Aplicao de mtodos rpidos

para controle microbiolgico

Neliane F.A.Silveira
I TAL
SEMINRIO FOOD DESIGN: TENDENCIAS EM HACCP
28 DE SETEMBRO DE 2006
Mtodos rpidos ou
alternativos
Para que servem?
Usados em que situaes?
O que seriam?
Grandes tendncias
Hoje: Todos preocupados com :
Inocuidade e Qualidade dos alimentos:
Monitoramento e Anlise
Microbiologicas
QUALIDADE DOS ALIMENTOS
Verificado por : Indicadores
Bactrias totais
Mesfilos
Psicrotroficas
Termofilas
S. aureus - homem- portador
Fungos- limpeza do local
Contaminao fecal_ Totais- Termotolerantes e E. coli
Enterobacteriaceae
Inocuidade
Verificada pelos patogenos:
Gram-positivos-( Intoxicao)-Listeria
monocytogenes, S. aureus, C. perfringens,
Bacillus cereus
Gram negativos: (Infeco) Salmonella,
Vibrio, E coli patogenicas, Campylobactyer,
E,sakazakii,Shigella Aeromonas, etc,.
Verificao:
Mtodos tradicionais, culturais, clssicos
Mtodos alternativos ou rpidos : Porque a
procura??????
Culturais: Problemas: pouco elaborados,
trabalhosos, demorados, muito material de
laboratrio, requer pessoal treinado, sujeito
a falhas humanas.
Problemas com os mtodos
tradicionais:
Sensibilidade insuficiente- capacidade de
detectar o que o mtodo prope,
Especificidade:Detecta so microrganismo
procurado- nem sempre ocorre!- da falso
negativos
Repetitividade: Se o operador fizer 50 vezes-
ele obtem o mesmo resultado- no ocorre
Reprodutibilidade: Gerar resultados
estatisticamente iguais - nem sempre ocorre!!
Mtodos novos no mercado
No perodo de 1993 ate 2000- houve
uma exploso no mercado de testes
alternativos comeando em pases
desenvolvidos : ate o ano 2000- muita
confuso na rea!!!
Atualmente: O mercado filtrou os que
no funcionavam e hoje os que esto
ai, so mtodos confiveis!
Objetivos dos mtodos rpidos
em anlises microbiologicas
1.Melhorar a eficincia dos laboratrios,
simplificando trabalhos, reduzindo o custo no
geral, aumentando a capacidade analtica
2. Aumentar confiabilidade dos resultados_
no preparado pelo analista- kit vem pronto
3. Aumentar a preciso dos resultados
Mesmo assim: deve ter um microbiologista
treinado
Mtodos Rpidos- 3 grupos
1. Automao laboratorial
2. Mtodos rpidos para avaliar a
qualidade
3.Mtodos rpidos para avaliar
inocuidade
1. Automao laboratorial
Utilizado nas etapas da analise:
a . Pesagem- Por ex, atravs de um
aparelho chamado DILUTER - ajustado que
ao colocar a amostra, pesa a aliquota
desejada, e j dilui acrescentando a gua
necessaria para a diluio!
b . Homogeneizao- Uso do stomacher-
homogeneizador de pisto
Continuao: automao
laboratorial
c .Semeadura - Utilizao de um aparelho
chamado- spiral plater- a amostra semeada
na placa, atraves de uma canula, que verte o
inoculo, e a placa fica numa superficie que gira.
d .Plaqueamento-Contagens no geral - Com
novos meios como os cromogenicos - uteis
para identificar certos microrganismos - j
seleciona melhor, evitando testes bioquimicos
inteis
2. Mtodos para avaliao
da qualidade
Mtodos de contagem- direta e
indireta
Contagem Direta
1. Membrana filtrante_ Utilizada para lquidos onde grande
quantidade necessitada para amostra : utilizada em gua,
refrigerantes,
2. Mtodos de contagem fluorogenicos_ como LST MUG-
no caso-baseada na propriedade da E coli- o indicador
procurado- adiciona-se MUG (u-metil umbeliferil beta-d-glico
rondeo) ao caldo da cultura (presuntivo)- O nmero de tubos
com gs e fluorescentes apos 24 h, ou 48- sob luz ultra-violeta
visvel,da o numero mais provvel de E.coli por grama
E coli- tem a enzima glucoronidase que degrada o MUG e da
fluorescncia
Um exemplo:Colilert
Vantagens: Simples
No requer trabalho de preparo
Execuo rpida
Nao exige confirmao
No requer equipamento de leitura
Desvantagem: ser aprovado s p/ gua
Existem testes de outras marcas comerciais semelhantes
(mesmo principio) a este aqui exposto,
esse foi citado como exemplo por ter sido o primeiro
conhecido no mercado.
1 . Galactopiranosdeo ortonitrofenil
ONPG
ortonitrofenil
ortonitrofenol
(Cor amarela)
oxidao
( P = reagente Colilert )
Onde , ONPG = enzima presente nos coliformes totais orto nitro fenil galacturonidase
2. 4-metil umbeliferil glucorondeo
glucoronidase
( P = reagente Colilert )
4 metil umbeliferil
oxidao
4-metil umbeliferona
Produo de brilho fluorescente
Onde, glucoronidase = enzimas presentes nas E. coli
COLILERT
VANTAGENS
DESVANTAGENS
Resultado em 24h
Praticidade na inoculao: placa de Petri, pipeta,...
Economia de tempo
Leitura aps 28h fornece
resultado no confivel devido
ao efeito limitado do
antibitico Solanium: leitura
deve ser efetuada entre 24 -
28h aps a incubao.
Apenas para amostras de gua.
QUANTI-TRAY/2000 Fabricante = IDEXX Laboratories Inc.
uma adaptao do sistema dos tubos mltiplos (NMP) , envolvendo , portanto, uma
tabela de leitura com base estatstica.
100ml de
amostra
de gua
+
Colilert
Distribuio na cartela contendo os tubos
Leitura sob luz UV
Selagem da cartela
incubao
Tabela
Resultado em NMP
Contagem direta- continuao-
3. Sistemas prontos para uso-
Ex: Placas de simplate_ 1 placa so- com
sulcos- amostra diluida-Ex:Contagem total
Placas de Petrifilm-3M - cartes-Coliformes,
S. aureus, Fungos, Contagem total, etc.
Placas de compact dry- Verus-Madasa- idem
Ilustrao:
PETRIFILM COLIFORMES (AOAC 991.14)
Coliformes totais e E. coli em amostras de alimentos em geral
Fabricante= 3M Prods para Microbiologia
Princpio de funcionamento
Modificao do mtodo tradicional de contagem de clulas
viveis em placas
Placas de Petrifilm
Vista Superior
ou planta
Filme de polipropileno
Adesivo c/ corante indicador
Gis hidrossolveis a frio
Nutriente e gis hidros. A fri
adesivo
Papel quadriculado c/
polietileno
Vista lateral
Amostra diluda
1ml
Espalhar o inculo com um difusor
1 minuto
Gelificao do meio de cultura
Incubao
Contagem de Aerbios colnias vermelhas
Contagem de coliformes colnias vermelhas com gs
Contagem de Bolores e Leveduras
Contagem de E. coli colnias azuis com gs
Placas para:
Leveduras = Colnias pequenas , rosa escuro a azul
esverdeada;
Bolores = colnias grandes , colorao variada
SIMPLATE Fabricante =BIOCONTROL ( www.biocontrolsys.com)
Amostra
na
diluio
desejada
Meio de
cultura
liofilizado
Simplate
+
100ml de gua
destilada estril
agitao
Meio de
cultura
rehidratado
1ml
9ml
Homogeneizao
Remoo do excesso do lquido
incubao
35
o
C/24h
( CT ; colif.)
25
o
C/72h
( B e L )
(Placa de plstico com 84 cavidades)
LEITURA
Colnias
vermelhas:
presena de
coliformes totais
Luz UV
Colnias
fluorescentes:
presena de E.coli
Tabela de NMP
Simplate CEC
Simplate TPC = Contagem total de bactrias por fluorescncia
Simplate TPC-Cl = Contagem total de bactrias por indicador de cor
Simplate SYM = Contagem de Bolores e Leveduras
Contagem Indireta
1. Bioluminescncia
2. Impedncia/Condutncia
Contagem Indireta
1.Tcnica de Bioluminescncia
Princpio: Quantidade de ATP detectada a
partir de clulas
metabolicamente ativas (residuos orgnicos,
inclusive microrganismos).
Mecanismo: reao de enzima luciferina-
luciferase (cauda do vagalume)
ATP- reage com a enzima produzindo luz, medida em um
luminometro
1.Bioluminescncia:
Aplicao comum: Monitoramento de Higienizao em plantas
processadoras de alimentos.
Equipamentos comercializados base de bioluminescncia:
Lightning e Hi-Lyte.
Consistem em um swab aplicado a superfcie a ser checada:
introduz num tubo com os reagentes necessrios e o coloca no
luminometro que mede a intensidade da luz:
Quanto mais sujo, + luz!
SISTEMA LIGHTNING
Fabricante =BIOCONTROL ( www.biocontrolsys.com)
Sistema Lightning monitora o processo de limpezqa
e sanificao de superfcies .
Princpio do mtodo: emisso de bioluminiscncia por ATP.
1 . Luciferina + luciferase + ATP + Mg
+2
Luciferil adenilato - luciferase + pirofosfato
2. Luciferil adenilato - luciferase + O
2
Luciferase + Oxiluciferina + AMP+ CO2 + LUZ
O substrato Luciferina sofre fosforilao atravs da enzima luciferase , na presena de ATP.
A molcula de ATP pode ser encontrada em : clulas microbianas viveis; clulas no
microbianas ( sangue, carne,...)
Sistema Lightning
detecta
ATP residual em superfcies
Componentes - sistema Lightning
Swab ; luminmetro ; alicate ; software
Buffer
swab
1
c
2
a
b
Luciferina
+
Luciferase
Buffer
swab
1
c
2
a
b
Luciferina
+
Luciferase
Procedimento de uso
1 ) Esfregao numa determinada superfcie.
2 ) Pea 1 em 2
3) Entortar a regio a com a mo :
escorrimento do buffer ao longo da haste
4) Alicate amassar a regio c para
romper a barreira b: permitindo o
contato entre buffer + esfera +
estremidade da haste
5 ) Agitar o conjunto 3
6) Introduzir a pea
1 no luminmetro e
fazer a leitura
3
!
"
#
$
0
2,5 3
7,5
Limpa alerta suja
luminmetro
Contagem Indireta - cont.
2. Tcnica de Impedncia/ Condutncia
Principio: Microrganismos alteram a corrente eltrica de um meio
de cultura: devido s atividades metablicas: Na multiplicao,
as molculas grandes (protenas, lpides,)se transformas em mol
culas menores:aminoacidos, ac. graxos, que sao quimicamente mais
ativas: o acumulo destes compostos: alteraes mensurveis
Ex,: BACTOMETER- Bio_Mrieux. A quantidade de microrganiamos
presentes definida pela determinao do TEMPO DE DETECO
Deteco ocorre qdo. a conc. Atinge 10
6
-10
7
microrg./ ml.
Curva-padro: Determina microrganismos presentes
3.METODOS RPIDOS PARA
AVALIAO DE INOCUIDADE
A.BI OQUI MI COS
B.I MUNOLOGI COS
C.MOLECULARES
METODOS RPIDOS PARA
AVALIAO DE INOCUIDADE
A. Bioqumicos:Mtodos que a partir
de uma cepa obtida por algum metodo
de deteco- inoculada em kits- e so
observadas para capacidade de realizar
determinadas reaes bioquimicas:
Ex: Galerias API_ Bio-Mrieux
BBLRapid test- Salmonella- OXOID
OXOID SalmonellaRAPID TEST Fabricante = Unipath Ltd
Somente linhagens mveis
Amostra pr-enriquecida
em BPW por 18h/37
o
C
+
Rappaport-Vassiliadis
modificado
Lisina Ferro Desoxicolato
modificado
Verde Brilhante modificado
Lisina Ferro Cistina
Vermelho Neutro
modificado
41
o
C / 24h
Leitura
A B
Tubo A = cor preta produo H
2
S
Tubo B = vermelha ou preta ausncia
fermentao da lactose
METODOS RPIDOS PARA
AVALIAO DE INOCUIDADE
B. Imunologicos: 4 grupos:
B1.Imunoenzimaticos
B2.Imunocaptura
B3.Imunoimobilizao
B4.Coaglutinao
B1. Imunoenzimticos
O tipo mais empregado: sandwich.
O patgeno PROCURADO capturado da amostra por anti-corpos
adsorvidos superfcie de uma matriz slida (esferas de de poli
etileno, placas de micro-titulao, papel, etc).
O complexo ntigeno-anticorpo reage com o conjugado, forma
novo anti-corpo especfico p/ o microrganismo em teste. Ligada
a enzima cromogenica (fosfatase alcalina/ peroxidase), o
sandwich reage com o substrato da enzima cromogenica e mostra
cor: teste positivo.
Ex. Unique
Vidas- Bio Merieux- automatizado
B2- Imunocaptura
Principio: capacidade dos microrganismos aderirem
superfcie
de partculas metlicas revestidas de anti-corpos
especficos
Ligando os antgenos bacterianos + anti-corpos: o sistema
tem
um suporte com m que atrai as partculas metlicas, e o
que fica
um concentrado de microrganismos procurados: entao
faz um
enriquecimento e plaqueamento ! Sorologia: deve ser feita
emcolonias suspeitas, dando assim resultado imediato,
B3- Imunoimobilizao
Princpio: Bactrias mveis cultivadas em meios semi-slidos
tem
sua mobilidade bloqueada pela adio de anti-corpos
flagelares
especficos.
Forma uma banda de precipitao visvel na interface
ANTI -CORPO/ BACTRI A.
Aplicvel a qualquer microrganismo flagelado (mvel).
Ex. Teste 1-2 da Bio-Control p/ Salmonella: Duas cmaras de
plstico interligadas em L . Na cmara horizontal fica o caldo
de enriquecimento seletivo p/ Salmonella e na vertical o meio
semi-solido
onde se coloca o antisoro flagelar polivalente.
B4- Coaglutinao
Conhecido como aglutinao de ltex(passiva
reversa)
Uso: toxinas microbianas
Aglutinao de partculas de ltex
sensibilizadas com anti-corpos anti-toxinas.
Ex.: RPLA kits_ OXOID p/ pesquisa de
enterotoxinas estafiloccicas.
Mtodos rpidos para avaliar
inocuidade
C. MTODOS MOLECULARES
C1. Sondas genticas- pouco usadas: Separa fita de
DNA- sonda reage-marcador- cor- le se no
colorimetro
C2.PCR- tradicional e automatizado- BAX SYSTEM
- desnatura fita dupla do DNA-94C/ -pareamento
com primers-37C/ -sntese da fita complementar-
amplia muito o DNA do patogeno de tiver-
definitivo- no confirma!
C3.Ribotipagem-Ribotipo- Sofisticao em analises
Consideraes finais
AEscolha da metodologia a ser adotada na realizao da anlise
deve ser norteada por:
Preciso pretendida
Custo/ tempo da anlise
Simplicidade
Treinamento do analista
Disponibilidade de meios e reagentes
Assistncia tcnica do fabricante
Espao no laboratrio, entre outros fatores!
Pode se utilizar qualquer mtodo em
qualquer fase da analise
Pre requisito: Microbiologista treinado sempre!
Bibliografia consultada
FRANCO, B D G M, Mtodos alternativo de
anlise microbiolgica de alimentos: uma
reviso, USP, faculdade de Cincias
farmacuticas - Depto, de Alimentos e Nutrio
experimental, 1999
FRANCO, BDGM, Mtodos rpidos em
microbiologia de alimentos- Curso Mtodos de
Analise em Microbiologia de Alimentos-ITAL,
2006
Obrigada!
nferraz@ital.sp.gov.br