Elemente de virusologie

CUPRINS
Virusurile:
Caractere generale
Clasificarea
Morfologie
Structur
Multiplicarea virusurilor
Metode de cultivare a virusurilor
(animale de laborator, ou embrionate,
culturi de celule)
Introducere
Virusologia medicala se ocup cu studiul virusurilor umane si animale,
cu implicarea acestora in patologia infecioas corespunztoare.

Virusurile sunt ageni infecioi cu dimensiuni foarte reduse, care
prezint parazitism strict intracelular.

Studii de dat recent au evideniat ageni subvirali cu potenial patogen
pentru plante, animale si om.
Viroizii sunt molecule de ARN circular, alctuit din 200-400 nucleotide,
fr capsid sau anvelop, care determin boli la plante.
Virusoizii (ageni satelii) au genomul alctuit din cca. 1000 nucleotide si
care se pot replica n asociere cu un alt virus a crui capsida o folosesc.
Exemplu: virusul hepatitei D (delta) al crui genom format din ARN se
acoper cu antigenul de suprafa al virusului hepatitei B (Ag HB
S
).
Transpozomii sunt fragmente de genom mobile, capabile s-i modifice
poziia.
Prionii sunt ageni infecioi neconvenionali de natur proteic(proteine
infecioase) care se pot replica la nivelul sistemului nervos central,
determinnd leziuni ireversibile.
Caractere generale
Caractere generale
Dimensiunile sunt reduse variind ntre 10-300 nm si pot fi evideniate
numai prin examinare electronooptic;

Virusurile sunt alctuite dintr-un miez de acid nucleic fie ARN fie ADN
(niciodat ambele la acelai virus), nconjurat de proteine aezate dup o
anumit simetrie care alctuiesc capsida viral.
Acidul nucleic viral conine ntreaga informaie genetic necesar
multiplicrii i codificrii celorlalte structuri virale care alctuiesc particula
infectant (virionul);
Virusurile se cultiv numai pe substraturi celulare vii, ele prezentnd
parazitism strict intracelular (nu se pot multiplica dect ntr-o celul
vie vegetal, bacterian sau animal, folosind aparatul ribozomal al
acesteia pentru programarea sintezelor proprii prin devierea
metabolismului celulei parazitate);
Virusurile nu sunt sensibile la antibiotice;
Replicarea viral induce sinteza unor substane numite interferoni care
induc n celulele nc neinfectate rezisten la infecie (aciune antiviral);
Infecia viral a celulelor organismului declaneaz viroza, care evolueaz
fie inaparent, fie cu manifestri fiziopatologice i clinice caracteristice;
Clasificarea virusurilor
Clasificarea virusurilor
Clasificarea epidemiologic este foarte util pentru clinician i se refer la calea de transmitere a virusului:
virusuri enterice cu transmitere fecal-oral (ex. poliovirusurile);
virusuri respiratorii cu transmitere aerian (ex. virusurile gripale);
virusuri cu transmitere sexual (ex. HIV);
virusuri cu transmitere prin snge (ex. virusul hepatitei B, C);
virusuri cu transmitere prin artropode (ex. arbovirusurile);
virusuri cu transmitere vertical, materno fetal (ex. virusul rubeolos, CMV).
Clasificarea virusurilor dup dimensiuni:
virusuri mici: au cuprins ntre 15-30 nm
de ex. Picornavirusurile (enterovirusurile)
virusuri mijlocii: au cuprins ntre 70-180 nm
de ex. mixovirusurile, virusurile din grupul herpes, HIV;
virusuri mari: au cuprins ntre 200-300 nm de ex. pox-virusurile.
Clasificarea virusurilor dup tropism:
virusuri dermotrope: de exemplu. herpesvirusurile, poxvirusurile, virusul rujeolos, virusul rubeolic;
virusuri enterotrope: de exemplu. enterovirusurile, rotavirusurile;
virusuri neurotrope: de exemplu. arbovirusurile, v. rabic;
virusuri cu tropism pentru cile respiratorii: de ex. mixovirusurile, adenovirusurile, rinovirusurile;
virusuri hepatotrope: ex. virusurile hepatitice A, B, C;
virusuri limfocitotrope: ex. HIV, v. rujeolos.
Clasificarea virusurilor dup acidul nucleic coninut:

n funcie de tipul de acid nucleic viral, exist urmtoarele familii cu importan medical:

RIBOVIRUSURI (Virusuri ARN)
DEZOXIRIBOVIRUSRI (Virusuri AND)
Clasificarea virusurilor
RIBOVIRUSURI (virusuri ARN):

1. Familia PICORNAVIRIDAE are 5 genuri:
Enterovirus (virusurile polio, Coxsackie, ECHO)
Cardiovirus (virusul encefalomiocarditei)
Rhinovirus (agenii guturaiului)
Aphtovirus (virusurile febrei aftoase)
Heparnavirus (virusul hepatitei A)
n aceast familie virusurile sunt fr anvelop, cu diametrul de 27-30 nm, au capsida cu simetrie icosaedric, au genom ss, cu
polaritate pozitiv i infecios.

2. Familia CALICIVIRIDAE cuprinde virusuri fr anvelop, cu simetrie icosaedric, cu diametrul 35-40 nm. Ex. coronavirusuri,
astrovirusuri, agentul Norwalk

3. Familia TOGAVIRIDAE include 4 genuri:
Alfavirus (virusurile encefalitelor ecvine de vest i est, de Venezuela etc.)
Rubivirus (virusul rubeolos)
Hepacivirus (virusul hepatitei C)
Pestivirus (virusul diareei bovine)
Aceste virusuri sunt anvelopate cu diametrul de 60-70 nm, cu simetrie icosaedric, au genom ss cu polaritate pozitiv, infecios.
4. Familia FLAVIVIRIDAE include virusurile febrei galbene, Denga, encefalitei ruse de primvar-var etc.

5. Familia ARTERIVIRIDAE cuprinde virusul arteritei ecvine.

6. Familia BUNYAVIRIDAE cuprinde virusurile encefalitei de California, virusul febrei hemoragice de Crimeea etc.

7. Familia ORTHOMIXOVIRIDAE include 3 tipuri de virusuri gripale Influenzavirus A, B, C. Sunt virusuri anvelopate cu
simetrie helicoidal, dimensiuni de ~ 80-120 nm, genom ss, segmentat, cu polaritate negativ.

8. Familia PARAMIXOVIRIDAE include genurile:
Morbillivirus (virusul rujeolos)
Pneumovirus (virusul respirator sinciial)
Paramixovirus (paramixovirusuri i virusul urlian)
Acestea sunt virusuri cu diametrul 100-150 nm cu caractere asemntoare ortomixovirusurilor, cu genom nesegmentat care i
confer stabilitate antigenic.

9. Familia RHABDOVIRIDAE (ex. virusul rabic etc.) - grupeaz virusuri anvelopate cu simetrie helicoidal, cu genom ss
nesegmentat cu polaritate negativ.

10. Familia FILOVIRIDAE include virusuri cauzatoare de febre hemoragice (virusul Marburg, virusul Ebola).

11. Familia CORONAVIRIDAE cuprinde virusuri cu genom ss cu polaritate pozitiv.

12. Familia REOVIRIDAE - are ca patogeni umani genurile:
Reovirus conine virusuri cu tropism respirator i intestinal
Orbivirus include virusuri encefalitogene
Rotavirus cuprind virusuri cauzatoare de gastroenterite la nou-nscui i copii mici

13. Familia RETROVIRIDAE include subfamiliile:
Oncovirinae virusuri oncogene ARN, exemplu HTLV1,2 (Human T Cell Leukemia Virus)
Lentivirinae ageni ai unor boli degenerative ale SNC i HIV (agentul cauzal al bolii SIDA)
Spumavirinae cauzeaz infecii cronice, asimptomatice
Sunt virusuri cu: simetrie icosaedric, genom ARN ss n dou copii identice, avnd prezent o enzim cu rol n replicare =
reverstranscriptaza.


Clasificarea virusurilor
RIBOVIRUSURI (virusuri ARN):

8. Familia PARAMIXOVIRIDAE include genurile:
Morbillivirus (virusul rujeolos)
Pneumovirus (virusul respirator sinciial)
Paramixovirus (paramixovirusuri i virusul urlian)
Acestea sunt virusuri cu diametrul 100-150 nm cu caractere asemntoare ortomixovirusurilor, cu genom nesegmentat care i
confer stabilitate antigenic.

9. Familia RHABDOVIRIDAE (ex. virusul rabic etc.) - grupeaz virusuri anvelopate cu simetrie helicoidal, cu genom ss
nesegmentat cu polaritate negativ.

10. Familia FILOVIRIDAE include virusuri cauzatoare de febre hemoragice (virusul Marburg, virusul Ebola).

11. Familia CORONAVIRIDAE cuprinde virusuri cu genom ss cu polaritate pozitiv.

12. Familia REOVIRIDAE - are ca patogeni umani genurile:
Reovirus conine virusuri cu tropism respirator i intestinal
Orbivirus include virusuri encefalitogene
Rotavirus cuprind virusuri cauzatoare de gastroenterite la nou-nscui i copii mici

13. Familia RETROVIRIDAE include subfamiliile:
Oncovirinae virusuri oncogene ARN, exemplu HTLV1,2 (Human T Cell Leukemia Virus)
Lentivirinae ageni ai unor boli degenerative ale SNC i HIV (agentul cauzal al bolii SIDA)
Spumavirinae cauzeaz infecii cronice, asimptomatice
Sunt virusuri cu: simetrie icosaedric, genom ARN ss n dou copii identice, avnd prezent o enzim cu rol n replicare =
reverstranscriptaza.


Clasificarea virusurilor
DEZOXIRIBOVIRUSURI (Virusuri ADN):

1. Familia PARVOVIRIDAE cuprinde virusuri mici (18-26 nm) fr anvelop, genom ss. Infecteaz celulele
stem ale mduvei osoase hematogene determinnd boli hematologice.

2. Familia PAPOVAVIRIDAE include virusuri grupate n:
subfamilia Polymixovirinae care determin tumori cu multiple localizri
subfamilia Papillomavirinae ce determin veruci sau papiloame cutanate
Sunt virusuri cu diametrul de 40-50 nm fr anvelop, cu o capsid icosaedric i un genom ADN ds circular.

3. Familia ADENOVIRIDAE cuprinde ageni virali cu tropism adeno-faringo-conjunctival. Sunt virusuri cu
diametrul 65-85 nm, fr anvelop, ce au capsid icosaedric i genom ds circularizat.

4. Familia HEPADNAVIRIDAE conine virusuri cu tropism hepatic (virusul hepatitei B la om) cu diametrul 42
nm, genom parial ds, aproape circular.

5. Familia HERPESVIRIDAE include 8 reprezentani cu importan maxim n patologia uman: virusurile
herpes simplex tip 1 i 2 (HSV 1 i 2), virusul citomegalic (CMV sau Human Herpes Virus 3 HHV-3), virusul
varicelo-zosterian (HHV-4), virusul Epstein-Barr (HHV-5) i HHV 6,7,8.
Sunt virusuri anvelopate cu nveliuri suplimentare pericapsidare, cu diametrul variabil ntre 120-300 nm, capsida
cu simetrie icosaedric genom linear ds.

6. Familia POXVIRIDAE include: virusul vaccinia, virusul variolic, virusul Molluscum contagiosum, agenii Orf
(parvaccinia). Sunt virusuri mari cu diametrul 200-350 nm cu anvelop, de form paralelipipedic.

Morfologia virusurilor
Morfologia virusurilor
Forma virusurilor
cilindric de exemplu unele virusuri vegetale de tipul virusului
mozaicului tutunului;
sferoidal de exemplu virusurile gripale;
cristaliform (poliedric) de exemplu enterovirusurile;
prism sau crmid de exemplu poxvirusurile.


Figure 1 An array of viruses. (a) The helical virus of rabies. (b) The segmented
helical virus of influenza. (c) A bacteriophage with an icosahedral head and
helical tail. (d) An enveloped icosahedral herpes simplex virus. (e) The
unenveloped polio virus. (f) The icosahedral HIV with spikes on its envelop
MICROSCOPIA ELECTRONIC
MICROSCOPIA ELECTRONIC
Virusul rubeolic Virusul hepatitic A
Virusul
stomatitei veziculoase
Virusul HIV (ME prin baleiaj) Virusul Pox
ADN VIRUSURI
Parvo virus adenovirus
Papillomavirus
Hepatitis B virus
Herpesvirus
Molluscum contagiosum
(Pox virus)
ARN VIRUSURI
Enterovirus Influenza viruses Paramyxovirus
Rotavirus
Morfologia virusurilor
Structura viral
Virionul, denumit i particul viral elementar, este alctuit dintr-un miez genomic, capsid i
uneori anvelopa (peplos):
a) Miezul genomic (genomul viral, nucleoidul) este alctuit din ADN sau ARN cu structur
polinucleotidic. Conine informaia genetic necesar pentru multiplicarea viral i devierea
metabolismului celulei gazd n sensul sintezei constituenilor virali;
Genomul ADN poate fi simplu (ss) sau dublu (ds) spiralat, linear, circular sau supranfurat;
Genomul ARN poate fi ss sau ds, continuu sau fragmentat. Unele virusuri cu genom ARNss pot fi cu
polaritate pozitiv cnd genomul servete ca ARNm sau cu polaritate negativ cnd numai spira
complementar poate s funcioneze ca ARNm .
Acidul nucleic viral conine suportul infectivitii virale.
b) Capsida reprezint nveliul extern al genomului viral, pe care l protejeaz. Este format din
subuniti identice denumite capsomere. Din punct de vedere structural acestea sunt alctuite
din: proteine simple (ex. virusul polio), hetero-proteine (ex. virusul gripal) sau glicoproteine virale
(ex. HIV).
Genomul viral mpreun cu capsida alctuiesc nucleocapsida. Acestea sunt elemente
structurale obligatorii ale particulei virale.
c) nveliul (peplos, manta, anvelop) este un element structural facultativ, fiind alctuit din
subuniti denumite peplomere, de natur proteic. Este prezent la unele virusuri, de exemplu HIV,
virusul gripal, etc. Proteinele componente ale nveliului extern sunt evideniate la microscopul
electronic ca nite proiecii pe suprafaa virionului. Aceste proteine reprezint material viral propriu
sau material celular mprumutat de la celula gazd, de exemplu lipoproteine, glicoproteine.
Exemple: glicoproteinele 120, 41 ale HIV-ului i hemaglutinina, neuraminidaza prezente la
virusurile gripale. nveliul viral pstreaz stabilitatea nucleocapsidei i asigur fixarea virionului pe
celula gazd pe care o infecteaz.
Tipu
Structura virala
Structura viral
b) Capsida reprezint nveliul extern al genomului viral, pe care l
protejeaz. Este format din subuniti identice denumite capsomere. Din
punct de vedere structural acestea sunt alctuite din: proteine simple (ex.
virusul polio), hetero-proteine (ex. virusul gripal) sau glicoproteine virale
(ex. HIV).
Genomul viral mpreun cu capsida alctuiesc nucleocapsida. Acestea
sunt elemente structurale obligatorii ale particulei virale.
c) nveliul (peplos, manta, anvelop) este un element structural
facultativ, fiind alctuit din subuniti denumite peplomere, de natur
proteic. Este prezent la unele virusuri, de exemplu HIV, virusul gripal,
etc. Proteinele componente ale nveliului extern sunt evideniate la
microscopul electronic ca nite proiecii pe suprafaa virionului. Aceste
proteine reprezint material viral propriu sau material celular
mprumutat de la celula gazd, de exemplu lipoproteine, glicoproteine.
Exemple: glicoproteinele 120, 41 ale HIV-ului i hemaglutinina,
neuraminidaza prezente la virusurile gripale. nveliul viral pstreaz
stabilitatea nucleocapsidei i asigur fixarea virionului pe celula gazd pe
care o infecteaza
Viral Structure
Nucleic acid
Capsid
Nucleocapsid
Envelope protein
Membrane protein
Viral envelope**
Viral Structure
Varies in size, shape and symmetry
VIP for classification
3 types of capsid symmetry:
Cubic (icosahedral)
Has 20 faces, each an equilateral triangle. Eg.
adenovirus
Helical
Protein binds around DNA/RNA in a helical fashion eg.
Coronavirus
Complex
Is neither cubic nor helical eg. poxvirus

Basic virus structure


Nucleoprotein:
Helix: capsomers associate with helical
nucleic acid
Icosahedron: the capsomers form a regular
solid structure enfolding the viral genome

Each type of virus has unique arrangement of
the capsid around its viral genetic material.

Capsid is a fundamental criterion in the
classification of viruses



Basic virus structure

Basic virus structure

Structura virala
Virus gripal
Virus HIV
Simetrie virala
Tipuri de simetrie viral
Capsomerele se pot aeza spaial n trei modele de simetrie
viral:
simetrie helicoidal (helical): acidul nucleic este situat
central rsucit ca o elice, iar capsomerele identice sunt
aezate metameric. Exemple: virusul mozaicului tutunului,
virusurile gripale, virusul rabic.
Simetrie icosaedric (cubic): capsomerele sunt aezate
dup axe de simetrie riguroase (dictate de genom),
realiznd n spaiu o figur geometric denumit icosaedru
(figur geometric cu 12 vrfuri, 20 de fee cu form de
triunghi echilateral i 30 de muchii). Conturul
nucleocapsidei privit n plan apare ca un hexagon.
Exemple: enterovirusuri, adenovirusuri, herpesvirusuri.
Simetrie mixt (complex) prezent la poxvirusuri.

Simetrie virala
Enveloped helical virus Enveloped icosahedral virus
Virusuri bacteriene-Bacteriofagii
Morfologia tipic a bacteriofagilor const n prezena capului
(gtului) i a cozii.
CAPUL este format dintr-un miez de acid nucleic ADN sau ARN
care reprezint 50 % din greutatea uscat a bacteriofagului se
gsete capsida format din capsomere identice aezate sub
form de prism hexagonal.
GTUL face legtura dintre cap i coad.
COADA este format n general din trei pri:
o miezul lacunar;
o teaca contractil;
o placa bazal (terminal) care poart ataate fibrele cozii.
Exist i forme atipice de bacteriofagi de exemplu: bacteriofagi
lipsii de coad, bacteriofagi filamentoi.

Virusuri bacteriene
DIAGNOSTICUL
VIRUSOLOGIC
Metode de diagnostic virusologic
1. Evidenierea direct a virusurilor ME,
imunofluorescen, identificarea antigenelor
virale
2. Izolarea virusurilor
3. Diagnostic imunobiologic evidenierea
rspunsului imun umoral i celular
Evidenierea direct a virusurilor
1. Detectarea antigenelor virale: imunofluorescen, ELISA etc.

2. Microscopia electronic: morfologia particulelor virale imuno-
electrono-microscopie

3. Microscopie optic: evidenierea incluziilor virale
intracelulare

4. Detectarea genomului viral: hibridizarea cu sonde de acizi nucleici,
reacia de polimerizare n lan
(PCR)
Microscopia electronica
Pentru vizualizare e necesara o concentratie de 10
6
particule de virus pe
ml, n mod normal se foloseste o marire de 50.000 60.000 ori. Viruii
pot fi detectate n urmtoarele specimene:

Fecalele: rotavirus, Adenovirus, virus Norwalk, Astrovirus, calicivirusul

Fluid vezicular: virusul Herpes Simplex, virusul varicella-zoster

Raclaj cutanat: papilomavirus, virusuri ORF, virusul molluscum
contagiosum
Microscopia electronic
Adenovirus
Rotavirusului
Imuno-Electrono-Microscopia
Sensibilitatea i specificitatea EM poate fi mbuntit prin
imunoelectronomicroscopie. Exist dou variante:

Microscopia clasice de electroni imunitar (IEM) - proba este
tratat cu specifice anti-seruri nainte de a fi pus n EM.
Particule virale prezente vor fi agglutinated i, astfel, aduna
mpreun de anticorpi.

Solid phase microscopie imunitar de electroni (SPIEM) - reea
este acoperit cu specifice anti-seruri. Virus particule prezent
n eantion va fi absorbit pe grila de anticorpi.
Dezavantaje ale microscopiei
electronice
Aparatura este extrem de scumpa
Intretinerea aparaturii este costisitoare
ONU Necesita Experien personal cu
Adesea sensibilitatea este slaba
Izolarea virusurilor
Metode de cultivare a virusurilor

Izolarea pe culturi celulare

Izolarea pe ou embrionat de gin

Izolarea pe animale de laborator
Metode de cultivare a virusurilor
1. Culturi celulare: linii celulare (rinichi de cine, Hibridoma)
Evidenierea efectelor virus specifice: efect
citopatic, efect hemadsorbant, efect
transformat, efect de interferen
Evidenierea virusurilor prin imunofluorescen

2. Cultivare pe ou embrionate: moartea embrionului, leziuni aparute pe
membrana corioalantoidiana, efectul
hemadsorbant al lichidului
amniotic/alantoidian

3. Izolarea pe animale de laborator: apariia unor leziuni virus specifice,
moartea animalului

Izolarea virusurilor
Exist 3 tipuri principale de culturi celulare:

1. Linii celulare primare ex. Rinichi de maimu, rinichi de cine
2. Linii celulare semi-continue ex. rinichi embrionar uman,
fibroblaste dermice
3. Linii celulare continue ex. HeLa, Vero, Hep2, LLC-MK2, MDCK

Culturile celulare primare sunt cele mai bune deoarece pot servi pentru
izolarea unei game largi de virusuri. ns sunt scumpe i greu de obinut n
cantiti mari. Liniile celulare continue sunt uor de ntreinut, dar gama
de virusuri ce pot fi izolate este destul de restrns.
IZOLAREA PE CULTURI CELULARE
Efecte virus-specifice pe
culturile celulare
Virusurile ce cresc pe culturile celulare pot produce:

1.Efect citopatic (ECP) efect balonizant, formarea de sinciii sau
moartea celulelor. Efectul citopatic poate fi specific sau nespecific.
2.Efect hemadsorbant celulele sunt capabile s lege eritrocitele
de mamifere. Ex virusurile gripale.
3.Efect transformant celulele din cultur se malignizeaz. Ex.
virusurile
4.Efect de interferen infecia cu un virus mpiedic apariia
efectului infeciei cu cel de-al doilea virus. Ex
Identificarea virusului izolat se poate face prin reaciile de
neutralizare, inhibare a hemaglutinrii sau imunofluorescen.


IZOLAREA PE CULTURI CELULARE
Linie celular MCF7
Linie celular
fibroblasti de soarece
Linie celular osteosarcom
Incluzii virale
Incluzii nucleare n microglii
v. herpes simplex, ctomegalovirusul, v. varicella-zoster,
papovavirusurile, v. rujeolos.
Incluzii nucleare n infecia cu CMV
Celule n ochi de bufni.
Incluzii celulare
V. rujeolos
Incluzii celulare
Corpi Negri in neuronii infectati cu v. rabic
Efecte virus specifice
(Courtesy of Linda Stannard, University of Cape Town, S.A.)
Efect citopatic CMV
Efect citopatic Virus varicelo
zosterian-balonizare
Efectul citopatic
Efectul citopatic al enterovirusului 71 i virusului herpetic balonizarea celulelor.
Efectul citopatic
Efectul citopatic cu formare de
sinciii virusul respirator
sinciial VRS (sus)i virusul
rujeolos (jos)
Efectul citopatic
Efectul citopatic al enterovirusului 71 i virusului herpetic balonizarea celulelor.
Efectul citopatic
Efectul citopatic cu formare de
sinciii virusul respirator
sinciial VRS (sus)i virusul
rujeolos (jos)
Efectul hemadsorbant
Efectul citopatic cu formare de sinciii produs de virusul urlian i
hemadsorbia eritrocitelor pe suprafaa stratului celular.
Dezavantaje ale culturilor
celulare
Perioada lung (pn la 4 sptmni) necesar pentru
obinerea rezultatului
Sensibilitate slab: sensibilitatea depinde n mare
msur de starea probei.
Sunt susceptibile la contaminare cu bacterii.
Sunt sensibile la substane toxice ce pot fi prezente n
prob.
Multe virusuri nu pot crete n culturi celulare ex.
virusul hepatititic B, virusurile diareigene,
parvovirusurile, virusurile papilomului uman
(VPU/HPV)

Tehnici rapide de cultivare
Exista Tehnici de cultivare de ngrijire rapid prin care agenii
virali sunt detectai n 2-4 zile de la inoculare.
De exemplu prin testul CMV DEAFF:

Cultura de celule este realizat ntr-un flacon de plastic

Dup inoculare, flaconul este centrifugat la viteza mica timp
de o or (pentru a accelera adsorbia virusului) i apoi incubat
timp de 2 pn la 4 zile.

Vasele sun scoase din incubator i examinate pentru prezena
de antigene precoce CMV prin imunofluorescen.
Testul DEAFF pentru CMV
Virusuri izolate pe culturi
celulare
Virusuri izolate uor pe
culturi celulare
Virusuri izolate mai rar
Virusul Herpes Simplex Varicela-Zoster
Citomegalovirus Virusul rujeolos
Adenovirus Virusul rubeolos
Poliovirusuri Rinovirusuri
Virusurile Coxsackie A Virusurile Coxsackie A
Virusurile ECHO
Virusurile gripale
Virusurile paragripale
Virusul urlian
Virusul respirator sinciial
INOCULAREA PE OU
INOCULAREA PE OU
Embrion viabil
Embrion mort
INOCULAREA PE ANIMAL


Symptoms
HBeAg
anti-HBe
Total anti-HBc
IgM anti-HBc
anti-HBs
HBsAg
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 52 100
Acute Hepatitis B Virus Infection with Recovery
Typical Serologic Course
Weeks after Exposure
Titre
Fecal
HAV
Symptoms
0 1 2 3 4 5 6 1
2
2
4
Hepatitis A Infection
Total anti-
HAV
Titre ALT
IgM anti-HAV
Months after exposure
Typical Serological Course
Complement Fixation Test
Complement Fixation Test in Microtiter Plate. Rows 1 and 2 exhibit complement
fixation obtained with acute and convalescent phase serum specimens,
respectively. (2-fold serum dilutions were used) The observed 4-fold increase is
significant and indicates recent infection.
ELISA
Microplate ELISA : coloured wells indicate reactivity
HEMAGLUTINARE PASIV
Western Blot
HIV-1 Western Blot
Lane1: Positive Control
Lane 2: Negative Control
Sample A: Negative
Sample B: Indeterminate
Sample C: Positive
Diagnostic rapid pe baza detectrii
antigenelor virale
Aspirat nazo-faringian
RSV
Virus gripal de tip A i B
Parainfluenza
Adenovirus

Materii fecale:
Rotaviruses
Adenoviruses
Astrovirus

Piele
HSV
VZV

Snge
CMV (Ag pp65)
Imunofluorescen
Test pozitiv de imunofluorescen
pentru antigenului virusului rabic
(Sursa: CDC)
Testarea antigenului
pp65 al CMV
Avantajele i dezavantajele
Avantajele
Rezultatul disponibile rapid, de obicei, n cteva ore.

Poteniale probleme
Deseori, sensibilitate foarte mult redus n comparaie cu
culturi de celule, poate fi la fel de mici ca 20%. Specificitatea
de multe ori sraci, de asemenea.
Necesit specimene bun.
Procedurile implicate sunt de multe ori plictisitor si
consumatoare de timp i, astfel, scumpe n termeni de timp de
laborator.
Specimenele de rutin, teste de
Clinical Category Blood Throat
swab
Faeces CSF Other
1. Meningitis + + + +
2. Encephalitis + + + + Brain biopsy
3. Paralytic disease + + + +
4. Respiratory illness + + Nasopharyngeal aspirate
5. Hepatitis +
6. Gastroenteritis +
7. Congenital diseases + Urine, saliva
8. Skin lesions + + Lesion sample e.g. vesicle
fluid, skin scrapping
9. Eye lesions Eye swab
10. Myocarditis + Pericardial fluid
11. Myositis + +
12. Glandular fever +
13. Post Mortem + Autopsy
After use, swabs should be broken into a small bottle containing 2 ml of virus transport medium.
Swabs should be sent to the laboratory as soon as possible without freezing. Faeces, CSF, biopsy or
autopsy specimens should be put into a dry sterile container.
Metodele Moleculara
Metode bazate pe detectarea genomului viral sunt, de asemenea,
cunoscute ca metode moleculare. Se spune adesea c metodele
molecular este direcia viitoare a diagnosticului virale.
Cu toate acestea, n practic, dei utilizarea acestor metode este
n cretere, ntr-adevr, rolul jucat de metode moleculare ntr-un
laborator de rutin virus de diagnosticare este nc mic n
comparaie cu metodele convenionale.
Cert este c, dei rolul de metode moleculare va crete rapid n
viitorul apropiat.
Classical Molecular Tehnici
de
Dot-blot, Southern blot, in-hydridization in situ sunt exemple
de tehnici clasice. Ele depind de utilizare a ADN-ului
specifice / sonde de ARN-ului pentru hibridizare.

Specificitatea reaciei depinde de condiiile de utilizat pentru
hibridizare. Cu toate acestea, sensibilitatea acestor tehnici nu
este mai bun dect metodele convenionale virale de
diagnosticare.

Cu toate acestea, deoarece acestea sunt de obicei mai
plictisitor i mai costisitoare dect tehnici convenionale, nu
au gsit de acceptare pe scar larg.
Reacie n lan a polimerazei (1)
PCR permite amplificarea in vitro a specifice secvene ADN-int cu un factor
de 106 i este, aadar, o tehnic extrem de sensibil.
Ea se bazeaz pe o reacie enzimatic care implic utilizarea de
oligonucleotides sintetice flanca int secvena nucleic de interes.
Oligonucleotides Acestea acioneaz ca grunduri pentru polimerazei
termostabil Taq. Cicluri repetate (de obicei 25 - 40) din denaturarea Template
ADN-ului (la 94oC), recoacere de primeri pentru secvene complementare
acestora (50oC), i extinderea primer (72oC), rezultat n producia
exponenial a fragmentului int specifice.
Sensibilitatea i specificitatea suplimentare pot fi obinute de ctre PCR
imbricate.
Detectarea i de identificare a produsului PCR este de obicei efectuat de ctre
agaroz electroforez gel, hibridare cu o sond oligonucleotidului specifice,
restricii enzim analiz, sau de secventiere ADN-ului.

De reacie n lan a polimerazei (2)
Avantaje al PCR:
Extrem de sensibilitate ridicat, poate detecta n jos pentru a genomului viral pe un
eantion de volum
Uor de configurat
Fast timpul de rspuns
Dezavantaje al PCR
Extrem de natur s contaminare
nalt grad de calificare necesar operatorului
Nu este uor s creeze un test cantitativ.
Un rezultat pozitiv poate fi dificil de interpretat, n special cu virusuri latente, cum ar
fi de CMV, n cazul n care orice persoan seropozitivi vor avea prezenta virusului in
sange, indiferent dac acetia au sau nu boala.
Aceste probleme sunt abordate de sosirea comerciale sisteme inchise, cum ar fi Cobas
Roche Amplicor care necesit manipulare minime. Utilizarea sintetice obiective interne
competitive n aceste teste comerciale, a facilitat o cuantificare precis a rezultatelor. Cu
toate acestea, aceste analize cantitative sunt foarte scumpe.
Schematic a reaciei PCR
Fiecare ciclu dubleaz numrul de copii al intei
Alte tehnici moleculare noi
ADN-ul ramificat este, n esen o tehnica de sensibile hydridization care implic
amplificare liniar. ntruct amplificare exponenial are loc n PCR.
Prin urmare, sensibilitatea de minciuni bDNA ntre tehnicilor de amplificare a
clasic i PCR. De alte tehnici de Newer moleculare depinde de o anumit form
de amplificare.
Comerciale tehnici de proprietate, cum ar fi LCR, NASBA, TMA depinde de
amplificarea exponenial a semnalului sau int.
Prin urmare, aceste tehnici sunt la fel de sensibile la contaminarea ca PCR i
mprtesc aceleai avantaje i dezavantaje.
PCR i tehnici legate sunt obligate s joace un rol din ce n ce mai important n
diagnosticul de infecii virale.
Cip ADN-ul este o alt tehnologie promitoare n cazul n care ar fi posibil
pentru a detecta un numr mare de virui, potenialul lor patogene, precum i
sensibilitatea lor de droguri, n acelai timp.

Method
Target
Amplification
Signal
Amplification Thermocycling Sensitivity
Commercial
Examples
PCR Exponential No Yes High Roche Amplicor
LCR No Exponential Yes High Abbot LCX
NASBA Exponential No No High Organon Teknika
TMA Exponential No No High Genprobe
Q-Replicase No Exponential No High None
Branched DNA No Linear No Medium Chiron Quantiplex
Comparaie ntre PCR i alte tehnici de
amplificare a acizilor nucleici