9 8 4 . M o r p h o l o g y , p . 1 6 5 - 1 9 9 .
I n M .
G o o d f e l l o w, M . M o r d a r s k i , a n d S . T. W i l l i a m s ( e d . ) ,
Th e
b i o l o g y
o f t h e a c t i n o m y c e t e s . A c a d e m i c P r e s s , I n c . , N e w
Yo r k .
1 4 9 .
L o n g e r i , L . , a n d M . A b a r z u a . 1 9 8 9 . U l t r a s t r u c t u r e o f F r a n k i a
i s o l a t e d f r o m t h r e e C h i l e a n s h r u b s ( R h a m n a c e a e ) , p . 4 7 - 5 3 . I n
F . A . S k i n n e r
( e d . ) , N i t r o g e n f i x a t i o n wi t h n o n - l e g u m e s .
Kl u we r A c a d e m i c
P u b l i s h e r s , Do r d r e c h t , Th e N e t h e r l a n d s .
1 5 0 .
L o p e z ,
M .
F . ,
M . S . F o n t a i n e , a n d J . G . To r r e y . 1 9 8 4 . L e v e l s o f
t r e h a l o s e a n d
g l y c o g e n i n F r a n k i a s p . H F P A r I 3 ( A c t i n o m y c e -
t a l e s ) .
C a n . J . M i c r o b i o l . 3 0 :7 4 6 - 7 5 2 .
1 5 1 .
L o p e z ,
M .
F . , a n d J . G . To r r e y . 1 9 8 5 . E n z y m e s o f g l u c o s e
m e t a b o l i s m i n F r a n k i a
s p . J . B a c t e r i o l . 1 6 2 :1 1 0 - 1 1 6 .
1 5 2 .
L o p e z ,
M .
F . ,
P .
Yo u n g , a n d J . G . To r r e y . 1 9 8 6 . A c o m p a r i s o n
o f c a r b o n s o u r c e u t i l i z a t i o n f o r g r o wt h a n d n i t r o g e n a s e a c t i v i t y
i n t wo F r a n k i a i s o l a t e s . C a n . J . M i c r o b i o l . 3 2 :3 5 3 - 3 5 8 .
1 5 3 . L o w, K. B . 1 9 8 7 . M a p p i n g t e c h n i qu e s a n d d e t e r m i n a t i o n o f
c h r o m o s o m e s i z e , p . 1 1 8 4 - 1 1 8 9 . I n F . C . N e i d h a r d t , J . L .
I n g r a h a m , K. B . L o w, B . M a g a s a n i k , M . S c h a e c h t e r , a n d
H . E . U m b a r g e r ( e d . ) , E s c h e r i c h i a c o l i a n d S a l m o n e l l a t y p h -
i m u r i u m : c e l l u l a r a n d m o l e c u l a r b i o l o g y . A m e r i c a n S o c i e t y f o r
M i c r o b i o l o g y , W a s h i n g t o n , D. C .
1 5 4 . L u n d qu i s t , P . - O . , a n d K. H u s s - Da n e l l . 1 9 9 2 . I m m u n o l o g i c a l
s t u d i e s o f g l u t a m i n e s y n t h e t a s e i n F r a n k i a - A l n u s i n c a n a s y m -
b i o s e s . F E M S M i c r o b i o l . L e t t . 9 1 :1 4 1 - 1 4 6 .
1 5 5 . M a l c o l m , D. C . , J . E . H o o k e r , a n d C . T. W h e e l e r . 1 9 8 5 .
F r a n k i a s y m b i o s i s a s a s o u r c e o f n i t r o g e n i n f o r e s t r y : a c a s e
s t u d y o n s y m b i o t i c n i t r o g e n - f i x a t i o n i n a m i x e d A l n u s - P i c e a
p l a n t a t i o n i n S c o t l a n d . P r o c . R . S o c . E d i n b . S e c t . B 8 5 :2 6 2 -
2 8 2 .
1 5 6 . M a z z u c c o , C . , a n d D. R . B e n s o n . 1 9 8 4 . [1 4 C ] m e t h y l a m m o n i u m
t r a n s p o r t b y F r a n k i a s p s t r a i n C p l l . J . B a c t e r i o l . 1 6 0 :6 3 6 - 6 4 1 .
1 5 7 . M e e s t e r s , T. M . 1 9 8 7 . L o c a l i z a t i o n o f n i t r o g e n a s e i n v e s i c l e s o f
F r a n k i a s p . C c I 7 b y i m m u n o g o l d l a b e l l i n g o n u l t r a t h i n s e c -
t i o n s . A r c h . M i c r o b i o l . 1 4 6 :3 2 7 - 3 3 1 .
1 5 8 . M e e s t e r s , T. M . , S . T. v a n G e n e s e n , a n d A . D. L . A k k e r m a n s .
1 9 8 5 . G r o wt h , a c e t y l e n e r e d u c t i o n a c t i v i t y a n d l o c a l i z a t i o n o f
n i t r o g e n a s e i n r e l a t i o n t o v e s i c l e f o r m a t i o n i n F r a n k i a s t r a i n s
C c l . 1 7 a n d C p l . 2 . A r c h . M i c r o b i o l . 1 4 3 :1 3 7 - 1 4 2 .
1 5 9 . M e e s t e r s , T. M . , W . M . V a n V l i e t , a n d A . D. L . A k k e r m a n s .
1 9 8 7 . N i t r o g e n a s e i s r e s t r i c t e d t o t h e v e s i c l e s i n F r a n k i a s t r a i n
E A N l p e c . P h y s i o l . P l a n t . 7 0 :2 6 7 - 2 7 1 .
1 6 0 . M i a n , S . , a n d G . B o n d . 1 9 7 8 . Th e o n s e t o f n i t r o g e n f i x a t i o n i n
y o u n g a l d e r p l a n t s a n d i t s r e l a t i o n t o d i f f e r e n t i a t i o n i n t h e
n o d u l a r e n d o p h y t e . N e w P h y t o l . 8 0 :1 8 7 - 1 9 2 .
1 6 1 . M i l l e r , I . M . , a n d D. D. B a k e r . 1 9 8 5 . I n i t i a t i o n , d e v e l o p m e n t
a n d s t r u c t u r e o f r o o t n o d u l e s i n E l a e a g n u s a n g u s t i f o l i a L .
( E l a e a g n a c e a e ) . P r o t o p l a s m a 1 2 8 :1 0 7 - 1 1 9 .
1 6 2 . M i l l e r , I . M . , a n d D. D. B a k e r . 1 9 8 6 . N o d u l a t i o n o f a c t i n o r h i z a l
p l a n t s b y F r a n k i a s t r a i n s c a p a b l e o f b o t h r o o t h a i r i n f e c t i o n
a n d i n t e r c e l l u l a r p e n e t r a t i o n . P r o t o p l a s m a 1 3 1 :8 2 - 9 1 .
1 6 3 . M i r z a , M . S . , A . H . C h a u d h a r y , a n d A . D. L . A k k e r m a n s . 1 9 8 7 .
H y d r o g e n u p t a k e b y t h e n i t r o g e n f i x i n g r o o t n o d u l e s a n d
n o d u l e h o m o g e n a t e s o f C o r i a r i a n e p a l e n s i s . P a k . J . B o t .
1 9 :2 3 7 - 2 4 1 .
1 6 4 . M i r z a , M . S . , D. H a h n , a n d A . D. L . A k k e r m a n s . I s o l a t i o n a n d
c h a r a c t e r i z a t i o n o f F r a n k i a s t r a i n s f r o m C o r i a r i a n e p a l e n s i s .
S y s t . A p p l . M i c r o b i o l . , i n p r e s s .
1 6 5 . M i r z a , M . S . , J . D. J a n s e , D. H a h n , a n d A . D. L . A k k e r m a n s .
1 9 9 1 . I d e n t i f i c a t i o n o f a t y p i c a l F r a n k i a s t r a i n s b y f a t t y a c i d
a n a l y s i s . F E M S M i c r o b i o l . L e t t . 8 3 :9 1 - 9 8 .
1 6 6 .
M o n z , C . A . , a n d C . R . S c h wi n t z e r . 1 9 8 9 . Th e p h y s i o l o g y o f
s p o r e - n e g a t i v e a n d s p o r e - p o s i t i v e n o d u l e s o f M y i c a g a l e .
P l a n t S o i l 1 1 8 :7 5 - 8 7 .
1 6 7 . M o o r e , A . W . 1 9 6 4 . N o t e o n n o n - l e g u m i n o u s n i t r o g e n - f i x i n g
p l a n t s i n A l b e r t a . C a n . J . B o t . 4 2 :9 5 2 - 9 5 5 .
1 6 8 . M o r t , A . , P . N o r m a n d , a n d M . L a l o n d e . 1 9 8 3 . 2 - O - m e t h y l - D-
m a n n o s e , a k e y s u g a r i n t h e t a x o n o m y o f F r a n k i a . C a n . J .
M i c r o b i o l . 2 9 :9 9 3 - 1 0 0 2 .
1 6 9 . M u l l e r , A . , P . B e n o i s t , H . G . Di e m , a n d J . S c h we n c k e . 1 9 9 1 .
A g e - d e p e n d e n t c h a n g e s i n e x t r a c e l l u l a r p r o t e i n s , a m i n o p e p t i -
d a s e a n d
p r o t e i n a s e a c t i v i t i e s i n F r a n k i a i s o l a t e B R . J . G e n .
M i c r o b i o l . 1 3 7 :2 7 8 7 - 2 7 9 6 .
1 7 0 .
M u l l i n , B . C . , a n d C . S . A n . 1 9 9 0 . Th e m o l e c u l a r g e n e t i c s o f
F r a n k i a , p . 1 9 5 - 2 1 4 . I n C . R . S c h wi n t z e r a n d J . D. Tj e p k e m a
( e d . ) , Th e b i o l o g y o f F r a n k i a a n d a c t i n o r h i z a l p l a n t s . A c a -
d e m i c P r e s s , I n c . , N e w Yo r k .
1 7 1 .
M u l l i n , B . C . , S . M . S we n s e n , a n d P . G o e t t i n g - M i n e s k y . 1 9 9 0 .
H y p o t h e s e s f o r t h e e v o l u t i o n o f a c t i n o r h i z a l s y m b i o s e s , p .
7 8 1 - 7 8 7 . I n P . M . G r e s s h o f f , L . E . R o t h , G . S t a c e y a n d W . E .
N e wt o n ( e d . ) , N i t r o g e n f i x a t i o n : a c h i e v e m e n t s a n d o b j e c t i v e s .
C h a p m a n & H a l l , N e w Yo r k .
1 7 2 .
M u r r a y , R . G . E . , D. J . B r e n n e r , R . R . C o l we l l , P . De V o s , M .
G o o d f e l l o w, P . A . D. G r i m o n t , N . P f e n n i g , E . S t a c k e b r a n d t ,
a n d A . Z a v a r z i n . 1 9 9 0 . R e p o r t o f t h e a d h o c c o m m i t t e e o n
a p p r o a c h e s t o t a x o n o m y wi t h i n t h e P r o t e o b a c t e r i a . I n t . J .
S y s t .
B a c t e r i o l . 4 0 :2 1 3 - 2 1 5 .

o
n

A
p
r
i
l

2
9
,

2
0
1
4

b
y

I
O
W
A

S
T
A
T
E

U
N
I
V
E
R
S
I
T
Y
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

1 7 3 . M u r r y , M . A . , M . S . F o n t a i n e , a n d J . D. Tj e p k e m a . 1 9 8 4 .
O x y g e n p r o t e c t i o n o f n i t r o g e n a s e i n F r a n k i a s p . H F P A r I 3 .
A r c h . M i c r o b i o l . 1 3 9 :1 6 2 - 1 6 6 .
1 7 4 . M u r r y , M . A . , M . S . F o n t a i n e , a n d J . G . To r r e y . 1 9 8 4 . G r o wt h
k i n e t i c s a n d n i t r o g e n a s e i n d u c t i o n i n F r a n k i a s p . H F P A r I 3
g r o wn i n b a t c h c u l t u r e . P l a n t S o i l 7 8 :6 1 - 7 8 .
1 7 5 . M u r r y , M . A . , a n d M . F . L o p e z . 1 9 8 9 . I n t e r a c t i o n b e t we e n
h y d r o g e n a s e , n i t r o g e n a s e , a n d r e s p i r a t o r y a c t i v i t i e s i n a
F r a n k i a i s o l a t e f r o m A l n u s r u b r a . C a n . J . M i c r o b i o l . 3 5 :6 3 6 - 6 4 1 .
1 7 6 . M u r r y , M . A . , Z . Z h a n g , a n d J . G . To r r e y . 1 9 8 5 . E f f e c t O f 0 2
o n v e s i c l e f o r m a t i o n , a c e t y l e n e r e d u c t i o n , a n d 0 2 - u p t a k e k i -
n e t i c s i n F r a n k i a s p . H F P C c I 3 i s o l a t e d f r o m C a s u a r i n a c u n -
n i n g h a m i a n a . C a n . J . M i c r o b i o l . 3 1 :8 0 4 - 8 0 9 .
1 7 7 . M y r o l d , D. D. , A . B . H i l g e r , a n d S . H . S t r a u s s . 1 9 9 0 . De t e c t i n g
F r a n k i a i n s o i l u s i n g P C R , p . 4 2 9 . I n P . M . G r e s s h o f f , L . E v a n s
R o t h , G . S t a c e y , a n d W . E . N e wt o n ( e d . ) , N i t r o g e n f i x a -
t i o n : a c h i e v e m e n t s a n d o b j e c t i v e s . C h a p m a n & H a l l , N e w
Yo r k .
1 7 8 . N a z a r e t , S . , B . C o u r n o y e r , P . N o r m a n d , a n d P . S i m o n e t . 1 9 9 1 .
P h y l o g e n e t i c r e l a t i o n s h i p s a m o n g F r a n k i a g e n o m i c s p e c i e s
d e t e r m i n e d b y u s e o f a m p l i f i e d 1 6 S r DN A s e qu e n c e s . J .
B a c t e r i o l . 1 7 3 :4 0 7 2 - 4 0 7 8 .
1 7 9 . N e wc o m b , W . , D. B a k e r , a n d J . G . To r r e y . 1 9 8 7 . O n t o g e n y a n d
f i n e s t r u c t u r e o f e f f e c t i v e r o o t n o d u l e s o f t h e a u t u m n o l i v e
( E l a e a g n u s u m b e l l a t a ) . C a n . J . B o t . 6 5 :8 0 - 9 4 .
1 8 0 . N e wc o m b , W . , D. C a l l a h a m , J . G . To r r e y , a n d R . L . P e t e r s o n .
1 9 7 9 . M o r p h o g e n e s i s a n d f i n e s t r u c t u r e o f t h e a c t i n o m y c e t o u s
e n d o p h y t e o f n i t r o g e n - f i x i n g r o o t n o d u l e s o f C o m p t o n i a p e r e -
g r i n a . B o t . G a z . 1 4 0 ( S u p p l . ) :S 2 2 - S 3 4 .
1 8 1 . N e wc o m b , W . , a n d S . M . W o o d . 1 9 8 7 . M o r p h o g e n e s i s a n d f i n e
s t r u c t u r e o f F r a n k i a ( A c t i n o m y c e t a l e s ) : t h e m i c r o s y m b i o n t o f
n i t r o g e n - f i x i n g a c t i n o r h i z a l r o o t n o d u l e s . I n t . R e v . C y t o l .
1 0 9 :1 - 8 8 .
1 8 2 . N i t t a y a j a r n , A . , B . C . M u l l i n , a n d D. D. B a k e r . 1 9 9 0 . S c r e e n i n g
o f s y m b i o t i c f r a n k i a e f o r h o s t s p e c i f i c i t y b y r e s t r i c t i o n f r a g -
m e n t l e n g t h p o l y m o r p h i s m a n a l y s i s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l .
5 6 :1 1 7 2 - 1 1 7 4 .
1 8 3 . N o r i d g e , N . A . , a n d D. R . B e n s o n . 1 9 8 6 . I s o l a t i o n a n d n i t r o g e n -
f i x i n g a c t i v i t y o f F r a n k i a s p . s t r a i n C p I l v e s i c l e s . J . B a c t e r i o l .
1 6 6 :3 0 1 - 3 0 5 .
1 8 4 . N o r m a n d , P . , a n d J . B o u s qu e t . 1 9 8 9 . P h y l o g e n y o f n i t r o g e n a s e
s e qu e n c e s i n F r a n k i a a n d o t h e r n i t r o g e n - f i x i n g m i c r o o r g a n -
i s m s . J . M o l . E v o l . 2 9 :4 3 6 - 4 4 7 .
1 8 5 . N o r m a n d , P . , B . C o u r n o y e r , P . S i m o n e t , a n d S . N a z a r e t . 1 9 9 2 .
A n a l y s i s o f a r i b o s o m a l R N A o p e r o n i n t h e a c t i n o m y c e t e
F r a n k i a . G e n e 1 1 1 :1 1 9 - 1 2 4 .
1 8 6 . N o r m a n d , P . , J . A . Do wn i e , A . W . B . J o h n s t o n , T. Ki e s e r , a n d
M . L a l o n d e . 1 9 8 5 . C l o n i n g o f a m u l t i c o p y p l a s m i d f r o m t h e
a c t i n o r h i z a l n i t r o g e n - f i x i n g b a c t e r i u m F r a n k i a a n d d e t e r m i n a -
t i o n o f i t s r e s t r i c t i o n m a p . G e n e 3 4 :3 6 7 - 3 7 0 .
1 8 7 . N o r m a n d , P . , M . G o u y , B . C o u r n o y e r , a n d P . S i m o n e t . 1 9 9 2 .
N u c l e o t i d e s e qu e n c e o f n i f D f r o m F r a n k i a a l n i s t r a i n A r I 3 :
p h y l o g e n e t i c i n f e r e n c e s . M o l . B i o l . E v o l . 9 :4 9 5 - 5 0 6 .
1 8 8 . N o r m a n d , P . , a n d M . L a l o n d e . 1 9 8 2 . E v a l u a t i o n o f F r a n k i a
s t r a i n s i s o l a t e d f r o m p r o v e n a n c e s o f t wo A l n u s s p e c i e s . C a n . J .
M i c r o b i o l . 2 8 :1 1 3 3 - 1 1 4 2 .
1 8 9 . N o r m a n d , P . , a n d M . L a l o n d e . 1 9 8 6 . Th e g e n e t i c s o f a c t i -
n o r h i z a l F r a n k i a : a r e v i e w. P l a n t S o i l 9 0 :4 2 9 - 4 5 3 .
1 9 0 . N o r m a n d , P . , P . S i m o n e t , a n d R . B a r d i n . 1 9 8 8 . C o n s e r v a t i o n o f
n i f s e qu e n c e s i n F r a n k i a . M o l . G e n . G e n e t . 2 1 3 :2 3 8 - 2 4 6 .
1 9 1 . N o r m a n d , P . , P . S i m o n e t , J . L . B u t o u r , C . R o s e n b e r g , A .
M o i r o u d , a n d M . L a l o n d e . 1 9 8 3 . P l a s m i d s i n F r a n / i a s p . J .
B a c t e r i o l . 1 5 5 :3 2 - 3 5 .
1 9 2 . P a r s o n s , R . , W . B . S i l v e s t e r , S . H a r r i s , W . T. M . G r u i t e r s , a n d
S . B u l l i v a n t . 1 9 8 7 . F r a n k i a v e s i c l e s p r o v i d e i n d u c i b l e a n d
a b s o l u t e o x y g e n p r o t e c t i o n f o r n i t r o g e n a s e . P l a n t P h y s i o l .
8 3 :7 2 8 - 7 3 1 .
1 9 3 . P i c a r d , C . , C . P o n s o n n e t , E . P a g e t , X. N e s m e , a n d P . S i m o n e t .
1 9 9 2 . De t e c t i o n a n d e n u m e r a t i o n o f b a c t e r i a i n s o i l b y d i r e c t
DN A e x t r a c t i o n a n d p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n . A p p l . E n v i -
r o n . M i c r o b i o l . 5 8 :2 7 1 7 - 2 7 2 2 .
1 9 4 . P o m m e r , E . H . 1 9 5 9 . U b e r d i e I s o l i e r u n g d e s
E n d o p h y t e n a u s
d e n W u r z e l k n o l l c h e n A l n u s g l u t i n o s a G a e r t n . u n d u b e r e r f o l -
g r e i c h e r e - i n f e k t i o n s v e r s u c h e . B e r . Dt s c h . B o t . G e s . 7 2 :1 3 8 -
1 5 0 .
1 9 5 .
P r a k a s h , R . K. , a n d B . C u m m i n g s . 1 9 8 8 . C r e a t i o n o f n o v e l
n i t r o g e n - f i x i n g a c t i n o m y c e t e s b y p r o t o p l a s t f u s i o n o f F r a n k i a
wi t h s t r e p t o m y c e s . P l a n t M o l . B i o l . 1 0 :2 8 1 - 2 8 9 .
1 9 6 . P r i n , Y. , L . M a g g i a , B . P i c a r d , H . G . Di e m , a n d P . G o u l l e t .
1 9 9 1 . E l e c t r o p h o r e t i c c o m p a r i s o n o f e n z y m e s f r o m 2 2 s i n g l e -
s p o r e c u l t u r e s o b t a i n e d f r o m F r a n / c i a s t r a i n O R S 1 4 0 1 0 2 .
F E M S M i c r o b i o l . L e t t . 7 7 :2 2 3 - 2 2 8 .
1 9 7 . P u p p o , A . , L .
Di m i t r i j e v i c , H . G . Di e m , a n d Y. R . Do m m e r -
g u e s .
1 9 8 5 .
H o m o g e n e i t y o f s u p e r o x i d e d i s m u t a s e p a t t e r n s i n
F r a n / c i a s t r a i n s f r o m C a s u a r i n a c e a e . F E M S M i c r o b i o l . L e t t .
3 0 :4 3 - 4 6 .
1 9 8 . Q u i s p e l , A . 1 9 9 0 . Di s c o v e r i e s , d i s c u s s i o n s , a n d t r e n d s i n
r e s e a r c h o n a c t i n o r h i z a l r o o t n o d u l e s y m b i o s e s b e f o r e 1 9 7 8 , p .
1 5 - 3 3 . I n C . R . S c h wi n t z e r a n d J . D. Tj e p k e m a , ( e d . ) , Th e
b i o l o g y o f F r a n k i a a n d a c t i n o r h i z a l p l a n t s . A c a d e m i c P r e s s ,
I n c . , N e w Yo r k .
1 9 9 . Q u i s p e l , A . , A . J . P .
B u r g g r a a f , H . B o r s j e , a n d T. Ta k . 1 9 8 3 .
Th e r o l e o f l i p i d s i n t h e g r o wt h o f F r a n k i a i s o l a t e s . C a n . J . B o t .
6 1 :2 8 0 1 - 2 8 0 6 .
2 0 0 . Q u i s p e l , A . , A . B . S v e n d s e n , J . S c h r i p s e m a , W . J . B a a s , C .
E r k e l e n s , a n d J . L u g t e n b u r g . 1 9 8 9 . I d e n t i f i c a t i o n o f d i p t e r o c a r -
p o l a s i s o l a t i o n f a c t o r f o r t h e i n d u c t i o n o f p r i m a r y i s o l a t i o n o f
F r a n k i a f r o m r o o t n o d u l e s o f A l n u s g l u t i n o s a ( L . ) G a e r t n e r .
M o l . P l a n t - M i c r o b e I n t e r a c t . 2 :1 0 7 - 1 1 2 .
2 0 1 . Q u i s p e l , A . , a n d T. Ta l k 1 9 7 8 . S t u d i e s o n t h e g r o wt h o f t h e
e n d o p h y t e o f A l n u s g l u t i n o s a ( L . ) G a e r t n . i n n u t r i e n t s o l u -
t i o n s . N e w P h y t o l . 8 1 :5 8 7 - 6 0 0 .
2 0 2 . R a c e t t e , S . , a n d J . G . To r r e y . 1 9 8 9 . Th e i s o l a t i o n , c u l t u r e a n d
i n f e c t i v i t y o f a F r a n / c i a s t r a i n f r o m G y m n o s t o m a p a p u a n u m
( C a s u a r i n a c e a e ) . P l a n t S o i l 1 1 8 :1 6 5 - 1 7 0 .
2 0 3 . R a c e t t e , S . , a n d J . G . To r r e y . 1 9 8 9 . R o o t n o d u l e i n i t i a t i o n i n
G y m n o s t o m a ( C a s u a r i n a c e a e ) a n d S h e p h e r d i a ( E l a e a g n a c e a e )
i n d u c e d b y F r a n k i a s t r a i n H F P G p I 1 . C a n . J . B o t . 6 7 :2 8 7 3 - 2 8 7 9 .
2 0 4 . R a c e t t e , S . , J . G . To r r e y , a n d R . H . B e r g . 1 9 9 1 . S p o r u l a t i o n i n
r o o t n o d u l e s o f a c t i n o r h i z a l p l a n t s i n o c u l a t e d wi t h p u r e c u l -
t u r e d s t r a i n s o f F r a n k i a . C a n . J . B o t . 6 9 :1 4 7 1 - 1 4 7 6 .
2 0 5 . R a s t o g i , V . K. , a n d R . J . W a t s o n . 1 9 9 1 . A s p a r t a t e a m i n o t r a n s -
f e r a s e a c t i v i t y i s r e qu i r e d f o r a s p a r t a t e c a t a b o l i s m a n d s y m b i -
o t i c n i t r o g e n f i x a t i o n i n R h i z o b i u m m e l i l o t i . J . B a c t e r i o l .
1 7 3 :2 8 7 9 - 2 8 8 7 .
2 0 6 . R e d d y , A . , B . B o c h e n e k , a n d A . M . H i r s c h . 1 9 9 2 . A n e w
R h i z o b i u m m e l i l o t i s y m b i o t i c m u t a n t i s o l a t e d a f t e r i n t r o d u c i n g
F r a n / c i a DN A s e qu e n c e i n t o a n o d A ::Tn 5 s t r a i n . M o l . P l a n t -
M i c r o b e I n t e r a c t . 5 :6 2 - 7 1 .
2 0 7 . R e d d y , A . , A . M . H i r s c h , a n d J . G . To r r e y . 1 9 8 8 . I s o l a t i o n o f
F r a n k i a s t r a i n H F P C c I 3 n o d u l a t i o n g e n e s b y c r o s s - s p e c i e s
c o m p l e m e n t a t i o n o f R h i z o b i u m m e l i l o t i , p . 2 1 3 - 2 1 4 . I n R .
P a l a c i o s a n d D. P . S . V e r m a ( e d . ) , M o l e c u l a r g e n e t i c s o f
p l a n t - m i c r o b e i n t e r a c t i o n s . Th e A m e r i c a n P h y t o p a t h o l o g i c a l
S o c i e t y , S t . P a u l , M i n n .
2 0 8 . R o c h e f o r t , D. A . 1 9 9 0 . S t u d i e s o n t h e m o l e c u l a r b i o l o g y o f
n i t r o g e n r e g u l a t i o n i n F r a n k i a . P h . D. t h e s i s . U n i v e r s i t y o f
C o n n e c t i c u t , S t o r r s .
2 0 9 . R o c h e f o r t , D. A . , a n d D. R . B e n s o n . 1 9 9 0 . M o l e c u l a r c l o n i n g ,
s e qu e n c i n g , a n d e x p r e s s i o n o f t h e g l u t a m i n e s y n t h e t a s e I I
( g l n I I ) g e n e f r o m t h e a c t i n o m y c e t e r o o t n o d u l e s y m b i o n t
F r a n k i a s p . s t r a i n C p I l . J . B a c t e r i o l . 1 7 2 :5 3 3 5 - 5 3 4 2 .
2 1 0 . R o d r i g u e z - B a r r u e c o , C . 1 9 6 8 . Th e o c c u r r e n c e o f t h e r o o t -
n o d u l e e n d o p h y t e s o f A l n u s g l u t i n o s a a n d M y r i c a g a l e i n s o i l s .
J . G e n . M i c r o b i o l . 5 2 :1 8 9 - 1 9 4 .
2 1 1 . R o d r i g u e z - B a r r u e c o , C . , F . S e v i l l a n o , a n d T. M . N e b r e d a . 1 9 8 8 .
E f f e c t i v e n o d u l a t i o n o f C o r i a r i a m r y r t i f o l i a L . i n d u c e d b y
F r a n k i a s t r a i n s f r o m A l n u s g l u t i n o s a L . ( G a e r t n . ) . P l a n t S o i l
1 1 0 :1 6 7 - 1 7 6 .
2 1 2 . R o e l o f s e n , W . , a n d A . D. L . A k k e r m a n s . 1 9 7 9 . U p t a k e a n d
e v o l u t i o n o f H 2 a n d r e d u c t i o n o f C 2 H 2 b y r o o t n o d u l e s a n d
h o m o g e n a t e s o f A l n u s g l u t i n o s a . P l a n t S o i l 5 2 :5 7 1 - 5 7 8 .
2 1 3 . R o h m e r , M . , P . B o u v i e r - N a v e , a n d G . O u r i s s o n . 1 9 8 4 . Di s t r i -
b u t i o n o f h o p a n o i d t r i t e r p e n e s i n p r o c a r y o t e s . J . G e n . M i c r o -
b i o l . 1 3 0 :1 1 3 7 - 1 1 5 0 .
2 1 4 . R o s e n d a h l , L . , a n d K. H u s s - Da n e l l . 1 9 8 8 . E f f e c t s o f e l e v a t e d
V O L . 5 7 , 1 9 9 3

o
n

A
p
r
i
l

2
9
,

2
0
1
4

b
y

I
O
W
A

S
T
A
T
E

U
N
I
V
E
R
S
I
T
Y
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

o x y g e n t e n s i o n s o n a c e t y l e n e r e d u c t i o n i n A l n u s i n c a n a -
F r a n k i a s y m b i o s e s . P h y s i o l . P l a n t . 7 4 :8 9 - 9 4 .
2 1 5 . S a f o - S a m p a h , S . , a n d J . G . To r r e y . 1 9 8 8 . P o l y s a c c h a r i d e -
h y d r o l y z i n g e n z y m e s o f F r a n k i a ( A c t i n o m y c e t a l e s ) . P l a n t S o i l
1 1 2 :8 9 - 9 7 .
2 1 6 . S a s a k a wa , H . , T. H i y o s h i , a n d T. S u g i y a m a . 1 9 8 8 . I m m u n o g o l d
l o c a l i z a t i o n o f n i t r o g e n a s e i n r o o t n o d u l e s o f E l a e a g n u s p u n -
g e n s Th u n b . P l a n t C e l l P h y s i o l . 2 9 :1 1 4 7 - 1 1 5 2 .
2 1 7 . S c h u b e r t , K. R . , a n d H . J . E v a n s . 1 9 7 6 . H y d r o g e n e v o l u t i o n : a
m a j o r f a c t o r a f f e c t i n g t h e e f f i c i e n c y o f n i t r o g e n f i x a t i o n i n
n o d u l a t e d s y m b i o n t s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 7 3 :1 2 0 7 -
1 2 1 1 .
2 1 8 . S c h u l t z , N . A . 1 9 8 9 . B i o c h e m i c a l a n d p h y s i o l o g i c a l
c h a r a c t e r -
i s t i c s o f F r a n k i a s p . s t r a i n C p l l v e s i c l e s . P h . D. t h e s i s . U n i -
v e r s i t y o f C o n n e c t i c u t , S t o r r s .
2 1 9 . S c h u l t z , N . A . , a n d D. R . B e n s o n . 1 9 8 9 . De v e l o p m e n t a l p o t e n -
t i a l o f F r a n k i a v e s i c l e s . J . B a c t e r i o l . 1 7 1 :6 8 7 3 - 6 8 7 7 .
2 2 0 . S c h u l t z , N . A . , a n d D. R . B e n s o n . 1 9 8 9 . E n z y m e s o f a m m o n i a
a s s i m i l a t i o n i n h y p h a e a n d v e s i c l e s o f F r a n k i a s p . s t r a i n C p I l .
J . B a c t e r i o l . 1 7 2 :1 3 8 0 - 1 3 8 4 .
2 2 1 . S c h we n c k e , J . 1 9 9 1 . R a p i d , e x p o n e n t i a l g r o wt h a n d i n c r e a s e d
b i o m a s s y i e l d o f s o m e F r a n k i a s t r a i n s i n b u f f e r e d a n d s t i r r e d
m i n e r a l m e d i u m ( B A P ) wi t h p h o s p h a t i d y l c h o l i n e . P l a n t S o i l
1 3 7 :3 7 - 4 1 .
2 2 2 . S c h wi n t z e r , C . R . 1 9 9 0 . S p o r e - p o s i t i v e a n d s p o r e - n e g a t i v e
n o d u l e s , p . 1 7 7 - 1 9 3 . I n C . R . S c h wi n t z e r a n d J . D. Tj e p k e m a
( e d . ) , Th e b i o l o g y o f F r a n k i a a n d a c t i n o r h i z a l p l a n t s . A c a -
d e m i c P r e s s , I n c . , N e w Yo r k .
2 2 3 . S c h wi n t z e r , C . R . , a n d J . D. Tj e p k e m a . 1 9 9 1 . A c t i n o r h i z a l
p l a n t s : F r a n k i a - s y m b i o s e s , p . 3 5 0 - 3 7 2 . I n M . J . Di l wo r t h a n d
A . R . G l e n n ( e d . ) , B i o l o g y a n d b i o c h e m i s t r y o f n i t r o g e n
f i x a t i o n . E l s e v i e r S c i e n c e P u b l i s h i n g , I n c . , N e w Yo r k .
2 2 4 . S e g u i n , A . , a n d M . L a l o n d e . 1 9 8 9 . De t e c t i o n o f p e c t o l y t i c
a c t i v i t y a n d p e l h o m o l o g o u s s e qu e n c e s i n F r a n k i a . P l a n t S o i l
1 1 8 :2 2 1 - 2 2 9 .
2 2 5 . S e l l s t e d t , A . , K. H u s s - Da n e l l , a n d A . A h l qv i s t . 1 9 8 6 . N i t r o g e n
f i x a t i o n a n d b i o m a s s p r o d u c t i o n i n s y m b i o s e s b e t we e n A l n u s
i n c a n a a n d F r a n k i a s t r a i n s wi t h d i f f e r e n t h y d r o g e n m e t a b o -
l i s m . P h y s i o l . P l a n t . 6 6 :9 9 - 1 0 7 .
2 2 6 . S e l l s t e d t , A . , a n d P . L i n b l a d . 1 9 9 0 . A c t i v i t i e s , o c c u r e n c e a n d
l o c a l i z a t i o n o f n i t r o g e n a s e i n f r e e - l i v i n g a n d s y m b i o t i c
F r a n k i a . P l a n t P h y s i o l . 9 2 :8 0 9 - 8 1 5 .
2 2 7 . S e n o , E . T. , a n d R . H . B a l t z . 1 9 8 9 . S t r u c t u r a l o r g a n i z a t i o n a n d
r e g u l a t i o n o f a n t i b i o t i c b i o s y n t h e s i s a n d r e s i s t a n c e g e n e s i n
a c t i n o m y c e t e s , p . 1 - 4 8 . I n S . S h a p i r o ( e d . ) , R e g u l a t i o n o f
s e c o n d a r y m e t a b o l i s m i n a c t i n o m y c e t e s . C R C P r e s s , I n c . ,
B o c a R a t o n , F l a .
2 2 8 . S h a t t e r s , R . G . , J . E . S o m e r v i l l e , a n d M . L . Ka h n . 1 9 8 9 .
R e g u l a t i o n o f g l u t a m i n e s y n t h e t a s e I I a c t i v i t y i n R h i z o b i u m
m e l i l o t i 1 0 4 A 1 4 . J . B a c t e r i o l . 1 7 1 :5 0 8 7 - 5 0 9 4 .
2 2 9 . S h i n e , J . , a n d L . Da l g a r n o . 1 9 7 4 . Th e 3 ' - t e r m i n a l s e qu e n c e o f
E s c h e r i c h i a c o l i 1 6 S r i b o s o m a l R N A : c o m p l e m e n t a r y t o n o n -
s e n s e t r i p l e t s a n d r i b o s o m e b i n d i n g s i t e s . P r o c . N a t l . A c a d .
S c i . U S A 7 1 :1 3 4 2 - 1 3 4 6 .
2 3 0 . S i l v e r , W . S . 1 9 6 4 . R o o t n o d u l e s y m b i o s i s . I . E n d o p h y t e o f
M y r i c a c e n i f e r a . J . B a c t e r i o l . 8 7 :4 1 6 - 4 2 1 .
2 3 0 a . S i l v e s t e r , W . B . U n p u b l i s h e d d a t a .
2 3 1 . S i l v e s t e r , W . B . 1 9 7 6 . E c o l o g i c a l a n d e c o n o m i c s i g n i f i c a n c e o f
t h e n o n - l e g u m e s y m b i o s i s , p . 4 8 9 - 5 0 6 . I n W . E . N e wt o n a n d
C . J . N y m a n ( e d . ) , P r o c e e d i n g s o f t h e F i r s t I n t e r n a t i o n a l
S y m p o s i u m o n N i t r o g e n F i x a t i o n . W a s h i n g t o n U n i v e r s i t y
P r e s s , P u l l m a n .
2 3 2 . S i l v e s t e r , W . B . , a n d S . L . H a r r i s . 1 9 8 9 . N o d u l e s t r u c t u r e a n d
n i t r o g e n a s e a c t i v i t y o f C o r i a r i a a r b o r e a i n r e s p o n s e t o v a r y i n g
P 0 2 - P l a n t S o i l 1 1 8 :9 7 - 1 0 9 .
2 3 3 . S i l v e s t e r , W . B . , S . L . H a r r i s , a n d J . D. Tj e p k e m a . 1 9 9 0 .
O x y g e n r e g u l a t i o n a n d h e m o g l o b i n , p . 1 5 7 - 1 7 6 . I n C . R .
S c h wi n t z e r a n d J . D. Tj e p k e m a ( e d . ) , Th e b i o l o g y o f F r a n c i a
a n d a c t i n o r h i z a l p l a n t s . A c a d e m i c P r e s s , I n c . , S a n Di e g o ,
C a l i f .
2 3 4 . S i l v e s t e r , W . B . , J . K. S i l v e s t e r , a n d J . G . To r r e y . 1 9 8 8 .
A d a p t a t i o n o f n i t r o g e n a s e t o v a r y i n g o x y g e n t e n s i o n a n d t h e
r o l e o f t h e v e s i c l e i n r o o t n o d u l e s o f A l n u s i n c a n a s s p . r u g o s a .
C a n . J . B o t . 6 6 :1 7 7 2 - 1 7 7 9 .
2 3 5 . S i l v e s t e r , W . B . , J . W h i t b e c k , J . K.
S i l v e s t e r ,
a n d J . G .
To r r e y .
1 9 8 8 . G r o wt h ,
n o d u l e
m o r p h o l o g y
a n d
o f
M y n i c a g a l e g r o wn
wi t h r o o t s a t v a r i o u s
o x y g e n
l e v e l s . C a n . J .
B o t . 6 6 :1 7 6 2 - 1 7 7 1 .
2 3 6 . S i l v e s t e r ,
W .
B . ,
a n d L . J . W a m s h i p .
1 9 9 0 . Tr a n s i e n t
r e s p o n s e s
o f n i t r o g e n a s e
t o
a c e t y l e n e
a n d
o x y g e n b y
a c t i n o r h i z a l n o d u l e s
a n d c u l t u r e d F r a n k i a . P l a n t
P h y s i o l .
9 2 :4 8 0 - 4 8 6 .
2 3 7 . S i m o n , L . ,
S .
J a b a j i - H a r e , J . B o u s qu e t ,
a n d M . L a l o n d e . 1 9 8 9 .
C o n f i r m a t i o n o f F r a n k i a
s p e c i e s u s i n g
c e l l u l a r
f a t t y
a c i d s
a n a l y s i s . S y s t . A p p l .
M i c r o b i o l . 1 1 :2 2 9 - 2 3 5 .
2 3 8 . S i m o n , L . ,
A .
S t e i n ,
S .
C o t e ,
a n d M . L a l o n d e . 1 9 8 5 . P e r f o r -
m a n c e o f i n v i t r o p r o p a g a t e d
A l n u s
g l u t i n o s a ( L . )
G a e r t n .
c l o n e s i n o c u l a t e d wi t h f r a n k i a e . P l a n t S o i l 8 7 :1 2 5 - 1 3 3 .
2 3 9 . S i m o n e t , P . , R . B a r d i n , J . H a u r a t ,
A .
M o i r o u d ,
a n d P . N o r -
m a n d . 1 9 8 6 . L o c a l i z a t i o n o f N I F
g e n e s
o n a
l a r g e p l a s m i d
i n
F r a n k i a s p . s t r a i n U L Q 0 1 3 2 1 0 5 0 0 9 . M o l . G e n . G e n e t . 2 0 4 :4 9 2 -
4 9 5 .
2 4 0 . S i m o n e t , P . ,
A .
C a p e l l a n o ,
E .
N a v a r r o ,
R .
B a r d i n ,
a n d A .
M o i r o u d . 1 9 8 4 . A n
i m p r o v e d
m e t h o d f o r
l y s i s
o f F r a n k i a wi t h
a c h r o m o p e p t i d a s e
a l l o ws d e t e c t i o n o f n e w
p l a s m i d s .
C a n . J .
M i c r o b i o l . 3 0 :1 2 9 2 - 1 2 9 5 .
2 4 1 . S i m o n e t , P . ,
P .
N o r m a n d ,
A . M .
H i r s c h ,
a n d A . D. L . A k k e r -
m a n s . 1 9 9 0 . Th e g e n e t i c s
o f t h e F r a n k i a a c t i n o r h i z a l
s y m b i o -
s i s , p . 7 0 - 1 0 9 . I n P . M . G r e s s h o f f
( e d . ) ,
Th e m o l e c u l a r
b i o l o g y
o f s y m b i o t i c n i t r o g e n
f i x a t i o n . C R C P r e s s , I n c . ,
B o c a R a t o n ,
F l a .
2 4 2 . S i m o n e t , P . ,
P .
N o r m a n d ,
A .
M o i r o u d ,
a n d M . L a l o n d e . 1 9 8 5 .
R e s t r i c t i o n e n z y m e d i g e s t i o n p a t t e r n s
o f F r a n k i a
p l a s m i d s .
P l a n t S o i l 8 7 :4 9 - 6 0 .
2 4 3 . S m o l a n d e r , A . 1 9 9 0 . F r a n k i a
p o p u l a t i o n s
i n s o i l s u n d e r d i f f e r -
e n t t r e e
s p e c i e s
wi t h
s p e c i a l e m p h a s i s
o n s o i l s u n d e r B e t u l a
p e n d u l a .
P l a n t S o i l 1 2 1 :1 - 1 0 .
2 4 4 . S m o l a n d e r , A . , a n d M . S a r s a . 1 9 9 0 . F r a n c i a s t r a i n s i n s o i l
u n d e r B e t u l a
p e n d u l a :
b e h a v i o r i n s o i l a n d i n
p u r e
c u l t u r e .
P l a n t S o i l 1 2 2 :1 2 9 - 1 3 6 .
2 4 5 . S m o l a n d e r , A . , a n d V . S u n d m a n . 1 9 8 7 . F r a n k i a i n a c i d s o i l s o f
f o r e s t s d e v o i d o f a c t i n o r h i z a l
p l a n t s . P h y s i o l .
P l a n t . 7 0 :2 9 7 -
3 0 3 .
2 4 6 . S m o l a n d e r , A . , C . V a n
DU k ,
a n d V . S u n d m a n . 1 9 8 8 . S u r v i v a l
o f F r a n c i a s t r a i n s i n t r o d u c e d i n t o s o i l . P l a n t S o i l 1 0 6 :6 5 - 7 2 .
2 4 7 . S t e e l e , B . P . ,
D. B .
S t e e l e ,
B . L .
N i e l s o n ,
a n d J . J . S h a w. 1 9 9 1 .
Tr a n s f o r m a t i o n o f F r a n k i a
b y e l e c t r o p o r a t i o n . I n t . S y m p .
B i o l . A c t i n o m y c e t e s ,
a b s t r . P 1 - 0 2 1 .
2 4 8 . S t . - L a u r e n t , L . , J . B o u s qu e t ,
L .
S i m o n ,
a n d M . L a l o n d e . 1 9 8 7 .
S e p a r a t i o n
o f v a r i o u s F r a n / i a s t r a i n s i n t h e A l n u s a n d E l a e -
a g n u s h o s t s p e c i f i c i t y g r o u p s u s i n g s u g a r a n a l y s i s .
C a n . J .
M i c r o b i o l . 3 3 :7 6 4 - 7 7 2 .
2 4 9 . S t . - L a u r e n t , L . ,
a n d M . L a l o n d e . 1 9 8 6 . I s o l a t i o n a n d c h a r a c -
t e r i z a t i o n o f F r a n k i a s t r a i n s i s o l a t e d f r o m
M y n i c a g a l e .
C a n . J .
B o t . 6 5 :1 3 5 6 - 1 3 6 3 .
2 5 0 . S t o we r s , M . D. , R . K. Ku l k a r n i , a n d D. B . S t e e l e . 1 9 8 6 .
I n t e r m e d i a r y
c a r b o n m e t a b o l i s m i n F r a n k i a . A r c h . M i c r o b i o l .
1 4 3 :3 1 9 - 3 2 4 .
2 5 1 . S t r a n d , R . , a n d W . L a e t s c h . 1 9 7 7 . C e l l a n d e n d o p h y t e s t r u c t u r e
o f t h e n i t r o g e n - f i x i n g r o o t n o d u l e s o f C e a n o t h u s i n t e g e r n i m u s
H . a n d A . I I .
P r o g r e s s
o f t h e
e n d o p h y t e
i n t o
y o u n g
c e l l s o f t h e
g r o wi n g
n o d u l e .
P r o t o p l a s m a
9 3 :1 7 9 - 1 9 0 .
2 5 2 . S t r o h l , W . R . 1 9 9 2 . C o m p i l a t i o n a n d a n a l y s i s o f DN A s e -
qu e n c e s
a s s o c i a t e d wi t h
a p p a r e n t s t r e p t o m y c e t e p r o m o t e r s .
N u c l e i c A c i d s R e s . 2 0 :9 6 1 - 9 7 4 .
2 5 3 . Ti s a , L . S . , a n d J . C . E n s i g n . 1 9 8 7 . C o m p a r a t i v e p h y s i o l o g y o f
a n d v e s i c l e d e v e l o p m e n t f o r F r a n c i a
s t r a i n s
C p I l , A C N 1 A G , E A N l p e c
a n d E U N l f . A r c h . M i c r o -
b i o l . 1 4 3 :1 3 7 - 1 4 2 .
2 5 4 . Ti s a , L . S . , a n d J . C . E n s i g n . 1 9 8 7 . I s o l a t i o n a n d n i t r o g e n a s e
a c t i v i t y
o f v e s i c l e s f r o m F r a n / i a
s p . s t r a i n E A N l p e c . J .
B a c t e r i o l . 1 6 9 :5 0 5 4 - 5 0 5 9 .
2 5 5 .
Tj e p k e m a , J . D. 1 9 7 9 .
O x y g e n r e l a t i o n s i n
l e g u m i n o u s a n d
a c t i n o r h i z a l
n o d u l e s , p . 1 7 5 - 1 8 6 . I n J . C .
G o r d o n ,
C . T.
W h e e l e r , a n d D. A .
P e r r y ( e d . ) , S y m b i o t i c n i t r o g e n f i x a t i o n i n
t h e
m a n a g e m e n t
o f
t e m p e r a t e
f o r e s t s .
O r e g o n S t a t e U n i v e r s i t y
P r e s s ,
C o r v a l l i s .

o
n

A
p
r
i
l

2
9
,

2
0
1
4

b
y

I
O
W
A

S
T
A
T
E

U
N
I
V
E
R
S
I
T
Y
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

2 5 6 . Tj e p k e m a , J . D. 1 9 8 3 . H e m o g l o b i n s i n t h e n i t r o g e n - f i x i n g r o o t
n o d u l e s o f a c t i n o r h i z a l p l a n t s . C a n . J . B o t . 6 1 :2 9 2 4 - 2 9 2 9 .
2 5 7 . Tj e p k e m a , J . D. , a n d D. J . A s a . 1 9 8 7 . To t a l a n d C O - r e a c t i v e
h e m e c o n t e n t o f a c t i n o r h i z a l n o d u l e s a n d t h e r o o t s o f s o m e
n o n - n o d u l a t e d p l a n t s . P l a n t S o i l 1 0 0 :2 2 5 - 2 3 6 .
2 5 8 . Tj e p k e m a , J . D. , a n d M . A . M u r r y . 1 9 8 9 . R e s p i r a t i o n a n d
n i t r o g e n a s e a c t i v i t y i n n o d u l e s o f C a s u a r i n a c u n n i n g h a m i a n a
a n d c u l t u r e o f F r a n k i a H F P 0 2 0 2 0 3 : e f f e c t s o f t e m p e r a t u r e a n d
p a r t i a l p r e s s u r e O f 0 2 - P l a n t S o i l 1 1 8 :1 1 1 - 1 1 8 .
2 5 9 . Tj e p k e m a , J . D. , W . O r m e r o d , a n d J . G . To r r e y . 1 9 8 0 . V e s i c l e
f o r m a t i o n a n d a c e t y l e n e r e d u c t i o n ( n i t r o g e n a s e a c t i v i t y ) i n
F r a n k i a s p . C p I l i n c u l t u r e . C a n . J . M i c r o b i o l . 2 7 :8 1 5 - 8 2 3 .
2 6 0 . Tj e p k e m a , J . D. , W . O r m e r o d , a n d J . G . To r r e y . 1 9 8 0 . V e s i c l e
f o r m a t i o n a n d a c e t y l e n e r e d u c t i o n a c t i v i t y i n F r a n k i a s p . C p I l
c u l t u r e d i n d e f i n e d n u t r i e n t m e d i a . N a t u r e ( L o n d o n ) 2 8 7 :6 3 3 -
6 3 5 .
2 6 1 . Tj e p k e m a , J . D. , C . R . S c h wi n t z e r , a n d D. R . B e n s o n . 1 9 8 6 .
P h y s i o l o g y o f a c t i n o r h i z a l n o d u l e s . A n n u . R e v . P l a n t P h y s i o l .
3 7 :2 0 9 - 2 3 2 .
2 6 2 . Tj e p k e m a , J . D. , C . R . S c h wi n t z e r , a n d C . A . M o n z . 1 9 8 8 . Ti m e
c o u r s e o f a c e t y l e n e r e d u c t i o n i n n o d u l e s o f f i v e a c t i n o r h i z a l
p l a n t s . P l a n t P h y s i o l . 8 6 :5 8 1 - 5 8 3 .
2 6 3 . Tj e p k e m a , J . D. , a n d C . S . Yo k u m . 1 9 7 4 . M e a s u r e m e n t o f
o x y g e n p a r t i a l p r e s s u r e wi t h i n s o y b e a n n o d u l e s b y o x y g e n
m i c r o e l e c t r o d e s . P l a n t a 1 1 9 :3 5 1 - 3 6 0 .
2 6 4 . To r r e y , J . G . 1 9 7 6 . I n i t i a t i o n a n d d e v e l o p m e n t o f r o o t n o d u l e s
o f C a s u a n i n a ( C a s u a r i n a c e a e ) . A m . J . B o t . 6 3 :3 3 5 - 3 4 4 .
2 6 5 . To r r e y , J . G . 1 9 8 7 . E n d o p h y t e s p o r u l a t i o n i n r o o t n o d u l e s o f
a c t i n o r h i z a l p l a n t s . P h y s i o l . P l a n t . 7 0 :2 7 9 - 2 8 8 .
2 6 6 . To r r e y , J . G . , a n d D. C a l l a h a m . 1 9 8 2 . S t r u c t u r a l f e a t u r e s o f t h e
v e s i c l e o f F r a n k i a s p . C p I l i n c u l t u r e . C a n . J . M i c r o b i o l .
2 8 :7 4 9 - 7 5 7 .
2 6 7 . To r r e y , J . G . , a n d S . R a c e t t e . 1 9 8 8 . S p e c i f i c i t y a m o n g t h e
C a s u a r i n a c e a e i n r o o t n o d u l a t i o n b y F r a n k i a . P l a n t S o i l 1 1 8 :
1 5 7 - 1 6 4 .
2 6 8 . To r r e y , J . G . , a n d J . D. Tj e p k e m a . 1 9 7 9 . S y m b i o t i c n i t r o g e n
f i x a t i o n i n a c t i n o m y c e t e - n o d u l a t e d p l a n t s . B o t . G a z .
1 4 0 ( S u p p l . ) :i - i i .
2 6 9 . Ts a i , Y. - L . , a n d D. R . B e n s o n . 1 9 8 9 . P h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r -
i s t i c s o f g l u t a m i n e s y n t h e t a s e s I a n d I I o f F r a n k i a s p . s t r a i n
C p I l . A r c h . M i c r o b i o l . 1 5 2 :3 8 2 - 3 8 6 .
2 7 0 . Tu n l i d , A . , N . A . S c h u l t z , D. R . B e n s o n , D. B . S t e e l e , a n d D. C .
W h i t e . 1 9 8 9 . Di f f e r e n c e s i n f a t t y a c i d c o m p o s i t i o n b e t we e n
v e g e t a t i v e c e l l s a n d v e s i c l e s o f F r a n k i a s p . s t r a i n C p I l . P r o c .
N a t l . A c a d . S c i . U S A 8 6 :3 3 9 9 - 3 4 0 3 .
2 7 1 . Twi g g , P . , C . A n , a n d B . C . M u l l i n . 1 9 9 0 . N u c l e o t i d e s e qu e n c e
o f n i f D, t h e s t r u c t u r a l g e n e c o d i n g f o r t h e a s u b u n i t o f t h e
M o F e p r o t e i n o f t h e n i t r o g e n a s e c o m p l e x f r o m t h e a c t i n o m y -
c e t e F r a n k i a , p . 7 7 1 . I n P . M . G r e s s h o f f , L . E . R o t h , G .
S t a c e y , a n d W . E . N e wt o n ( e d . ) , N i t r o g e n f i x a t i o n a c h i e v e -
m e n t s a n d o b j e c t i v e s . C h a p m a n & H a l l , N e w Yo r k .
2 7 2 . Ty s o n , J . H . , a n d W . S . S i l v e r . 1 9 7 9 . R e l a t i o n s h i p o f u l t r a s t r u c -
t u r e t o a c e t y l e n e r e d u c t i o n ( n i t r o g e n f i x a t i o n ) i n r o o t n o d u l e s
o f C a s u a r i n a . B o t . G a z . 1 4 0 ( S u p p l . ) :S 4 4 - S 4 8 .
2 7 3 . Tz e a n , S . S . , a n d J . G . To r r e y . 1 9 8 9 . S p o r e g e r m i n a t i o n a n d t h e
l i f e c y c l e o f F r a n k i a i n v i t r o . C a n . J . M i c r o b i o l . 3 5 :8 0 1 - 8 0 6 .
2 7 4 . V a n d e n B o s c h , K. A . , a n d J . G . To r r e y . 1 9 8 3 . H o s t - e n d o p h y t e
i n t e r a c t i o n s i n e f f e c t i v e a n d i n e f f e c t i v e n o d u l e s i n d u c e d b y t h e
e n d o p h y t e o f M y r i c a g a l e . C a n . J . B o t . 6 1 :2 8 9 8 - 2 9 0 9 .
2 7 5 . V a n d e n B o s c h , K. A . , a n d J . G . To r r e y . 1 9 8 4 . C o n s e qu e n c e s o f
s p o r a n g i a l d e v e l o p m e n t f o r n o d u l e f u n c t i o n i n r o o t n o d u l e s o f
C o m p t o n i a p e r e g r i n a a n d M y r i c a g a l e . P l a n t P h y s i o l . 7 6 :5 5 6 -
5 6 0 .
2 7 6 . V a n d e n B o s c h , K. A . , a n d J . G . To r r e y . 1 9 8 5 . De v e l o p m e n t o f
e n d o p h y t i c F r a n k i a s p o r a n g i a i n f i e l d - a n d l a b o r a t o r y - g r o wn
n o d u l e s o f C o m p t o n i a p e r e g r i n a a n d M y r i c a g a l e . A m . J . B o t .
7 2 :9 9 - 1 0 8 .
2 7 7 . V a n Di k , C . 1 9 7 8 . S p o r e f o r m a t i o n a n d e n d o p h y t e d i v e r s i t y i n
r o o t n o d u l e s o f A l n u s g l u t i n o s a ( L . ) V i l l . N e w P h y t o l . 8 1 :6 0 1 -
6 1 5 .
2 7 8 . V a n Di k , C . 1 9 7 9 . E n d o p h y t e d i s t r i b u t i o n i n t h e s o i l , p . 8 4 - 9 4 .
I n J . C . G o r d o n , C . T. W h e e l e r , a n d D. A . P e r r y ( e d . ) ,
S y m b i o t i c n i t r o g e n f i x a t i o n i n t h e m a n a g e m e n t o f t e m p e r a t e
f o r e s t s . O r e g o n S t a t e U n i v e r s i t y P r e s s , C o r v a l l i s .
2 7 9 . V a n DU k , C . 1 9 8 4 . E c o l o g i c a l a s p e c t s o f s p o r e f o r m a t i o n i n t h e
F r a n k i a - A l n u s s y m b i o s i s . P h . D. t h e s i s . S t a t e U n i v e r s i t y , L e i -
d e n , Th e N e t h e r l a n d s .
2 8 0 . V a n DU k , C . , a n d E . M e r k u s . 1 9 7 6 . A m i c r o s c o p i c s t u d y o f t h e
d e v e l o p m e n t o f a s p o r e - l i k e s t a g e i n t h e l i f e c y c l e o f t h e r o o t
n o d u l e e n d o p h y t e o f A l n u s g l u t i n o s a ( L . ) V i l l . N e w P h y t o l .
7 7 :7 3 - 9 0 .
2 8 1 . V a n DU k , C . , A . S l u i m e r , a n d A . W e b e r . 1 9 8 8 . H o s t r a n g e
d i f f e r e n t i a t i o n o f s p o r e - p o s i t i v e a n d s p o r e - n e g a t i v e s t r a i n
t y p e s o f F r a n k i a i n s t a n d s o f A l n u s g l u t i n o s a a n d A l n u s i n c a n a
i n F i n l a n d . P h y s i o l . P l a n t . 7 2 :3 4 9 - 3 5 8 .
2 8 2 . V a n Di k , C . , a n d A . S l u i m e r - S t o l k . 1 9 9 0 . A n i n e f f e c t i v e s t r a i n
t y p e o f F r a n k i a i n t h e s o i l o f n a t u r a l s t a n d s o f A l n u s g l u t i n o s a
( L . ) G a e r t n e r . P l a n t S o i l 1 2 7 :1 0 7 - 1 2 1 .
2 8 3 . V a n S t r a t e n , J . , A . D. L . A k k e r m a n s , a n d W . R o e l o f s e n . 1 9 7 7 .
N i t r o g e n a s e a c t i v i t y o f e n d o p h y t e s u s p e n s i o n s d e r i v e d f r o m
r o o t n o d u l e s o f A l n u s , S h e p h e r d i a a n d M y r i c a s p p . N a t u r e
( L o n d o n ) 2 6 6 :2 5 7 - 2 5 8 .
2 8 4 . V i k m a n , P . A . 1 9 9 0 . R e s p i r a t o r y c a p a c i t y a n d i t s s i g n i f i c a n c e
i n n i t r o g e n f i x i n g F r a n k i a p r e p a r e d f r o m g r e y a l d e r ( A l n u s
i n c a n a ) . P h . D. t h e s i s . U n i v e r s i t y o f U m e a , U m e a , S we d e n .
2 8 5 . V i k m a n , P . A . , a n d K. H u s s - Da n e l l . 1 9 8 7 . P u r i t y o f F r a n k i a
p r e p a r a t i o n s f r o m r o o t n o d u l e s o f A l n u s i n c a n a . P h y s i o l .
P l a n t . 7 1 :4 8 9 - 4 9 4 .
2 8 6 . W a y n e , L . G . , D. J . B r e n n e r , R . R . C o l we l l , P . A . D. G r i m o n t ,
0 . Ka n d l e r , M . I . Kr i c h e v s k y , L . H . M o o r e , W . E . C . M o o r e ,
R . G . E . M u r r a y , E . S t a c k e b r a n d t , M . P . S t a r r , a n d H . G .
Tr u p e r . 1 9 8 7 . R e p o r t o f t h e a d h o c c o m m i t t e e o n r e c o n c i l i a t i o n
o f a p p r o a c h e s t o b a c t e r i a l s y s t e m a t i c s . I n t . J . S y s t . B a c t e r i o l .
3 7 :4 6 3 - 4 6 4 .
2 8 7 . W e b e r , A . 1 9 9 0 . H o s t s p e c i f i c i t y a n d e f f i c i e n c y o f n i t r o g e n a s e
a c t i v i t y o f F r a n k i a s t r a i n s f r o m A l n u s i n c a n a a n d A l n u s
g l u t i n o s a . S y m b i o s i s 8 :4 7 - 6 0 .
2 8 8 . W h e e l e r , C . T. , S . H . W a t t s , a n d J . R . H i l l m a n . 1 9 8 3 . C h a n g e s
i n c a r b o h y d r a t e s a n d n i t r o g e n o u s c o m p o u n d s i n t h e r o o t
n o d u l e s o f A l n u s g l u t i n o s a i n r e l a t i o n t o d o r m a n c y . N e w
P h y t o l . 9 5 :2 0 9 - 2 1 8 .
2 8 9 . W i n s h i p , L . J . , a n d J . D. Tj e p k e m a . 1 9 8 5 . N i t r o g e n f i x a t i o n
a n d r e s p i r a t i o n b y r o o t n o d u l e s o f A l n u s r u b r a B o n g . : e f f e c t s o f
t e m p e r a t u r e a n d o x y g e n c o n c e n t r a t i o n . P l a n t S o i l 8 7 :9 1 - 1 0 7 .
2 9 0 . W o l l u m , A . G . , I I , C . T. Yo u n g b e r g , a n d F . W . C h i c h e s t e r .
1 9 6 8 . R e l a t i o n o f p r e v i o u s t i m b e r s t a n d a g e t o n o d u l a t i o n o f
C e a n o t h u s v e l u t i n u s . F o r e s t S c i . 1 4 :1 1 4 - 1 1 8 .
2 9 1 . Z e n g , S . , J . D. Tj e p k e m a , a n d R . H . B e r g . 1 9 8 9 . G a s d i f f u s i o n
p a t h wa y i n n o d u l e s o f C a s u a r i n a c u n n i n g h a m i a n a . P l a n t S o i l
1 1 8 :1 1 9 - 1 2 3 .
2 9 2 . Z h a n g , X. , a n d D. R . B e n s o n . 1 9 9 2 . U t i l i z a t i o n o f a m i n o a c i d s
b y F r a n k i a s p . s t r a i n C p I l . A r c h . M i c r o b i o l . 1 5 8 :2 5 6 - 2 6 1 .
2 9 3 . Z h a n g , Z . , M . F . L o p e z , a n d J . G . To r r e y . 1 9 8 4 . A c o m p a r i s o n
o f c u l t u r a l c h a r a c t e r i s t i c s a n d i n f e c t i v i t y o f F r a n k i a i s o l a t e s
f r o m r o o t n o d u l e s o f C a s u a r i n a s p e c i e s . P l a n t S o i l 7 8 :7 9 - 9 0 .
2 9 4 . Z h a n g , Z . , a n d J . G . To r r e y . 1 9 8 5 . S t u d i e s o f a n e f f e c t i v e s t r a i n
o f F r a n k i a f r o m A l l o c a s u a r i n a l e h m a n n i a n a o f t h e C a s u a r i -
n a c e a e . P l a n t S o i l 8 7 :1 - 1 6 .
V O L . 5 7 , 1 9 9 3

o
n

A
p
r
i
l

2
9
,

2
0
1
4

b
y

I
O
W
A

S
T
A
T
E

U
N
I
V
E
R
S
I
T
Y
h
t
t
p
:
/
/
m
m
b
r
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

Microbiol. Rev. 1993 Benson 293-319

Hochgeladen von

Dokumentinformationen

Copyright

Verfügbare Formate

Dieses Dokument teilen

Dokument teilen oder einbetten

Freigabeoptionen

Stufen Sie dieses Dokument als nützlich ein?

Sind diese Inhalte unangemessen?

Copyright:

Verfügbare Formate

Microbiol. Rev. 1993 Benson 293-319

Hochgeladen von

Copyright:

Verfügbare Formate

1993, 57(2):293. Microbiol. Rev.

D R Benson and W B Silvester

symbionts of actinorhizal plants.

Das könnte Ihnen auch gefallen