U n i v e r s i t a t A u t n o m a d e B a r c e l o n a

ESCOLA TCNICA SUPERIOR D'ENGINYERIA

DEPARTAMENT D'ENGINYERIA QUMICA
RECUPERACIN, PURIFICACIN Y CARACTERIZACIN
DE LIPASAS PRODUCIDAS POR Candida rugosa.
APLICACIN A LA RESOLUCIN DE COMPUESTOS
QUIRALES Y DISEO DEL REACTOR ENZIMTICO.
Pr o gr a m a d e Do c t o r a d o :
BIOTECNOLOGA
Me m o r i a qu e pa r a o pt a r a l gr a d o d e Do c t o r e n In ge n i e r a Qu m i c a pr e s e n t a :
ANTONIO SNCHEZ FERRER
FRA NCISCO VA LERO B A RRA NCO, Pr o fe s o r t i t u l a r d e l De pa r t a m e n t
d 'En gi n ye r i a Qu m i c a d e l a U n i v e r s i t a t A u t n o m a d e B a r c e l o n a y
FCO. JA VIER LA FU ENTE SA NCHO, Pr o fe s o r t i t u l a r d e l De pa r t a m e n t
d 'En gi n ye r i a Qu m i c a d e l a U n i v e r s i t a t A u t n o m a d e B a r c e l o n a
CERTIFICAN:
Qu e e l l i c e n c i a d o A n t o n i o Sn c he z Fe r r e r ha r e a l i za d o , ba jo
n u e s t r a d i r e c c i n , e l t r a ba jo qu e , c o n t t u l o "Recuperacin,
purificacin y caracterizacin de lipasas producidas por
Candida rugosa. Aplicacin a la resolucin de
compuestos quirales y diseo del reactor enzimtico",
pr e s e n t a e n e s t a m e m o r i a , l a c u a l c o n s t i t u ye s u Te s i s pa r a
o pt a r a l Gr a d o d e Do c t o r e n In ge n i e r a Qu m i c a .
Y pa r a qu e c o n s t e a l o s e fe c t o s qu e c o r r e s po n d a ,
pr e s e n t a m o s a l a Es c o l a Tc n i c a Su pe r i o r d 'En gi n ye r i a d e l a
U n i v e r s i t a t A u t n o m a d e B a r c e l o n a e l t r a ba jo c i t a d o ,
fi r m a n d o e l pr e s e n t e c e r t i fi c a d o e n B e l l a t e r r a , a 1 d e
Se t i e m br e d e 1998.
.V
Fr a n c i s c o Va l e r o B a r r a n c o
Fe o . Ja v i e r La fu e n t e Sa n c ho
A mis padres
Agradecimientos
A l o l a r go d e l o s 3 a o s y m e d i o qu e m e ha o c u pa d o l a r e a l i za c i n d e e s t e t r a ba jo , m u c ha s ha n s i d o l a s
pe r s o n a s qu e c o n s u a yu d a , a t e n c i n , s a be r e s c u c ha r o s i m pl e c o m pa a s e ha n he c ho m e r e c e d o r a s d e
a pa r e c e r e n e s t e a pa r t a d o . Si n e m ba r go , t o d a s l a s t e s i s , c o r n o l a s pe r s o n a s , n u n c a s o n po r d e fi n i c i n
c o m pl e t a s o pe r fe c t a s , c o m o e s t o y s e gu r o qu e n o l o s e r l a l i s t a d e ge n t e i n c l u i d a a qu e n e s t e m o m e n t o .
En pr i m e r l u ga r , qu e r a d e d i c a r e s t e t r a ba jo a m i s pa d r e s , l a s pe r s o n a s qu e ha n he c ho qu e yo e s t u d i a r a y
qu e s i e m pr e ha n pr o c u r a d o , d e n t r o d e s u s po s i bi l i d a d e s , qu e yo t u v i e r a l o m e jo r .
Ta m bi n qu i e r o d e d i c a r e s t e t r a ba jo a La u r a , l a qu e ha s i d o m i c o m pa e r a d u r a n t e t o d o s e s t o s a o s ,
r e c o r d n d o l e l a d e u d a qu e t e n go c o n e l l a po r t o d o e l t i e m po qu e e s t e t r a ba jo n o s ha r o ba d o .
A m i s a m i go s , A l e x, Jo a n , Ju l i n , Ja v i , Ra m n , Jo s Ra m n y l o s qu e a ho r a n o r e c u e r d o , po r fo r m a r pa r t e
d e m i v i d a y ha be r c o m pa r t i d o t a n t a s c o s a s c o n m i go , c o n v i r t i n d o s e e n u n a pa r t e fu n d a m e n t a l d e m i v i d a .
Qu i e r o a gr a d e c e r a m i s d i r e c t o r e s d e t e s i s , Pa c o y Ja v i e r , a d e m s d e fo r m a r m e c o m o c i e n t fi c o , e l ha be r
s a bi d o c o n v e r t i r s e e n m i s a m i go s , t a n t o qu e s e m e ha ga d i fc i l l l a m a r l e s m s "je fe s " o "d i r e c t o r e s ". A
e l l o s , qu e s i e m pr e ha n e s t a d o a m i l a d o , qu e r r a r e c o r d a r l e s qu e m i c o m pr o m i s o pe r s o n a l c o n e l l o s v a m s
a l l d e e s t o s 3 a o s y m e d i o .
Qu i e r o d e ja r c o n s t a n c i a a qu t a m bi n d e l a s u e r t e qu e he t e n i d o d e t r a ba ja r e n u n gr u po d e i n v e s t i ga c i n
c o m o e l d e l i pa s a s . Los c o n o c i m i e n t o s t a n t o c i e n t fi c o s c o m o hu m a n o s qu e he o bt e n i d o d e l t r a ba jo e n e s t e
gr u po n o s e pu e d e n e xpl i c a r e n c u a t r o l n e a s , pe r o m e gu s t a r a c i t a r a qu a A l be r t o Sa n z, qu e ha
c o m pa r t i d o t a n t a s y t a n t a s c o s a s y ho r a s c o n m i go , Pa u Fe r r e r y Jo s Lu s Mo n t e s i n o s , qu e m e ha n
i n c u l c a d o e l r i go r c o m o n o r m a d e t r a ba jo , y a Ca r i e s Ca s a s , c u ya e xpe r i e n c i a y s e n t i d o c o m n ha n s i d o
u n o d e l o s pi l a r e s d e m i fo r m a c i n .
Me n c i n a pa r t e qu e r r a ha c e r d e A l i c i a , qu e pa r a m ha s i d o c o m o u n s o pl o d e a i r e fr e s c o e n m o m e n t o s
c r t i c o s d e m i t r a ba jo . Su s i m pa t a , c o m pa a y a yu d a qu e d a r n s i e m pr e e n m i m e m o r i a .
A Or i o l , m e gu s t a r a d e s e a r l e t o d a l a s u e r t e d e l m u n d o e n s u t e s i s .
Me gu s t a r a ha c e r e xt e n s i v o e s t e a gr a d e c i m i e n t o a t o d a l a ge n t e d e l De pa r t a m e n t d 'En gi n ye r i a Qu m i c a ,
po r c r e a r e l e n t o r n o d e t r a ba jo a d e c u a d o e n e l qu e ha s i d o po s i bl e d e s a r r o l l a r e s t e t r a ba jo .
En pa r t i c u l a r , m e gu s t a r a a gr a d e c e r a t o d o s a qu e l l o s qu e m e ha n d e m o s t r a d o qu e s e r Do c t o r e s a l go m s
qu e c o m pa r e c e r a n t e u n t r i bu n a l d u r a n t e u n o s m i n u t o s y r e d a c t a r u n m a n u s c r i t o , e n t r e e l l o s a Pa u Fe r r e r ,
Jo s Lu s Mo n t e s i n o s , Mo n t s e Sa r r , Jo a n A l bi o l , Jo s Lu s d e l Ro , Eu ge n i o Fe r r e i r a , Fe l Vzqu e z,
Nu r i a A d r o e r , Ca r i e s Ca m pm a j y s o br e t o d o , Go yo A l v a r o , c u ya c o l a bo r a c i n fu e c l a v e e n c i e r t o s
m o m e n t o s d e e s t a t e s i s .
Ta m bi n m e gu s t a r a d a r l a s gr a c i a s a a qu e l l a ge n t e qu e m e ha a yu d a d o e n u n m o m e n t o u o t r o e n e l
l a bo r a t o r i o , e n pa r t i c u l a r a Si l v i a Ro m e r o y Me r c Fi t .
A Ju a n B a e za y Da v i d Ga br i e l , po r c o m pa r t i r t a n t o s c o n o c i m i e n t o s , e xpe r i e n c i a s y o t r a s c o s i l l a s .
A l a ge n t e d e l gr u po d e Ppt i d o s , po r e l i n t e r s qu e d e m o s t r a r o n y po r s u s a po r t a c i o n e s a e s t e t r a ba jo , e n
e s pe c i a l , a Gl o r i a Ca m i n a l .
A d o s pe r s o n a s pa r a m m u y e s pe c i a l e s qu e c o m pa r t i e r o n c o n m i go a l go m s qu e s u s ho r a s d e t r a ba jo ,
Ro s i Te l l o y Ma n u e l Pl a za , qu e a d e m s pu e d e n s e n t i r s e c o a u t o r e s d e e s t e t r a ba jo .
A l a ge n t e d e l a Es c u e l a d e Mo l l e t , e n pa r t i c u l a r Xa v i y M
a
A n ge l s , po r ha be r c o n fi a d o e n m , y a l o s qu e
e s pe r o c o r r e s po n d e r e n l o s pr xi m o s a o s .
A Ca r i e s So l , po r s u s c l a s e s .
A Ma n e l Po c h, po r ha be r s e i n t e r e s a d o s i e m pr e e n m y e n m i t r a ba jo .
A l a ge n t e d e Pu r a c B i o qu m i c a , po r l o s o c ho m e s e s qu e pa s a l l a pr e n d i e n d o a v e r l a s c o s a s d e s d e o t r o
pu n t o d e v i s t a .
A Na c ho , po r t o d o s l o s m o m e n t o s qu e he m o s c o m pa r t i d o "e n l a s o n d a s " y a t o d a l a ge n t e a n n i m a qu e he
c o n o c i d o v i r t u a l m e n t e .
A l a t r o pa qu e n o s r e u n i m o s a c o m e r e n l a Me r c , Jo a n , Jo s Lu s , A l be r t o , Fe m a n d o , Or i o l , e t c . po r l o s
r a t o s qu e he m o s pa s a d o ju n t o s .
A l a s s e o r a s d e l a l i m pi e za d e l a U A B , po r ha be r s i d o m i n i c a c o m pa a e n m u c ha s ho r a s d e l a
r e a l i za c i n d e e s t e t r a ba jo .
A l a Ge n e r a l i t a t d e Ca t a l u n ya , qu e m e fi n a n c i c o n u n a be c a d u r a n t e l a r e a l i za c i n d e l t r a ba jo y a l a
U n i v e r s i t a t A u t n o m a d e B a r c e l o n a , qu e m e pe r m i t i l a r e a l i za c i n d e e s t e t r a ba jo .
A l o s pr o gr a m a s B IO-4-96-0005 (Eu r o pe a n Pr o gr a m o n B i o t e c hn o l o gy), QFN94-4627-C02-1 (Pr o gr a m a
d e Qu m i c a Fi n a , Pl a n Na c i o n a l d e R+D. CIRTT, Ge n e r a l i t a t d e Ca t a l u n ya ) y CICYT-QU I97-0506-C03
(Pr o gr a m a Es pa o l e n Te c n o l o ga s d e Pr o c e s o s Qu m i c o s ) qu e fi n a n c i a r o n n u e s t r o pr o ye c t o d e
i n v e s t i ga c i n d u r a n t e e s t o s a o s .
A t o d a l a ge n t e qu e pa r t i c i p e n d i c ho s pr o ye c t o s y c o n l a qu e he t e n i d o l a s u e r t e d e t r a ba ja r , A Ma r i s a
Ra y s u e qu i po d e l a U n i v e r s i d a d d e Vi go , a Jo s Ma n u e l Gu i s a n y s u e qu i po d e l In s t i t u t o d e Ca t l i s i s y
Pe t r o l e o qu m i c a d e Ma d r i d y a Jo s Ma r a Sn c he z-Mo n t e r o , Cha m i , Is i d o r o , A n d r s , Jo s Vi c e n t e y
c o m pa a d e l De pa r t a m e n t o d e Qu m i c a Or gn i c a y Fa r m a c u t i c a d e l a Fa c u l t a d d e Fa r m a c i a d e Ma d r i d
po r s u a c o gi d a c u a n d o e s t u v e a l l . Ta m bi n m e gu s t a r a a c o r d a r m e d e Er n s t We ht je (yo u r e a l l y s a v e d m y
l i fe !).
A t o d a l a fa u n a d e l Ko ko , y a l o s bu e n o s r a t o s d e m i v i d a qu e ha n pa s a d o a l l .
A l o s hr o e s (d e fi n i d o s po r A l e xi s Mqu i n a ), a SK o RB , a l o s he r m a n o s Ga l l a ghe r y a l a l l u v i a
ndice
NDICE
0. Re s u m e n 1
1. In t r o d u c c i n 3
1.1. El pa pe l d e l a s l i pa s a s e n l a B i o t e c n o l o ga 3
1.1.1. En zi m a s . De fi n i c i n d e l i pa s a s : a c t i v i d a d l i po l t i c a y e s t e r s i c a 3
1.1.2. Fu e n t e s d e o bt e n c i n d e l i pa s a s . Es pe c i fi c i d a d 5
1.1.3. Re a c c i o n e s c a t a l i za d a s po r l i pa s a s 6
1.1.4. A pl i c a c i o n e s bi o t e c n o l gi c a s d e l a s l i pa s a s 8
1.2. Pr e c e d e n t e s e n l a pr o d u c c i n d e l i pa s a s 11
1.3. Mt o d o s d e pu r i fi c a c i n y c a r a c t e r i za c i n d e pr o t e n a s 12
1.3.1. Mt o d o s d e c o n c e n t r a c i n d e pr o t e n a 12
1.3.2. Mt o d o s d e pr e c i pi t a c i n 14
1.3.3. Cr o m a t o gr a fa 16
1.3.3.1. Cr o m a t o gr a fa d e i n t e r c a m bi o i n i c o 17
1.3.3.2. Cr o m a t o gr a fa d e fi l t r a c i n e n ge l 17
1.3.3.3. Cr o m a t o gr a fa hi d r o fbi c a 19
1.3.3.4. Cr o m a t o gr a fa d e a fi n i d a d 21
1.3.3.5. Cr o m a t o e n fo qu e 22
1.3.4. El e c t r o fo r e s i s 22
1.3.5. El e c t r o fo r e s i s c a pi l a r 23
1.4. Li pa s a s d e Candida rugosa 26
1.4.1. Es t r u c t u r a y m e c a n i s m o d e r e a c c i n 26
1.4.2. Is o fo r m a s pr e s e n t e s 27
1.4.3. Pu r i fi c a c i n d e l a s i s o fo r m a s pr e s e n t e s e n Candida rugosa 29
1.4.4. Di fe r e n c i a s e n t r e r e a c t i v i d a d e n t r e l a s i s o fo r m a s 32
1.4.5. Obt e n c i n d e u n a l i pa s a d e pr o pi e d a d e s c a t a l t i c a s r e pr o d u c i bl e s ..33
1.5. U t i l i za c i n d e e n zi m a s e n m e d i o o r gn i c o 35
1.5.1. In t r o d u c c i n . Ve n t a ja s y d e s v e n t a ja s 35
1.5.2. El e c c i n d e l d i s o l v e n t e . In fl u e n c i a d e l a gu a 36
1.5.3. In m o v i l i za c i n d e e n zi m a s 37
ndice
II
1.5.3.1. In t r o d u c c i n 37
1.5.3.2. Tc n i c a s d e i n m o v i l i za c i n d e e n zi m a s 38
1.5.3.3. Se l e c c i n d e l a t c n i c a d e i n m o v i l i za c i n 41
1.6. B i o r e a c t o r e s e n zi m t i c o s 43
1.6.1. Re a c t o r e s i d e a l e s . Di s t r i bu c i n d e t i e m po d e r e s i d e n c i a (DTR) 43
1.6.2. Mo d e l o s d e fl u jo 46
1.6.2.1. Mo d e l o d e d i s pe r s i n a xi a l 46
1.6.2.2. Mo d e l o d e t a n qu e s e n s e r i e 47
1.6.2.3. Mo d e l o s c o m pa r t i m e n t a d o s 47
1.6.3. Ti po s d e r e a c t o r e s e n zi m t i c o s 48
1.6.4. Pr o c e s o s i n d u s t r i a l e s e n zi m t i c o s 51
1.7. U t i l i za c i n d e l i pa s a s 53
1.7.1. In m o v i l i za c i n d e l i pa s a s 53
1.7.2. Ci n t i c a s e n zi m t i c a s pa r a l i pa s a s 58
1.7.3. B i o r e a c t o r e s c o n l i pa s a s 61
1.7.4. Fo r m a s d e e xpr e s a r y c a l c u l a r l a e n a n t i o s e l e c t i v i d a d 64
1.7.5. Re s o l u c i n d e c i d o s 2-a r i l pr o pi n i c o s c o n l i pa s a s 66
1.7.5.1. Pr e c e d e n t e s 66
1.7.5.2. Fa c t o r e s qu e a fe c t a n a e s t e t i po d e r e a c c i o n e s 68
1.7.6. Re s o l u c i n d e r a n s -2-fe n i l -c i c l o he xa n o l c o n l i pa s a s 80
1.8. Va l o r a c i n e c o n m i c a d e pr o c e s o s 81
1.8.1. Es t i m a c i n d e l a s pa r t i d a s n e c e s a r i a s 81
1.8.2. Cl c u l o d e Ne t Ca s h Fl o w (NCF) y Re n t Di s c o u n t e d Ca s h
Fl o w(RDCF) 83
2. Obje t i v o s 85
3. Ma t e r i a l e s y m t o d o s 87
3.1. Me t o d o l o ga e xpe r i m e n t a l 87
3.1.1. Fe r m e n t a c i n 87
3.1.1.1. Mo n t a je e xpe r i m e n t a l d e l a fe r m e n t a c i n 87
3.1.1.2. Me d i o y r e a c t i v o s d e l a fe r m e n t a c i n 88
3.1.1.3. Ma n t e n i m i e n t o d e l a l e v a d u r a y s i s t e m a d e i n c u l o s 89
3.1.2. Se pa r a c i n 90
ndice i.J.1
3.1.3. Cr o m a t o gr a fa e n FPLC 91
3.1.3.1. Cr o m a t o gr a fa d e i n t e r c a m bi o i n i c o 91
3.1.3.2. Cr o m a t o gr a fa d e ge l fi l t r a c i n 92
3.1.3.3. Cr o m a t o gr a fa d e i n t e r a c c i n hi d r o fbi c a 93
3.1.4. El e c t r o fo r e s i s 93
3.1.5. Re a c c i o n e s n o qu i r a l e s 94
3.1.5.1. Re a c c i o n e s d e hi d r l i s i s 94
3.1.5.2. Re a c c i o n e s d e s n t e s i s 94
3.1.6. In m o v i l i za c i n 94
3.1.6.1. In m o v i l i za c i n s o br e Ce l i t a y Po l i a m i d a 94
3.1.6.2. In m o v i l i za c i n s o br e Du o l i t e 95
3.1.6.3. In m o v i l i za c i n s o br e EP100 95
3.1.7. Re a c c i o n e s qu i r a l e s 95
3.1.8. Di s e o d e e xpe r i m e n t o s 97
3.1.9. Mo n t a je d e l a s r e a c c i o n e s e n c o n t i n u o 97
3.2. Mt o d o s d e a n l i s i s 98
3.2.1. Fe r m e n t a c i n y pu r i fi c a c i n 98
3.2.1.1. De t e r m i n a c i n d e l a bi o m a s a po r pe s o s e c o 98
3.2.1.2. Te s t d e a c t i v i d a d l i po l t i c a po r m t o d o t u r bi d i m t r i c o 98
3.2.1.3. A n l i s i s c o l o r i m t r i c o d e l a a c t i v i d a d e s t e r s i c a 99
3.2.1.4. A n l i s i s d e pr o t e n a t o t a l po r e l m t o d o d e Lo wr y 99
3.2.1.5. A n l i s i s d e pr o t e n a t o t a l po r e l m t o d o d e B r a d fo r d 100
3.2.1.6. De t e r m i n a c i n d e l o s po l i s a c r i d o s t o t a l e s po r e l
m t o d o d e l a A n t r o n a 101
3.2.2. Re a c c i o n e s c o n l i pa s a s 102
3.2.2.1. A n l i s i s d e c i d o pr o pi n i c o po r Cr o m a t o gr a fa d e
Ga s e s 102
3.2.2.2. A n l i s i s d e pr o pi o n a t o d e n -bu t i l o po r Cr o m a t o gr a fa
d e Ga s e s 103
3.2.2.3. A n l i s i s d e he xa n o l po r Cr o m a t o gr a fa d e Ga s e s 104
3.2.2.4. A n l i s i s d e bu t a n o l po r HPLC 105
3.2.2.5. A n l i s i s d e e n a n t i m e r o s d e i bu pr o fe n o po r HPLC 106
ndice
IV
3.2.2.6. A n l i s i s d e e n a n t i m e r o s d e l c i d o 2-fe n i l -pr o pi n i c o
po r HPLC 107
3.2.2.7. A n l i s i s d e e n a n t i m e r o s d e /r a A w-2-fe n i l -l -c i c l o he xa n o l
po r HPLC 108
4. Re s u l t a d o s y d i s c u s i n 109
4.1. Pr o d u c c i n d e l a l i pa s a U A B 109
4.1.1. Es t r a t e gi a d e fe r m e n t a c i n 109
4.1.2. De t e r m i n a c i n d e l a l e y d e a d s o r c i n d e l i pa s a s s o br e
e l c i d o o l e i c o 111
4.1.3. Co n c l u s i o n e s 120
4.2. Se pa r a c i n d e l a l i pa s a U A B 121
4.2.1. Obt e n c i n d e u n c o n c e n t r a d o l qu i d o d e l i pa s a s U A B 121
4.2.2. Obt e n c i n d e u n a l i pa s a U A B s l i d a 124
4.2.2.1. Pr e c i pi t a c i n c o n e t a n o l 124
4.2.2.2. Pr e c i pi t a c i n c o n s u l fa t o a m n i c o 125
4.2.2.3. Li o fi l i za c i n d i r e c t a 127
4.2.3. Co n c l u s i o n e s 129
4.3. Es t i m a c i n e c o n m i c a d e l pr o c e s o d e pr o d u c c i n d e l i pa s a s U A B 131
4.3.1. Pa r t i d a s qu e c o m po n e n l a e s t i m a c i n e c o n m i c a 131
4.3.1.1. Ve n t a s (V) 131
4.3.1.2. In m o v i l i za d o (I) , 131
4.3.1.3. Co s t e s 133
4.3.1.4. A m o r t i za c i n 136
4.3.1.5. Ca pi t a l c i r c u l a n t e 136
4.3.2 Cl c u l o d e l a r e n t a bi l i d a d 137
4.3.3. Co n c l u s i o n e s 138
4.4. Ca r a c t e r i za c i n d e l a l i pa s a U A B y c o m pa r a c i n c o n l i pa s a s
c o m e r c i a l e s d e Si gm a 1754-t i po VII 139
4.4.1. De t e r m i n a c i n d e l a s pr o t e n a s pr e s e n t e s e n l a l i pa s a U A B 139
4.4.2. Se pa r a c i n d e l a s d i s t i n t a s pr o t e n a s pr e s e n t e s 144
4.4.2.1. Cr o m a t o gr a fa d e i n t e r c a m bi o i n i c o 144
ndice v
4.4.3.2. Cr o m a t o gr a fa d e ge l fi l t r a c i n . Re l a c i n l i pa s a -
po l i s a c r i d o 147
4.4.3.3. Cr o m a t o gr a fa d e i n t e r a c c i n hi d r o fbi c a : s e pa r a c i n
d e ba n d a s 3 y 4 149
4.4.3. Co n c l u s i o n e s 155
4.5. U t i l i za c i n d e l a l i pa s a U A B l i br e e n r e a c c i o n e s d e s n t e s i s n o qu i r a l e s ... 157
4.5.1. Es t e r i fi c a c i n d e l c i d o pr o pi n i c o c o n a l c o ho l e s l i n e a l e s 157
4.5.2. Co n c l u s i o n e s 162
4.6. In m o v i l i za c i n d e l a l i pa s a U A B 163
4.6.1. Ne c e s i d a d d e i n m o v i l i za r l a l i pa s a U A B 163
4.6.2. In m o v i l i za c i n po r a d s o r c i n 163
4.6.2.1. In m o v i l i za c i n s o br e c e l i t a y po l i a m i d a 164
4.6.2.2. In m o v i l i za c i n s o br e Du o l i t e ... 167
4.6.2.3. In m o v i l i za c i n s o br e EP100 170
4.6.3. In m o v i l i za c i n po r u n i n c o v a l e n t e 172
4.6.4. Co n c l u s i o n e s 174
4.7. U t i l i za c i n d e l a l i pa s a U A B i n m o v i l i za d a e n r e a c c i o n e s d e s n t e s i s
qu i r a l e s 175
4.7.1. El e c c i n d e l a s r e a c c i o n e s 175
4.7.2. Co n d i c i o n e s d e r e a c c i n . El e c c i n d e l a e n zi m a 177
4.7.3. Co m pa r a c i n e n t r e l i pa s a U A B y Li po zym e IM20 178
4.7.4. Co n c l u s i o n e s 182
4.8. Es t u d i o d e l a e s t e r i fc a c i n e n a n t i o s e l e c t i v a d e i bu pr o fe n o m e d i a n t e
Li po zym e EVI20 185
4.8.1. Me t o d o l o ga ge n e r a l 185
4.8.2. De t e r m i n a c i n d e l o s fa c t o r e s qu e i n fl u ye n e n l a r e a c c i n 186
4.8.3. Di s e o d e e xpe r i m e n t o s 188
4.8.4. De t e r m i n a c i n d e l a c i n t i c a d e r e a c c i n 199
4.8.5. Se l e c c i n d e t i po d e r e a c t o r e n c o n t i n u o : RCFP o RCTA 205
4.8.6. Es t u d i o s e n u n RCFP 207
4.8.7. Co m po r t a m i e n t o d e l a gu a e n e l s i s t e m a 212
4.8.8. Es t u d i o hi d r o d i n m i c o d e l RCFP: DTR 215
ndice
VI
4.8.9. Co n c l u s i o n e s 223
4.9. Es t u d i o d e l a e s t e r i fi c a c i n e n a n t i o s e l e c t i v a d e fr a s -2-fe n i l -l -
c i c l o he xa n o l c o n l i pa s a U A B 225
4.9.1. Opt i m i za c i n d e l a s c o n d i c i o n e s d e r e a c c i n 225
4.9.2. De t e r m i n a c i n d e l a c i n t i c a e n e l pt i m o 232
4.9.3. El e c c i n d e l t i po d e r e a c t o r 234
4.9.4. Fu n c i o n a m i e n t o d e l RCFP 235
4.9.5. Co n c l u s i o n e s 237
5. Co n c l u s i o n e s 239
6. No m e n c l a t u r a 241
7. B i bl i o gr a fa 243
7.1. Re fe r e n c i a s 243
7.2. B i bl i o gr a fa e l e c t r n i c a 262
8. A pn d i c e s 263
8.1. Ca l i br a d o d e l a a c t i v i d a d l i po l t i c a 263
8.2. Ca l i br a d o d e a c t i v i d a d e s t e r s i c a 264
8.3. Ca l i br a d o d e pr o t e n a t o t a l po r e l m t o d o d e Lo wr y 265
8.4. Ca l i br a d o d e pr o t e n a t o t a l po r e l m t o d o d e B r a d fo r d 266
8.5. Ca l i br a d o d e po l i s a c r i d o s po r e l m t o d o d e l a A n t r o n a 267
8.6. Ca l i br a d o d e c i d o pr o pi n i c o po r c r o m a t o gr a fa d e ga s e s 268
8.7. Ca l i br a d o d e pr o pi o n a t o d e n -bu t i l o po r c r o m a t o gr a fa d e ga s e s 269
8.8. Ca l i br a d o d e he xa n o l po r c r o m a t o gr a fa d e ga s e s 270
8.9. Ca l i br a d o d e bu t a n o l po r HPLC 271
8.10. A n l i s i s d e i bu pr o fe n o po r c o l u m n a d e HPLC qu i r a l 272
8.11. A n l i s i s d e c i d o 2-fe n i l pr o pi n i c o po r c o l u m n a d e HPLC qu i r a l 273
8.12. A n l i s i s d e r a 5-2-fe n i l -l -c i c l o he xa n o l po r c o l u m n a d e HPLC qu i r a l ..274
8.13. Cr o m a t o gr a fa e n FPLC 275
8.14. Di s e o d e e xpe r i m e n t o s 276
8.15. Pr o gr a m a d e c o n t r o l d e l a m i c r o bu r e t a 280
Resumen
0. RESUMEN
En e s t a m e m o r i a s e pr e s e n t a n l o s r e s u l t a d o s o bt e n i d o s e n e l e s t u d i o d e l a a pl i c a c i n d e
l a s l i pa s a s pr o d u c i d a s po r Candida rugosa m e d i a n t e fe r m e n t a c i n e n l a r e s o l u c i n d e
c o m pu e s t o s qu i r a l e s d e i n t e r s fa r m a c u t i c o po r m e d i o d e r e a c c i o n e s d e e s t e r i fi c a c i n e n
m e d i o o r gn i c o .
En e l pr e s e n t e t r a ba jo s e ha i n i c i a d o l a s e pa r a c i n d e l i pa s a s pr o d u c i d a s po r
fe r m e n t a c i n d e Candida rugosa c r e c i e n d o s o br e c i d o o l e i c o e n u n pr o c e s o fe d -ba t c h a
e s c a l a pl a n t a pi l o t o , c o n s i gu i n d o s e u n a l i pa s a c l a r a m e n t e s u pe r i o r e n t r m i n o s d e a c t i v i d a d
l i po l t i c a a l o s pr e pa r a d o s c o m e r c i a l e s pr o po r c i o n a d o s po r Si gm a y A m a n o . La r e c u pe r a c i n
d e u n pr e pa r a d o s l i d o c o n t e n i e n d o e s t a s l i pa s a s (d e n o m i n a d o l i pa s a U A B ) s e r e a l i z po r
m t o d o s s e n c i l l o s y fc i l m e n t e e s c a l a bl e s c o m o c e n t r i fu ga c i n , fi l t r a c i n , u l t r a fi l t r a c i n y
l i o fi l i za c i n , qu e o r i gi n a r o n r e c u pe r a c i o n e s d e a c t i v i d a d s u pe r i o r e s a l 90 %. A l m i s m o
t i e m po , s e pr e s e n t a u n a e v a l u a c i n e c o n m i c a pr e l i m i n a r d e l pr o c e s o .
Se ha c o n s e gu i d o l a c a r a c t e r i za c i n d e l a s pr o t e n a s pr e s e n t e s e n e l pr e pa r a d o s l i d o
fi n a l , d e s c r i bi n d o s e l a pr e s e n c i a d e d o s i s o e n zi m a s c o r r e s po n d i e n t e s a d o s ge n e s d e l i pa s a d e
Candida rugosa. Ta m bi n s e ha d e s c r i t o l a pr e s e n c i a d e a l m e n o s d o s pr o t e n a s d e n a t u r a l e za
e s t e r s i c a , qu e s e ha n c o n s e gu i d o pu r i fi c a r m e d i a n t e l a i m pl e m e n t a c i n d e u n s i s t e m a d e
pu r i fi c a c i n po r c r o m a t o gr a fa hi d r o fbi c a y d e i n t e r c a m bi o i n i c o u t i l i za n d o l a t e c n o l o ga
FPLC.
Se ha c o m pr o ba d o l a po t e n c i a l i d a d d e l u s o d e l a l i pa s a U A B e n r e a c c i o n e s d e s n t e s i s
c o n s u bs t r a t o s d e n a t u r a l e za n o qu i r a l , o r i gi n a n d o r e s u l t a d o s s i m i l a r e s a l o s d e l a s l i pa s a s
c o m e r c i a l e s d e Candida rugosa d e Si gm a y A m a n o .
Se ha e s t u d i a d o l a i n m o v i l i za c i n d e l a l i pa s a U A B s o br e d i s t i n t o s s o po r t e s : c e l i t a ,
po l i a m i d a , d u o l i t e , t o yo pe a r l y EP100, r e s u l t a n d o e l m e jo r s o po r t e e l EP100, c o n e l qu e s e
o bt i e n e u n bi o c a t a l i za d o r d e a c t i v i d a d c o m pa r a bl e a l pr o d u c t o Li po zym e EVI20 d e No v o
Resumen
No r d i s k (qu e c o r r e s po n d e a l i pa s a deMucor tniehei i n m o v i l i za d a s o br e d u o l i t e ) e n r e a c c i o n e s
d e s n t e s i s n o qu i r a l .
Se ha e s t u d i a d o l a u t i l i za c i n d e l a l i pa s a U A B i n m o v i l i za d a s o br e EP100 e n l a
r e s o l u c i n d e s u bs t r a t o s d e n a t u r a l e za qu i r a l d e i n t e r s fa r m a c u t i c o (a n t i i n fl a m a t o r i o s n o
e s t e r o i d a l e s ) c o m o e l c i d o 2-fe n i l pr o pi n i c o y e l i bu pr o fe n o m e d i a n t e e s t e r i fc a c i n c o n
bu t a n o l e n i s o o c t a n o . En a m bo s c a s o s l a l i pa s a U A B o r i gi n r e s u l t a d o s s u pe r i o r e s e n
e n a n t i o s e l e c t i v i d a d pe r o i n fe r i o r e s e n v e l o c i d a d d e s n t e s i s c u a n d o s e c o m pa r a Li po zym e
IM20. Ta m bi n s e ha e s t u d i a d o l a r e s o l u c i n d e /r <m s '-2-fe n i l -c i c l o he xa n o l (i n t e r m e d i a r i o
pa r a l a pr o d u c c i n d e o t r o s c o m pu e s t o s qu i r a l e s ) c o n c i d o pr o pi n i c o e n i s o o c t a n o , e n c u yo
c a s o s l o c o n l a l i pa s a U A B s e o bt u v o u n a r e s o l u c i n s a t i s fa c t o r i a .
Se ha d e s a r r o l l a d o u n s i s t e m a e n c o n t i n u o pa r a l a r e s o l u c i n a l t a m e n t e
e n a n t i o s e l e c t i v a d e i bu pr o fe n o u t i l i za n d o Li po zym e IM20. La d e t e r m i n a c i n d e l a s
c o n d i c i o n e s pt i m a s d e r e a c c i n s e r e a l i z m e d i a n t e u n d i s e o d e e xpe r i m e n t o s fa c t o r i a l . El
s i s t e m a e n c o n t i n u o pr o pu e s t o c o n s i s t e e n u n r e a c t o r d e l e c ho fi jo c o n fl u jo pi s t n qu e m o s t r
u n fu n c i o n a m i e n t o pt i m o d u r a n t e 100 ho r a s d e o pe r a c i n . Me d i a n t e t c n i c a s d e d i s t r i bu c i n
d e t i e m po d e r e s i d e n c i a s e e s t u d i e l c o m po r t a m i e n t o hi d r o d i n m i c o d e l r e a c t o r d e m o s t r a n d o
e s t a r pr xi m o a u n fl u jo pi s t n i d e a l .
El s i s t e m a e n c o n t i n u o t a m bi n s e u t i l i z c o n xi t o e n l a r e s o l u c i n a l t a m e n t e
e n a n t i o s e l e c t i v a d e r <m s -2-fe n i l -c i c l o he xa n o l u t i l i za n d o l i pa s a U A B i n m o v i l i za d a s o br e
EP100. La d e t e r m i n a c i n d e l a s c o n d i c i o n e s pt i m a s d e r e a c c i n s e r e a l i z d e n u e v o
m e d i a n t e u n d i s e o d e e xpe r i m e n t o s fa c t o r i a l .
Introduccin
1. INTRODUCCIN
1.1. El pa pe l d e l a s l i pa s a s e n l a B i o t e c n o l o ga
1.1.1. En zi m a s . De fi n i c i n d e l i pa s a s : a c t i v i d a d l i po l t i c a y e s t e r s i c a
U n a d e l a s a pl i c a c i o n e s m s c o m u n e s d e l a B i o t e c n o l o ga e s l a pr o d u c c i n y
u t i l i za c i n d e e n zi m a s . La s e n zi m a s s o n s u bs t a n c i a s d e n a t u r a l e za pr o t e i c a y c o m o
bi o c a t a l i za d o r e s pr e s e n t a n gr a n d e s v e n t a ja s s o br e l o s c a t a l i za d o r e s qu m i c o s m s c o m u n e s
c o m o s o n s u m a yo r e s pe c i fi c i d a d y s e l e c t i v i d a d , pr i n c i pa l m e n t e d e bi d o a l he c ho d e qu e s o n
c a t a l i za d o r e s pt i c a m e n t e s e l e c t i v o s , a d e m s d e t r a ba ja r e n c o n d i c i o n e s d e r e a c c i n c e r c a n a s
a l a s qu e s e e n c u e n t r a n e n m e d i o s fi s i o l gi c o s , a l c o n t r a r i o d e l a m a yo r a d e r e a c c i o n e s
qu m i c a s c o n v e n c i o n a l e s . Es t e he c ho i m pl i c a , a d e m s , l a a u s e n c i a d e pr o d u c t o s s e c u n d a r i o s
c o n l a c o n s i gu i e n t e s i m pl i fi c a c i n , a pr i o r i , d e l a s e t a pa s d e s e pa r a c i n y pu r i fi c a c i n .
Po r e l c o n t r a r i o , l a s e n zi m a s pr e s e n t a n u n a s e r i e d e i n c o n v e n i e n t e s c o m o s o n s u
e l e v a d o c o s t e y s u po c a e s t a bi l i d a d e n m e d i o s y c o n d i c i o n e s a l e ja d a s d e l a s fi s i o l gi c a m e n t e
ha bi t u a l e s , e n pa r t i c u l a r , e s m a r c a d a l a d e pe n d e n c i a d e l a a c t i v i d a d d e u n a e n zi m a c o n
fa c t o r e s a m bi e n t a l e s c o m o t e m pe r a t u r a , pr e s i n o pH y o pe r a c i o n a l e s c o m o a gi t a c i n ,
a i r e a c i n , e t c . Po r o t r o l a d o , l a pr e s e n c i a d e i n hi bi c i o n e s qu e m o d i fi c a n l a a c t i v i d a d
e n zi m t i c a , o bl i ga a t r a ba ja r ha bi t u a l m e n t e a c o n c e n t r a c i o n e s d e s u bs t r a t o s y pr o d u c t o s ba ja s ,
l o qu e m u c ha s v e c e s pr o v o c a u n e n c a r e c i m i e n t o d e l a e t a pa d e pu r i fi c a c i n d e l pr o d u c t o d e
i n t e r s .
La s l i pa s a s (t r i a c i l gl i c e r o l s t e r hi d r o l a s a s : EC. 3.1.1.3) pe r t e n e c e n a u n gr u po d e
e n zi m a s hi d r o l t i c o s c u ya fu n c i n bi o l gi c a e s c a t a l i za r l a hi d r l i s i s d e t r i gl i c r i d o s pa r a
o bt e n e r c o m o pr o d u c t o s fi n a l e s c i d o s gr a s o s l i br e s y gl i c e r o l o pr o d u c t o s i n t e r m e d i o s c o m o
m o n o o d i gl i c r i d o s . En l a fi gu r a 1.1 s e pu e d e o bs e r v a r c u a l s e r a l a r e a c c i n n a t u r a l d e l a s
l i pa s a s e n m e d i o a c u o s o .
Introduccin
CH,OH
O-R
3H,O CHOH + 3RCOOH
-OR
HC'
O-R
Tr i gc r i d o
CHi OH
Gl i o e r o l A c i d o gr a s o
Fi g. 1.1.: A c c i n t pi c a d e l a s l i pa s a s hi d r o l i za n d o u n t r i gl i c r i d o .
En l a n a t u r a l e za , l a s l i pa s a s a c t a n e n l a i n t e r fa s e o r gn i c o -a c u o s a , y s u m o d e l o
c i n t i c o n o r m a l m e n t e n o s e a ju s t a a c i n t i c a s d e l t i po Mi c ha e l i s -Me n t e n s i e n d o ge n e r a l m e n t e
m u c ho m s c o m pl e jo (Ve r ge r et al, 1990). De he c ho , l a c a r a c t e r s t i c a c l a r a m e n t e
d i fe r e n c i a d a d e l a s l i pa s a s c o n r e s pe c t o a o t r o s e n zi m a s qu e t a m bi n pu e d e n hi d r o l i za r e s t e r e s
c o m o l a s e s t e r a s a s e s l a n e c e s i d a d d e u n a i n t e r fa s e o r gn i c o -a c u o s a pa r a r e a l i za r d i c ha
fu n c i n c a t a l t i c a .
Lo s s u bs t r a t o s pr o pi o s d e l a s l i pa s a s s o n e s t e r e s i n s o l u bl e s y c u a n d o l a e n zi m a a c t a
e n e s t a i n t e r fa s e o r gn i c o -a c u o s a s e ha bl a d e actividad lipoltica y s u c i n t i c a n o pu e d e s e r
d e s c r i t a po r e l m o d e l o c l s i c o d e Mi c ha e l i s -Me n t e n . En e l c a s o d e l a a c t i v i d a d l i po l t i c a
n o r m a l m e n t e s e pr o d u c e u n fe n m e n o d e a d s o r c i n i n i c i a l s o br e l a fa s e o r gn i c a , a l qu e s i gu e
l a r e a c c i n pr o pi a m e n t e d i c ha s o br e l a i n t e r fa s e , c o n l a fo r m a c i n d e c o m pl e jo e n zi m a -
s u bs t r a t o y po s t e r i o r l i be r a c i n d e l o s pr o d u c t o s a l a fa s e a c u o s a c o n l a po s t e r i o r r e ge n e r a c i n
d e l a e n zi m a (Ja e ge r et al, 1994).
En e l c a s o d e l a actividad estersica l a s i t u a c i n e s c o m pl e t a m e n t e d i fe r e n t e pu e s t o
qu e l a s e s t e r a s a s c a t a l i za n hi d r l i s i s d e e s t e r e s s o l u bl e s , t r a ba ja n d o s i n i n t e r fa s e y pu d i e n d o
d e s c r i bi r s e s u c i n t i c a m e d i a n t e m o d e l o s d e Mi c ha e l i s -Me n t e n . En e s t e pu n t o , e s n e c e s a r i o
s e a l a r qu e l a m a yo r a d e l i pa s a s s o n t a m bi n e s t e r a s a s , s i n e m ba r go , n o o c u r r e l o m i s m o c o n
l a s e s t e r a s a s , qu e n o s u e l e n c a t a l i za r r e a c c i o n e s c o n s u bs t r a t o s i n s o l u bl e s , pr e c i s a m e n t e po r l a
n e c e s i d a d d e t r a ba ja r e n l a i n t e r fa s e .
Introduccin
1.1.2. Fu e n t e s d e o bt e n c i n d e l i pa s a s . Es pe c i fi c i d a d
Si bi e n l a pr i m e r a fu e n t e d e o bt e n c i n d e l a s l i pa s a s fu e a pa r t i r d e pn c r e a s d e
m a m fe r o s (c e r d o s ge n e r a l m e n t e ) e n l a a c t u a l i d a d s e o bt i e n e n v a fe r m e n t a t i v a a pa r t i r d e u n a
a m pl i a v a r i e d a d d e m i c r o o r ga n i s m o s e n t r e l o s qu e s e e n c u e n t r a n ba c t e r i a s (Ja e ge r et al,
1994), l e v a d u r a s y ho n go s (Ra pp y B a c kha u s , 1992). En pa r t i c u l a r , l a s l i pa s a s pr o d u c i d a s po r
ba c t e r i a s , c o m o l a s pr o d u c i d a s po r l a s e s pe c i e s Pseudomonas, l a s pr o d u c i d a s po r ho n go s qu e
pe r t e n e c e n a l a s e s pe c i e s Penicillium, Rhizopus, Rhizomucor, Geotrichum y l a s d e l e v a d u r a s
c o m o d i s t i n t a s e s pe c i e s d e Candida s o n l a s m s d e s t a c a d a s e n c u a n t o a pr o d u c c i n i n d u s t r i a l .
La pr o d u c c i n d e l i pa s a s a pa r t i r d e c a d a u n o d e l o s m i c r o o r ga n i s m o s d e pe n d e e n gr a n
m e d i d a d e fa c t o r e s a m bi e n t a l e s , c o m o t e m pe r a t u r a o pH, c o m po s i c i n d e l m e d i o d e
fe r m e n t a c i n : fu e n t e s d e c a r bo n o , n i t r ge n o , c o n c e n t r a c i n d e s a l e s i n o r gn i c a s , a s c o m o
po r c e n t a je d e o xge n o d i s u e l t o , pu d i e n d o e s t o s fa c t o r e s a l t e r a r l a e s t r u c t u r a d e l a e n zi m a y l a
r e l a c i n l i pa s a e xt r a c e l u l a r /i n t r a c e l u l a r . La s c o n d i c i o n e s ha bi t u a l m e n t e u t i l i za d a s s o n :
t e m pe r a t u r a a l r e d e d o r d e l o s 30C, pH e n zo n a n e u t r a y c o n d i c i o n e s a e r o bi a s . Co m o fu e n t e d e
c a r bo n o s e s u e l e u t i l i za r u n a fu e n t e m i xt a c o m pu e s t a po r u n gl c i d o y u n l pi d o , a c t u a n d o e s t e
l t i m o c o m o i n d u c t o r pa r a l a pr o d u c c i n d e l i pa s a s . Co m o fu e n t e d e n i t r ge n o s e s u e l e
u t i l i za r u r e a o s a l e s i n o r gn i c a s d e a m o n i o .
En e l De pa r t a m e n t d 'En gi n ye r i a Qu m i c a d e l a U n i v e r s i t a t A u t n o m a d e B a r c e l o n a s e
ha n e s t u d i a d o l o s d i v e r s o s fa c t o r e s qu e a fe c t a n a l a fe r m e n t a c i n d e Candida rugosa pa r a l a
pr o d u c c i n d e l i pa s a s . Se e s t u d i a r o n fu e n t e s d e c a r bo n o m i xt a s (Va l e r o et al., 1991)
d e s t a c a n d o u n c r e c i m i e n t o pt i m o e n a c e i t e d e o l i v a y c o n s t a t n d o s e e l e fe c t o i n hi bi t o r i o d e
l a gl u c o s a s o br e l a pr o d u c c i n d e l i pa s a s . Po s t e r i o r m e n t e s e e s t u d i e l e fe c t o d e i n t r o d u c i r l o s
c o m po n e n t e s d e l a c e i t e d e o l i v a , gl i c e r o l y c i d o o l e i c o , po r s e pa r a d o (De l Ro et al., 1990)
o bs e r v n d o s e qu e s e pr o d u c a u n c r e c i m i e n t o d i a u xi c o e n e l c u a l pr i m e r o s e c o n s u m a e l
gl i c e r o l y d e s pu s e l c i d o o l e i c o , e n c u ya fa s e s e pr o d u c a l a pr o d u c c i n d e l a e n zi m a .
Fi n a l m e n t e s e e l i gi e l c i d o o l e i c o c o m o s u bs t r a t o d e e n t r e l o s d i s t i n t o s c i d o s gr a s o s
pr o ba d o s (Obr a d o r s et al, 1993). A c t u a l m e n t e s e t r a ba ja c o n c i d o o l e i c o c o m o n i c a fu e n t e
d e c a r bo n o y s e ha d e s a r r o l l a d o u n m o d e l o m a t e m t i c o e s t r u c t u r a l pa r a d e s c r i bi r e l
c r e c i m i e n t o d e Candida rugosa y l a pr o d u c c i n d e l i pa s a s (Mo n t e s i n o s et al, 1995).
Introduccin
Re c i e n t e m e n t e s e ha c o n s t a t a d o e l e fe c t o qu e s o br e l a pr o d u c c i n d e l i pa s a s t i e n e e l t a m a o
d e l a go t a d e c i d o o l e i c o (Da l m a u et al, 1998) y s u i m po r t a n c i a c o m o c r i t e r i o d e e s c a l a d o e n
o pe r a c i o n e s d e pr o d u c c i n d e l i pa s a s a e s c a l a pi l o t o .
Po r o t r o l a d o , l a e s pe c i fi c i d a d d e l a s l i pa s a s e s t d i r e c t a m e n t e r e l a c i o n a d a c o n e l
m i c r o o r ga n i s m o pr o d u c t o r d e l a s m i s m a s . De a c u e r d o c o n e s t o , e xi s t e n l i pa s a s n o
e s pe c fi c a s , e s d e c i r , a qu l l a s qu e hi d r o l i za n e l t r i gl i c r i d o e n c u a l qu i e r a d e s u s po s i c i o n e s ,
o bt e n i n d o s e c o m o pr o d u c t o s i n t e r m e d i o s (1,2)(2,3)(1,3) d i gl i c r i d o s y m o n o gl i c r i d o s . A
e s t e gr u po pe r t e n e c e l a l i pa s a d e Candida rugosa y l a d e Candida crvala (Ro s e y Ha r r i s o n ,
1989). Po r l o qu e s e r e fi e r e a l i pa s a s e s pe c fi c a s , d i c ha e s pe c i fi c i d a d pu e d e s e r d e d o s t i po s :
1) Po s i c i o n a l : c u a n d o s e hi d r o l i za n pr e fe r e n t e m e n t e c i e r t a s po s i c i o n e s d e l t r i gl i c r i d o ,
n o r m a l m e n t e l a s po s i c i o n e s 1 y 3 qu e s o n l a s m s a c c e s i bl e s , po r e je m pl o , pe r t e n e c e n a
e s t e t i po l a s l i pa s a s pr o d u c i d a s po r Yarrowia lipolytica, Candida deformans, Aspergillus
niger, Rhizopus arrhizus, Rhizopus japonicus y Rhizopus delemar (Ma c r a e , 1983; Ma c r a e
y Ha m m o n d , 1985; Ro s e y Ha r r i s o n , 1989).
2) De c i d o gr a s o : c u a n d o s e c a t a l i za l a hi d r l i s i s d e u n d e t e r m i n a d o t i po d e c i d o gr a s o
pa r t i c u l a r d e u n t r i gl i c r i d o . Eje m pl o s d e e s t e t i po s o n l a s l i pa s a s d e Penicillium
cyclopium, Aspergillus niger, Rhizopus delemar, y Geotrichum candidum (B o r gs t r m y
B r o c km a n , 1984; Si d e bo t t o m etal., 1991).
1.1.3. Re a c c i o n e s c a t a l i za d a s po r l i pa s a s
El i n t e r s d e a l gu n o s t i po s d e l i pa s a e s c o n s e c u e n c i a d e s u a c c i n e s pe c fi c a s o br e
u n o s e n l a c e s qu m i c o s d e t e r m i n a d o s . Es t o pe r m i t e u n a a m pl i a s e r i e d e a pl i c a c i o n e s c o m o l a
r e s o l u c i n d e c o m pu e s t o s qu i r a l e s y l a o bt e n c i n , c o n u n a l t o r e n d i m i e n t o , d e c i d o s gr a s o s
d e e l e v a d a pu r e za a pa r t i r d e a c e i t e s y gr a s a s . En ge n e r a l , l a s l i pa s a s t a m bi n c a t a l i za n o t r a s
r e a c c i o n e s n o n e c e s a r i a m e n t e l i po l t i c a s , l o qu e ha c e qu e e s t a e n zi m a t e n ga u n a a m pl i a
u t i l i za c i n e n r e a c c i o n e s m u y d i v e r s a s .
Ot r a s a pl i c a c i o n e s m u y i n t e r e s a n t e s v i e n e n d a d a s po r l a c a pa c i d a d d e e s t o s e n zi m a s d e
Introduccin
c a t a l i za r l a r e a c c i n i n v e r s a l o qu e pe r m i t e l a s n t e s i s d e e s t e r e s , l a t r a n s e s t e r i fc a c i n y l a
i n t e r e s t e r i fc a c i n (Ja e ge r et al, 1994). En e s t o s l t i m o s c a s o s c i t a d o s l a c o n c e n t r a c i n d e l
a gu a e n e l m e d i o s e r u n pa r m e t r o c l a v e pa r a d e s pl a za r e l e qu i l i br i o ha c i a l a s n t e s i s d e l o s
pr o d u c t o s d e i n t e r s , s i e n d o m u y c o m u n e s l o s s i s t e m a s d e e l i m i n a c i n c o n t i n u a d e l a gu a
fo r m a d a d u r a n t e l a r e a c c i n (Kwo n et al, 1995).
La transesterificacin s e d e fi n e c o m o u n a r e a c c i n d e s n t e s i s e n l a c u a l e l a c i l
d o n a d o r e s u n s t e r , y s e d i s t i n gu e n d o s t i po s d e t r a n s e s t e r i fi c a c i o n e s , gl i c e r l i s i s y
a l c o hl i s i s , s e gn s e a e l gl i c e r o l o u n a l c o ho l e l a c i l r e c e pt o r . En l a fi gu r a 1.2 s e pu e d e
o bs e r v a r e l m e c a n i s m o d e l a t r a n s e s t e r i fc a c i n .
Alcohlisis
O
II
R,COR
2
T "
Li pa s a i
R
3
OH -^ R
3
COR, ROH
O
II
Glicerlisis R,COR,
O
u n
u n
OH
Li pa s a
U U J
/-XTT
U r l
OH
R
2
OH
Fi g. 1.2.: Ti po s d e t r a n s e s t e r i fi c a c i o n e s c o n l i pa s a s .
Po r o t r o l a d o , l a interesterificacin e s u n pr o c e s o t i l pa r a c a m bi a r l a c o m po s i c i n d e
c i d o s gr a s o s e n u n e n l a c e s t e r , e n e l c u a l e l gr u po a c i l s e i n t e r c a m bi a e n t r e u n s t e r y u n
c i d o gr a s o (a c i d l i s i s ) o e n t r e d o s e s t e r e s c o m o s e pr e s e n t a e n l a fi gu r a 1.3.
O
u
R,COR
2
i ?
R
3
COH
O
II
R
3
COR
4
Li pa s a ^
Acidlisis
Li pa s a
O
II
R,COH
O
I I
R,COR
4
O
I I
R
3
COR
2
O
I I
R
3
COR
2
Fi g. I.3.: Ti po s d e i n t e r s e s t e r i fi c a c i o n e s c o n l i pa s a s .
Introduccin
1.1.4. A pl i c a c i o n e s bi o t e c n o l gi c a s d e l a s l i pa s a s
La s a pl i c a c i o n e s bi o t e c n o l gi c a s c l s i c a s c o n i n t e r s i n d u s t r i a l d e l a s l i pa s a s e s t n
n t i m a m e n t e l i ga d a s a l o s d i s t i n t o s t i po s d e r e a c c i o n e s qu e s o n c a pa c e s d e l l e v a r a c a bo , a s
pu e s , s e t i e n e n d i s t i n t a s po s i bi l i d a d e s :
a) Reacciones de hidrlisis:
Hi d r l i s i s d e a c e i t e s v e ge t a l e s e n l a i n d u s t r i a o l e o qu m i c a (Pi a zza , 1991).
- Pr o d u c c i n d e a r o m a s y s a bo r e s pa r a l a i n d u s t r i a a l i m e n t a r i a ,
- In c l u s i n e n d e t e r ge n t e s pa r a l a e l i m i n a c i n d e m a n c ha s d e gr a s a s .
- Fi n a l i d a d e s a n a l t i c a s pa r a l a d e t e r m i n a c i n d e l a e s t r u c t u r a d e t r i gl i c r i d o s .
- Re s o l u c i n d e m e zc l a s qu i r a l e s (U s hi o et al., 1992).
b) Reacciones de sntesis:
Sn t e s i s d e t r i gl i c r i d o s (Er ga n y Ir a n i , 1991).
Sn t e s i s d e pr e c u r s o r e s d e ppt i d o s (Ma t o s et al, 1987).
- Pr o d u c c i n d e e s t e r o i d e s pa r a l a i n d u s t r i a fa r m a c u t i c a .
- Re s o l u c i n d e m e zc l a s r a c m i c a s d e a l c o ho l e s e n l a i n d u s t r i a fa r m a c u t i c a (He d s t r m et
al, 1993).
Sn t e s i s d e a l c o ho l e s t e r pn i c o s c o m o s a bo r i za n t e s (Ni s hi o et al, 1987).
Sn t e s i s d e e s t e r e s gl u c d i c o s pa r a l a i n d u s t r i a c o s m t i c a (Se i n o et al, 1984).
c) Reacciones de interesterificacin:
- Va r i a c i n d e l a c o m po s i c i n d e c i d o s gr a s o s e n m e zc l a s d e t r i gl i c r i d o s (Wi s d o m et al,
1987).
- El i m i n a c i n d e c i d o s gr a s o s r e s po n s a bl e s d e c a u s a r l a i n e s t a bi l i d a d e n e l s a bo r d e c i e r t o s
a c e i t e s y m a n t e qu i l l a s (Ka i m a l y Sa r o ja , 1988).
d) Reacciones de transesterificacin:
- Pr e pa r a c i n d e c o m pu e s t o s e n a n t i o m r i c a m e n t e pu r o s (Sa n t a n i e l l o et al, 1993).
- Tr a n s e s t e r i fi c a c i o n e s e n a n t i o s e l e c t i v a s d o bl e s (The i l y B jo r kl i n g, 1993).
Introduccin
A c t u a l m e n t e , e l e s t u d i o d e l a s l i pa s a s s e e n c a m i n a a u n a s e r i e d e a pl i c a c i o n e s d e
qu m i c a fi n a d e i n t e r s fu n d a m e n t a l m e n t e fa r m a c u t i c o , bs i c a m e n t e e n e l c a m po d e l a
r e s o l u c i n d e c o m pu e s t o s qu i r a l e s . La s n o r m a t i v a s d e l e gi s l a c i n e n l a s qu e s e t i e n d e a e xi gi r
pr o d u c t o s pt i c a m e n t e pu r o s e n l u ga r d e m e zc l a s r a c m i c a s e s t n pr o v o c a n d o u n gr a n
e s fu e r zo d e i n v e s t i ga c i n e n e l c a m po d e l a s l i pa s a s c o m o bi o c a t a l i za d o r e s
e n a n t i o m r i c a m e n t e a c t i v o s . A l gu n o s d e l o s t r a ba jo s e n l o s qu e s e e s t ha c i e n d o pa r t i c u l a r
hi n c a pi s o n :
- Pr e pa r a c i n d e cicloalcanoles e n a n t i o m r i c a m e n t e pu r o s c o m o i n t e r m e d i a r i o s d e
r e a c c i o n e s d e i n t e r s fa r m a c o l gi c o (Ta yl o r et al, 1997).
Sn t e s i s e n a n t i o s e l e c t i v a d e a-Amino-{3-hidroxi cidos c o m o pr o d u c t o s pa r a e l u c i d a r
e s t r u c t u r a s t r i d i m e n s i o n a l e s d e pr o t e n a s y ppt i d o s (Su t he r l a n d y Wi l l i s , 1997).
Pr e pa r a c i n d e anlogos de hormonas e n a n t i o m r i c a m e n t e pu r o s (Ni s hi za wa et al,
1997).
Pr e pa r a c i n d e e n a n t i m e r o s pu r o s d e l c i d o 2-ariI-propinico, c o m o i bu pr o fe n o ,
n a pr o xe n o , ke t o pr o fe n o , e t c . d e u t i l i d a d fa r m a c o l gi c a c o m o a n t i i n fl a m a t o r i o s (B o t t a et
al, 1997; Cha n gyTs a i , 1997).
Sn t e s i s a l t a m e n t e d i e s t e r e o s e l e c t i v a d e p-Lactonas c o m o i n t e r m e d i a r i o s pa r a l a
pr o d u c c i n d e c o m pu e s t o s qu i r a l e s (Ya n g et al, 1997).
- Pr o d u c c i n d e a ge n t e s a n t i ps i c t i c o s c o m o d e r i v a d o s d e butiro fenonas
e n a n t i o m r i c a m n e t e pu r o s (Gi l et al, 1997).
Sn t e s i s d e piranonas pt i c a m e n t e pu r a s , t i l e s e n c i e r t a s r e a c c i o n e s qu i r a l e s c o m o
a d i c i o n e s c c l i c a s (Va n d e n He u v e l et al, 1997).
Re s o l u c i n c i n t i c a d e alcoholes secundarios (Le gr o s et al, 1997'; Lju bo v i c a n d Su n ji c ,
1997).
Pr e pa r a c i n d e qu i n o n a s d i t e r pe n o i d e s t i l e s e n e l t r a t a m i e n t o d e l a a r t r i t i s (Ya m a m u r a et
al, 1997).
- Pr o d u c c i n d e biosurfactantes c o m o c i d o a r a qu i d n i c o d e a pl i c a c i n e n l a i n d u s t r i a d e
l a a l i m e n t a c i n , c o s m t i c a y fa r m a c u t i c a (Wa r d et al, 1997).
- Pr e pa r a c i n d e etanolaminas pt i c a m e n t e a c t i v a s d e i n t e r s fi s i o l gi c o e n m e d i c i n a
(Fu r u t a n i e a /., 1997).
10 Introduccin
B i o c o n v e r s i n d e t r i gl i c r i d o s c o n c i d o s gr a s o s po l i i n s a t u r a d o s a hidroperxidos d e a l t a
r e a c t i v i d a d e n l a i n d u s t r i a a l i m e n t a r i a (Ga r go u r i y Le go y, 1997).
Sn t e s i s d e pr o d u c t o s antitumorales c o m o a c e t o m i c i n a (Ki n d e r m a n y Fe r i n ga , 1998).
Sn t e s i s d e amidas qu i r a l e s a pa r t i r d e m e zc l a s r a c m i c a s d e e s t e r e s d e a m i d a s (De Ca s t r o
y Ga go , 1998).
Sn t e s i s d e antioxidantes d e r i v a d o s d e l a v i t a m i n a E (be n zo fu r a n i l e s ) pa r a e l t r a t a m i e n t o
d e c i e r t a s e n fe r m e d a d e s (A ye r s et a /., 1997).
Tr a n s e s t e r i fi c a c i n d e 1,3-pr o pa n o d i o l e s pa r a l a c o n s t r u c c i n d e 3-a c e t o xi pr o pa n o l e s
u s a d o s e n l a s n t e s i s d e alcaloides (Fa d e l y A r ze l , 1997).
Sn t e s i s d e compuestos fluoroorgnicos d e i n t e r s e n m e d i c i n a y bi o l o ga e n s n t e s i s d e
bi o m o l c u l a s (Go j etal, 1997).
Pr e pa r a c i n d e c i a n o c i c l o a l c a n o l e s pa r a l a po s t e r i o r pr o d u c c i n d e 1,3-heterociclos
(Fo r r o et al, 1997).
Co n s t r u c c i n d e biosensores, po r e je m pl o , pa r a l a d e t e r m i n a c i n d e c i d o s gr a s o s e n
a l i m e n t o s (Sc ho e m a ke r et al, 1997).
Pr o d u c c i n d e peroxi cidos i m po r t a n t e s e n s n t e s i s o r gn i c a y e n l a i n d u s t r i a qu m i c a
(Kl a a s y Wa r we l , 1997).
Re s o l u c i n d e antibiticos c o m o n i t r o i m i d a zo l e s (Sku pi n et al, 1997).
Introduccin ^ ______ 11
1.2. Pr e c e d e n t e s e n l a pr o d u c c i n l i pa s a s
Ha c e a pr o xi m a d a m e n t e 12 a o s qu e e n e l De pa r t a m e n t d 'En gi n ye r i a Qu m i c a d e l a
U n i v e r s i t a t A u t n o m a d e B a r c e l o n a s e c o m e n z u n a n u e v a l n e a d e i n v e s t i ga c i n c o n e l t t u l o
ge n e r a l d e m o n i t o r i za c i n y c o n t r o l d e bi o r r e a c t o r e s . U n o d e l o s pr o c e s o s e s c o gi d o s pa r a l a
m o n i t o r i za c i n y e l c o n t r o l d e l m i s m o fu e l a pr o d u c c i n d e l i pa s a s po r Candida rugosa.
A l o l a r go d e e s t o s a o s s e ha n r e a l i za d o a v a n c e s i m po r t a n t e s e n l a pr o d u c c i n d e l a
e n zi m a , s i e m pr e t r a ba ja n d o c o n l a c e pa d e c o l e c c i n s i n a l t e r a r l a ge n t i c a m e n t e , a ba s e d e
o pt i m i za r l a s c o n d i c i o n e s a m bi e n t a l e s d e l m e d i o d e fe r m e n t a c i n (fu e n t e s d e c a r bo n o y
n i t r ge n o , c o n d i c i o n e s d e a i r e a c i n ) y u t i l i za n d o d i fe r e n t e s e s t r a t e gi a s d e o pe r a c i n . To d o
e s t e t r a ba jo ha pe r m i t i d o e l a u m e n t o d e l a pr o d u c c i n d e l a e n zi m a e n u n fa c t o r e n t r e 50 y 75
v e c e s . La m o n i t o r i za c i n pr c t i c a m e n t e c o m pl e t a d e l a fe r m e n t a c i n , c o n s i s t e e n e l
s e gu i m i e n t o e n l n e a d e l a a c t i v i d a d e n zi m t i c a y l a s v e l o c i d a d e s d e c o n s u m o d e o xge n o
(OU R) y d e pr o d u c c i n d e C2 (CER) m e d i a n t e e s pe c t r o m e t r a d e m a s a s . A pa r t i r d e e s t a
l t i m a m e d i d a y m e d i a n t e l a u t i l i za c i n d e "s o ft wa r e s e n s o r s " s e ha n e s t i m a d o o t r o s
pa r m e t r o s c l a v e d e l a fe r m e n t a c i n c o m o l a bi o m a s a , v e l o c i d a d e s pe c fi c a d e c r e c i m i e n t o y
s u bs t r a t o c o n s u m i d o (Mo n t e s i n o s et al, 1993a ; Mo n t e s i n o s et al., 1994).
To d a e s t a i n fo r m a c i n o bt e n i d a a t r a v s d e e xpe r i m e n t o s e n d i s c o n t i n u o y c o n t i n u o ha
d e s e m bo c a d o e n l a e l a bo r a c i n d e u n m o d e l o m a t e m t i c o e s t r u c t u r a d o qu e d e s c r i be
c o r r e c t a m e n t e e l pr o c e s o (Mo n t e s i n o s et al., 1995) y qu e ha pe r m i t i d o , m e d i a n t e
s i m u l a c i o n e s , e s t a bl e c e r d i fe r e n t e s e s t r a t e gi a s d e o pe r a c i n e n fe d -ba t c h (c a u d a l d e a d i c i n
c o n s t a n t e , v e l o c i d a d e s pe c fi c a d e c r e c i m i e n t o c o n s t a n t e , r e l a c i n s u bs t r a t o /bi o m a s a
c o n s t a n t e ) c o m o l a s m s r e n t a bl e s d e s d e e l pu n t o d e v i s t a d e pr o d u c t i v i d a d , e xpe c t a t i v a s qu e
ha n s i d o c o m pr o ba d a s e xpe r i m e n t a l m e n t e (Go r d i l l o et al., 1998). In fo r m a c i n e xha u s t i v a d e l
d e s a r r o l l o d e e s t o s s i s t e m a s s e e n c u e n t r a e n l o s t r a ba jo s d e Va l e r o (1990), De l Ro (1991),
Mo n t e s i n o s (1993b), Go r d i l l o (1996) y Sa n z (1998).
Es e n e s t e pu n t o , e n e l qu e s e t i e n e u n gr a n c o n o c i m i e n t o d e l s i s t e m a y u n a gr a n
m o n i t o r i za c i n d e l m i s m o , e n e l qu e s e pl a n t e a l a r e c u pe r a c i n d e l a e n zi m a d e n u e s t r o s
pr o pi o s c a l d o s d e c u l t i v o s y s u u t i l i za c i n e n r e a c c i o n e s d e qu m i c a fi n a ,
12 Introduccin
1.3. Mt o d o s d e pu r i fi c a c i n y c a r a c t e r i za c i n d e pr o t e n a s
1.3.1. Mt o d o s d e c o n c e n t r a c i n d e pr o t e n a
No r m a l m e n t e , l a c o n c e n t r a c i n d e pr o t e n a r e s u l t a n t e a l fi n a l d e u n a fe r m e n t a c i n e s
d e l o r d e n d e u n o s po c o s gr a m o s po r l i t r o , pu d i e n d o l l e ga r a s e r d e l o r d e n d e m i l i gr a m o s po r
l i t r o . Es t o i m pu l s a a l a i n v e s t i ga c i n d e m t o d o s d e c o n c e n t r a c i n d e l a pr o t e n a a pa r t i r d e l
c a l d o d e c u l t i v o , a d e m s d e pe r s e gu i r l a e l i m i n a c i n d e c i e r t o s c o m po n e n t e s c o m o s o n l a
bi o m a s a (pa r a pr o t e n a s e xt r a c e l u l a r e s , c o m o e s e l c a s o d e l a l i pa s a d e Candida rugosa) y l a
r e d u c c i n d e l a e l e v a d a c o n c e n t r a c i n d e s a l e s i n o r gn i c a s qu e s u e l e n t e n e r l o s m e d i o s d e
fe r m e n t a c i n .
U n pr o c e s o t i po pa r a l a o bt e n c i n d e u n pr o d u c t o o bt e n i d o po r v a bi o t e c n o l gi c a
s u e l e c o n s t a r d e l a s s i gu i e n t e s e t a pa s (B e l t e r et a /., 1988):
1. Eliminacin de insolubles: bs i c a m e n t e fi l t r a c i n y c e n t r i fu ga c i n c o m o o pe r a c i o n e s
u n i t a r i a s , pr o d u c e n po c a c o n c e n t r a c i n y m e jo r a d e l a c a l i d a d d e l pr o d u c t o .
2. Aislamiento de productos: e t a pa e n l a qu e s e e l i m i n a n m a t e r i a l e s d e pr o pi e d a d e s m u y
d i s t i n t a s a l pr o d u c t o d e i n t e r s , y d o n d e s u e l e o c u r r i r u n a a pr e c i a bl e c o n c e n t r a c i n y
m e jo r a d e l a c a l i d a d d e l pr o d u c t o .
3. Purificacin: d o n d e m e d i a n t e t c n i c a s a l t a m e n t e s e l e c t i v a s s e s e pa r a e l pr o d u c t o d e
i n t e r s d e pr o d u c t o s d e c a r a c t e r s t i c a s fs i c o -qu m i c a s s i m i l a r e s .
4. Cristalizacin: e t a pa fi n a l pa r a l a o bt e n c i n d e u n s l i d o d e a l t a pu r e za .
En c a s o s r e a l e s , c o m o o pe r a c i o n e s d e s e pa r a c i n d e l a biomasa s e pu e d e n d e s t a c a r :
1. Centrifugacin: o pe r a c i n u n i t a r i a s l i d o -l qu i d o e n l a qu e u n s l i d o y u n l qu i d o s e
s e pa r a n po r d i fe r e n c i a s d e d e n s i d a d a l a pl i c a r l e s u n a fu e r za c e n t r fu ga . La s e pa r a c i n d e l
s l i d o y e l l qu i d o pu e d e s e r t i po s e d i m e n t a c i n a l c a m po c e n t r fu go o t i po fi l t r a c i n c o n
fi l t r o s c e n t r fu go s .
Introduccin 13
2. Filtracin: o pe r a c i n bs i c a e n l a qu e s e s e pa r a n s l i d o s e n s u s pe n s i n e n u n l qu i d o
ha c i e n d o pa s a r l a m e zc l a po r u n po r o qu e e s c a pa z d e r e t e n e r e l s l i d o .
3. Decantacin: c o n e l m i s m o pr i n c i pi o qu e l a c e n t r i fu ga c i n pe r o l o s s l i d o s s o n
s e pa r a d o s po r d i fe r e n c i a d e d e n s i d a d c o n r e s pe c t o a l l qu i d o s o m e t i d o s n i c a m e n t e a l a
a c c i n d e l a fu e r za d e l a gr a v e d a d .
U n a v e z s e d i s po n e d e u n a c o r r i e n t e l i br e d e bi o m a s a , s e i m po n e l a t a r e a d e r e d u c i r d e
fo r m a c o n s i d e r a bl e e l v o l u m e n d e l c a l d o y c o n c e n t r a r , po r t a n t o , e l pr o d u c t o d e i n t e r s . En
e s t a fa s e , s e r e qu e r i r t a m bi n u n a d i s m i n u c i n d e l a c o n c e n t r a c i n d e l a s s a l e s u o t r o s
c o m pl e m e n t o s d e l m e d i o . En e s t e c a m po , e xi s t e n d i v e r s a s o pe r a c i o n e s d e u s o m u y ge n e r a l
(De u t s c he r , 1988):
1. Dilisis: u s a d a pa r a l a e l i m i n a c i n d e c o m po n e n t e s d e ba jo pe s o m o l e c u l a r , n o r m a l m e n t e
s a l e s i n o r gn i c a s , s e ba s a e n l a s pr o pi e d a d e s d e u n a m e m br a n a s e m i pe r m e a bl e qu e
pe r m i t e e l pa s o a m o l c u l a s d e u n d e t e r m i n a d o c o r t e m o l e c u l a r , s i e n d o e l t r a n s po r t e
c o n s e c u e n c i a d e u n a d i fe r e n c i a d e c o n c e n t r a c i n a a m bo s l a d o s d e l a m e m br a n a .
2. Ultrafiltracin: t a m bi n ba s a d a e n e l u s o d e u n a m e m br a n a s e m i pe r m e a bl e c o n u n r a n go
d e fi n i d o d e c o r t e m o l e c u l a r , a u n qu e a d i fe r e n c i a d e l a d i l i s i s i m pl i c a e l u s o d e fu e r za
pa r a fa v o r e c e r e l pa s o d e l l qu i d o a t r a v s d e l a m e m br a n a , ya s e a c o n pr e s i n , v a c o o po r
fu e r za gr a v i t a c i o n a l . Es u n a t c n i c a v e r s t i l c u yo u s o e s a pl i c a bl e d e s d e e s c a l a d e
l a bo r a t o r i o a i n d u s t r i a l . La s m e m br a n a s d e u l t r a fi l t r a c i n d e be n s e r e s t r u c t u r a s s l i d a s ,
r gi d a s y e s t a bl e s a l a pr e s i n d e t r a ba jo y a d e m s t e n e r e l c o r t e a pr o pi a d o pa r a l a
c o n c e n t r a c i n d e l a pr o t e n a d e i n t e r s , e s d e c i r , l o m s c e r c a n o po s i bl e a l pe s o d e l a
pr o t e n a pe r o a s e gu r a n d o l a c o m pl e t a r e c u pe r a c i n . U n a t e n d e n c i a c o n o c i d a d e l a s
m e m br a n a s d e u l t r a fi l t r a c i n e s s u c a pa c i d a d d e a d s o r be r pr o t e n a e n l a s u pe r fi c i e ,
e s pe c i a l m e n t e l a s d e c e l u l o s a , s i e n d o r e c o m e n d a bl e e l u s o d e m e m br a n a s d e po l i s u l fo n a
c u ya a fi n i d a d qu m i c a po r l a s pr o t e n a s e s m u c ho m e n o r . Ot r o e fe c t o c o n o c i d o e n l a
u l t r a fi l t r a c i n e s l a d i s m i n u c i n d e l fl u jo a t r a v s d e l a m e m br a n a c o n e l pa s o d e l t i e m po ,
fe n m e n o c a u s a d o po r l a po l a r i za c i n d e l a m e m br a n a y qu e n o r m a l m e n t e i m pl i c a e l
l a v a d o d e l a s m e m br a n a s c o n s o l u c i o n e s l i m pi a d o r a s d e c a r c t e r a l c a l i n o , o t e n e r
a gi t a c i n c e r c a d e l a m e m br a n a .
14 Introduccin
3. Liofilizacin: s e t r a t a d e l a e v a po r a c i n po r s u bl i m a c i n d e l a s o l u c i n c o n ge l a d a
c o n t e n i e n d o l a pr o t e n a d e i n t e r s . El s i s t e m a s e c o m po n e d e u n r e c i pi e n t e a d e c u a d o , u n a
t r a m pa fr a d e c o n d e n s a c i n y u n a bo m ba d e v a c o d e e l e v a d a c a pa c i d a d . No r m a l m e n t e ,
s e r e c o m i e n d a u n a r pi d a c o n ge l a c i n pa r a fa v o r e c e r l a e s t a bi l i d a d d e l a pr o t e n a , a d e m s
d e i n t e n t a r a u m e n t a r l a r e l a c i n s u pe r fi c i e /v o l u m e n e xpu e s t o a l v a c o pa r a a u m e n t a r l a
v e l o c i d a d d e s u bl i m a c i n . El gr a n i n c o n v e n i e n t e d e e s t a t c n i c a e s qu e n o i m pl i c a n i n gn
t i po d e s e pa r a c i n e xc e pt o po r l o qu e s e r e fi e r e a c o m pu e s t o s v o l t i l e s , po r l o qu e l a s s a l e s
y o t r o s c o m po n e n t e s n o v o l t i l e s pe r m a n e c e r n e n e l s l i d o y s u c o n c e n t r a c i n a u m e n t a r
ju n t o c o n l a d e l pr o d u c t o d e i n t e r s .
1.3.2. Mt o d o s d e pr e c i pi t a c i n
Es t o s m t o d o s s u e l e n s e r u n pa s o pr e v i o a u n m t o d o e s pe c fi c o d e s e pa r a c i n d e l a
pr o t e n a d e i n t e r s , y c o n e l l o s s e s u e l e c o n s e gu i r l a pr e c i pi t a c i n n o s e l e c t i v a d e u n a
c o n ju n t o d e pr o t e n a s . La s pr o t e n a s pu e d e n s e r pr e c i pi t a d a s c a u s a n d o pe r t u r ba c i o n e s e n e l
d i s o l v e n t e qu e a fe c t e n a l pH, a l a fu e r za i n i c a y a l a t e m pe r a t u r a ; n o r m a l m e n t e d e bi d o a l a
a d i c i n d e e l e v a d a s c o n c e n t r a c i o n e s d e c i e r t a s s a l e s o d i s o l v e n t e s o r gn i c o s m i s c i bl e s .
En e l c a s o d e l a a d i c i n d e a l gu n a s a l i n o r gn i c a e s t o s e a s o c i a a qu e e l c a m bi o d e
c o n d i c i o n e s e n e l d i s o l v e n t e pr o v o c a c a m bi o s d e c o n fo r m a c i n e n l a pr o t e n a , bs i c a m e n t e l a
e s t r u c t u r a d e pu e n t e s d e hi d r ge n o , c o n l o qu e s e pr o d u c e u n a n e u t r a l i za c i n d e l a s c a r ga s
e xt e r n a s d e l a pr o t e n a po r pa r t e d e l a s a l , o r i gi n a n d o a s s u pr e c i pi t a c i n . No r m a l m e n t e , e l
a u m e n t o e n l a fu e r za i n i c a d e l m e d i o pr o v o c a l a a gr e ga c i n d e l a s pr o t e n a s . A d e m s c a d a
s a l t e n d r u n a fu e r za i n i c a d i fe r e n t e , pu d i n d o s e c l a s i fi c a r d e m o d o c u a l i t a t i v o c i e r t o s i o n e s
t pi c o s :
A n i o n e s : PO
4
3
" > SO
4
2
" > CH
3
COO" > Cl " > B r " > NO
3
" > C1O
3
" > I" > SCN"
m a yo r e fe c t o "s a l t i n g-o u t "
Ca t i o n e s : NH4
+
< Rb
+
< K
+
< Na
+
< Cs
+
< Li
+
< Mg
2+
< B a
2+
m a yo r e fe c t o c a o t r pi c o - >
Introduccin 15
A u m e n t a n d o e l e fe c t o d e "s a l t i n g-o u t " s e fa v o r e c e n l a s i n t e r a c c i o n e s hi d r o fbi c a s , m i e n t r a s
qu e e l e fe c t o c a o t r pi c o l a s d e bi l i t a .
La a d i c i n d e d i s o l v e n t e s o r gn i c o s s u e l e pr o d u c i r c a m bi o s m s i m po r t a n t e s , ya qu e
s e pr o d u c e u n a i n t e r a c c i n e n t r e l o s gr u po s hi d r o fbi c o s d e l d i s o l v e n t e y l o s d e l a pr o t e n a
pr o v o c a n d o u n c a m bi o e n l a c a pa d e hi d r a t a c i n d e s t a pu d i e n d o t e n e r e fe c t o s m s
i m po r t a n t e s s o br e l a a c t i v i d a d bi o l gi c a d e l a pr o t e n a .
Co m o agentes precipitantes m s i m po r t a n t e s s e pu e d e n d e s t a c a r :
1) Sales inorgnicas:
- Cl o r u r o s : d e s o d i o , po t a s i o y c a l c i o .
- Fo s fa t o s : d e s o d i o y po t a s i o .
Su l fa t e s : d e m a gn e s i o y a m o n i o .
En t r e e l l o s , e l s u l fa t o a m n i c o e s , s i n d u d a , e l a ge n t e pr e c i pi t a n t e d e pr o t e n a s m s u t i l i za d o
(Je r n e jc y Le gi s a , 1996; Sc ha e fe r et a /., 1997) pu e s t o qu e t i e n e u n a s e r i e d e c a r a c t e r s t i c a s
qu e l o c o n v i e r t e n e n pt i m o :
Su e l e v a d a s o l u bi l i d a d i m pl i c a l a pr e c i pi t a c i n d e l a m a yo r a d e pr o t e n a s .
Su ba jo c a l o r d e d i s o l u c i n , qu e n o i m pl i c a c a m bi o s e n l a t e m pe r a t u r a .
Su ba ja d e n s i d a d a e l e v a d a c o n c e n t r a c i n , l o c u a l n o i n t e r fi e r e e n l a po s t e r i o r
c e n t r i fu ga c i n .
De he c ho , i n c l u s o s e ha n d e s a r r o l l a d o d i v e r s a s t c n i c a s d e pr e c i pi t a c i n fr a c c i o n a d a c o n
s u l fa t o a m n i c o v a r i a n d o l a c o n c e n t r a c i n d e s t e (Kn e ppe r et al., 1998).
2) Disolventes orgnicos:
- Et a n o l (A d hi r a i y Se l v a m , 1998)
- Me t a n o l (Ki m et al., 1997)
_16 Introduccin
- A c e t o n a (Mi n a ga wa et al., 1997)
- A c e t o n i t r i l o (Du c ha r m e y Fa r i n o t t i , 1997)
El t r a t a m i e n t o c o n d i s o l v e n t e s o r gn i c o s d e be r e a l i za r s e c o n e xt r e m o c u i d a d o e n l a s
o pe r a c i o n e s d e pr e c i pi t a c i n d e pr o t e n a pa r a o bt e n e r bu e n o s r e n d i m i e n t o s (Ra et al., 1993)
Po r e je m pl o , e n e l c a s o d e l e t a n o l , s e r e qu i e r e :
- Te m pe r a t u r a s i e m pr e po r d e ba jo d e l o s 0C.
- A gi t a c i n a d e c u a d a d u r a n t e l a a d i c i n d e l e t a n o l .
- Et a n o l pr e v i a m e n t e e n fr i a d o a ba ja t e m pe r a t u r a .
- B a o fr o pa r a a bs o r be r l a t r a n s fe r e n c i a d e c a l o r .
- A d i c i n l e n t a d e l e t a n o l pa r a d i s m i n u i r e fe c t o s d e a l t a c o n c e n t r a c i n l o c a l d e e t a n o l .
- Pe r i o d o s d e e qu i l i br a c i n t r a s c a d a a d i c i n d e e t a n o l m a n t e n i e n d o l a t e m pe r a t u r a .
1.3.3. Cr o m a t o gr a fa
La c r o m a t o gr a fa e s u n a t c n i c a a m pl i a m e n t e d e s a r r o l l a d a e n l a s e pa r a c i n d e
pr o t e n a s y n o r m a l m e n t e s e u s a pa r a s e pa r a r l a pr o t e n a d e i n t e r s d e l r e s t o d e pr o t e n a s o d e
o t r a s s u bs t a n c i a s qu e i n t e r a c c i o n e n fu e r t e m e n t e c o n l a pr o t e n a c o m o pu e d e n s e r
po l i s a c r i d o s u o t r a s m a c r o m o l c u l a s .
La c r o m a t o gr a fa n o d e be d e s e r c o n s i d e r a d a u n a o pe r a c i n bs i c a d e s e pa r a c i n s i n o
u n c o n ju n t o d e t c n i c a s ba s a d a s e n d i s t i n t o s pr i n c i pi o s qu e pe r m i t e n a i s l a r o s e pa r a r pr o t e n a s
d e o t r a s m o l c u l a s d e pa r e c i d a s c a r a c t e r s t i c a s . De a c u e r d o c o n e s t o , e xi s t i r n d i fe r e n t e s
c r o m a t o gr a fa s a pl i c a bl e s a l a pu r i fi c a c i n d e pr o t e n a s . La a pl i c a c i n d e l a c r o m a t o gr a fa
pa r a pr o t e n a s i m pl i c a n o r m a l m e n t e l a u t i l i za c i n d e i n s t r u m e n t a c i n t i po FPLC ("Fa s t
Pr o t e i n Li qu i d Chr o m a t o gr a phy") o FIPLC ("Hi gh Pe r fo r m a n c e Li qu i d Chr o m a t o gr a phy"), d e
c a r c t e r n o r m a l m e n t e a n a l t i c o , a u n qu e a m bo s s i s t e m a s pu e d e n s e r d e s a r r o l l a d o s a e s c a l a
pr e pa r a t i v a .
Introduccin 17
1.3.3.1. Cr o m a t o gr a fa d e i n t e r c a m bi o i n i c o
El fu n d a m e n t o d e l a s e pa r a c i n e s e l pu n t o i s o e l c t r i c o (pl ) d e l a pr o t e n a e i m pl i c a
d o s pa s o s s u c e s i v o s , l a u n i n d e l a pr o t e n a a u n a s e r i e d e c a r ga s fi ja s , y l a po s t e r i o r e l u c i n
d e l a pr o t e n a d e d i c ha s c a r ga s po r a d i c i n d e u n a s o l u c i n qu e v u e l v e a d e s pl a za r l a pr o t e n a .
La fa s e s l i d a s u e l e i n c l u i r r e l l e n o s d e c e l u l o s a , d e xt r a n o s , a ga r o s a y po l i e s t i r e n o , m i e n t r a s
qu e gr u po s fu n c i o n a l e s t pi c o s s o n DEA E (d i e t i l a m i n o e t i l ), CM (c a r bo xi m e t i l ) y PE
(po l i e t i l e n i m i n a ). Lo s e l u ye n t e s pu e d e n s e r m u y v a r i a d o s , pe r o n o r m a l m e n t e s e t r a t a d e s a l e s
t a m po n a d a s a u n pH qu e e s t a bi l i c e l a pr o t e n a , pu d i n d o s e e s t a bl e c e r gr a d i e n t e s d e
c o n c e n t r a c i n d e l e l u ye n t e pa r a fa v o r e c e r l a s e pa r a c i n d e l a s d i s t i n t a s pr o t e n a s (t e c n o l o ga
FPLC).
Lo s r e l l e n o s d e c o l u m n a u t i l i za d o s pu e d e n s e r d e i n t e r c a m bi o a m n i c o (r e l l e n o c o n
c a r ga po s i t i v a ) o c a t i n i c o (r e l l e n o c o n c a r ga n e ga t i v a ) y l a e l e c c i n d e u n r e l l e n o s e r
fu n c i n d e l v a l o r d e l o s pu n t o s i s o e l c t r i c o s d e l a s pr o t e n a s qu e c o n t e n ga l a m e zc l a . En
c o n c r e t o , pa r a pr o t e n a s qu e s e ha l l e n a u n pH s u pe r i o r a s u pl , l a c a r ga s e r n e ga t i v a , c o n l o
qu e t e n d r n qu e u t i l i za r s e r e l l e n o s d e i n t e r c a m bi o a n i n i c o , y a l c o n t r a r i o pa r a pH i n fe r i o r e s
a l p.
Es t a t c n i c a e s t a m pl i a m e n t e d e s a r r o l l a d a pa r a l a s e pa r a c i n d e u n gr a n r a n go d e
pr o t e n a s y e s d e c a r c t e r ge n e r a l (B r e c c i a et al, 1998; A l fo n zo et al, 1997; Ca i et al, 1998),
d e he c ho , s e ha a pl i c a d o c o n xi t o e n e l c a m po d e l a s l i pa s a s (Sha w y Cha n g, 1989; Ra et
al, 1993; Li n ko y Wu , 1996).
1.3.3.2. Cr o m a t o gr a fa d e fi l t r a c i n e n ge l
El fu n d a m e n t o d e e s t a c r o m a t o gr a fa e s e l t a m a o r e l a t i v o d e l a s pr o t e n a s , pe r o a l
c o n t r a r i o d e l a c r o m a t o gr a fa d e i n t e r c a m bi o i n i c o , n i n gu n a d e l a s pr o t e n a s e s r e t e n i d a e n e l
ge l d e fi l t r a c i n d e l a c o l u m n a . Co m o s o po r t e d e l a c o l u m n a c r o m a t o gr fc a s e u s a u n l e c ho
po r o s o , c o n u n v o l u m e n i n t e r n o y u n o e xt e r n o . La s m o l c u l a s gr a n d e s n o pe n e t r a n e n e l
v o l u m e n i n t e r n o y e l u ye n r pi d a m e n t e , m i e n t r a s qu e l a s pe qu e a s s o n c a pa c e s d e pa s a r a l
18 Introduccin
v o l u m e n i n t e r n o y e l u ye n m s l e n t a m e n t e . Es t e c o m po r t a m i e n t o s e i l u s t r a e n l a fi gu r a 1.4.
42
o
+ Pe s o Mo l e c u l a r -
Ti e m po
Fig. 1.4: Sa l i d a t pi c a d e u n a c o l u m n a d e fi l t r a c i n e n ge l .
De n u e v o , l a e l e c c i n d e l ge l a u t i l i za r d e pe n d e r d e l t a m a o d e l a s pr o t e n a s qu e s e
qu i e r a n s e pa r a r . U n a bu e n a i n d i c a c i n d e l t a m a o m o l e c u l a r l a d a e l pe s o m o l e c u l a r , a u n qu e
e n o c a s i o n e s n o s e a d i r e c t a m e n t e pr o po r c i o n a l a l t a m a o ya qu e s t e d e pe n d e d e o t r o s
fa c t o r e s c o m o c o n fo r m a c i n t r i d i m e n s i o n a l , e s t a d o d e a gr e ga c i n , a s o c i a c i n c o n o t r a s
m a c r o m o l c u l a s , e t c . Si n e m ba r go , y c o m o o r i e n t a c i n , e l v a l o r d e l pe s o m o l e c u l a r e s e l qu e
s e n e c e s i t a a l a ho r a d e e l e gi r u n r e l l e n o , po r e je m pl o , l a e m pr e s a Pha r m a c i a B i o t e c h t i e n e
r a n go s d e t r a ba jo qu e v a n d e s d e ppt i d o s a pr o t e n a s d e 8000 kDa , c o m o s e o bs e r v a e n l a
t a bl a 1.1.
La d e t e r m i n a c i n d e l pe s o m o l e c u l a r e s , po r o t r o l a d o , po c o c o m pl e ja m e d i a n t e
Introduccin 19
t c n i c a s d e e l e c t r o fo r e s i s , c o n l o c u a l s e r u n pr i m e r pa s o i m pr e s c i n d i bl e a n t e s d e e l e gi r e s t a
c r o m a t o gr a fa c o m o po s i bl e m t o d o d e s e pa r a c i n .
Re l l e n o
Su pe r d e x Pe pt i d e
Su pe r d e x 30
Su pe r d e x 75
Su pe r d e x 200
Su pe r s e 6
Su pe r s e 12
Se pha c r yl S-100
Se pha c r yl S-400
Ra n go d e s e pa r a c i n (kDa )
0.1-7
<10
3-70
10-600
5-5000
1-300
1-100
20-8000
Tabla 1.1.: Ra n go s d e s e pa r a c i n pa r a a l gu n o s d e l o s r e l l e n o s d e Pha r m a c i a B i o t e c h.
Lo s m a t e r i a l e s m s ha bi t u a l e s e n l o s qu e s e c o n s t r u ye n e s t o s ge l e s s u e l e n s e r
a l t a m e n t e po r o s o s , d e s t a c a n d o m a t r i c e s d e a ga r o s a , d e xt r a n o s o a c r i l a m i d a c o n d i s t i n t a s
po s i bi l i d a d e s po r l o qu e s e r e fi e r e a r e c u pe r a c i n , e s pe c i fi c i d a d y e s t a bi l i d a d .
Es t a t c n i c a e s d e a m pl i a u t i l i za c i n e n l a s e pa r a c i n d e m u c ha s pr o t e n a s qu e
pr o v i e n e n d e c a l d o s d e c u l t i v o t a n t o a n i v e l d e c a r a c t e r i za c i n (Ma gn u s o n y Cr a wfo r d , 1997;
A n d e r s s o n et al, 1998) c o m o a e s c a l a i n d u s t r i a l , d o n d e ha s i d o u n a d e l a s t c n i c a s
c r o m a t o gr fl c a s m s e m pl e a d a s e n l a s e pa r a c i n d e pr o t e n a s (Sc a n d e l l a y Pe t t e r s s o n , 1991;
Ki t t e l be r ge r e a /., 1998).
1.3.3.3. Cr o m a t o gr a fa hi d r o fbi c a
Co m o s u n o m br e i n d i c a , e s t a t c n i c a s e ba s a e n l a s i n t e r a c c i o n e s d e l o s gr u po s
hi d r o fbi c o s d e l a pr o t e n a c o n u n s o po r t e d e n a t u r a l e za t a m bi n hi d r o fbi c a . En e s t e c a s o , l a
fo r m a d e o pe r a r e s l a o pu e s t a a l c a s o d e l a c r o m a t o gr a fa d e i n t e r c a m bi o i n i c o . La c o l u m n a
s e c a r ga c o n l a pr o t e n a d i s u e l t a e n u n a d i s o l u c i n d e fu e r za i n i c a e l e v a d a , fa v o r e c i e n d o a s
s u i n t e r a c c i n c o n e l s o po r t e hi d r o fbi c o . Po s t e r i o r m e n t e , l a fu e r za i n i c a s e v a d i s m i n u ye n d o
d e m a n e r a qu e l a s pr o t e n a s v a n e l u yn d o s e e n fu n c i n d e s u hi d r o fo bi c i d a d c r e c i e n t e , c o m o
s e i l u s t r a e n l a fi gu r a 1.5.
20 Introduccin
Lo s m a t e r i a l e s u t i l i za d o s pa r a e s t a c r o m a t o gr a fa s u e l e n s e r m a t r i c e s d e a ga r o s a o
d e r i v a d o s c o n l i ga n d o s t i po i s o pr o pi l , bu t i l , o c t i l o fe n i l qu e s o n l o s qu e u n e n a l o s gr u po s
hi d r o fbi c o s qu e c o n t i e n e n c i e r t o s a m i n o c i d o s qu e c o m po n e n l a s pr o t e n a s . Po r l o qu e s e
r e fi e r e a e l u ye n t e s , l o s m s a m pl i a m e n t e u s a d o s s o n l o s ba s a d o s e n s a l e s d e e l e v a d a fu e r za
i n i c a , s i e n d o e l m s ha bi t u a l e l s u l fa t o a m n i c o e n c o n c e n t r a c i o n e s s u pe r i o r e s a 1 M.
c tf
O -
- Hi d r o fo bi c i d a d d e l a s pr o t e n a s +
O
'c
3
N
Ti e m po
Fig. 1.5: Sa l i d a t pi c a d e u n a c o l u m n a d e i n t e r a c c i n hi d r o fbi c a .
Si bi e n e s t a t c n i c a s e r s l o a pl i c a bl e a c a s o s e n qu e s e t e n ga u n c o n o c i m i e n t o d e qu e
l a pr o t e n a d e i n t e r s t e n ga u n c a r c t e r hi d r o fbi c o , ha y ba s t a n t e s e je m pl o s d e a pl i c a c i n d e
e s t a c r o m a t o gr a fa e n d i s t i n t a s pr o t e n a s (Che n et al., 1997a ; Sc o t t et al., 1997), ha bi e n d o s i d o
a pl i c a d a t a m bi n a l a r e s o l u c i n d e l i pa s a s (Ra y B a l l e s t e r o s , 1994).
Introduccin 21
1.3.3.4. Cr o m a t o gr a fa d e a fi n i d a d
Se t r a t a d e l a c r o m a t o gr a fa m s s e l e c t i v a ya qu e s e pr o d u c e u n a i n t e r a c c i n e s pe c fi c a
e n t r e e l s o po r t e c r o m a t o gr fc o y l a pr o t e n a d e i n t e r s , s i e n d o u n a t c n i c a bi o e s pe c fi c a ,
pu e s t o qu e s e pr o d u c e u n "r e c o n o c i m i e n t o " d e l s o po r t e ha c i a a l gn pu n t o d e l a pr o t e n a ,
qu e d a n d o a s l i ga d a a l s o po r t e . Es t a t c n i c a ha s i d o m u y d e s a r r o l l a d a e n l o s l t i m o s a o s y s e
pr e s e n t a c o m o l a he r r a m i e n t a m s po d e r o s a pa r a l a pu r i fi c a c i n d e pr o t e n a s , ha bi e n d o
i n fi n i d a d d e t r a ba jo s d e pu r i fi c a c i n m e d i a n t e e l u s o d e e s t a s c r o m a t o gr a fa s d e a fi n i d a d
(Ol c za k et al, 1997; De a n e et a /., 1998).
A l gu n a s d e l a s c r o m a t o gr a fa s d e a fi n i d a d m s ha bi t u a l e s s e d e t a l l a n e n l a s i gu i e n t e l i s t a :
1) Afinidad por ciertos grupos funcionales, c o m o -NKfe , -OH, -SH, -COOH, -CHO d e
e s pe c i a l u s o e n l a s e pa r a c i n d e ppt i d o s .
2) Afinidad por protenas de fusin: d o n d e l o s l i ga n d o s pu e d e n s e r n qu e l , IgG pa r a
pr o t e n a s e s pe c fi c a s qu e i n t e r a c c i o n e n c o n e s t o s gr u po s .
3) Afinidad por anticuerpos monoclonales y policlonales: pa r a l a pu r i fi c a c i n d e
a n t i c u e r po s m o n o c l o n a l e s y po l i c l o n a l e s IgG, d o n d e l o s gr u po s u t i l i za d o s s o n Pr o t e n a A
o G n a t i v a o r e c o m bi n a n t e .
4) Afinidad por glicoprotenas: bs i c a m e n t e pa r a gl i c o pr o t e n a s qu e c o n t i e n e n c c -D-
m a n o s a s y a -D-gl u c o s a s d o n d e s e u s a n c o m o l i ga n d o s Co n c a v a l i n a A y d i v e r s o s t i po s d e
l e c t i n a s .
5) Afinidad por enzimas: e l gr u po m s a m pl i o d o n d e e xi s t e n l i ga n d o s e s pe c fi c o s pa r a
A TPa s a s , d e s o xi r i bo n u c l e a s a s , e xo n u c l e a s a s , l i pa s a s , e n zi m a s d e pe n d i e n t e s d e NA D
+
y
NA DP
+
, fo s fo d i e s t e r a r s a s , pr o t e a s a s y e n d o n u c l e a s a s e n t r e o t r a s .
6) Afinidad por otras protenas: c o m o a l bm i n a e i n t e r fe r o n e s pe c fi c a m e n t e u o t r o s
gr u po s d e pr o t e n a s c o m o l i po pr o t e n a s , pr o t e n a s d e m e m br a n a , n e u r o t r a n s m i s o r e s ,
fa c t o r e s d e c o a gu l a c i n , fa c t o r e s d e c r e c i m i e n t o , e t c .
Es t a t c n i c a t a m bi n s e pu e d e u t i l i za r pa r a l a s e pa r a c i n d e o t r o s t i po s d e m a c r o m o l c u l a s
c o m o A DN o c l u l a s (c r o m a t o gr a fa d e a fi n i d a d c e l u l a r ).
22 Introduccin
1.3.3.5. Cr o m a t o e n fo qu e
B a s a d o e n l a c a r ga s u pe r fi c i a l d e l a pr o t e n a , e n e s t e m t o d o s e a pl i c a u n gr a d i e n t e d e
pH, d e m a n e r a qu e l a c a r ga d e l a s m o l c u l a s e s t c o n t i n u a m e n t e c a m bi a n d o a m e d i d a qu e
v a r a e l pH, pr o v o c a n d o l a e l u c i n d e l a s pr o t e n a s d e s d e l a r e s i n a a m e d i d a qu e a l c a n za n s u
pu n t o i s o e l c t r i c o , e s d e c i r , e l pH qu e n e u t r a l i za s u c a r ga s u pe r fi c i a l . Es t e m t o d o s u e l e s e r
m u y e s pe c fi c o pe r o pr e s e n t a e l pr o bl e m a d e qu e s e t i e n e qu e t r a ba ja r a u n pH
c o r r e s po n d i e n t e a l pl d e c a d a u n a d e l a s pr o t e n a s qu e c o n t i e n e a l m e zc l a a t r a t a r , y e s t o
pu e d e a fe c t a r m u c ho a pr o t e n a s qu e s e a n s e n s i bl e s a v a r i a c i o n e s i m po r t a n t e s d e l pH.
Lo s r e l l e n o s u t i l i za d o s s o n s i m i l a r e s a l c a s o d e l a c r o m a t o gr a fa d e i n t e r c a m bi o
a m n i c o . El pr o c e s o i m pl i c a e m pe za r c o n u n pH e l e v a d o s u pe r i o r a l pl d e l a s pr o t e n a s d e l a
m e zc l a pa r a po s t e r i o r m e n t e i r d i s m i n u ye n d o e s t e pH y e l u i r l a s pr o t e n a s c u a n d o s e a l c a n c e
c a d a pu n t o i s o e l c t r i c o . Es t e m t o d o e s a pl i c a bl e pa r a m e zc l a s d e pr o t e n a s d e c a r a c t e r s t i c a s
c o n o c i d a s (Le e et al., 1997; A l fo n zo e al., 1997).
1.3.4. El e c t r o fo r e s i s
La e l e c t r o fo r e s i s s e d e fi n e c o m o l a m i gr a c i n d e m a c r o m o l c u l a s c a r ga d a s ba jo l a
i n fl u e n c i a d e u n c a m po e l c t r i c o , y s u e l e e m pl e a r s e c a s i s i e m pr e a e s c a l a d e l a bo r a t o r i o c o n
fi n e s a n a l t i c o s o d e c a r a c t e r i za c i n . No r m a l m e n t e , s e u s a u n a s o l u c i n d e e l e v a d a fu e r za
i n i c a pa r a c o n c e n t r a r e i n m o v i l i za r l a s pr o t e n a s , y s e a pl i c a u n a d i fe r e n c i a d e po t e n c i a l a l
ge l qu e c o n t i e n e l a s pr o t e n a s qu e m i gr a r a n e n fu n c i n d e s u c a r ga o d e s u pe s o m o l e c u l a r s i
pr e v i a m e n t e ha n s i d o i gu a l a d a s l a s c a r ga s .
El m t o d o m s po pu l a r d e e l e c t r o fo r e s i s d e u n a d i m e n s i n e s e l c o n o c i d o po r SDS-
PA GE ("So d i u m d o d e c yl s u l fa t e -po l ya c r yl a m i d e ge l e l e c t r o pho r e s i s ") u s a d o pa r a l a
d e t e r m i n a c i n d e pe s o s m o l e c u l a r e s d e m a c r o m o l c u l a s c o m o l a s pr o t e n a s , qu e u n a v e z
d o t a d a s d e u n a c a r ga e qu i v a l e n t e , m i gr a n ba jo l a a c c i n d e u n c a m po e l c t r i c o s o br e u n ge l e n
fu n c i n d e s u t a m a o m o l e c u l a r . Lo s pe s o s m o l e c u l a r e s d e l a s pr o t e n a s s e d e t e r m i n a n po r
c o m pa r a c i n d e s u s m o v i l i d a d e s c o n a l gu n o s m a r c a d o r e s d e pe s o m o l e c u l a r c o n o c i d o .
Introduccin 23
Ot r o m t o d o u t i l i za d o fr e c u e n t e m e n t e e s e l d e n o m i n a d o Is o e l e c t r o e n fo qu e , e n e s t a
t c n i c a , c u a n d o u n a pr o t e n a e s i n t r o d u c i d a e n u n m e d i o d e pH v a r i a bl e ba jo l a i n fl u e n c i a d e
u n c a m po e l c t r i c o , s e m u e v e ha c i a e l po l o o pu e s t o a s u c a r ga , pe r o e n s u m i gr a c i n a t r a v s
d e l gr a d i e n t e d e pH, l a pr o t e n a pu e d e ga n a r o pe r d e r pr o t o n e s , d e m a n e r a qu e s u c a r ga
d i s m i n u i r y pe r d e r m o v i l i d a d , l l e ga n d o ha s t a e l pu n t o e n qu e e l pH i gu a l e s u pu n t o
i s o e l c t r i c o . Su s a pl i c a c i o n e s e n e l c a m po d e l a c a r a c t e r i za c i n d e pr o t e n a s e n t o d a s s u s
v a r i e d a d e s y po s i bi l i d a d e s s o n m u y n u m e r o s a s (De u t s c he r , 1988; Ri gu e t t i , 1990).
1.3.5. El e c t r o fo r e s i s c a pi l a r
La e l e c t r o fo r e s i s c a pi l a r (CE) s e d e fi n e c o m o u n a t c n i c a d e a l t a r e s o l u c i n pa r a l a
s e pa r a c i n d e u n a a m pl i a ga m a d e m o l c u l a s d e i n t e r s bi o l gi c o c o m o m e t a bo l i t o s ,
a m i n o c i d o s , c i d o s n u c l e i c o s , gl c i d o s , pr o t e n a s y ppt i d o s , a u n qu e s u m a yo r a pl i c a c i n
a c t u a l m e n t e e s t e n e l c a m po d e l a n l i s i s d e c a t i o n e s y a n i o n e s (Fu n g y La u , 1998a ; Fu n g et
al, 1998b).
A l i gu a l qu e e n e l c a s o d e l a e l e c t r o fo r e s i s e n ge l , l a s s e pa r a c i o n e s e n CE s e ba s a n e n
l a r e l a c i n c a r ga -m a s a . La CE e m pl e a c o l u m n a s c a pi l a r e s d e s l i c e qu e pu e d e n s e r o n o
d e r i v a t i za d a s po r d o n d e l a s pr o t e n a s s e m u e v e n e n s o l u c i n . Es t a t c n i c a pu e d e u t i l i za r s e a
m o d o d e e l e c t r o fo r e s i s e n ge l pa r a d e t e r m i n a r l o s pe s o s m o l e c u l a r e s d e l a s pr o t e n a s o bi e n ,
pa r a c o n o c e r l o s pu n t o s i s o e l c t r i c o s d e d i c ha s pr o t e n a s . En e s t e l t i m o c a s o , c o n o c i d o c o m o
i s o e l e c t r o e n fo qu e , l a pr o t e n a s e d e s pl a za c u a n d o s e c r e a u n gr a d i e n t e d e pH e n l a c o l u m n a
ha s t a pa r a r s e e n e l pu n t o e n e l qu e e n pH e s i gu a l a l pl . Tr a s e s t o , l a m u e s t r a s e m o v i l i za
r o m pi e n d o e l gr a d i e n t e d e pH o hi d r o d i n m i c a m e n t e , o bt e n i n d o s e pi c o s pa r e c i d o s a l o s
o bt e n i d o s m e d i a n t e l a s t c n i c a s c r o m a t o gr fc a s t i po FPLC y HPLC.
En s u fo r m a m s s i m pl e , l a s e pa r a c i n m e d i a n t e CE s e c o n s i gu e pa s a n d o u n v o l t a je
e n t r e d o s r e c i pi e n t e s l l e n o s d e a l gn t a m pn qu e e s t n u n i d o s po r u n c a pi l a r t a m bi n l l e n o d e
l qu i d o (Fi g. 1.6). Es t o pr o d u c e l a ge n e r a c i n d e l o qu e s e c o n o c e po r fl u jo e l e c t r o o s m t i c o ,
qu e pe r m i t e a l a s m o l c u l a s d e i n t e r s pa s a r d e u n e xt r e m o d e l c a pi l a r a l o t r o . En e l c a s o d e l
i s o e l e c t r o e n fo qu e , l a fo r m a m s c o m n d e o pe r a r e s s i t u a r e n c a d a e xt r e m o d e l c a pi l a r u n a
s o l u c i n d e pH c i d o y bs i c o r e s pe c t i v a m e n t e , a pl i c a r po t e n c i a l pa r a c r e a r u n gr a d i e n t e d e
24 Introduccin
pH a l o l a r go d e l c a pi l a r qu e pe r m i t a a l a s m o l c u l a s , e n e s t e c a s o pr o t e n a s , m o v e r s e ha s t a
a l c a n za r e l pH c o r r e s po n d i e n t e a s u pu n t o i s o e l c t r i c o , e n e l qu e d e ja r n d e m o v e r s e . En e s t e
pu n t o , s e i gu a l a e l pH d e c t o d o y n o d o s i t u a n d o e l m i s m o c o m pu e s t o (c i d o o ba s e ) e n c a d a
e xt r e m o d e l a c o l u m n a , d e m a n e r a qu e s e r o m pe e l gr a d i e n t e d e pH, y l a s pr o t e n a s s a l e n d e l a
c o l u m n a c o n s e c u t i v a m e n t e po r s u pl d e a c u e r d o a c o m o s e ha ya n d i s t r i bu i d o e n l a pr i m e r a
fa s e (Co l i ga n et al., 1995).
Lo s c a pi l a r e s u t i l i za d o s t i e n e n ge n e r a l m e n t e d e 30 a 50 c m d e l a r go c o n 50-75 \im d e
d i m e t r o i n t e r n o , l o qu e s u po n e v o l m e n e s d e l o r d e n d e m i c r o l i t r o s . Lo s c a pi l a r e s t i e n e n u n
gr o s o r m u y pe qu e o , l o qu e pe r m i t e u n a e fe c t i v a e l i m i n a c i n d e l c a l o r ge n e r a d o po r l o s
v o l t a je s qu e n o r m a l m e n t e a l c a n za n l o s 30 kV, n e c e s a r i o s pa r a e s t e t i po d e s e pa r a c i o n e s . Lo s
c a pi l a r e s pu e d e n e s t a r v a c o s (n o r m a l m e n t e e n e l c a s o d e l a n l i s i s d e i o n e s ) pe r o pa r a
pr o t e n a s s e r e c o m i e n d a e l u s o d e c a pi l a r e s r e l l e n o s d e l o s c u a l e s e n e l m e r c a d o s e e n c u e n t r a n
d i s t i n t o s t i po s c u ya s d i fe r e n c i a s s u e l e n s e r d e hi d r o fo bi c i d a d .
Ca pi l a r
\
De t e c t o r
r *^ S
(~*
W
~*$S
/i l i l l l l l l l
Vo l t a je
Ta m pn /m u e s t r a Ta m pn
Fi g. I.6.: Es qu e m a d e u n a CE.
Introduccin 25
A u n qu e l a CE ha s i d o a pl i c a d a c o n xi t o e n l a r e s o l u c i n d e a l gu n a s pr o t e n a s (Ji n et
al, 1997; Pa r k et al, 1997; Ma gn u s o n y Cr a wfo r d , 1997; Xu et a /., 1997), e l he c ho d e qu e
e s t a t c n i c a s e a u n a d e m s d i fc i l e s d e o pt i m i za r pa r a t e n e r bu e n a s s e pa r a c i o n e s e n m e zc l a s
c o m pl e ja s c o m o l a s qu e pr o v i e n e n ha bi t u a l m e n t e d e c a l d o s d e fe r m e n t a c i n , ha pr o v o c a d o
qu e n o s e a t o d a v a u n s i s t e m a d e s e pa r a c i n c o m n e n bi o t e c n o l o ga , a u n qu e s i n e m ba r go , e s
u n a he r r a m i e n t a t i l e n l a d e t e r m i n a c i n c u a n t i t a t i v a r pi d a d e l a pu r e za d e c i e r t a s m u e s t r a s .
26 _^Introduccin
1.4. Li pa s a s d e Candida rugosa
1.4.1. Es t r u c t u r a v m e c a n i s m o d e r e a c c i n
U n a d e l a s c a r a c t e r s t i c a s m s i m po r t a n t e s d e l a s l i pa s a s y qu e l a s d i fe r e n c i a d e o t r a s
e n zi m a s e s l a pr o pi e d a d qu e t i e n e n d e a d s o r be r s e s o br e s u pe r fi c i e s hi d r o fbi c a s , pr o v o c a n d o
n o r m a l m e n t e u n a u m e n t o d e s u a c t i v i d a d c a t a l t i c a . Es t e he c ho , c o n o c i d o c o m o a c t i v a c i n
i n t e r fa c i a l s e e xpl i c a m e d i a n t e l a e s t r u c t u r a t r i d i m e n s i o n a l d e l a e n zi m a . Lo s a n l i s i s po r
d i fr a c c i n d e r a yo s X r e v e l a n l a e xi s t e n c i a d e u n a e s t r u c t u r a e n hl i c e a l fa qu e r e c u br e e l
c e n t r o a c t i v o d e l a e n zi m a , y qu e s e a c t i v a po r d e s pl a za m i e n t o d e e s t a e s t r u c t u r a e n fo r m a d e
t a pa , c u yo m o v i m i e n t o c r e a u n a e s t r u c t u r a a po l a r e xpo n i e n d o l o s gr u po s c a t a l t i c o s d e l a
pr o t e n a , m i e n t r a s qu e l a s u pe r fi c i e hi d r o fbi c a e s t a bi l i za e l c o n t a c t o e n t r e l a e n zi m a y l a
i n t e r fa s e l i pd i c a (B r zo zo ws ki et al, 1991).
Re c i e n t e m e n t e , s e ha d e t e r m i n a d o l a e s t r u c t u r a d e u n a l i pa s a d e Candida rugosa e n
s u s c o n fo r m a c i o n e s c e r r a d a s y a bi e r t a (Fi g. 1.7). La c o m pa r a c i n e n t r e a m ba s e s t r u c t u r a s
i n d i c a qu e l a a c t i v a c i n r e qu i e r e e l m o v i m i e n t o y r e pl e ga m i e n t o d e u n s o l o bu c l e , d e m a n e r a
qu e c o m po r t a l a a pa r i c i n d e u n a s u pe r fi c i e hi d r o fbi c a a l r e d e d o r d e l c e n t r o a c t i v o qu e
pe r m i t e l a i n t e r a c c i n c o n l a i n t e r fa s e l i pd i c a . Es t e m o v i m i e n t o s e a s o c i a a u n a i s o m e r i za c i n
d e cis a trans d e l e n l a c e pe pt d i c o d e l r e s i d u o pr o l i n a . Es t a i s o m e r i za c i n e s u n m e c a n i s m o d e
c i e r r e e n u n a u o t r a c o n fo r m a c i n , a fe c t a n d o a l a v e l o c i d a d d e r e o r i e n t a c i n d e l a pr o t e n a e n
e s t e m o v i m i e n t o d e c i e r r e y a pe r t u r a (Gr o c hu l s ki et al, 1993; Gr o c hu l s ki et al, 1994).
Po r l o qu e s e r e fi e r e a l a c a t l i s i s e n s , d u r a n t e l a r e a c c i n s e fo r m a u n i n t e r m e d i a r i o
t e t r a d r i c o qu e s e t r a n s fo r m a e n u n c o m pl e jo a c i l -e n zi m a , pa r a qu e po s t e r i o r m e n t e l a l i pa s a
e n fo r m a l i br e s e r e ge n e r e po r l a r e a c c i n hi d r o l t i c a c o n u n a m o l c u l a d e a gu a . El
m e c a n i s m o po r e l c u a l l a l i pa s a hi d r o l i za u n e n l a c e s t e r s e i n i c i a c o n u n a t a qu e n u c l e fi l o
po r pa r t e d e l o xge n o d e l a c a d e n a l a t e r a l d e l a s e r i n a ha c i a e l t o m o d e c a r bo n o d e l gr u po
c a r bo n i l o d e l e n l a c e s t e r d a n d o l u ga r a l a fo r m a c i n d e u n c o m pl e jo i n t e r m e d i a r i o
t e t r a d r i c o . La hi s t i d i n a i n c r e m e n t a e l c a r c t e r n u c l e fi l o d e l gr u po hi d r o xi l o d e l a s e r i n a , ya
qu e s u a n i l l o i m i d a zo l s e pr o t o n a a d qu i r i e n d o c a r ga po s i t i v a , e s t a bi l i za d a gr a c i a s a l a c a r ga
n e ga t i v a d e l r e s i d u o c i d o . El i n t e r m e d i a r i o t e t r a d r i c o s e e s t a bi l i za po r pu e n t e s d e hi d r ge n o
Introduccin 27
c o n l o s e n l a c e s a m i n a d e l o s r e s i d u o s qu e pe r t e n e c e n a l a c a v i d a d d e o xi a n i n . Fi n a l m e n t e s e
l i be r a e l a l c o ho l , qu e d a n d o e l c o m pl e jo a c i l -e n zi m a , y m e d i a n t e e l a t a qu e n u c l e fi l o d e u n i o n
hd r o xi l o s e l i be r a e l c i d o gr a s o y s e r e ge n e r a l a e n zi m a (Gr o c hu l s ki et al, 1993; Gr o c hu l s ki
etal., 1994).
73
2 cis-trans
73
cis-trans
Fi g. I.7.: Co n fo r m a c i o n e s y po s i c i o n e s d e l a s d o s t a pa s a bi e r t a (a ) y c e r r a d a (b) pa r a l i pa s a d e
Candida rugosa (Gr o c hu l s ki et al, 1994).
1.4.2. Is o fo r m a s pr e s e n t e s
U n a d e l a s c a r a c t e r s t i c a s m s i m po r t a n t e s qu e ha y qu e t e n e r e n c u e n t a a l e s t u d i a r l a s
l i pa s a s d e Candida rugosa e s e l he c ho d e qu e a pa r e zc a n m l t i pl e s i s o fo r m a s d e l i pa s a s e n l o s
pr e pa r a d o s c o m e r c i a l e s d e e s t a e n zi m a . A l m e n o s 7 ge n e s d i s t i n t o s d e l i pa s a s , n o m br a d o s d e
Li pl a Li p7 ha n s i d o d e s c r i t o s e n Candida rugosa, a u n qu e s l o 5 d e e l l o s (Li pl -Li p5) ha n
s i d o c o m pl e t a m e n t e c a r a c t e r i za d o s (Lo t t i y A l be r ghi n a , 1996). De e s t o s 5 ge n e s , s l o s e ha n
i d e n t i fi c a d o 3 pr o d u c t o s (l o s c o r r e s po n d i e n t e s a Li pl , Li p2 y Li p3) e n l o s pr e pa r a d o s
c o m e r c i a l e s d e e s t a e n zi m a .
28
Introduccin
A pa r t i r d e e s t a s s e c u e n c i a s d e ge n e s , s e ha e l a bo r a d o l a s e c u e n c i a a m o n i a c d i c a
t e r i c a d e l a s d i fe r e n t e s i s o e n zi m a s , a s c o m o o t r a s c a r a c t e r s t i c a s c o m o pe s o m o l e c u l a r ,
pu n t o s d e gl i c o s i l a c i n t e r i c o s y pu n t o i s o e l c t r i c o . En l a t a bl a 1.2 s e r e c o ge l a s e c u e n c i a d e
a m i n o c i d o s c o m e n za n d o po r e l N-t e r m i n a l d e l o s d i s t i n t o s ge n e s d e l i pa s a d e Candida
rugosa, m a r c a n d o a qu e l l o s pu n t o s d o n d e n o c o i n c i d e n , m i e n t r a s qu e e n l a t a bl a 1.3 s e
i n c l u ye n l a s pr e v i s i o n e s t e r i c a s o bt e n i d a s a pa r t i r d e l a s s e c u e n c i a s d e l a t a bl a 1.2.
5 19 22 30 35 40 45-46 49
Lipl APTA T LANGDTITGLNAI I NE A FLGIPFA E PPVG N LRFK D PVPY SG SL D G
Lip2 APTA T LANGDTITGLNAI V NE K FLGIPFA E PPVG T LRFK P PVPY SA SL N G
Lip3 APTA K LANGDTITGLNAI I NE A FLGIPFA E PPVG N LRFK D PVPY SG SL N G
Lip4 APTA T LANGDTITGLNAI I NE A FLGIPFA Q PPVG N LRFK P PVPY SA SL N G
Lip5 APTA T LANGDTITGLNAI I NE A FLGJPFA E PPVG N LRFK D PVPY RG SL N G
Tabla I.2.: Se c u e n c i a d e a m i n o c i d o s pa r a l o s d i s t i n t o s ge n e s d e l i pa s a d e Candida rugosa.
Pr o t e n a
Li pl
Li p2
Li p3
Li p4
Li p5
PM
57223
57744
57291
57051
56957
Pl
4.5
4.9
5.1
5.7
5.5
Pu n t o s d e gl i c o s i l a c i n
3
1
3
1
3
Tabla 1.3.: Pr e d i c c i n t e r i c a pa r a l a s d i s t i n t a s i s o fo r m a s d e l i pa s a s d e Candida rugosa.
La s d i s t i n t a s s e c u e n c i a s d e s c r i t a s e n l a t a bl a 1.2 pr e s e n t a ha s t a u n 84 % d e s i m i l i t u d ,
c o n zo n a s a l t a m e n t e c o n s e r v a d a s qu e i n t e r v i e n e n e n e l pl e ga m i e n t o y fu n c i n c a t a l t i c a y
o t r a s m s v a r i a bl e s c u ya s d i fe r e n c i a s m a r c a n l a e s pe c i fi c i d a d d e l a e n zi m a (Lo t t i et al, 1994).
Introduccin ___ 29
1.4.3. Pu r i fi c a c i n d e l a s i s o fo r m a s pr e s e n t e s e n Candida rugosa
A u n qu e e n l a bi bl i o gr a fa s e e n c u e n t r a n n u m e r o s o s t r a ba jo s d e pu r i fi c a c i n y
c a r a c t e r i za c i n d e l a s d i s t i n t a s i s o fo r m a s d e l i pa s a s , a s c o m o d e o t r a s pr o t e n a s a s o c i a d a s
ge n e r a l m e n t e d e n a t u r a l e za e s t e r s i c a , pr e s e n t e s e n l o s pr e pa r a d o s c o m e r c i a l e s d e l i pa s a s d e
Candida rugosa, e xi s t e n m u y po c o s t r a ba jo s d e pu r i fi c a c i n r e fe r i d o s a l a i n fl u e n c i a d e l a s
c o n d i c i o n e s d e c u l t i v o y fi s i o l o ga d e Candida rugosa y s u pe r fi l l i ps i c o /e s t e r s i c o s e c r e t a d o
po r e l m i c r o o r ga n i s m o (Lo t t i et al, 1998).
La m a yo r a d e t c n i c a s qu e s e ha n u t i l i za d o pa r a l a s e pa r a c i n d e d i c ha s i s o fo r m a s
i n c l u ye n o pe r a c i o n e s d e c r o m a t o gr a fa d e d i s t i n t o s t i po s . Pr e v i a m e n t e a s u u t i l i za c i n s e
r e a l i za u n pr e t r a t a m i e n t o o s e m i pu r i fi c a c i n d e l a m u e s t r a , m e d i a n t e o pe r a c i o n e s d e
c e n t r i fu ga c i n , pr e c i pi t a c i n o d i l i s i s , pa r a e l i m i n a r gr a n pa r t e d e l a s i m pu r e za s i n s o l u bl e s y
s o l u bl e s qu e c o n t i e n e n l o s pr e pa r a d o s c o m e r c i a l e s . Ha y qu e d e s t a c a r qu e e n m u c ho s d e l o s
t r a ba jo s s e e n c u e n t r a n fr a c c i o n e s d e pr o t e n a s qu e d i fi e r e n e n a l gu n a c a r a c t e r s t i c a , pe r o r a r a
v e z e xi s t e u n a i d e n t i fi c a c i n c o n l a s d i s t i n t a s i s o fo r m a s pr e v i s t a s po r l a s s e c u e n c i a s
pr e s e n t a d a s e n l a t a bl a 1.2.
Es t o e s d e bi d o a qu e l a he t e r o ge n e i d a d d e i s o fo r m a s d e l i pa s a s e n c o n t r a d a s e n
pr e pa r a d o s c o m e r c i a l e s pu e d e s e r d e bi d a n o t a n t o a v a r i a c i o n e s e n l a s e c u e n c i a d e
a m i n o c i d o s s i n o a d i fe r e n c i a s e n l a gl i c o s i l a c i n d e l a s pr o t e n a s , a s c o m o a a s o c i a c i o n e s d e
n a t u r a l e za n o c o v a l e n t e e n t r e l a s l i pa s a s e i m pu r e za s pr e s e n t e s e n l o s c a l d o s d e fe r m e n t a c i n ,
c o m o po l i s a c r i d o s d e e l e v a d o pe s o m o l e c u l a r , qu e s o n ha bi t u a l m e n t e pr o d u c i d o s po r
m i c r o o r ga n i s m o s pr o d u c t o r e s d e l i pa s a s (Ci r i gl i a n o y Ca r m a n , 1984; Ci r i gl i a n o y Ca r m a n
1985).
En l a t a bl a 1.4 s e d e t a l l a u n a r e c o pi l a c i n d e l o s d i s t i n t o s t r a ba jo s r e a l i za d o s po r
d i s t i n t o s a u t o r e s e n l a pu r i fi c a c i n d e l a s d i s t i n t a s i s o fo r m a s pr e s e n t e s e n pr e pa r a d o s
c o m e r c i a l e s . En l a t a bl a t a m bi n s e i n d i c a s i e xi s t e u n a c o r r e l a c i n e n t r e l a s fr a c c i o n e s
o bt e n i d a s y a l gu n a d e l a s s e c u e n c i a s d e t e r m i n a d a s po r Lo t t i et al. (1996) d e l a t a bl a 1.2. Es t a
a n a l o ga s e r e a l i za n o r m a l m e n t e po r d e t e r m i n a c i n d e l N-t e r m i n a l ha s t a e l a m i n o c i d o
d i s t i n t i v o d e c a d a i s o fo r m a .
30 Introduccin
A u t o r
Ve e r a r a ga v a n y Gi bbs (1989)
Sha w y Cha n g (1989)
B r a hi m i -Ho m etal. (1990)
A l l e n m a r k y Ohl s s o n (1992)
Ra etal, (1993)
Cha n g e fa /., (1994)
Ra y B a l l e s t e r o s ( 1 994)
Go r d i l l o e fa /. (1995)
Li n ko yWu (1996)
Di c zfa l u s y e fa /. (1997)
Lu n d e l l etal. (1998)
Pr o c e d e n c i a
Si gm a
Si gm a
Si gm a
Si gm a
Si gm a
Si gm a
A m a n o
Me i t o Sa n gyo
Si gm a
Fe r m e n t a c i n
B i o c a t a l ys t
Si gm a
Si gm a
Fr a c c i o n e s
2 d y II)
3 (A , B y C)
2 (I y II)
2 (I y II)
2(A yB )
( 1 )
2
3
1
2(A yB )
w
2( l y 2)
2 (1 y 2)
w
3(CELl ,2y3)
w
2(A yB )
CT
Ca r a c t e r i s i t c a s
PM=58,pI=5.6,5.8
PM=62
PM=60, pl =4.3, 4.7
-
PM=60,pI=5.5,4.8
-
-
-
-
PM=60
PM=57,60
"
PM=60
Cr o m a t o gr a fa u t i l i za d a
I. i n i c o
I. i n i c o
I. i n i c o + 1. hi d r o fo b.
I i n i c o + G. fi l t r a c i n
I. i n i c o + A fi n i d a d
-
-
-
I. hi d r o fo b.+ G. fi l t r a c i n
I. i n i c o
I. hi d r o fo b.+ G. fi l t r a c i n
I. hi d r o fo b.+ G. fi l t r a c i n
+ 1. i n i c o
I. i n i c o
(1)
La l i pa s a A c o r r e s po n d e a Li p3 c o n u n gr a d o d e gl i c o s i l a c i n d e l 6.7 %, m i e n t r a s qu e l a
l i pa s a B , m a yo r i t a r i a , pu e d e c o r r e s po n d e r a Li p 1,2,4 o 5, c o n u n gr a d o d e gl i c o s i l a c i n d e l
2.7 %.
(2)
Va r i a c i n d e l m t o d o pr o pu e s t o pa r a s e pa r a r l a s i s o e n zi m a s A y B d e l pu n t o
(1)
.
(3)
Si gu i e n d o e l pr o t o c o l o d e s c r i t o po r Ra y B a l l e s t e r o s (1994).
(4)
CEL-1 y CEL-3 s e i d e n t i fi c a n c o n Li pl y CEL-2 e s e l pr o d u c t o d e l ge n Li p2, d e n u e v o
Li pl a pa r e c e c o m o m a yo r i t a r i a , s i n e m ba r go , c o n t r a r i a m e n t e a l o d e s c r i t o po r Ra et al.
(1993), n o a pa r e c e Li p3. En e s t e t r a ba jo ha n s i d o i d e n t i fi c a d a s pr o t e n a s d e n a t u r a l e za
e s t e r s i c a e n pr e pa r a d o s d e Si gm a t i po VII (Di c zfa l u s y y A l e xs o n , 1996; Di c zfa l u s y et al,
1997) po r m e d i o d e c r o m a t o gr a fa hi d r o fbi c a . Co n c r e t a m e n t e s e t r a t a d e a c i l -Co A
t i o e s t e r a s a s /c a r bo xi l e s t e r a s a s pr e s e n t e s e n pe qu e a s c a n t i d a d e s e n e l l i o fi l i za d o c o m e r c i a l .
(5)
Si gu i e n d o e l pr o t o c o l o d e s c r i t o po r Ra et al. (1993).
Tabla 1.4.: Re s u m e n d e l o s t r a ba jo s d e pu r i fi c a c i n r e a l i za d o s c o n l i pa s a s d e Candida
rugosa.
Co m o s e pu e d e o bs e r v a r e n l a t a bl a 1.4, l o s r e s u l t a d o s o bt e n i d o s s o n m u y d i v e r s o s y
s i gu i e n d o d i fe r e n t e s t c n i c a s d e pu r i fi c a c i n o i n c l u s o c a m bi a n d o d e pr o v e e d o r o d e l o t e s e
o bt i e n e n d i s t i n t a s pr o po r c i o n e s e i n c l u s o s e i d e n t i fi c a n d i s t i n t a s i s o e n zi m a s . A d e m s , e n
Introduccin
31
m u c ha s o c a s i o n e s l a s l i pa s a s s e pr e s e n t a n e n fo r m a d e a gr e ga d o s o a s o c i a d a s a o t r a s
m o l c u l a s (Sha w y Cha n g, 1989). Es t e he c ho , u n i d o a qu e l a s l i pa s a s pr e s e n t a n u n a
i m po r t a n t e he t e r o ge n e i d a d e n l a gl i c o s i l a c i n (Ta bl a 1.5), pr o v o c a qu e l o s i n t e n t o s d e
i d e n t i fi c a r l o s pi c o s o bt e n i d o s c r o m a t o gr fl c a m e n t e c o n pr o t e n a s pu r a s s e a n e xt r e m a d a m e n t e
d i fc i l e s . En l a t a bl a 1.5 s e pr e s e n t a n a m o d o d e r e s u m e n a qu e l l a s pu r i fi c a c i o n e s qu e ha n
l l e ga d o a e s t e t i po d e i d e n t i fi c a c i n pa r a l a l i pa s a c o m e r c i a l d e Si gm a .
.Pr o t e n a
Li pl /B
Li p3/A
Li pl
Li pl
Li p2
PM (kDa )
62
64
60
60
58
pl
4.8
5.5
-
-
-
% Gl i c o s i l a c i n
3.6%
8.0%
-
5.0%
1.5%
A u t o r
Raetal. (1993)
Ra et al (1993)
Gr o c hu l s ki et al (1993)
Di c zfa l u s ye /a /. (1997)
Di c zfa l u s y et al. (1997)
Tabla 1.5.: Re s u m e n d e l o s t r a ba jo s d e pu r i fi c a c i n r e a l i za d o s c o n l i pa s a s d e Candida rugosa
e n l o s qu e s e l l e ga a u n a i d e n t i fi c a c i n d e u n ge n d e s c r i t o po r Lo t t i et al. (1996).
Ot r o fa c t o r a t e n e r e n c u e n t a e s qu e e n e s t e t i po d e c r o m a t o gr a fa s n o r m a l m e n t e l o s
r e n d i m i e n t o s o bt e n i d o s s o n m u y ba jo s , c o n t a bi l i za n d o l a a c t i v i d a d qu e s e r e c u pe r a e n l a s
fr a c c i o n e s c o n r e s pe c t o a l a d e pa r t i d a . Es t o n o r m a l m e n t e v i e n e c o m pe n s a d o po r u n o s
e l e v a d o s fa c t o r e s d e pu r i fi c a c i n qu e r e fl e ja n e l a u m e n t o pr o d u c i d o e n l a a c t i v i d a d e s pe c fi c a .
Po r e je m pl o , l a t a bl a 1.6 pr o po r c i o n a d a po r Ra et al. (1993) m u e s t r a c l a r a m e n t e l a
d i s m i n u c i n d e l r e n d i m i e n t o a l m i s m o t i e m po qu e e l a u m e n t o d e l fa c t o r d e pu r i fi c a c i n :
Pu r i fi c a c i n
Cr u d o
Pr e c . e t a n o l
DEA E
Li p A
Li p B
Se pha c r yl
Li p A
Li p B
Pr o t e n a t o t a l
(m g)
1100
500
A c t . e s p. (U /m g)
(Tr i bu t i r i n a )
65
120
Fa c t o r d e
pu r i fi c a c i n
1.0
1.8
Re n d i m i e n t o
(%)
100
84
80
154
134
230
2.0
3.5
15
49
4.5
20
750
744
11.5
11.3
5
21
Tabla 1.6.: Re n d i m i e n t o s y fa c t o r e s d e pu r i fi c a c i n pa r a l a pu r i fi c a c i n d e i s o fo r m a s d e
Candida rugosa s e gn Ra et al, 1993.
32 Introduccin
Ot r o s d a t o s pr o po r c i o n a d o s po r Ve e r a r a ga v a n y Gi bbs (1989) ha bl a n d e
r e c u pe r a c i o n e s d e l o r d e n d e l 20 % y fa c t o r e s d e pu r i fi c a c i n c e r c a n o s a 6, m i e n t r a s qu e d a t o s
d e Di c zfa l u s y y A l e xs o n (1996) o bt i e n e n r e n d i m i e n t o s i n fe r i o r e s a l 20 % c o n fa c t o r e s d e
pu r i fi c a c i n c e r c a n o s a 20 pa r a e l m e jo r d e l o s c a s o s .
No o bs t a n t e , t o m a n d o c o m o r e fe r e n c i a l a l i pa s a d e Si gm a , s e pu e d e n po s t u l a r u n a
s e r i e d e c o n c l u s i o n e s :
- Exi s t e l a pr e s e n c i a d e d o s i s o fo r m a s , d e l a s c u a l e s l a m a yo r i t a r i a c o r r e s po n d e a l ge n Li pl .
- Es t a fo r m a m a yo r i t a r i a c o r r e s po n d i e n t e a l ge n Li pl e s l a d e n o m i n a d a Li pB po r Ra et al,
(1993).
- En c u a n t o a l a o t r a i s o fo r m a , l a m a yo r a d e a u t o r e s s e a l a n qu e s e t r a t a d e l a
c o r r e s po n d i e n t e a l ge n Li p3, m i e n t r a s qu e Di c zfa l u s y et al. (1997) i d e n t i fi c a n e l ge n Li p2.
Lo s pe s o s m o l e c u l a r e s y pu n t o s i s o e l c t r i c o s d e t e r m i n a d o s e xpe r i m e n t a l m e n t e d i fi e r e n d e
l o s pr e v i s t o s t e r i c a m e n t e .
Ha y u n a c i e r t a he t e r o ge n e i d a d e n e l gr a d o d e gl i c o s i l a c i n qu e pa r e c e d e pe n d e r i n c l u s o
d e l l o t e e s t u d i a d o .
- Se ha c o n s t a t a d o po r pa r t e d e Di c zfa l u s y y A l e xs o n (1996) l a pr e s e n c i a d e a l m e n o s d o s
e s t e r a s a s e n e l pr e pa r a d o d e Si gm a .
- La pr e s e n c i a d e c o n t a m i n a n t e s e n l a m u e s t r a , l a po s i bi l i d a d d e a gr e ga c i n d e l a s l i pa s a s y
l a a s o c i a c i n a o t r a s m a c r o m o l c u l a s d i fi c u l t a l a pu r i fi c a c i n d e e s t a l i pa s a .
1.4.4. Di fe r e n c i a s d e r e a c t i v i d a d e n t r e l a s i s o fo r m a s
Exi s t e n po c o s e s t u d i o s d o n d e s e ha ya d e t e r m i n a d o d i s t i n t a r e a c t i v i d a d e n t r e l a s d o s
i s o fo r m a s m a yo r i t a r i a s pr e s e n t e s e n l a s l i pa s a s c o m e r c i a l e s d e Candida rugosa. De t o d a s
fo r m a s , l o s pr i m e r o s e s t u d i o s r e a l i za d o s po r Sha w y Cha n g (1989) s u ge r a n qu e ha ba
d i fe r e n c i a s e n l a a c t i v i d a d e n zi m t i c a d e l a s d i s t i n t a s fr a c c i o n e s s e pa r a d a s a l v a r i a r l a l o n gi t u d
d e l a c a d e n a d e l gr u po a c i l o d e l s t e r qu e s e hi d r o l i za ba . Es t o s r e s u l t a d o s fu e r o n c o n fi r m a d o s
po r B r a hi m i -Ho r n et al. (1989) c u a n d o s e c o m pa r l a a c t i v i d a d e s t e r s i c a d e a m ba s fr a c c i o n e s
y po r Ra et al. (1993), ya qu e c u a n d o s e pa r a r o n l a s l i pa s a s A y B (qu e po r pr i m e r a v e z
Introduccin 33
c o r r e s po n d a n a d o s ge n e s i d e n t i fi c a d o s pa r a Candida rugosa), s e l l e g a l a c o n c l u s i n d e
qu e l a l i pa s a B pr e s e n t a ba m e n o r a fi n i d a d po r s u bs t r a t o s s o l u bl e s (/?-n i t r o fe n i l bu t i r a t o ,
a c t i v i d a d e s t e r s i c a ) y po r t r i gl i c r i d o s d e c a d e n a c o r t a (t r i bu t i r i n a ) qu e po r s u bs t r a t o s d e
n a t u r a l e za l i pd i c a c o m o t r i o l e n a , y qu e , e n c a m bi o , l a l i pa s a A t e n a m s a fi n i d a d po r
s u bs t r a t o s e s t e r s i c o s , a d e m s d e o t r a s d i fe r e n c i a s i m po r t a n t e s d e t i po bi o qu m i c o c o m o pH y
t e m pe r a t u r a pt i m o s , i n fl u e n c i a d e d i s o l v e n t e s o r gn i c o s , e t c . qu e ha ba n s i d o c o n s t a t a d o s e n
t r a ba jo s a n t e r i o r e s .
Si n e m ba r go , A l l e n m a r k y Ohl s s o n (1992) fu e r o n l o s pr i m e r o s e n pr o ba r d i s t i n t a s
fr a c c i o n e s d e l i pa s a s e n s u bs t r a t o s d e n a t u r a l e za qu i r a l , o bs e r v a n d o c o m o l o s e xc e s o s
e n a n t i o m r i c o s o bt e n i d o s v a r i a ba n e n fu n c i n d e l a fr a c c i n u t i l i za d a . Ot r o s e s t u d i o s
po s t e r i o r e s a pu n t a n a qu e e n r e a c c i o n e s d e t r a n s e s t e r i fi c a c i n l a l i pa s a B o r i gi n u n o s
r e s u l t a d o s m u c ho m e jo r e s e n s e l e c t i v i d a d y c o n v e r s i n qu e l a l i pa s a A (Li n ko y Wu , 1996).
Si n e m ba r go , e s t u d i o s r e c i e n t e s (Lu n d e l l e t a l , 1998) n o d e t e r m i n a r o n d i s t i n t a s
e n a n t i o s e l e c t i v i d a d e s pa r a l a s l i pa s a A y B e n l a r e s o l u c i n d e a l c o ho l e s s e c u n d a r i o s , a u n qu e
s s e d e t e c t a r o n d i fe r e n c i a s e n l a r e s o l u c i n d e d e r i v a d o s d e l c i d o 2-fe n i l pr o pi n i c o c o m o
i bu pr o fe n o (He r n i z et al., 1997) d o n d e l a l i pa s a B s e m o s t r m u c ho m s e n a n t i o s e l e c t i v a ,
he c ho qu e ha ba s i d o c o n s t a t a d o pr e v i a m e n t e c o n e s t e t i po d e c o m pu e s t o s y c o n /?-n i t r o fe n i l
e s t e r e s (He r n i z et al., 1995).
1.4.5. Obt e n c i n d e u n a l i pa s a d e pr o pi e d a d e s c a t a l t i c a s r e pr o d u c i bl e s
A l a v i s t a d e l o e xpl i c a d o e n e s t e c a pt u l o , l a s r u t a s pa r a c o n s e gu i r u n a l i pa s a d e
Candida rugosa qu e s e a r e pr o d u c i bl e e n s u a c t i v i d a d c a t a l t i c a s o n e s e n c i a l m e n t e l a s t r e s
s i gu i e n t e s :
1. Trabajar con isoformas puras: s i n e m ba r go , e s t o pr e s e n t a l o s pr o bl e m a s qu e s e ha n
d e s c r i t o a n t e r i o r m e n t e , c o m o s o n l a d i fi c u l t a d d e o bt e n e r e s t a s i s o fo r m a s y l o s ba jo s
r e n d i m i e n t o s qu e s e o r i gi n a n e n e s t e t i po d e pr o c e s o s .
34 Introduccin
2. Expresin en otros microorganismos: o t r a po s i bi l i d a d e s c l o n a r y e xpr e s a r u n o d e l o s
ge n e s qu e c o d i fi c a n l a pr o d u c c i n d e a l gu n a d e l a s i s o fo r m a s d e Candida rugosa e n a l gn
o t r o m i c r o o r ga n i s m o hu s pe d . Si n e m ba r go , Candida rugosa n o u t i l i za e l c d i go ge n t i c o
u n i v e r s a l c o m n a l a m a yo r a d e o r ga n i s m o s (Ka wa gu c hi et al., 1989), c a m bi a n d o e l
c o d n u n i v e r s a l pa r a l e u c i n a , CU G, po r s e r i n a . Co m o c o n s e c u e n c i a , l a e xpr e s i n d e l ge n
s e l e c c i o n a d o e n m i c r o o r ga n i s m o s c o m o Sacharomyces cerevisiae o r i gi n a l i pa s a s i n a c t i v a s
(Fu s s e t i et al, 1996). Es t e pr o bl e m a ha s i d o r e c i e n t e m e n t e s o l u c i o n a d o po r t r e s v a s
d i s t i n t a s pa r a e l ge n Li p 1:
Expresin del gen en un microorganismo que codifique igual que Candida rugosa
c o m o e s Candida maltosa (Mi l e t o et al, 1998).
Mutagnesis del gen natural d e Li pl y e xpr e s i n e n S. cerevisiae (B r o c e a et al.,
1998).
Sntesis qumico-enzimtica del gen y e xpr e s i n d e s t e e n S. cerevisiae y Pichia
Pastoris (B r o c e a et al, 1998).
3. Control preciso de las condiciones de fermentacin: d e m o s t r a d o qu e l a s c o n d i c i o n e s d e
fe r m e n t a c i n a fe c t a n a l a pr o po r c i n d e l o s i s o e n zi m a s o bt e n i d o s (Go r d i l l o et al, 1998) e s
e v i d e n t e qu e m e d i a n t e u n c o n t r o l d e l a s c o n d i c i o n e s d e fe r m e n t a c i n s e o bt i e n e u n
pr o d u c t o r e pe t i t i v o . Si n e m ba r go , e l pr o c e s o d e d o wn s t r e a m y l a s c o n d i c i o n e s d e
a l m a c e n a m i e n t o t a m bi n ha n d e e s t a r pe r fe c t a m e n t e d e fi n i d a s , ya qu e s e ha c o n s t a t a d o
c o n l i pa s a s c o m e r c i a l e s qu e n o s l o a l c a m bi a r d e l o t e , s i n o a l v a r i a r e l t i e m po d e
a l m a c e n a m i e n t o , l a s pr o pi e d a d e s d e l c a t a l i za d o r s o n v a r i a bl e s (Ts a i y Do r d i c k, 1996b).
Introduccin 35_
1.5. U t i l i za c i n d e e n zi m a s e n m e d i o o r gn i c o
1.5.1. In t r o d u c c i n . Ve n t a ja s v d e s v e n t a ja s
El u s o d e l a s e n zi m a s e n m e d i o o r gn i c o ha t e n i d o u n gr a n d e s a r r o l l o e n l o s l t i m o s
a o s d e bi d o a qu e m u c ha s d e l a s r e a c c i o n e s d e i n t e r s s l o pu e d e n l l e v a r s e a c a bo e n e s t e t i po
d e m e d i o s . Si bi e n e s c i e r t o qu e a l gu n a s pr o pi e d a d e s d e l a s e n zi m a s t i e n d e n a m e jo r a r e n e s t e
t i po d e m e d i o s , e n ge n e r a l s e pu e d e po s t u l a r qu e l a a c t i v i d a d e n zi m t i c a e s m e n o r e n
d i s o l v e n t e s o r gn i c o s qu e e n m e d i o a c u o s o .
A m o d o d e r e s u m e n , e n t r e l a s v e n t a ja s d e t r a ba ja r e n m e d i o o r gn i c o s e pu e d e n c i t a r
(Go d t fr e d s e n e a /., 1985; Do r d i c k, 1991; Kv i t t i n ge n , 1994):
- A u m e n t a r l a s o l u bi l i d a d d e s u bs t r a t o s a pe l a r e s .
Fa v o r e c e r l a r e a c c i n d e s n t e s i s fr e n t e a l a hi d r l i s i s d e s pl a za n d o e l e qu i l i br i o
t e r m o d i n m i c o .
- El i m i n a c i n d e l a s r e a c c i o n e s l a t e r a l e s qu e d e pe n d a n d e l a gu a .
A l t e r a c i n e n s u bs t r a t o s y e s pe c i fi c i d a d .
A u s e n c i a d e n e c e s i d a d d e i n m o v i l i za c i n , ya qu e l a s e n zi m a s n o s o n s o l u bl e s e n m e d i o s
o r gn i c o s .
- La s e n zi m a s s o n fc i l m e n t e r e c u pe r a bl e s po r fi l t r a c i n o c e n t r i fu ga c i n ya qu e
c o n s t i t u ye n u n a fa s e d i fe r e n t e d e l m e d i o .
A l t r a t a r s e d e m e d i o s o r gn i c o s , n o r m a l m e n t e l a s e pa r a c i n d e l pr o d u c t o e s m s s i m pl e ,
d e bi d o a qu e l o s pr o d u c t o s t i e n e n ba jo pu n t o d e e bu l l i c i n .
- Me jo r a d e l a t e r m o e s t a bi l i d a d .
- El i m i n a c i n d e c o n t a m i n a c i n m i c r o bi a n a .
- Po t e n c i a l u s o d e l a s e n zi m a s pa r a s e r u t i l i za d a s d i r e c t a m e n t e e n u n n u e v o o ya e xi s t e n t e
pr o c e s o qu m i c o .
- La gr a n v a r i e d a d d e r e a c c i o n e s qu e s o n c a pa c e s d e c a t a l i za r l a s e n zi m a s e n m e d i o s
o r gn i c o s .
_36 Introduccin
- La po s i bi l i d a d d e l a s e n zi m a s d e a c t u a r e n a n t i o s e l e c t i v a m e n t e s o br e s u bs t r a t o s o r gn i c o s
d e n a t u r a l e za qu i r a l .
- La s e n zi m a s t r a ba ja n ha bi t u a l m e n t e e n c o n d i c i o n e s s u a v e s c e r c a n a s a l a s fi s i o l gi c a s .
- La a l t a s e l e c t i v i d a d c o n r e s pe c t o a l s u bs t r a t o .
- La s e n zi m a s pu e d e n s e r o bt e n i d a s po r fe r m e n t a c i n .
De l a m i s m a m a n e r a , s i n e m ba r go , e l e m pl e o d e e n zi m a s e n m e d i o o r gn i c o pr e s e n t a
u n a s e r i e d e i n c o n v e n i e n t e s , e n t r e l o s qu e po d e m o s d e s t a c a r (Go d t fr e d s e n et al., 1985):
- La s e n zi m a s s e i n a c t i v a n fu e r t e m e n t e po r m u c ho s d i s o l v e n t e s o r gn i c o s .
- La s e n zi m a s s e i n a c t i v a n c u a n d o n o t r a ba ja n e n zo n a s c e r c a n a s a l pH pt i m o , y e n
d i s o l v e n t e s o r gn i c o s e s t e fa c t o r e s d i fc i l d e c o n t r o l a r .
- La s e n zi m a s pr e s e n t a n i n hi bi c i n po r m u c ho s d e l o s pr o d u c t o s y s u bs t r a t o s hi d r o fl i c o s
qu e a pa r e zc a n e n l a r e a c c i n .
- La m a yo r a d e d i s o l v e n t e s o r gn i c o s n o s o n a c e pt a bl e s d e s d e e l pu n t o d e v i s t a m e d i o
a m bi e n t a l .
- Co m pl e ji d a d e l e v a d a d e l s i s t e m a d e r e a c c i n .
Mu c ho m e n o r c o n o c i m i e n t o t e r i c o d e l o s m e c a n i s m o s d e r e a c c i n e n m e d i o o r gn i c o , a s
c o m o d e l o s fa c t o r e s qu e a fe c t a n a l d i s e o d e l r e a c t o r y m o d e l i za c i n d e l pr o c e s o .
Co s t e a d i c i o n a l d e l d i s o l v e n t e .
A s pu e s , l a e l e c c i n d e u n pr o c e s o e n zi m t i c o e n u n d i s o l v e n t e o r gn i c o v e n d r
d e t e r m i n a d a a l t e n e r e n c u e n t a t o d a s e s t a s c o n s i d e r a c i o n e s , d e e n t r e l a s c u a l e s l a m s
i m po r t a n t e e s l a a c t i v i d a d qu e pr e s e n t e l a e n zi m a e n e l d i s o l v e n t e u t i l i za d o .
1.5.2. El e c c i n d e l d i s o l v e n t e . In fl u e n c i a d e l a gu a
La a c t i v i d a d c a t a l t i c a d e l a s e n zi m a s e n m e d i o o r gn i c o d e pe n d e e n gr a n m e d i d a d e
qu e e n e s t o s d i s o l v e n t e s m a n t e n ga n l a e s t r u c t u r a pr o t e i c a , qu e v i e n e c o n d i c i o n a d a po r
m u l t i t u d d e pu e n t e s d e hi d r ge n o qu e s e fo r m a n e n t r e l a pr o t e n a e l m e d i o qu e l a r o d e a . De
he c ho , u n a e n zi m a pr e s e n t a r s u a c t i v i d a d pt i m a pa r a u n a c o n fo r m a c i n d e fi n i d a qu e v e n d r
d e t e r m i n a d a po r u n c o n ju n t o d e i n t e r a c c i o n e s d e t i po pu e n t e d e hi d r ge n o , i n i c a s , c o v a l e n t e s
Introduccin 37
e hi d r o fbi c a s (Le hn i n ge r , 1982). Pa r a pr e s e r v a r e s t a c o n fo r m a c i n e s n e c e s a r i a l a pr e s e n c i a
d e l o qu e s e d e n o m i n a u n a c a pa d e hi d r a t a c i n , c u ya pr d i d a s u po n e n o r m a l m e n t e u n fu e r t e
d e s c e n s o e n l a a c t i v i d a d c a t a l t i c a .
La s e n zi m a s n e c e s i t a n e s t a c a pa d e hi d r a t a c i n pa r a r e a l i za r s u a c t i v i d a d c a t a l t i c a , s i n
e m ba r go , d e pe n d e r d e c a d a c a s o l a c a n t i d a d d e a gu a n e c e s a r i a pa r a pr e s e r v a r l a c a pa d e
hi d r a t a c i n y e n e s t e a s pe c t o t e n d r m u c ha i m po r t a n c i a e l t i po d e d i s o l v e n t e u t i l i za d o y s u s
c a r a c t e r s t i c a s .
1.5.3. In m o v i l i za c i n d e e n zi m a s
1.5.3.1. In t r o d u c c i n
La i n m o v i l i za c i n d e u n a e n zi m a o , e n ge n e r a l , d e u n bi o c a t a l i za d o r c o n s i s t e e n s u
l o c a l i za c i n e n u n a r e gi n d e fi n i d a d e e s pa c i o m a n t e n i e n d o a l gu n a a c t i v i d a d c a t a l t i c a
d e s e a d a . En l o s s i s t e m a s d e i n m o v i l i za c i n l a d i fu s i n e s e l m e c a n i s m o pr e d o m i n a n t e pa r a e l
t r a n s po r t e d e m a t e r i a , e s d e c i r , d o n d e l a a gi t a c i n n o ju e ga n i n gn pa pe l e n e l t r a n s po r t e
c o n v e c t i v o .
La s pr i n c i pa l e s v e n t a ja s d e u t i l i za r e n zi m a s i n m o v i l i za d o s s o n :
Se pu e d e n r e u t i l i za r y u t i l i za r d e fo r m a c o n t i n u a .
Pe r m i t e n a u m e n t a r l a c o n c e n t r a c i n d e e n zi m a e n e l m e d i o d e r e a c c i n .
Se fa c i l i t a s u s e pa r a c i n d e l m e d i o d e r e a c c i n .
Se s u e l e pr o d u c i r u n a u m e n t o d e l a e s t a bi l i d a d d e l a e n zi m a .
- To d o s e s t o s fa c t o r e s s u e l e n ge n e r a r u n a u m e n t o d e l a pr o d u c t i v i d a d , l o qu e s u e l e
d e s e m bo c a r e n u n s i s t e m a e c o n m i c a m e n t e r e n t a bl e .
Co m o d e s v e n t a ja s pr i n c i pa l e s s e pu e d e n s e a l a r l a s s i gu i e n t e s :
- Se a a d e u n a n u e v a e t a pa e n l a pr e pa r a c i n d e l a e n zi m a .
38 Introduccin
- La a c t i v i d a d c a t a l t i c a pu e d e qu e d a r a fe c t a d a n e ga t i v a m e n t e .
- Lo s fe n m e n o s d e d i fu s i n pu e d e n l i m i t a r l a v e l o c i d a d d e r e a c c i n .
En r e s u m e n , l a n e c e s i d a d d e i n m o v i l i za r u n a e n zi m a v e n d r c o n d i c i o n a d a po r e l
s i s t e m a d e r e a c c i n qu e s e r e qu i e r a e m pl e a r y s o br e t o d o , d e l t i po d e bi o r e a c t o r qu e s e d e s e e
u t i l i za r . En t r m i n o s ge n e r a l e s , pa r a pr o c e s o s e n ba t c h n o s e r n e c e s a r i a l a i n m o v i l i za c i n , a s
c o m o pa r a pr o c e s o s e n t a n qu e a gi t a d o e n c o n t i n u o , e n l o s qu e l a a gi t a c i n s u e l e t e n e r u n
e fe c t o n e ga t i v o e n l a i n t e gr i d a d d e l a s pa r t c u l a s . Si n e m ba r go , pa r a pr o c e s o s e n c o n t i n u o t i po
fl u jo pi s t n s e r pr c t i c a m e n t e s i e m pr e n e c e s a r i o e l u s o d e a l gn s i s t e m a d e i n m o v i l i za c i n .
En t r e e s t o s l t i m o s d e s t a c a n s i s t e m a s e n l e c ho fi jo , l e c ho fl u i d i za d o o fi br a s hu e c a s
(Za bo r s ky, 1973; B a i l e y y Ol l i s , 1986;Mo s ba c h, 1987).
1.5.3.2. Tc n i c a s d e i n m o v i l i za c i n d e e n zi m a s
Lo s pr i n c i pa l e s pr o t o c o l o s d e i n m o v i l i za c i n s e pu e d e n d i v i d i r e n fu n c i n d e l
m e c a n i s m o e n qu e s e ba s a n , t a l c o m o s e e s qu e m a t i za e n l a Fi g. 1.8.
Adsorcin
Es t a e s l a t c n i c a m s s i m pl e y l a m s c o m n y c o n s i s t e e n po n e r e n c o n t a c t o u n a
d i s o l u c i n d e l a e n zi m a e n s u s c o n d i c i o n e s pt i m a s c o n u n a d s o r be n t e a c t i v o . Tr a s u n c i e r t o
t i e m po , s e l i m pi a l a pa r t c u l a pa r a e l i m i n a r l a e n zi m a n o i n m o v i l i za d a . La s fu e r za s qu e
fa v o r e c e n e s t a i n t e r a c c i n s u e l e n s e r d e t i po i n i c o o hd r o fbi c o y e n ge n e r a l d e c a r c t e r
d bi l .
El pr o bl e m a pr i n c i pa l d e l a i n m o v i l i za c i n po r a d s o r c i n e s l a r e v e r s i bi l i d a d d e l
pr o c e s o , d a d o qu e s e t r a t a d e u n pr o c e s o e n e qu i l i br i o , y qu e e l c a m bi o e n c o n d i c i o n e s c o m o
pH y t e m pe r a t u r a pu e d e n pr o v o c a r e l d e s pl a za m i e n t o d e l a e n zi m a ha c i a l a fa s e s o l u bl e . En
pr o c e s o s d o n d e s e t r a ba je c o n d i s o l v e n t e s o r gn i c o s , e s e l m t o d o m s a c o n s e ja bl e pu e s t o qu e
n o e xi s t e d i c ha r e v e r s i bi l i d a d .
Introduccin
39
A d s o r c i n En l a c e c o v a l e n t e
"Cr o s s l i n ki n g" In c l u s i n
Fi g. I.8.: pr i n c i pa l e s m t o d o s d e i n m o v i l i za c i n d e e n zi m a s .
Es t e m t o d o s e ha a pl i c a d o a m pl i a m e n t e pa r a e n zi m a s d e t o d o t i po y e n c o n c r e t o pa r a
l i pa s a s (Mu r r a y et a /., 1997; Kn e ze v i c et al, 1998), e n pa r t i c u l a r m e d i a n t e e l e m pl e o d e
s o po r t e s qu e fa v o r e c e n l a s i n t e r a c c i o n e s hi d r o fbi c a s (B a s t i d a et al, 1998).
A l gu n o s d e l o s s o po r t e s u t i l i za d o s m s c o m n m e n t e pa r a r e a l i za r e s t e t i po d e
i n m o v i l i za c i n s o n : a l m i n a , c e l u l o s a , a ga r o s a , c o n c a v a l i n a A , s i l i c a ge l , v i d r i o po r o s o ,
r e s i n a s d e i n t e r c a m bi o i n i c o , c e l i t a s y d i v e r s o s t i po s d e po l m e r o s .
40
Introduccin
Enlace covalente
En e s t e c a s o , l a u n i n e n zi m a -s o po r t e s e r e a l i za m e d i a n t e u n e n l a c e d e n a t u r a l e za
c o v a l e n t e . Exi s t e u n a gr a n v a r i e d a d d e m t o d o s e n fu n c i n d e l a n a t u r a l e za d e l s o po r t e y s u
gr u po fu n c i o n a l , e l gr u po fu n c i o n a l d e l a e n zi m a qu e i n t e r a c c i o n a c o n e l s o po r t e , l a a c t i v a c i n
pr e v i a d e l o s s o po r t e s y l o s a ge n t e s e n l a za n t e s u t i l i za d o s (Za bo r s ky, 1973; Mo s ba c h, 1987).
En l a t a bl a 1.7 s e r e c o ge n a l gu n o s d e l o s m t o d o s m s ha bi t u a l e s d e i n m o v i l i za c i n po r
e n l a c e c o v a l e n t e , a s c o m o a l gu n o s d e l o s s o po r t e s m s ha bi t u a l e s qu e s e u t i l i za n .
Gr u po fu n c i o n a l
d e l s o po r t e
Hi d r o xi l o
Ca r bo xi l o
A m i n o
A l d e hi d o
Im i d o s t e r e s
Ti o l
Eje m pl o s d e s o po r t e
De xt r a n o s , c e l u l o s a s
Po l i a c r i l a m i d a s
Ce r m i c a s
m o d i fi c a d a s
A l d e hi d o s
po l i m r i c o s
De r i v a d o s d e n i l n
Po l i s a c r i d o s
m o d i fi c a d o s
A ge n t e a c o pl a d o r
B r o m u r o d e
c i a n ge n o
Ca r bo d i i m i d a s
Gl u t a r a l d e hd o
Ni t r i t o s d i c o
Re a c c i n d i r e c t a
Re a c c i n d i r e c t a
Re a c c i n d i r e c t a
Gr u po r e a c t i v o d e l a
pr o t e n a
A m i n o
A m i n o
A m i n o
A m i n o y o t r o s
A m i n o
Ci s -t i o l
Ta bl a 1.7: A l gu n o s m t o d o s c o m u n e s d e fo r m a c i n d e e n l a c e c o v a l e n t e e n t r e e n zi m a y
s o po r t e .
U n o d e l o s pr o bl e m a s m s i m po r t a n t e s qu e pr e s e n t a e s t e t i po d e pr o t o c o l o e s qu e l a s
pr d i d a s d e a c t i v i d a d s u e l e n s e r m a yo r e s qu e e n e l c a s o d e l a a d s o r c i n , d e bi d o a qu e s e
pr o d u c e n m o d i fi c a c i o n e s qu m i c a s e n a l gn a m i n o c i d o d e l a e n zi m a .
Es t e s i s t e m a d e i n m o v i l i za c i n e s m u y ha bi t u a l pa r a d i s t i n t o s t i po s d e e n zi m a s
i m pl i c a n d o n o r m a l m e n t e pr d i d a s d e a c t i v i d a d pe r o m e jo r a s e n l a e s t a bi l i d a d fr e n t e a fa c t o r e s
c o m o pH y t e m pe r a t u r a (Che l l a pa n d i a n , 1998; Spa gn a et al, 1998), a u n qu e s u a pl i c a c i n e n
l i pa s a s ha s i d o m u c ho m s r e d u c i d a (Mo r e n o et a /., 1997).
Introduccin 41
"Crosslin king"
Me d i a n t e l a fo r m a c i n d e e n l a c e s c r u za d o s e n t r e e n zi m a s , s e fo r m a n a gr e ga d o s
i n s o l u bl e s m e d i a n t e u n a ge n t e m u l t i fu n c i o n a l qu e s e e n l a za c o v a l e n t e m e n t e a l a e n zi m a .
No r m a l m e n t e l o s a ge n t e s u s a d o s s o n l o s m i s m o s qu e pa r a l a i n m o v i l i za c i n po r e n l a c e
c o v a l e n t e . Es t e m t o d o e s d e u s o m s r e s t r i n gi d o y s u e l e t e n e r u n a a pl i c a c i n a n a l t i c a e n e l
d e s a r r o l l o d e bi o s e n s o r e s (Gu e r r i e r i et al, 1998).
Inclusin
Es t e m t o d o s e ba s a e n l a fo r m a c i n d e u n a m a t r i z t r i d i m e n s i o n a l e n pr e s e n c i a d e l
bi o c a t a l i za d o r , qu e qu e d a a t r a pa d o d e n t r o d e s u e s t r u c t u r a . La m a t r i z ha d e pe r m i t i r l a
r e t e n c i n d e l a e n zi m a a l m i s m o t i e m po qu e l a d i fu s i n d e s u bs t r a t o s y pr o d u c t o s y l a s m s
u t i l i za d a s s o n po l m e r o s s i n t t i c o s o ge l e s d e o r i ge n n a t u r a l .
Es t e s i s t e m a ha s i d o a m pl i a m e n t e u t i l i za d o pa r a l a i n m o v i l i za c i n d e c l u l a s , y s u
a pl i c a c i n pa r a e n zi m a s e s ba s t a n t e r e d u c i d a d e bi d o a u n a u m e n t o i m po r t a n t e d e l o s
pr o bl e m a s d e d i fu s i n y qu e l a r e t e n c i n d e l a e n zi m a e s m u y po br e . No o bs t a n t e , s e ha
a pl i c a d o e n l a c o n s t r u c c i n d e e l e c t r o d o s e n zi m t i c o s , po r e je m pl o , gl u c o s a o xi d a s a y
he xo ki n a s a pa r a l a d e t e r m i n a c i n d e A TP (Co m pa gn o n e y Gu i l ba u l t , 1997), a l c o ho l
d e s hi d r o ge n a s a pa r a l a d e t e r m i n a c i n d e e t a n o l (Ca i et al, 1997) o d i a m i n a o xi d a s a pa r a l a
d e t e r m i n a c i n d e d i a m i n a (B o u v r e t t e et al, 1997).
1.5.3.3. Se l e c c i n d e l a t c n i c a d e i n m o v i l i za c i n
En l a t a bl a 1.8 s e r e c o ge n a l gu n a s d e l a s pr i n c i pa l e s c a r a c t e r s t i c a s qu e d e fi n e n l o s
m t o d o s d e i n m o v i l i za c i n e xi s t e n t e s pa r a e n zi m a s , s i n e m ba r go , l a e l e c c i n s i e m pr e v e n d r
m a r c a d a po r l a e n zi m a pa r t i c u l a r y s u s c a r a c t e r s t i c a s pa r t i c u l a r e s e n c a d a c a s o (Za bo r s ky,
1973; Mo s ba c h, 1987).
42 Introduccin
Ca r a c t e r s t i c a
Pr e pa r a c i n
A c t i v i d a d
e n zi m t i c a
Es pe c i fi c i d a d
d e s u bs t r a t o
Fu e r za d e
e n l a c e
Re ge n e r a c i n
A pl i c a bi l i d a d
Co s t e
A d s o r c i n
fs i c a
Fc i l
B a ja
No
m o d i fi c a bl e
Dbi l
Po s i bl e
B a ja
B a jo
En l a c e i n i c o
Fc i l
A l t a
No
m o d i fi c a bl e
Mo d e r a d a
Po s i bl e
Mo d e r a d a
B a jo
En l a c e
c o v a l e n t e
Di fc i l
A l t a
Mo d i fi c a bl e
Fu e r t e
Im po s i bl e
Mo d e r a d a
A l t o
"Cr o s s l i n ki n g"
Di fc i l
Mo d e r a d a
Mo d i fi c a bl e
Fu e r t e
Im po s i bl e
B a ja
Mo d e r a d o
In c l u s i n
Di fc i l
A l t a
No
m o d i fi c a bl e
Fu e r t e
Im po s i bl e
A l t a
B a jo
Tabla 1.8: Co m pa r a c i n e n t r e m t o d o s d e i n m o v i l i za c i n d e e n zi m a s .
Introduccin
1.6. B i o r e a c t o r e s e n zi m t i c o s
1.6.1. Re a c t o r e s i d e a l e s . Di s t r i bu c i n d e t i e m po d e r e s i d e n c i a (DTR)
En e l e s t u d i o d e l o s m o d e l o s d e fl u jo qu e d e s c r i be n e l c o m po r t a m i e n t o d e l o s
r e a c t o r e s , s e ha c e r e fe r e n c i a a d o s m o d e l o s i d e a l e s , e l d e fl u jo pi s t n y e l d e t a n qu e a gi t a d o o
d e m e zc l a pe r fe c t a , qu e r e pr e s e n t a n l o s d o s e xt r e m o s e n e l d i s e o y fu n c i o n a m i e n t o d e u n
r e a c t o r (Le v e n s pi e l , 1979). La v e n t a ja d e u t i l i za r e s t o s s i s t e m a s e s s u s i m pl i c i d a d y e n qu e
u n o d e l o s d o s o r i gi n a n o r m a l m e n t e e l fu n c i o n a m i e n t o pt i m o . No o bs t a n t e , l a m a yo r a d e
r e a c t o r e s r e a l e s t i e n e n u n c o m po r t a m i e n t o i n t e r m e d i o e n t r e e s t o s d o s e xt r e m o s . En l o s
r e a c t o r e s r e a l e s m u c ha s v e c e s a pa r e c e n zo n a s m u e r t a s , c a n a l e s pr e fe r e n c i a l e s , r e t r o m e zc l a y
o t r a s d i s t o r s i o n e s d e l m o d e l o d e fl u jo i d e a l .
En e l c a s o d e l o s r e a c t o r e s r e a l e s , l a d i s t r i bu c i n d e t i e m po d e r e s i d e n c i a (DTR) d e l
m a t e r i a l a t r a v s d e l r e a c t o r e s e l fa c t o r qu e d e t e r m i n a r e n qu e pu n t o e n t r e l o s d o s
c o m po r t a m i e n t o s i d e a l e s s e s i t a e l fl u jo d e u n bi o r e a c t o r . La t c n i c a u t i l i za d a pa r a
d e t e r m i n a r e l m o d e l o d e fl u jo d e u n r e a c t o r e s l a d e n o m i n a d a e s t m u l o -r e s pu e s t a , ba s a d a e n l a
i n ye c c i n d e u n t r a za d o r i n e r t e y s i gu i e n d o l a r e s pu e s t a d e l s i s t e m a a n a l i za n d o l a e v o l u c i n
d e l a c o n c e n t r a c i n d e l t r a za d o r a l a s a l i d a .
La e l e c c i n d e l t r a za d o r e s d e v i t a l i m po r t a n c i a pa r a o bt e n e r u n a i n fo r m a c i n pr e c i s a
a c e r c a d e l c o m po r t a m i e n t o d e l fl u i d o d e n t r o d e l bi o r e a c t o r . Lo s r e qu i s i t o s qu e d e be c u m pl i r
e l t r a za d o r s o n l o s s i gu i e n t e s :
- Mi s c i bl e y d e pr o pi e d a d e s s i m i l a r e s a l a s d e l fl u i d o qu e s e e s t i n v e s t i ga n d o .
- In e r t e , s i n i n t e r a c c i o n a r c o n e l bi o c a t a l i za d o r n i c o n l o s s u bs t r a t o s y pr o d u c t o s d e l a
r e a c c i n .
Fc i l m e n t e a n a l i za bl e , y d e t e c t a bl e e n c o n c e n t r a c i o n e s ba ja s .
- En s i s t e m a s m u l t i fs i c o s (po r e je m pl o , e n zi m a s i n m o v i l i za d o s ), n o ha d e s e r t r a n s po r t a d o
e n t r e fa s e s .
44 Introduccin
La i n t r o d u c c i n d e l t r a za d o r e n e l a l i m e n t o a l r e a c t o r pu e d e s e gu i r d i v e r s a s
e s t r a t e gi a s , s i e n d o l o s m s ha bi t u a l e s l o s d e pu l s o y e s c a l n . En l a t c n i c a d e pu l s o , s e
i n t r o d u c e d e fo r m a i n s t a n t n e a u n a c a n t i d a d M d e l t r a za d o r a l a c o r r i e n t e d e a l i m e n t o qu e
e n t r a e n e l r e a c t o r , y s u c o n c e n t r a c i n d e s a l i d a s e r e gi s t r a a l o l a r go d e l t i e m po . En l a fi g. 1.9
s e pr e s e n t a u n e je m pl o d e e s t a t c n i c a .
En t r a d a
QL
V
C "
Sa l i d a i d e a l
fl u jo pi s t n
t a n qu e a gi t a d o
Fi g. I.9.: Re s pu e s t a d e s i s t e m a s i d e a l e s pa r a u n pu l s o d e t r a za d o r .
A pa r t i r d e l a c u r v a s e pu e d e c a l c u l a r e l t i e m po d e r e s i d e n c i a r e a l d e l r e a c t o r qu e v i e n e d a d o
po r l a e c u a c i n (1):
f 'tCdt
T = *
t'Cdt
JO
( 1 )
y c o m pa r a r l o c o n e l t i e m po d e r e s i d e n c i a i d e a l qu e v e n d r d a d o po r :
T = (2)
OL
V
'
A d e m s , e l c l c u l o d e l a i n t e gr a l d e l a c o n c e n t r a c i n d e t r a za d o r c o n r e s pe c t o a l t i e m po ha d e
r e s u l t a r l a c a n t i d a d t o t a l d e t r a za d o r i n t r o d u c i d a e n e l s i s t e m a , qu e po r o t r o l a d o s e c o n o c e .
Es t e s e r e l t e s t d e c o n s i s t e n c i a d e l e xpe r i m e n t o .
Introduccin
45
Mu c ha s v e c e s l a c u r v a C fr e n t e a t s e r e pr e s e n t a d e fo r m a a d i m e n s i o n a l c o m o u n a
c u r v a d e E v s 9 e n l a qu e E r e pr e s e n t a l a c o n c e n t r a c i n a d i m e n s i o n a l c a l c u l a d a c o m o V-C/M
y d o n d e 0 e s e l t i e m po a d i m e n s i o n a l c a l c u l a d o c o m o t /i .
En e l c a s o d e qu e e l t r a za d o r s e i n t r o d u zc a e n fo r m a d e e s c a l n , c o n u n c a u d a l m , l a
v a r i a c i n d e l a c o n c e n t r a c i n a l a s a l i d a d e l bi o r e a c t o r s e r d e l a fo r m a qu e i n d i c a l a fi g. 1.10.
En t r a d a \,
V
Sa l i d a i d e a l
~ fl u jo pi s t n
t a n qu e a gi t a d o
Fig. 1.10: Re s pu e s t a d e s i s t e m a s i d e a l e s pa r a u n e s c a l n d e t r a za d o r .
En e s t e c a s o , d e l a a pl i c a c i n d e l ba l a n c e d e m a t e r i a pa r a e l s i s t e m a s e d e d u c e e l t e s t
d e c o n s i s t e n c i a , qu e v i e n e d a d o po r l a e c u a c i n (3):
C
max
l=mV/QL
2
(3)
La c u r v a n o r m a l i za d a pa r a l o s e xpe r i m e n t o s e n e s c a l n s e c o n o c e c o m o c u r v a F qu e
s e c a l c u l a c o m o Qi /C/m , m i e n t r a s qu e e l t i e m po d e r e s i d e n c i a r e a l s e c a l c u l a s e gn l a
e c u a c i n (4):
46 Introduccin
f
m m
_!
' ~~ fCme,
f
c
La s fu n c i o n e s E y F e s t n r e l a c i o n a d a s e n t r e s , ya qu e l a pr i m e r a e s l a d e r i v a d a d e l a
s e gu n d a , y l a s e gu n d a l a i n t e gr a l d e l a pr i m e r a . Po r t a n t o , i n d e pe n d i e n t e m e n t e d e c o m o s e
ha ga l a i n t r o d u c c i n d e l t r a za d o r , e l t r a t a m i e n t o po s t e r i o r d e l o s d a t o s pu e d e ha c e r s e d e
a m ba s fo r m a s . U n a v e z o bt e n i d a l a d i s t r i bu c i n d e t i e m po d e r e s i d e n c i a s e pu e d e pa s a r a
e s t u d i a r c u a l e s e l t i po d e fl u jo e n e l r e a c t o r .
1.6.2. Mo d e l o s d e fl u jo
U n a v e z c o n o c i d o s l o s d a t o s d e d i s t r i bu c i n d e t i e m po d e r e s i d e n c i a pa r a u n s i s t e m a
d e t e r m i n a d o , l a s c a r a c t e r s t i c a s d e fl u jo ha n d e s e r e v a l u a d a s c u a n t i t a t i v a m e n t e m e d i a n t e e l
u s o d e a ju s t e d e m o d e l o s m a t e m t i c o s . Lo s m o d e l o s d e fl u jo n o i d e a l pu e d e n d i v i d i r s e e n t r e s
gr u po s :
Modelos de dispersin: c o r r e s po n d i e n t e s a pe qu e a s v a r i a c i o n e s d e l m o d e l o d e fl u jo e n
pi s t n .
- Modelos de recirculacin: c o r r e s po n d i e n t e s a pe qu e a s v a r i a c i o n e s d e l m o d e l o d e
m e zc l a c o m pl e t a .
Modelos compartim en tados: pa r a e l r e s t o d e s i t u a c i o n e s i n t e r m e d i a s .
1.6.2.1. Mo d e l o d e d i s pe r s i n a xi a l
Co n s i s t e e n u n a v a r i a c i n d e l m o d e l o d e fl u jo e n pi s t n i d e a l , e n e l qu e s e c o n s i d e r a
u n pr o c e s o d e d i s pe r s i n a xi a l a l m i s m o t i e m po qu e e l fl u jo c o n v e c t i v o . La i n t r o d u c c i n d e
e s t e t r m i n o o r i gi n a qu e l a c o n c e n t r a c i n a d i m e n s i o n a l e n fu n c i n d e l t i e m po v i e n e d a d a po r
l a e c u a c i n (5):
(5)
d o n d e Pe e s e l n m e r o d e Pe c l e t qu e s e d e fi n e c o m o :
Introduccin 47
'. = (6)
D,
d o n d e :
L e s l a l o n gi t u d d e l r e a c t o r
u e s l a v e l o c i d a d d e l fl u i d o e n e l r e a c t o r
D
z
e s e l c o e fi c i e n t e d e d i s pe r s i n a xi a l .
y e xpr e s a e l gr a d o d e m e zc l a d e l r e a c t o r , e s d e c i r , u n Pe = O s i gn i fi c a u n s i s t e m a d e t a n qu e
a gi t a d o pe r fe c t o , m i e n t r a s qu e Pe = o o i n d i c a u n fl u jo pi s t n i d e a l .
Pa r a v a r i a c i o n e s pe qu e a s d e l fl u jo pi s t n , l a s c u r v a s qu e pr e d i c e e l m o d e l o s o n
s i m t r i c a s , m i e n t r a s qu e pa r a d e s v i a c i o n e s m s c o n s i d e r a bl e s l a fo r m a d e l a c u r v a n o e s
s i m t r i c a , y e s t o o c u r r e pa r a v a l o r e s i n fe r i o r e s d e 100 d e l n m e r o d e Pe c l e t .
1.6.2.2. Mo d e l o t a n qu e s e n s e r i e
El r e a c t o r s e r e pr e s e n t a po r u n a s e r i e d e t a n qu e s pe r fe c t a m e n t e a gi t a d o s y d e l m i s m o
v o l u m e n , c o n e c t a d o s e n s e r i e . El gr a d o d e m e zc l a d e l r e a c t o r gl o ba l v i e n e d a d o po r e l n m e r o
d e t a n qu e s N. A s , c u a n t o m s e l e v a d o e s e l n m e r o d e t a n qu e s , e l r e a c t o r s e a c e r c a m s a u n
fl u jo pi s t n . En e s t e c a s o , a pa r t i r d e l ba l a n c e d e m a t e r i a s e pu e d e d e d u c i r l a e xpr e s i n pa r a l a
c u r v a E qu e s e pr e s e n t a e n l a e c u a c i n (7):
e xp(-W) (7)
(N-)\
Co n e s t a e c u a c i n s e pu e d e ge n e r a r u n a fa m i l i a d e c u r v a s d a n d o d i s t i n t o s v a l o r e s a N.
1.6.2.3. Mo d e l o s c o m pa r t i m e n t a d o s
Lo s m o d e l o s a n t e r i o r e s ba s a d o s e n d e s v i a c i o n e s d e u n m o d e l o i d e a l n o s o n c a pa c e s d e
e xpl i c a r t o d a s l a s d e s v i a c i o n e s r e s pe c t o a l fl u jo i d e a l . Pa r a d e s c r i bi r l o s r e a c t o r e s qu e
pr e s e n t a n r e gi o n e s po c o a gi t a d a s , c a n a l i za c i n o r e c i r c u l a c i n i m po r t a n t e d e fl u i d o e n t r e o t r a s
48 Introduccin
po s i bl e s d i s fu n c i o n e s s e n e c e s i t a n m o d e l o s m u l t i pa r a m t r i c o s , e n l o s c u a l e s e l v o l u m e n d e l
r e a c t o r s e d i v i d e e n t r e s d i fe r e n t e s fr a c c i o n e s :
- r e gi n d e fl u jo pi s t n
- r e gi n d e fl u jo a gi t a d o
- zo n a s m u e r t a s
m i e n t r a s qu e e l fl u jo e n s u i n t e r i o r s e c o m po n e d e :
- fl u jo a c t i v o
- fl u jo d e by-pa s s
fl u jo d e r e c i r c u l a c i n
Co m pa r a n d o l a c u r v a r e a l d e DTR y l a s c u r v a s t e r i c a s pa r a d i fe r e n t e s c o m bi n a c i o n e s
d e c o m pa r t i m e n t o s y fl u jo s , s e pu e d e d e t e r m i n a r qu e m o d e l o s e a ju s t a m e jo r a l r e a c t o r r e a l .
Le v e n s pi e l (1979) r e a l i za u n a d e s c r i pc i n d e t a l l a d a d e a l gu n o s d e l o s m o d e l o s
c o m pa r t i m e n t a d o s t pi c o s qu e d e s c r i be n a l gu n a s s i t u a c i o n e s r e a l e s .
1.6.3. Ti po s d e bi o r e a c t o r e s e n zi m t i c o s
Cu a n d o s e u t i l i za n bi o c a t a l i za d o r e s i n m o v i l i za d o s , e xi s t e n d o s po s i bl e s
c o n fi gu r a c i o n e s d e r e a c t o r d e a c u e r d o c o n l a m o v i l i d a d d e l a s pa r t c u l a s d e c a t a l i za d o r :
pa r t c u l a s e n m o v i m i e n t o o fi ja s . Lo s s i s t e m a s e n qu e l a s pa r t c u l a s n o e s t n fi ja s s o n
bs i c a m e n t e t r e s :
- r e a c t o r d e t a n qu e a gi t a d o
- r e a c t o r d e l e c ho fl u i d i za d o
- r e a c t o r "a i r -l i ft "
m i e n t r a s qu e l o s s i s t e m a s c o n pa r t c u l a s fi ja s s e c o n o c e n c o m o r e a c t o r e s d e l e c ho fi jo (B r i n k
et al, 1988) e i n c l u ye n l o s r e a c t o r e s d e m e m br a n a s .
El r e a c t o r d e tanque agitado e s e l m s s i m pl e d e d i s e o y u n o d e l o s m s u t i l i za d o s ,
a u n qu e s u u s o n o e s r e c o m e n d a bl e pa r a e n zi m a s i n m o v i l i za d a s d e bi d o a l a po c a r e s i s t e n c i a d e
l a s pa r t c u l a s a l e s fu e r zo c o r t a n t e d e l a s pa l a s d e l a gi t a d o r , o e n c a s o s d o n d e e xi s t a i n hi bi c i n
Introduccin 49
po r pr o d u c t o , ya qu e t r a ba ja a l a s c o n d i c i o n e s d e s a l i d a . No o bs t a n t e , e xi s t e n a l gu n o s t r a ba jo s
u t i l i za n d o e n zi m a s l i br e s (Ma r go t etal, 1998).
El r e a c t o r d e lecho fluidizado s e c a r a c t e r i za po r qu e l a s pa r t c u l a s d e l bi o c a t a l i za d o r
s e m a n t i e n e n e n s u s pe n s i n e n e l r e a c t o r m e d i a n t e e l c a u d a l d e a l i m e n t a c i n , l a r e c i r c u l a c i n
d e l l qu i d o o e l ga s pr o d u c i d o y/o a po r t a d o a l s i s t e m a . En e s t e c a s o s e n e c e s i t a n pa r t c u l a s d e
t a m a o pe qu e o y d e d e n s i d a d c e r c a n a a l a d e l m e d i o pa r a fa v o r e c e r l a fl u i d i za c i n , c o n l o
qu e s e fa v o r e c e l a t r a n s fe r e n c i a d e m a t e r i a e n t r e e l m e d i o y e l bi o c a t a l i za d o r . Si n e m ba r go , s u
pr i n c i pa l d e s v e n t a ja e s e l m a n t e n i m i e n t o d e l a fl u i d i za c i n qu e d e pe n d e fu e r t e m e n t e d e l a
d e n s i d a d d e l a s pa r t c u l a s . Es t e s i s t e m a e s po c o e m pl e a d o e n e n zi m a s a u n qu e e xi s t e a l gu n a
a pl i c a c i n c o n l i pa s a s (Fi s hm a n y Zv i e l y, 1998).
U n c a s o pa r t i c u l a r d e r e a c t o r fl u i d i za d o e s e l d e l a s columnas de burbujeo e n qu e l a s
pa r t c u l a s d e bi o c a t a l i za d o r e s t n d i s pe r s a s e n l a fa s e fl u i d a po r e fe c t o d e l a a s c e n s i n d e l a s
bu r bu ja s d e u n ga s , o po r e fe c t o c o n ju n t o d e l fl u jo d e ga s y l qu i d o .
En e l r e a c t o r air-Iift s e d i s t i n gu e n d o s zo n a s d i fe r e n c i a d a s , d e l a s c u a l e s s l o u n a e s
a l i m e n t a d a c o n u n ga s . La d i fe r e n c i a d e c o m po s i c i n e n l a zo n a a i r e a d a y l a n o a i r e a d a
pr o v o c a u n a d i fe r e n c i a d e d e n s i d a d qu e pr o v o c a l a c i r c u l a c i n d e l fl u i d o . De n u e v o , l a
v e n t a ja d e e s t e t i po d e r e a c t o r e s s o n l o s e l e v a d o s c o e fi c i e n t e s d e t r a n s fe r e n c i a c o n s e gu i d o s .
Exi s t e n a l gu n o s e je m pl o s d e e s t e t i po d e r e a c t o r c o m o s o n l a pr o d u c c i n d e c i d o gl u c n i c o
c o n gl u c o s a o xi d a s a (Na ka o etal., 1997).
El s i s t e m a m s u t i l i za d o pa r a e n zi m a s e s e l r e a c t o r d e lecho fijo. Es t e e s e l m o d e l o d e
bi o r e a c t o r m s l i ga d o a l u s o d e e n zi m a s i n m o v i l i za d o s . Es t e e s e l m o d e l o m s s i m pl e d e
c o n s t r u c c i n y o pe r a c i n e n e l qu e l a s o l u c i n d e s u bs t r a t o qu e s e a l i m e n t a a l r e a c t o r c i r c u l a
e n u n a d i r e c c i n d e t e r m i n a d a y s i m u l t n e a m e n t e v a t e n i e n d o l u ga r s u c o n v e r s i n , po r t a n t o ,
s e r a d e c u a d o e n e l c a s o d e i n hi bi c i n po r pr o d u c t o pe r o n o e n c a s o s d e i n hi bi c i n po r
s u bs t r a t o . El m o d e l o qu e s i gu e e s t e r e a c t o r e n e l c a s o i d e a l e s e l d e fl u jo pi s t n . La l i m i t a c i n
m s i m po r t a n t e d e e s t e t i po d e r e a c t o r e s l a pr d i d a d e c a r ga qu e s e pr o d u c e po r e l pa s o d e l
fl u i d o a t r a v s d e l l e c ho , a s c o m o l a d i fu s i n e n e l i n t e r i o r d e l a s pa r t c u l a s . Es t o s d o s
fa c t o r e s s e r n l o s qu e d e t e r m i n e n e l t a m a o d e l a pa r t c u l a s e l e c c i o n a d o , ya qu e pa r t c u l a s
50 Introduccin
m u y gr a n d e s pr o v o c a n po c a pr d i d a d e c a r ga pe r o t i e n e n l i m i t a c i o n e s d i fu s i o n a l e s
i m po r t a n t e s m i e n t r a s qu e c o n e l u s o d e pa r t c u l a s pe qu e a s s e fa v o r e c e l a d i fu s i n i n t e r n a
pe r o a u m e n t a n l o s pr o bl e m a s d e pr d i d a d e c a r ga a t r a v s d e l l e c ho .
Es t e s i s t e m a e s t a m pl i a m e n t e u t i l i za d o pa r a t o d o t i po d e e n zi m a s , n o r m a l m e n t e e n e l
c a s o d e m e d i o s o r gn i c o s c o n e n zi m a s i n m o v i l i za d o s e n d i s t i n t o s t i po s d e s o po r t e s , c o m o
a c i l a s a s (B i a n c hi et al, 1997), e n zi m a s pe c t o l t i c a s (Di n e l l a et al., 1997), a m i l a s a s (A r i c a et
al, 1998), d e s t a c a n d o s u a pl i c a c i n e n s i s t e m a s d e d e t e r m i n a c i n a n a l t i c a t i po FIA (Fl o w
In je c t i o n A n a l ys i s ) (Ki ba et al, 1997).
U n c a s o pa r t i c u l a r m u y u t i l i za d o e n r e a c t o r e s e n zi m t i c o s s o n l o s r e a c t o r e s c o n
m e m br a n a s , c u ya c o n fi gu r a c i n m s ha bi t u a l e s l a c o n o c i d a c o m o fi br a s hu e c a s (ho l l o w
fi be r s ). Es t o s r e a c t o r e s o pe r a n c o m o fl u jo s e n pi s t n e n l o s c u a l e s l a e n zi m a e s t i n m o v i l i za d a
e n e l e s pa c i o l i br e e n t r e l a s fi br a s , e l s u bs t r a t o d i fu n d e a t r a v s d e l a m e m br a n a , r e a c c i o n a c o n
l a e n zi m a y e l pr o d u c t o s e d e v u e l v e po r d i fu s i n a l a zo n a d e s u s pe n s i n ho m o gn e a (Fi g.
1.11).
A l i m e n t o *
En zi m a
In m o v i l i za d o
Su bs t r a t o
Pr o d u c t o
Pr o d u c t o
Fi g. 1.11.: Es qu e m a d e u n r e a c t o r d e fi br a s hu e c a s .
Es t e s i s t e m a e s t m u y i m pl e m e n t a d o e n t o d o t i po d e e n zi m a s c o m o a m i l a s a s (Lo pe z-
U l i ba r r i y Ha l l , 1997), a u n qu e ha s i d o e m pl e a d o c o n xi t o ju n t o a r e a c t o r e s d e m e m br a n a e n
ge n e r a l fu n d a m e n t a l m e n t e u t i l i za n d o l i pa s a s d e bi d o a l a c a pa c i d a d d e s t a s d e i n m o v i l i za r s e
e n s u pe r fi c i e s (Pr a ze r e s et al, 1993; Ma t s u m a e et al, 1994).
Introduccin
51
1.6.4. Pr o c e s o s i n d u s t r a l e s e n zi m t i c o s
Go d fr e y y We s t (1996) r e c o ge n a qu e l l o s pr o c e s o s d o n d e l a s e n zi m a s s e e m pl e a n e n
pr o c e s o s a e s c a l a i n d u s t r i a l . En l a t a bl a 1.9 s e r e c o ge n a l gu n o s d e e s t o s pr o c e s o s .
Pr o c e s o
Fe r m e n t a c i n
a l c o hl i c a
En zi m a s a n a l t i c o s
(bi o s e n s o r e s )
En zi m a s a n a l t i c o s
(d i a gn o s i s )
Pr o d u c c i n d e pa s t a
Pr o d u c c i n d e c e r v e za
Pr o d u c c i n d e qu e s o
Pr o d u c c i n d e fr u c t o s a
Mo d i fi c a c i n d e a c e i t e s
y gr a s a s
Pr o d u c c i n d e
a s pa r t a m o
Pr o d u c c i n d e e s t e r e s
qu e d a n s a bo r e s
Pr o d u c c i n d e
e m u l s i fi c a n t e s
Pr o d u c t o s
fa r m a c u t i c o s
De t e r ge n t e s
Tr a t a m i e n t o d e r e s i d u o s
Pr o d u c c i n d e zu m o s
Pr o d u c c i n d e
a m i n o c i d o s
Pr o d u c c i n d e
bl o qu e a n t e s qu i r a l e s
Pr o d u c c i n d e pi e l e s
Ext r a c c i n d e a c e i t e
En zi m a (s )
a -a m i l a s a
gl u c o a m i l a s a
Va r i o s
Va r i o s
A m i l a s a s
Ca r bo hi d r a s a s
Pr o t e i n a s a s y l i pa s a s
Pr o t e a s a s
a -a m i l a s a
Li pa s a s
Li s o zi m a
Xi l o s a i s o m e r a s a
Li pa s a s
Te r m o l i s i n a
Li pa s a s
Li pa s a s
Li pa s a s
Pr o t e a s a s
A c i l a s a s
A m i n o t r a n s fe r a s a s
Pr o t e a s a s
Li pa s a s
A m i l a s a s
Ce l u l a s a s
Va r i o s
Va r i o s
A c i l a s a s
Li pa s a s
Pr o t e a s a s
Fo s fo l i pa s a s
In m o v i l i za c i n
En zi m a l i br e
In c l u s i n
Cr o s s l i n ki n g
En zi m a l i br e
En zi m a l i br e
En zi m a l i br e
En zi m a l i br e
En zi m a l i br e
A d s o r c i n
En zi m a l i br e
A d s o r c i n
En zi m a l i br e
A d s o r c i n
En l a c e c o v a l e n t e
Cr o s s l i n ki n g
En zi m a l i br e
En zi m a l i br e
En zi m a l i br e
En zi m a l i br e
In c l u s i n
En zi m a l i br e
En zi m a l i br e
B i o r e a c t o r u t i l i za d o
t a n qu e a gi t a d o
-
-
t a n qu e a gi t a d o
t a n qu e a gi t a d o
-
t a n qu e a gi t a d o
l e c ho fi jo
t a n qu e a gi t a d o
t a n qu e a gi t a d o
l e c ho fl u i d i za d o
l e c ho fi jo
t a n qu e a gi t a d o
t a n qu e a gi t a d o
l e c ho fi jo
t a n qu e a gi t a d o
t a n qu e a gi t a d o
r e a c t o r d e m e m br a n a
r e a c t o r d e m e m br a n a
-
t a n qu e a gi t a d o
52 Introduccin
Pr o d u c c i n d e pa pe l
Hi d r l i s i s d e a l m i d n
In d u s t r i a t e xt i l
Pr o d u c c i n d e v i n o
En r i qu e c e r a l i m e n t o
d e a n i m a l e s
Ce l u l a s a s
A m i l a s a s
A m i l a s a s
Pe c t i n a s a s
Va r i o s
En zi m a l i br e
En zi m a l i br e
En zi m a l i br e
En zi m a l i br e
En zi m a l i br e
t a n qu e a gi t a d o
t a n qu e a gi t a d o
-
-
-
Tabla 1.9.: A l gu n o s pr o c e s o s e n zi m t i c o s i n d u s t r i a l e s .
Introduccin 53
1.7. U t i l i za c i n d e l i pa s a s
1.7.1. In m o v i l i za c i n d e l pa s a s
La s l i pa s a s s e ha n i n m o v i l i za d o a l o l a r go d e l o s l t i m o s a o s e n u n gr a n n m e r o d e
s o po r t e s y u t i l i za n d o u n gr a n n m e r o d e m t o d o s . En t r e e l l o s , s e ha n d e s a r r o l l a d o m t o d o s d e
a d s o r c i n , i n c l u s i n , e n l a c e c o v a l e n t e u t i l i za n d o pr c t i c a m e n t e t o d o t i po d e s o po r t e s ,
hi d r o fl i c o s , hi d r o fbi c o s d e t o d o t i po d e pr o c e d e n c i a . En l a t a bl a 1.10 s e r e c o ge n a m o d o d e
r e s u m e n a l gu n a s d e l a s a pl i c a c i o n e s m s r e pr e s e n t a t i v a s e n l a s qu e s e ha n e m pl e a d o l i pa s a s
i n m o v i l i za d a s , r e c o gi n d o s e t a m bi n l a t c n i c a e m pl e a d a d e i n m o v i l i za c i n y e l s o po r t e
u t i l i za d o .
La m a yo r a d e l o s t r a ba jo s u t i l i za n l a t c n i c a d e a d s o r c i n s o br e d i s t i n t o s s o po r t e s ,
a u n qu e t a m bi n s e e n c u e n t r a n pr e s e n t e n l o s m t o d o s d e e n l a c e c o v a l e n t e y e n m e n o r m e d i d a
l o s d e i n c l u s i n y c r o s s l i n ki n g. El gr a n d e s a r r o l l o d e l a s l i pa s a s c o m o bi o c a t a l i za d o r e s
e n a n t i o s e l e c t i v o s a s c o m o s u bu e n c o m po r t a m i e n t o e n m e d i o s o r gn i c o s (Ca m bo u y
Kl i ba n o v , 1984) o r i gi n a n qu e l a i n m o v i l i za c i n s e a u n fa c t o r a t e n e r e n c u e n t a e n c u a l qu i e r
r e a c c i n qu e i m pl i qu e e l u s o d e l i pa s a s . Si n e m ba r go , l a po t e n c i a l i d a d fu n d a m e n t a l d e l a
i n m o v i l i za c i n qu e e s l a po s i bl e r e u t i l i za c i n d e l a e n zi m a r a r a v e z e s e s t u d i a d a (Vzqu e z-
Li m a et al, 1995).
Co m o fa c t o r e s i m po r t a n t e s qu e pu e d e n d e s t a c a r s e e n l a i n m o v i l i za c i n c a be d e s t a c a r
l o s s i gu i e n t e s (Ta bl a 1.10):
- El m t o d o u s a d o po r e xc e l e n c i a e s e l d e adsorcin s o br e s o po r t e s d e n a t u r a l e za m u y
d i v e r s a , s i e n d o po s i bl e s l o s s o po r t e s hi d r o fbi c o s y hi d r o fl i c o s .
- La t c n i c a d e i n m o v i l i za c i n po r a d s o r c i n qu e e s n o r m a l m e n t e m u y s e n c i l l a i m pl i c a
po n e r e n c o n t a c t o u n a s o l u c i n d e l a l i pa s a qu e s e qu i e r e i n m o v i l i za r c o n e l s o po r t e y
d e ja r u n t i e m po d e c o n t a c t o (qu e s u e l e v a r i a r e n t r e 1 y 24 ho r a s ) e n l a s c o n d i c i o n e s
a d e c u a d a s (s u e l e n s e r l i ge r a a gi t a c i n y ba ja t e m pe r a t u r a a u n pH c e r c a n o a l pt i m o ) ha s t a
a l c a n za r e l e qu i l i br i o d e a d s o r c i n qu e s u e l e v e n i r d e s c r i t o po r u n a l e y d e t i po La n gm u i r
(Gi t l e n s e n et a /., 1997). Tr a s e s t o s e s e pa r a e l m e d i o po r fi l t r a c i n o l i o fl i za c i n . En e l
54
Introduccin
pr i m e r c a s o s e s u e l e l a v a r e l s o po r t e c o n a gu a d e s t i l a d a o t a m pn m i e n t r a s qu e e n e l
s e gu n d o c a s o s e pr o d u c e u n a d e po s i c i n d e l a l i pa s a s o br e e l s o po r t e .
- Lo s m t o d o s d e i n m o v i l i za c i n po r e n l a c e c o v a l e n t e s o n po s i bl e s pe r o s e e m pl e a n e n
m e n o r m e d i d a , a s c o m o l o s d e i n c l u s i n o "c r o s s l i n ki n g". Es t o s m t o d o s i n c l u ye n u n
pr e t r a t a m i e n t o d e l s o po r t e y s u e l e n pr o v o c a r pr d i d a s o c a m bi o s i m po r t a n t e s e n l a
a c t i v i d a d e n zi m t i c a .
- La i n m o v i l i za c i n d e l i pa s a s s u e l e s u po n e r u n a m e jo r a e n l a estabilidad d e l a e n zi m a ,
a u n qu e t a m bi n pu e d e c a m bi a r pr o pi e d a d e s c o m o l o s pt i m o s d e t e m pe r a t u r a y pH y e n
a l gu n o s c a s o s pa r e c e t e n e r i n fl u e n c i a s o br e l a e n a n t i o s e l e c t i v i d a d .
- A u n qu e e n l a m a yo r a d e t r a ba jo s n o s e ha e s t u d i a d o e l e fe c t o d e l a reutilizacin d e
l i pa s a s i n m o v i l i za d a s , e n ge n e r a l , s e pu e d e c o n c l u i r qu e l a s l i pa s a s pu e d e n r e u t i l i za r s e s i n
t r a t a m i e n t o s m u y c o m pl e jo s , n o r m a l m e n t e t a n s i m pl e s c o m o u n a o pe r a c i n d e l a v a d o y
s e c a d o .
- La s l i pa s a s i n m o v i l i za d a s c o n d i s t i n t o s m t o d o s pu e d e n s e r u t i l i za d a s e n u n a gr a n
v a r i e d a d d e reacciones, t a n t o d e hi d r l i s i s c o m o d e s n t e s i s , a s c o m o e n t o d o t i po d e
m e d i o s , a c u o s o s , o r gn i c o s o bi fs i c o s .
- La s t c n i c a s d e i n m o v i l i za c i n s e ha n a pl i c a d o a l i pa s a s pr o v e n i e n t e s d e u n a gr a n
v a r i e d a d d e microorganismos, e i n c l u s o a l i pa s a s o bt e n i d a s a pa r t i r d e m a m fe r o s .
En t r e t o d a s l a s l i pa s a s e s t u d i a d a s qu e s e ha n i n m o v i l i za d o , d e s t a c a n po r n m e r o d e
a pl i c a c i o n e s l a s s i gu i e n t e s :
a ) Candida rugosa: s e c o m pr a d e fo r m a l i br e y s e i n m o v i l i za e n d i s t i n t o s s o po r t e s .
b) Mucor miehei: e n c o n c r e t o Li po zym e d i s t r i bu i d o po r No v o No r d i s k, qu e e s u n a l i pa s a
ya i n m o v i l i za d a e n Du o l i t e A 568.
c ) Candida antrctica: l i pa s a B c o m e r c i a l i za d a po r No v o No r d i s k c o n e l n o m br e d e
No v o zym e 435, qu e ya v i e n e i n m o v i l i za d a e n u n a r e s i n a a c r l i c a .
d ) Ot r a s l i pa s a s qu e s e u s a n i n m o v i l i za d a s e n m e n o r pr o po r c i n : Pseudomonas sp. (Fi s hm a n
y Zv i e l y, 1998), Rhizopus niveus (De Ca s t r o y Ga go , 1998) y Penicillium roquefortii
(Fu r e bye /a /., 1997).
Introduccin 55
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58 Introduccin
1.7.2. Ci n t i c a s e n zi m t c a s pa r a l i pa s a s
En ge n e r a l , l a s c i n t i c a s d e s c r i t a s pa r a l i pa s a s s o n m u y v a r i a d a s y d e pe n d e r n
bs i c a m e n t e d e t r e s fa c t o r e s :
- d e l t i po d e r e a c c i n qu e s e e s t e s t u d i a n d o .
d e l m e d i o d e r e a c c i n : a c u o s o , o r gn i c o o bi fs i c o .
- d e s i l a l i pa s a s e e n c u e n t r a i n m o v i l i za d a o n o .
El m e c a n i s m o n a t u r a l d e l a s l i pa s a s c u a n d o t r a ba ja n e n fo r m a s o l u bl e hi d r o l i za n d o
s u bs t r a t o s i n s o l u bl e s (a c t i v i d a d l i po l t i c a ) n o s e c o r r e s po n d e ha bi t u a l m e n t e c o n u n a c i n t i c a
d e t i po Mi c ha e l i s -Me n t e n (Ve r ge r et al, 1990), d e bi d o a qu e e l m e c a n i s m o d e r e a c c i n
n o r m a l m e n t e i n c l u ye u n a pr i m e r a e t a pa d e a d s o r c i n s o br e l a s u pe r fi c i e d e l s u bs t r a t o , e t a pa
qu e m u c ha s v e c e s pu e d e s e r l i m i t a n t e (Ma r a n go n i , 1994) y qu e n o r m a l m e n t e e s l a qu e s e
i n t e n t a m e jo r a r po r d i s t i n t o s m t o d o s (Ki m et al., 1984; Ki m y Chu n g, 1989). Ot r o fa c t o r qu e
t e n d r n qu e t e n e r e n c u e n t a l o s m o d e l o s c i n t i c o s d e t a l l a d o s e s l a c o n o c i d a a c t i v a c i n
i n t e r fa c i a l qu e s e pr o d u c e e n l a s l i pa s a s a l e n c o n t r a r u n a i n t e r fa s e o r gm c o -a c u o s a y qu e s e ha
d e s c r i t o c o m o a l t a m e n t e v a r i a bl e e n fu n c i n d e l m i c r o o r ga n i s m o y d e l s u bs t r a t o (Ja e ge r et al.,
1994;Ma r t i n e l l e e a /., 1995).
Si n e m ba r go , c u a n d o l o s e s t e r e s qu e s e hi d r o l i za n s o n s o l u bl e s (a c t i v i d a d e s t e r s i c a )
n o e xi s t e d i c ha i n t e r fa s e y l a s l i pa s a s s u e l e n s e gu i r c i n t i c a s d e t i po Mi c ha e l i s -Me n t e n
(Re d o n d o ^ al, 1995).
No o bs t a n t e , ha y qu e s e a l a r qu e e n m u c ha s o c a s i o n e s , a u n qu e n o s e s i ga u n a c i n t i c a
s i m pl e , s e a d o pt a e l u s o d e ps e u d o c i n t i c a s d e t i po s e n c i l l o c o m o pr i m e r o r d e n o l a pr o pi a d e
Mi c ha e l i s -Me n t e n c o m o s i m pl i fi c a c i n d e c i n t i c a s m u c ho m s c o m pl e ja s , o r i gi n n d o s e e n
e s t e c a s o l o qu e s e c o n o c e n c o r n o c o n s t a n t e s a pa r e n t e s (Ga r go u r i et al., 1991; A r r o yo et al.,
1996).
Cu a n d o s e t r a ba ja c o n l i pa s a s i n m o v i l i za d a s , l a s d i fe r e n c i a s qu e pu e d e n a pa r e c e r c o n
r e s pe c t o a l a e n zi m a l i br e s o n m u y i m po r t a n t e s , o bt e n i n d o s e c o n s t a n t e s c i n t i c a s qu e pu e d e n
Introduccin 59
d i fe r i r e n r d e n e s d e m a gn i t u d pa r a e n zi m a s l i br e s e i n m o v i l i za d o s s o br e d i fe r e n t e s s o po r t e s o
m e d i a n t e d i s t i n t a s t c n i c a s . Po r e je m pl o , Sn c he z et al. (1996) o bt i e n e n pa r a Candida rugosa
c a m bi o s d e ha s t a 20 v e c e s e n l a s c o n s t a n t e s c i n t i c a s c u a n d o s e i n m o v i l i z c o v a l e n t e m e n t e l a
e n zi m a e n s i l i c a y a ga r o s a , a u n qu e e s t o s c a m bi o s e r a n n o t a bl e m e n t e d i fe r e n t e s e n e l c a s o d e
qu e s e t r a t a r a d e a c t i v i d a d e s t e r s i c a o l i po l t i c a . A l m i s m o t i e m po , c u a n d o l a s l i pa s a s
i n m o v i l i za d a s s e u t i l i za r o n pa r a l l e v a r a c a bo r e a c c i o n e s qu i r a l e s , l a s v e l o c i d a d e s d e r e a c c i n
pa r a c a d a e n a n t i m e r o e r a n d i s t i n t a s .
Ot r o s a u t o r e s , s i n e m ba r go , ha n e n c o n t r a d o d i fe r e n t e s r e s u l t a d o s pa r a o t r o s t i po s d e
l i pa s a s . Li e be r m a n y Ol l i s (1975) u t i l i za n d o m t o d o s d e i n m o v i l i za c i n t i po "c r o s s l i n ki n g"
c o n l i pa s a pa n c r e t i c a s e a l a n l a o bt e n c i n d e l o s m i s m o s pa r m e t r o s c i n t i c o s pa r a l a e n zi m a
l i br e e i n m o v i l i za d a . Pe n c r e a c 'h y B a r a t t i (1997) c o n l i pa s a s d e Pseudomonas cepacia
o bs e r v a n qu e l a e n zi m a l i br e o i n m o v i l i za d a s o br e po l i pr o pi l e n o po r o s o o be d e c a a c i n t i c a d e
Mi c ha e l i s -Me n t e n pe r o c o n c o n s t a n t e s v a r i a bl e s s e gn e l t i po d e s u bs t r a t o c o n r e s pe c t o a l a
l i pa s a l i br e .
Po r l o qu e s e r e fi e r e a l i pa s a s l i br e s e i n m o v i l i za d a s t r a ba ja n d o e n m e d i o o r gn i c o ,
r e c i e n t e m e n t e s e ha n pu bl i c a d o d i v e r s o s t r a ba jo s pr o po n i e n d o d i s t i n t a s c i n t i c a s a s o c i a d a s a
d i v e r s o s m e c a n i s m o s d e r e a c c i n , a d e m s d e l a s c l s i c a s ps e u d o c i n t i c a s d e s c r i t a s pa r a
m e d i o s a c u o s o s . En t r e e l l a s d e s t a c a n :
1) B o t t a et al. (1997): r e a l i za n u n a a pr o xi m a c i n a l a c i n t i c a m e d i a n t e e l e s t u d i o
t r i d i m e n s i o n a l d e l a s m o l c u l a s qu e pa r t i c i pa n e n l a r e a c c i n . Me d i a n t e l a s e s t r u c t u r a s d e l
c e n t r o a c t i v o d e t e r m i n a d a s e xpe r i m e n t a l m e n t e , s e d e d u c e n l a a fi n i d a d d e l a l i pa s a d e
Candida rugosa ha c i a c i e r t o s s u bs t r a t o s . Lo s a u t o r e s s u gi e r e n u n a v a d e s i m u l a c i n pa r a
r e a l i za r e s t o s c l c u l o s .
2) Ot r a a pr o xi m a c i n pa r a e xpl i c a r v a l o r e s c i n t i c o s e s l a d e s a r r o l l a d a po r Pa r v e et al.
(1997) d o n d e s e i n t e r pr e t a n l o s d a t o s d e v e l o c i d a d i n i c i a l a pa r t i r d e l a t e o r a d e
l o c a l i za t i o n d e o r bi t a l e s .
3) En m u c ho s c a s o s , d o n d e a pa r e c e n e s t e r i fc a t i o n e s e n l a s qu e s e pr o d u c e a gu a , s e
c o r r e l a c i o n a l a c i n t i c a c o n e l c o m po r t a m i e n t o qu e t i e n e e l a gu a e n e l s i s t e m a y s e s e a l a
60
Introduccin
l a a c t i v i d a d d e a gu a c o m o u n fa c t o r d e t e r m i n a n t e e n l a fo r m u l a c i n y c l c u l o d e l a
c i n t i c a (Selmiet al., 1997).
4) Che n y Wa n g (1997b): pr o po n e n u n a c i n t i c a d e t i po Pi n g-Po n g B i B i ba s a d a e n e l
m e c a n i s m o pr o pu e s t o po r Chu l a l a ks a n a n u ku l et al. (1990). U n e s qu e m a d e u n a s n t e s i s d e
u n a a l c o ho l c o n u n c i d o gr a s o pa r a ge n e r a r s t e r y a gu a s e d e t a l l a e n l a Fi g. 1.12.
-r
e
Fig. 1.12: Es qu e m a d e l m e c a n i s m o d e u n a r e a c c i n d e e s t e r i fc a c i n s e gn e l m o d e l o Pi n g-
Po n g B i B i d e s c r i t o po r Che n y Wa n g (1997b). E: e n zi m a . S: c i d o gr a s o , W: a gu a , C:
a l c o ho l , P: s t e r , EC: c o m pl e jo e n zi m a -a l c o ho l , ES: c o m pl e jo e n zi m a -c i d o gr a s o , E*S:
c o m pl e jo a c i l -e n zi m a , E*SC: c o m pl e jo i n t e r m e d i a r i o .
5) Po r l t i m o , s e a l a r qu e e n t r a ba jo s r e c i e n t e s s e ha l l e ga d o a d i fe r e n c i a r d i s t i n t o s
c o m po r t a m i e n t o s c i n t i c o s pa r a i s o e n zi m a s A y B pu r o s d e l i pa s a d e Candida rugosa
(Pl o u et al., 1997). En e l t r a ba jo s e c o n s t a t a c o m o pa r a d i s t i n t o s s u bs t r a t o s l a s c i n t i c a s
po d a n s e r d i fe r e n t e s pa r a a m bo s i s o e n zi m a s . A m o d o d e r e s u m e n :
- Actividad lipsica (t r i bu t i r i n a ): e l v a l o r d e l a c o n s t a n t e e s pe c fi c a a pa r e n t e d e Mi c ha e l i s -
Me n t e n e s e l d o bl e pa r a l a l i pa s a A .
- Actividad estersica (p-n i t r o fe n i l a c e t a t o ): c o m po r t a m i e n t o c i n t i c o m u y s i m i l a r pa r a
a m ba s i s o e n zi m a s . Se s i gu e u n a c i n t i c a d e t i po Mi c ha e l i s -Me n t e n .
- Enantioselectividad (2-c l o r o -m e t i l -pr o pi o n a t o ): n i n gu n a d e l a s i s o e n zi m a s s i gu e u n a
c i n t i c a d e Mi c ha e l i s -Me n t e n s i n o d e t i po s i gm o i d a l . A l m i s m o t i e m po , s e o bs e r v a n
l i ge r a s d i fe r e n c i a s e n l a e n a n t i o s e l e c t i v i d a d .
Introduccin 61
1.7.3. B i o r e a c t o r e s c o n l i pa s a s
En ge n e r a l , s e pu e d e c o n s i d e r a r qu e e l s i s t e m a m s e c o n m i c a m e n t e fa v o r a bl e pa r a
t r a ba ja r c o n l i pa s a s e n u n bi o r e a c t o r e s e l d e u t i l i za r l a s i n m o v i l i za d a s . Es t o e s d e bi d o
n o r m a l m e n t e a l a u m e n t o d e e s t a bi l i d a d qu e n o r m a l m e n t e l l e v a a s o c i a d o e l pr o c e s o d e
i n m o v i l i za c i n y qu e e n s i s t e m a s e n c o n t i n u o e s e l fa c t o r d e t e r m i n a n t e d e l a v i a bi l i d a d d e l
pr o c e s o .
Lo s c i n c o t i po s d e bi o r e a c t o r e s qu e m s c o m n m e n t e s e ha n e m pl e a d o c o n l i pa s a s
i n m o v i l i za d a s s o n :
- r e a c t o r d i s c o n t i n u o d e t a n qu e a gi t a d o
r e a c t o r d e l e c ho fi jo o e m pa c a d o
- r e a c t o r c o n t i n u o d e t a n qu e a gi t a d o
- r e a c t o r d e l e c ho fl u i d i za d o
- r e a c t o r d e m e m br a n a
En e l t r a ba jo d e B a l c a o etal. (1996b) s e r e c o ge n c o n d e t a l l e m u c ho s d e l o s t r a ba jo s e n
l o s qu e s e ha n d e s a r r o l l a d o r e a c t o r e s c o n l i pa s a s i n m o v i l i za d a s .
Lo s r e a c t o r e s discontinuos de tanque agitado s o n l o s m s u t i l i za d o s ,
c a r a c t e r i zn d o s e po r u n s i s t e m a d e o pe r a c i n s e n c i l l o a s c o m o u n a r e c u pe r a c i n s i m pl e po r
fi l t r a c i n o c e n t r i fu ga c i n d e l a e n zi m a . Si n e m ba r go , e l pr o bl e m a d e o pe r a r e n d i s c o n t i n u o
ge n e r a l a a pa r i c i n d e t i e m po s d e c a r ga y d e s c a r ga qu e l i m i t a n e n c i e r t o s pr o c e s o s s u
a pl i c a c i n a gr a n e s c a l a . En e s t e r i fl c a c i o n e s e n m e d i o o r gn i c o , d o n d e s e pr o d u c e a gu a qu e
pu e d e s e r c a u s a n t e d e u n d e s c e n s o e n e l r e n d i m i e n t o d e l r e a c t o r , n o r m a l m e n t e e s t e s i s t e m a
t e n d r qu e l l e v a r a c o pl a d o u n s i s t e m a e fe c t i v o d e e l i m i n a c i n d e l a gu a d e l o s qu e e l m s
ha bi t u a l e s l a a d i c i n d e s a l e s o d e t a m i z m o l e c u l a r (Vzqu e z-Li m a et al., 1995; Ha n y Rhe e ,
1998). En e s t e s i s t e m a s e ha n d e s a r r o l l a d o l a m a yo r a d e r e a c c i o n e s d e s c r i t a s c o n l i pa s a s t a n t o
l i br e s c o m o i n m o v i l i za d a s (B a l c a o etal., 1996b).
62 Introduccin
Los reactores de lecho fijo c o n s t i t u ye n u n a bu e n a a l t e r n a t i v a d e bi d o a s u a l t a
e fi c a c i a , fa c i l i d a d d e c o n s t m c c i n y fo r m a d e o pe r a r (c o m o r e a c t o r d e fl u jo pi s t n ) y ha n s i d o
u t i l i za d o s t r a d i c i o n a l m e n t e e n o pe r a c i o n e s a e s c a l a i n d u s t r i a l . En e s t e c a s o t a m bi n s u e l e s e r
n e c e s a r i o a l gn s i s t e m a d e c o n t r o l d e a gu a e n r e a c c i o n e s d e e s t e r i fc a c i n (Ro s e l l et al.,
1996). No r m a l m e n t e , l o s pr o bl e m a s a s o c i a d o s a e s t e t i po d e r e a c t o r s o n l a pr d i d a d e c a r ga a
t r a v s d e l r e a c t o r y l a po s i bl e l i m i t a c i n d e l a d i fu s i n . Es t a c o n fi gu r a c i n d e r e a c t o r s e ha
e m pl e a d o e n r e a c c i o n e s e n m e d i o o r gn i c o i n c l u ye n d o s n t e s i s d e e s t e r e s , i n t e r e s t e r i fi c a c i n ,
t r a n s e s t e r i fi c a c i n , a l c o hl i s i s y e n a l gu n a s c a s o s pa r a hi d r l i s i s d e a c e i t e s c u a n d o l a
i n m o v i l i za c i n e r a d e t i po c o v a l e n t e (B a l c a o et al., 1996b) y e n a l gu n a s r e s o l u c i o n e s d e
m e zc l a s r a c m i c a s (B a t t i s t e l et al., 1991).
Po r l o qu e s e r e fi e r e a l reactor continuo de tanque agitado, s u u s o e s ba s t a n t e
l i m i t a d o a pe s a r d e s u ba jo c o s t e d e bi d o a qu e n o r m a l m e n t e r e qu i e r e m a yo r v o l u m e n d e
r e a c c i n pa r a l a s c i n t i c a s qu e d e s c r i be n e l c o m po r t a m i e n t o d e l a s Hpa s a s . Ot r o i m pe d i m e n t o
i m po r t a n t e qu e pr e s e n t a e s e l e fe c t o n e ga t i v o qu e s u e l e t e n e r l a a gi t a c i n m e c n i c a s o br e e l
s o po r t e d e i n m o v i l i za c i n y s o br e l a pr o pi a e n zi m a (Le e y Cho o , 1989). Es t a c o n fi gu r a c i n s e
ha e m pl e a d o e n a l gu n a s r e a c c i o n e s d e hi d r l i s i s , a c i d l i s i s y s n t e s i s d e e s t e r e s (B a l c a o et al.,
1996b).
El r e a c t o r d e lecho fluidizado s e pr e s e n t a c o m o u n i n t e r m e d i o e n t r e l o s d o s t i po s
a n t e r i o r e s y e s u n a o pc i n pa r a e l i m i n a r r e s t r i c c i o n e s d i fu s i o n a l e s . Si n e m ba r go , s u
c o m pl e ji d a d d e o pe r a c i n ha l i m i t a d o s u u s o c o n Hpa s a s a a l gu n a s r e a c c i o n e s d e
e s t e r i fc a c i n (B a l c a o et al, 1996b).
Lo s r e a c t o r e s d e membrana ha n s i d o a m pl i a m e n t e u t i l i za d o s c o n Hpa s a s . En e s t o s
r e a c t o r e s , l a l i pa s a s e i n m o v i l i za e n u n a m e m br a n a , qu e pu e d e s e r e n fo r m a d e s u pe r fi c i e o e n
fo r m a d e fi br a hu e c a . Es t o s r e a c t o r e s s o n m u y i n d i c a d o s e n s i s t e m a s bi fs i c o s y s u pr i n c i pa l
pr o bl e m a o pe r a c i o n a l e s e l d e l a po l a r i za c i n d e l a m e m br a n a . U n r e s u m e n d e l a s po s i bl e s
c o n fi gu r a c i o n e s s e r e c o ge e n e l t r a ba jo d e Pr a ze r e s y Ca br a l (1994). Lo s t i po s d e m e m br a n a s
qu e s e ha n u t i l i za d o s o n m u y v a r i a bl e s , hi d r o fl i c a s e hi d r o fbi c a s , a u n qu e e n t r a ba jo s
r e c i e n t e s s e s e a l a n l a s hi d r o fl i c a s c o m o l a s m e jo r e s e n t r m i n o s d e pr o d u c t i v i d a d (B o u we r
et al., 1991).
Introduccin
63
A l gu n a s d e l a s r e a c c i o n e s e n l a s qu e s e ha n a pl i c a d o c o n xi t o l i pa s a s i n m o v i l i za d a s e n
r e a c t o r e s d e m e m br a n a s e d e t a l l a n e n l a t a bl a 1.11.
A u t o r
Hoqetal. (1984)
Hoqetal. (1985)
Y aman et al. (1986)
Ta yl o r et al. (1986)
Pr o n ke /a /. (1988)
Mulcatuetal. (1992)
Li pa s a
Chromobacterium
viscosum
Candida rugosa
Pseudomonas flor escens
Thermomyces lanuginosus
Candida rugosa
Aspergillus niger
Re a c c i n
Sn t e s i s d e
gl i c r i d o s
Hi d r l i s i s d e
a c e i t e d e
o l i v a
Gl i c e r l i s i s d e
gr a s a s
Hi d r l i s i s d e
gr a s a s
Hi d r l s i s d e
t r i gl i c r i d o s
Hi d r l i s i s d e
a c e i t e
Ti po d e
m e m br a n a
Mi c r o po r o s a d e
po l i pr o pi l e n o
(Hi d r o fbi c a )
Mi c r o po r o s a d e
po l i pr o pi l e n o
(Hi d r o fbi c a )
Mi c r o po r o s a d e
po l i pr o pi l e n o
(Hi d r o fbi c a )
Mi c r o po r o s a d e
n i l n
(Hi d r o fbi c a )
Ce l u l o s a
(Hi d r o fl i c a )
Mi c r o po r o s a d e
po l i pr o pi l e n o
(Hi d r o fbi c a )
Co n fi gu r a c i n
Su pe r fi c i e
Fi br a hu e c a
Su pe r fi c i e
Su pe r fi c i e
Fi br a hu e c a
Fi br a hu e c a
64 _ _ Introduccin
1.7.4. Fo r m a s d e e xpr e s a r v c a l c u l a r l a e n a n t i o s e l e c t i v i d a d
De s d e e l i n i c i o d e l d e s a r r o l l o d e r e a c c i o n e s c u yo o bje t i v o e r a r e s o l v e r u n a m e zc l a
r a c m i c a , ha e xi s t i d o l a n e c e s i d a d d e c u a n t i fi c a r e l pr o gr e s o o l a c a l i d a d d e l pr o d u c t o
o bt e n i d o . La r e fe r e n c i a c l s i c a e s l a pr o po r c i o n a d a po r Che n et al. (1982) d o n d e s e d e fi n e n
l o s s i gu i e n t e s c o n c e pt o s :
Exc e s o e n a n t i o m r i c o (EE):
(8)
El e xc e s o e n a n t i o m r i c o s i e m pr e s e r e fi e r e a u n o d e l o s d o s e n a n t i m e r o s R o S, y pu e d e
r e fe r i r s e a l pr o d u c t o o a l r e a c t i v o (Ec u a c i n (8)), v i n i e n d o e l u s o d e u n o u o t r o c o n d i c i o n a d o
po r l a fa c i l i d a d d e a n l i s i s d e pr o d u c t o s o r e a c t i v o s . El e xc e s o e n a n t i o m r i c o t o m a r v a l o r e s
e n t r e e l O y e l 100%.
En a n t i o s e l e c t i v i d a d o "e n a n t i o m e r i c r a t i o " (E):
Es t e v a l o r r e l a c i o n a l a c o n v e r s i n t o t a l c o n e l e xc e s o e n a n t i o m r i c o pa r a d a r u n v a l o r e n t r e O
pa r a r e a c c i n n o e n a n t i o s e l e c t i v a e i n fi n i t o pa r a u n a r e a c c i n c o m pl e t a m e n t e e n a n t i o s e l e c t i v a .
En t r m i n o s ge n e r a l e s , s e c o n s i d e r a u n a r e a c c i n e n a n t i o s e l e c t i v a a pa r t i r d e v a l o r e s d e E
s u pe r i o r e s a 25, a u n qu e e s t e v a l o r d e pe n d e fu e r t e m e n t e d e l a r e n t e c o n s u l t a d a . La v e n t a ja d e
u s a r e s t e v a l o r e s qu e n o d e pe n d e d e l a c o n v e r s i n y, po r t a n t o , n o ha d e v a r i a r a l o l a r go d e l a
r e a c c i n , t e n i e n d o s u o r i ge n e n c o n s i d e r a c i o n e s c i n t i c a s . Ta m bi n pu e d e s e r c a l c u l a d o a
pa r t i r d e l EE d e l pr o d u c t o o d e l r e a c t i v o .
Co n v e r s i n (X):
Es t e v a l o r t i e n e e l s i gn i fi c a d o ge n e r a l d e c o n v e r s i n , c o n l o qu e s e pu e d e c a l c u l a r d e d i s t i n t a s
fo r m a s a pa r t i r d e l a s c o n c e n t r a c i o n e s d e pr o d u c t o s o r e a c t i v o s .
Introduccin 65
En e l t r a ba jo d e St r a a t ho f y Jo n ge ja n (1997) s e ha c e u n a r e c o pi l a c i n d e d i s t i n t a s
fo r m a s d e e v a l u a r l a e n a n t i o s e l e c t i v i d a d a pa r t i r d e l v a l o r pr o pu e s t o po r Che n et al. (1982).
En e s t e t r a ba jo s e e s t u d i a n m t o d o s d e c l c u l o d e e s t e pa r m e t r o y s e d i s c u t e l a i n fl u e n c i a qu e
t i e n e n fa c t o r e s c o m o :
- Pr e s e n c i a d e r e a c c i o n e s pa r a l e l a s
- Ci n t i c a y t e r m o d i n m i c a d e l a r e a c c i n pr i n c i pa l
- In hi bi c i n e n zi m t i c a
Co n c e n t r a c i n e n e xc e s o d e e n zi m a
Ho m o ge n e i d a d d e l a s fa s e s
- Equ i l i br i o qu m i c o
- Li m i t a c i n po r d i fu s i n
- Me zc l a i n c o m pl e t a
- Ti po d e r e a c t o r
A u n qu e l o s pa r m e t r o s d e s c r i t o s po r Che n et al. (1982) ha n s i d o a m pl i a m e n t e
u t i l i za d o s e n t o d o t i po d e r e s o l u c i o n e s (Ka zl a u s ka s et al., 1991; Chi o u et al., 1992;
Sa n t a n i e l l o et al., 1993, Se c u n d o et al., 1997), a l gu n o s a u t o r e s pr o po n e n o t r a s fo r m a s d e
c u a n t i fi c a r l a e n a n t i o s e l e c t i v i d a d ; a s , St r a a t ho f et al. (1995) pr o po n e n e l u s o d e u n ba l a n c e
qu i r a l e n e l c a s o d e qu e l a r e s o l u c i n s e a c i n t i c a ,
Po r o t r o l a d o , Lpe z-B e l m o n t e et al (1997) pr o po n e n u n n u e v o pa r m e t r o
d e n o m i n a d o fa c t o r e n a n t i o m r i c o (EF) qu e pe r m i t e e v a l u a r l a e n a n t i o s e l e c t i v i d a d d e fo r m a
s e n c i l l a . El fa c t o r e n a n t i o m r i c o s e c a l c u l a c o m o e l c o c i e n t e d e l e xc e s o e n a n t i o m r i c o
e xpe r i m e n t a l (c a l c u l a d o s e gn l a e c u a c i n (8)) y e l d e n o m i n a d o e xc e s o e n a n t i o m r i c o t e r i c o
(e c u a c i n (9)), qu e c o r r e s po n d e a l v a l o r qu e t e n d r a e l e xc e s o e n a n t i o m r i c o s i s l o
r e a c c i o n a r a e l e n a n t i m e r o d e v e l o c i d a d d e r e a c c i n m s r pi d a . A s pu e s , u n v a l o r d e l fa c t o r
e n a n t i o m r i c o d e 1 s i gn i fi c a e n a n t i o s e l e c t i v i d a d pe r fe c t a , m i e n t r a s qu e u n v a l o r d e O
c o r r e s po n d e a a u s e n c i a d e r e s o l u c i n .
= EEIEE
T
c o n EEr = -(xl OO) (10)
l OO-JT
V
'
66 Introduccin
1.7.5. Re s o l u c i n d e c i d o s 2-a r i l pr o pi n i c o s c o n l i pa s a s
1.7.5.1. Pr e c e d e n t e s
Du r a n t e l o s l t i m o s a o s , l a r e s o l u c i n v a hi d r l i s i s , s n t e s i s y t r a n s e s t e r i fi c a c i n , d e
pr o d u c t o s fi n a l e s o i n t e r m e d i a r i o s d e l a i n d u s t r i a e n ge n e r a l y fa r m a c u t i c a e n pa r t i c u l a r s e ha
i n c r e m e n t a d o e s pe c t a c u l a r m e n t e t a n t o e n l a i n v e s t i ga c i n a c a d m i c a c o m o e n l a i n d u s t r i a l
(Fe d e r s e l , 1993; Ma r go l i n , 1993; St i n s o n , 1994).
La s pr i n c i pa l e s r a zo n e s qu e ha n m o t i v a d o e s t e c a m bi o e n e l i n t e r s po r e s t e t i po d e
c o m pu e s t o s s o n :
El be n e fi c i o m d i c o d e u s a r n i c a m e n t e e l c o m pu e s t o pt i c a m e n t e pu r o qu e t i e n e l a
a c t i v i d a d bi o l gi c a . Ha y n u m e r o s o s e je m pl o s e n l o s qu e e l pr i n c i pi o a c t i v o d e s e a d o s e
e n c u e n t r a e xc l u s i v a m e n t e e n u n o d e l o s e n a n t i m e r o s . La pr e s e n c i a d e l o t r o e n a n t i m e r o
pu e d e c a u s a r pr d i d a d e po t e n c i a e n e l e n a n t i m e r o d e i n t e r s , i n a c t i v a c i n e n i n c l u s o
a c t u a r c o n e fe c t o t o t a l m e n t e o pu e s t o a l d e s e a d o , pu d i e n d o l l e ga r a c a u s a r t r a s t o r n o s e n e l
pa c i e n t e (A r i e n , 1986).
Ca m bi o s e n l a n o r m a t i v a d e r e gu l a c i n d e l u s o d e e s t e t i po d e m e d i c a m e n t o s . La s n u e v a s
n o r m a t i v a s pr o m o v i d a s po r l a s a u t o r i d a d e s c o r r e s po n d i e n t e s e s t n fa v o r e c i e n d o
fu e r t e m e n t e e l d e s a r r o l l o d e pr o d u c t o s fa r m a c u t i c o s qu e c o n t e n ga n n i c a m e n t e e l
e n a n t i m e r o bi o l gi c a m e n t e a c t i v o y n o l a m e zc l a r a c m i c a , s i e n d o pr o hi bi d a , e n u n fu t u r o
n o m u y l e ja n o , l a pr e s e n c i a d e l r a c m i c o i n c l u s o e n a qu e l l o s c a s o s e n qu e pa r e zc a s e r
i n o c u o l a pr e s e n c i a d e l bi o l gi c a m e n t e n o a c t i v o .
Lo s gr a n d e s a v a n c e s pr o d u c i d o s e n l a s n t e s i s d e c o m pu e s t o s pt i c a m e n t e pu r o s . De
m a n e r a qu e e s po s i bl e l a pr o d u c c i n d e gr a n d e s c a n t i d a d e s d e e n a n t i m e r o s m e d i a n t e e l
u s o d e s n t e s i s qu m i c a a s i m t r i c a , c i n t i c a e n zi m t i c a , c r i s t a l i za c i n e n a n t i o s e l e c t i v a o
c r o m a t o gr a fa qu i r a l . En t r e e s t o s m t o d o s l a a pl i c a c i n d e e n zi m a s o m i c r o o r ga n i s m o s e s t
a u m e n t a n d o c o n s i d e r a bl e m e n t e (Kl i ba n o v , 1990; Sc ho ffe r s e a /., 1996).
Introduccin 67
De e n t r e l o s m u c ho s c o m pu e s t o s qu e a c t u a l m e n t e s e r e s u e l v e n v a e n zi m t i c a s e v a a
c e n t r a r e l e s t u d i o e n l a r e s o l u c i n d e c i d o s 2-a r i l -pr o pi n i c o s (pr o fe n o s ). En l a t a bl a 1.12 s e
r e c o ge n l o s pr i n c i pa l e s c o m po n e n t e s d e e s t e gr u po .
Co m pu e s t o Fr m u l a Es t r u c t u r a
A c i d o 2-fe n i l
pr o pi n i c o
HO
O
Ibu pr o fe n o C
13
H
18
0
2
Na pr o xe n o
Ke t o pr o fe n o
Fl u n o xa pr o fe n o Ci
6
Hi
2
FN0
3
B e n o xa pr o fe n o Ci
6
H
12
Cl N0
3
Fl u r bi pr o fe n o Ci
5
H
13
F0
2
Tabla 1.12: Es t r u c t u r a s d e a l gu n o s d e c i d o s 2-a r i l pr o pi n i c o s r e s u e l t o s c o n l i pa s a s .
68 Introduccin
Es t o s c o m pu e s t o s fo r m a n u n i m po r t a n t e gr u po d e fr m a c o s a n t i i n fl a m a t o r i o s n o
e s t e r o i d a l e s , c o n o c i d o s ba jo l a s s i gl a s NSA IDs ("n o n -s t e r o i d a l a n t i -i n fl a m a t o r y d r u gs "). Su
a c t i v i d a d fa r m a c o l gi c a r e s i d e pr i n c i pa l m e n t e e n e l (S)-e n a n t i m e r o (Hu t t y Ca l d we l l , 1984).
Po r e je m pl o , s e ha d e m o s t r a d o qu e e l (S)-i bu pr o fe n o e s 160 v e c e s m s a c t i v o qu e e l (R) e n l a
i n hi bi c i n d e l a s n t e s i s d e l a pr o s t a gl a n d i n a i n v i t r o (A d a m s et al., 1976). A n t e e s t o s
r e s u l t a d o s qu e d a m a n i fi e s t o e l gr a n e s fu e r zo qu e s e e s t pr o d u c i e n d o pa r a c o n s e gu i r s i n t e t i za r
e l e n a n t i m e r o d e i n t e r s pu r o , a pe s a r d e qu e a e xc e pc i n d e l (S)-n a pr o xe n o y e l (S)-
fl u n o xa pr o fe n o s e e s t n u t i l i za n d o e n l o s pr o d u c t o s t e r a pu t i c o s c o m o m e zc l a r a c m i c a .
De e n t r e t o d a e s t a fa m i l i a d e c o m pu e s t o s e l e s t u d i o s e c e n t r a r e n e l c i d o 2-fe n i l
pr o pi n i c o , c o m o e l pr e c u r s o r d e l a fa m i l i a , y e l i bu pr o fe n o . El i bu pr o fe n o , c o m o i n t e gr a n t e
d e l a fa m i l i a NSA IDs , e s u n a ge n t e a n t i i n fl a m a t o r i o n o e s t e r o i d a l u s a d o e n e l t r a t a m i e n t o d e
l a a r t r i t i s y o t r a s e n fe r m e d a d e s s i m i l a r e s (Da v i e s y A v e r y, 1971; Ha m m a n et al., 1997;
Yo s hi d a et al., 1997). Po r o t r o l a d o , l a r e s o l u c i n d e l l e v a r a c a bo m e d i a n t e e s t e r i fi c a c i n d e
e s t o s c i d o s c o n u n a l c o ho l l i n e a l e n m e d i o o r gn i c o .
1.7.5.2. Fa c t o r e s qu e a fe c t a n a e s t e t i po d e r e a c c i o n e s
Lo s pr i n c i pa l e s fa c t o r e s qu e a fe c t a n a e s t e t i po d e r e a c c i o n e s d e s n t e s i s , e n l a s qu e
i n t e r v i e n e n u n c i d o o r gn i c o d e n a t u r a l e za qu i r a l y u n a l c o ho l e n m e d i o o r gn i c o , s e pu e d e n
r e s u m i r e n l o s s i gu i e n t e s pu n t o s :
1. Na t u r a l e za y fu e n t e d e l a e n zi m a (m i c r o bi a n a , e xt r a c c i n d e r ga n o s d e a n i m a l e s , e t c .).
2. Ti po s d e a l c o ho l e s y c i d o s u t i l i za d o s .
3. Re l a c i n c i d o -a l c o ho l e m pl e a d a .
4. Co n c e n t r a c i n d e l a e n zi m a .
5. Co n c e n t r a c i n d e l o s s u bs t r a t o s .
6. Fa c t o r e s fs i c o s e xt e r n o s (t e m pe r a t u r a , a gi t a c i n , e t c .).
7. Ti po d e d i s o l v e n t e .
8. In fl u e n c i a d e l a gu a .
9. Ti e m po d e r e a c c i n .
10. Mo d i fi c a c i n d e l a e n zi m a .
Introduccin
69
El c o m e n t a r i o d e e s t o s pu n t o s s e v a a c e n t r a r e n l a u t i l i za c i n d e l i pa s a s m i c r o bi a n a s
pa r a l a s n t e s i s d e e s t e r e s d e c i d o s 2-a r i l -pr o pi n i c o s , y pa r t i c u l a r m e n t e e l i bu pr o fe n o . Es
i m po r t a n t e s e a l a r qu e e s t o s fa c t o r e s c i t a d o s pu e d e n a fe c t a r t a n t o a l a v e l o c i d a d d e
e s t e r i fc a c i n c o m o a l a e n a n t i o s e l e c t i v i d a d . No s i e m pr e l a m a yo r v e l o c i d a d d e e s t e r i fl c a c i n
pr o po r c i o n a r l a m xi m a e n a n t i o s e l e c t i v i d a d . Po r e s t e m o t i v o , c o m o l a e n a n t i o s e l e c t i v i d a d
s u e l e s e r e l fa c t o r d e t e r m i n a n t e , l a s c o n d i c i o n e s pt i m a s n o s i e m pr e c o i n c i d e n c o n l a s d e l a
m xi m a v e l o c i d a d d e e s t e r i fl c a c i n .
Fuentes de lipasas microbianas
Exi s t e u n gr a n n m e r o d e m i c r o o r ga n i s m o s pr o d u c t o r e s d e l i pa s a s c u yo s pr e pa r a d o s
e n zi m t i c o s s e pu e d e n o bt e n e r c o m e r c i a l m e n t e d e d i v e r s o s pr o v e e d o r e s . De he c ho Mu s t r a n t a
(1992) r e a l i z u n a m pl i o e s t u d i o pa r a d e t e r m i n a r e l t i po d e l i pa s a s m s a d e c u a d o pa r a l a
r e s o l u c i n d e l i bu pr o fe n o r a c m i c o m e d i a n t e l a e s t e r i fc a c i n e n m e d i o o r gn i c o . En l a t a bl a
1.13 s e r e c o ge n l o s pr e pa r a d o s u t i l i za d o s a m pl i a d o s c o n l o s u t i l i za d o s po r o t r o s gr u po s d e
i n v e s t i ga c i n .
Su m i n i s t r a d o r
B i o c a t a l ys t (U K)
A m a n o Pha r m a c e u t i c a l (JP)
Si gm a (U SA )
Me i t o -Sa n gyo (JP)
B DH(U K)
No v o In d u s t r i (DM)
Or i ge n m i c r o bi a n o
Candida rugosa
Geotrichum candidum
Rhizopus arrhizus
Aspergillus niger
Penicillium cyclopium
Aspergillus niger
Candida rugosa
Pseudomonas fluorescens
Mucor javanicus
Rhizopus arrhizus
Candida rugosa
Ext r a c t o d e pn c r e a s po r c i n o
Candida rugosa
Candida rugosa
Rhizomucor miehei (Li po zym e IM)
Candida antrctica (No v o zym e 435)
Tabla 1.13: Pr i n c i pa l e s l i pa s a s c o m e r c i a l e s pr o ba d a s pa r a l a e s t e r i fc a c i n d e c i d o s 2-a r i l -
pr o pi n i c o s e n m e d i o o r gn i c o (Mu s t r a n t a , 1992).
70 Introduccin
De t o d o s e s t o s pr e pa r a d o s e n zi m t i c o s l o s n i c o s qu e fu e r o n c a pa c e s d e r e a l i za r l a
s n t e s i s d e l i bu pr o fe n o fu e r o n l o s d e r i v a d o s d e Candida rugosa, Mucor javanicus, y l o s
pr e pa r a d o s d e No v o In d u s t r i d e Khizomucor miehei y Candida antrctica, c a t a l i za n d o
pr e fe r e n c i a l m e n t e l a e s t e r i fi c a c i n d e l S-e n a n t i m e r o . Mu s t r a n t a (1992) c e n t r s u s e s t u d i o s
e n e l pr e pa r a d o d e Candida rugosa po r l a m a yo r e n a n t i o s e l e c t i v i d a d m o s t r a d a e n
c o m pa r a c i n c o n l a d e Khizomucor miehei ba jo l a s m i s m a s c o n d i c i o n e s d e e n s a yo . Pe r o
t a m bi n e xi s t e n e s t u d i o s i n t e r e s a n t e s d e l a r e s o l u c i n d e l i bu pr o fe n o c o n Mucor javanicus
(Go t o et al, 1996), Rhizomucor miehei (Lpe z-B e l m o n t e et al, 1997) y Candida antrctica
(A r r o yo y Si n i s t e r r a , 1994).
Es m u y c u r i o s o t a m bi n v e r l a s d i fe r e n c i a s m a n i fi e s t a s e n t r e l o s pr e pa r a d o s
s u m i n i s t r a d o s po r l o s d i v e r s o s pr o v e e d o r e s . Si bi e n e s t a d i s pe r s i n po d r a e n t e n d e r s e e n t r e
d i fe r e n t e s s u m i n i s t r a d o r e s , s e ha n e n c o n t r a d o d i s c r e pa n c i a s e n l a s pr o pi e d a d e s c a t a l t i c a s d e
u n m i s m o s u m i n i s t r a d o r d e pe n d i e n d o d e l l o t e u t i l i za d o . Es t a s v a r i a c i o n e s m u c ha s v e c e s n o
s l o d e be n i m pu t a r s e a l s u m i n i s t r a d o r , s i n o t a m bi n a l a m a n i pu l a c i n d e l pr e pa r a d o y a l
a l m a c e n a m i e n t o d e l m i s m o (Ts a i y Do r d i c k, 1996b).
Mu s t r a n t a (1992) pr e s e n t a u n a i n t e r e s a n t e t a bl a d e c o m pa r a c i n e n t r e l a l i pa s a d e
Candida rugosa e n fu n c i n d e l s u m i n i s t r a d o r . Lo s pa r m e t r o s d e c o m pa r a c i n u t i l i za d o s
fu e r o n :
1. La a c t i v i d a d l i po l t i c a d e t e r m i n a d a a pa r t i r d e l a r e a c c i n d e hi d r l i s i s d e l a c e i t e d e o l i v a y
e xpr e s a d a e n u n i d a d e s d e a c t i v i d a d po r m g.
2. El c o n t e n i d o e n pr o t e n a c o m o % e n pe s o s e c o u t i l i za n d o e l m t o d o d e Lo wr y.
3. El r e n d i m i e n t o d e l a r e a c c i n d e e s t e r i fi c a c i n 12m M d e i bu pr o fe n o , u t i l i za n d o a l c o ho l
a m l i c o 24 m M e n n -he xa n o y e xpr e s a d o c o r n o (i m o l /g d e l i pa s a .
Lo s r e s u l t a d o s s e r e c o ge n e n l a t a bl a 1.14. En d i c ha t a bl a s e o bs e r v a u n a c o r r e l a c i n
e n t r e l o s v a l o r e s d e a c t i v i d a d d e hi d r l i s i s fr e n t e a a c e i t e d e o l i v a c o n l o s d e e s t e r i fi c a c i n d e
i bu pr o fe n o , m i e n t r a s qu e e s t a c o r r e l a c i n n o e xi s t e e n e l c a s o d e l c o n t e n i d o e n pr o t e n a t o t a l .
Se gn e s t o , u n a m e d i d a d e a c t i v i d a d l i po l t i c a s e r a m s r e pr e s e n t a t i v a qu e u n a d e pr o t e n a
t o t a l .
Introduccin 71
Su m i n i s t r a d o r
B i o c a t a l ys t
Me i t o -Sa n gyo
A m a n o
B DH
Si gm a
A . Li po l t i c a (U /m g)
(a c e i t e d e o l i v a )
670
750
145
77
85
Pr o t e n a (%)
10.0
12.9
9.0
7.3
7.0
Re n d i m i e n t o d e l a
e s t e r i fc a c i n d e
i bu pr o fe n o
(u ,m o l /g d e l i pa s a )
480
432
168
48
24
Tabla 1.14: Co m pa r a c i n d e l a l i pa s a d e Candida rugosa d e pe n d i e n d o d e l s u m i n i s t r a d o r .
Tipos de alcoholes y cidos utilizados.
Co n r e l a c i n a l t i po d e a l c o ho l , e n ge n e r a l s e pu e d e a fi r m a r qu e , i n d e pe n d i e n t e m e n t e
d e l o r i ge n d e l a l i pa s a m i c r o bi a n a , l a m xi m a v e l o c i d a d d e e s t e r i fc a c i n s e o bt i e n e pa r a
a l c o ho l e s pr i m a r i o s , d i s m i n u ye n d o pa r a a l c o ho l e s s e c u n d a r i o s y s i e n d o n u l a pa r a a l c o ho l e s
t e r c i a r i o s . Es t a t e n d e n c i a s e o bs e r v a c o n Candida rugosa (Mu s t r a n t a , 1992) Rhizomucor
miehei (Lpe z-B e l m o n t e et a /., 1997) y Candida antrctica (A r r o yo y Si n i s t e r r a , 1994).
Si s e c o m pa r a e l e fe c t o d e l n m e r o d e t o m o s d e c a r bo n o d e l o s a l c o ho l e s pr i m a r i o s
l i n e a l e s , s e o bs e r v a qu e l o s a l c o ho l e s d e c a d e n a c o r t a (m e t a n o l , e t a n o l ) pr e s e n t a n u n a ba ja
a c t i v i d a d ya qu e s o n c a pa c e s d e d e s hi d r a t a r l a e n zi m a (Go r m a n y Do r d i c k, 1992). No t a n
c l a r a e s l a s e l e c c i n e n t r e e l pr o pa n o l o e l bu t a n o l y u n o d e c a d e n a m s l a r ga c o m o e l o c t a n o l ,
o bt e n i n d o s e r e s u l t a d o s c o n t r a d i c t o r i o s e n fu n c i n d e l a l i pa s a m i c r o bi a n a u t i l i za d a . La
u t i l i za c i n d e a l c o ho l e s r a m i fi c a d o s c o r t o s c o m o e l 3-m e t i l -l -bu t a n o l pr o v o c a n u n a
i m po r t a n t e d i s m i n u c i n d e l a v e l o c i d a d d e e s t e r i fc a c i n , d e bi d o a i m pe d i m e n t o s e s t r i c o s , d e
m a n e r a qu e e l r a d i c a l m e t i l o e n l a po s i c i n 3 pu e d e i m pe d i r e l a c e r c a m i e n t o d e l a l c o ho l a l
c e n t r o a c t i v o d e l a e n zi m a .
Pa r e c e c l a r o qu e s e r n l o s a l c o ho l e s hi d r o fbi c o s l o s m s a pr o pi a d o s pa r a s e r
r e c o n o c i d o s po r e l c e n t r o a c t i v o d e l a l i pa s a d e bi d o a s u c o n o c i d a n a t u r a l e za hi d r o fbi c a . No
o bs t a n t e s t e n o d e be s e r e l n i c o pa r m e t r o c o n s i d e r a d o y pa r m e t r o s c o m o l a ge o m e t r a d e
72 Introduccin
l o s a l c o ho l e s d e be n s e r t a m bi n t e n i d o s e n c u e n t a . En c u a n t o a l a e n a n t i o s e l e c t i v i d a d e l
a l c o ho l pu e d e i n fl u i r d e m a n e r a i m po r t a n t e . A s c o n Li po zym e l a s l a r ga s c a d e n a s l i n e a l e s
pa r e c e n i n c r e m e n t a r l a e n a n t i o s e l e c t i v i d a d . Es t o s r e s u l t a d o s e s t a r a n d e a c u e r d o c o n l o s
o bs e r v a d o s e n l a e s t e r i fi c a c i n d e l c i d o o c t a n o i c o c o n d i fe r e n t e s a l c o ho l e s qu i r a l e s (Ga t fi e l d ,
1984). Co m o c o n c l u s i n l o s a l c o ho l e s m s c o m n m e n t e u t i l i za d o s pa r a l a r e s o l u c i n d e l
i bu pr o fe n o s o n pr o pa n o l , bu t a n o l y o c t a n o l .
A u n qu e n u e s t r o e s t u d i o s e c e n t r a e n l a r e s o l u c i n d e l i bu pr o fe n o s e ha n r e a l i za d o
e s t u d i o s c o n o t r o s c i d o s 2-a r i l -pr o pi n i c o s . Co n c r e t a m e n t e c o n Li po zym e Lpe z-B e l m o n t e
et al. (1997) o bt i e n e n qu e e l r e n d i m i e n t o s i gu e e l s i gu i e n t e o r d e n d e s pu s d e 72 ho r a s d e
o pe r a c i n :
Ibu pr o fe n o > n a pr o xe n o > ke t o pr o fe n o > c i d o 2-fe n i l -pr o pi n i c o
Es t a t e n d e n c i a e s d i fe r e n t e pa r a e l No v o zym e (A r r o yo y Si n i s t e r r a , 1994) i gu a l m e n t e
d e s pu s d e 72 ho r a s d e o pe r a c i n :
Ke t o pr o fe n o > i bu pr o fe n o > c i d o 2-fe n i l -pr o pi n i c o > fl u r bi pr o fe n o > n a pr o xe n o
In d e pe n d i e n t e m e n t e d e l o s r e n d i m i e n t o s y d e l o r i ge n d e l pr e pa r a d o e n zi m t i c o l a
e n a n t i o s e l e c t i v i d a d e xpr e s a d a c o m o r e l a c i n o "e n a n t i o m e r i c r a t i o " e s ba ja e n t o d o s l o s c a s o s ,
pu e s t o qu e n o s u pe r a e l v a l o r d e 4.
A d e s t a c a r qu e s i bi e n l a r e s o l u c i n e s m a yo r i t a r i a m e n t e d e l S-e n a n t i m e r o , e n e l c a s o
d e l ke t o pr o fe n o e l e n a n t i m e r o m a yo r i t a r i o qu e s e r e s u e l v e e s e l R-e n a n t i m e r o .
Relacin cido-alcohol empleada.
Ge n e r a l m e n t e s e t r a ba ja c o n e xc e s o d e l c o m pu e s t o n o qu i r a l , qu e e n l a r e a c c i n a
e s t u d i o s e r a e l a l c o ho l c o n o bje t o d e a s e gu r a r l a c o m pl e t a c o n v e r s i n d e l r e a c t i v o
e n a n t i o m r i c o . En l a bi bl i o gr a fa s e r e c o ge n r e l a c i o n e s d e s d e 1:1 ha s t a u n m xi m o d e 1:4.
Introduccin 73
Concentracin de la enzima
Exi s t e u n pt i m o d e c o n c e n t r a c i n d e l pr e pa r a d o e n zi m t i c o a u t i l i za r . Es t e pt i m o
c o r r e s po n d e a l a m xi m a pr o d u c t i v i d a d e xpr e s a d a c o m o (m o l e s d e pr o d u c t o /s u bs t r a t o
(pr o d u c i d o -c o n s u m i d o ) po r m g d e l bi o c a t a l i za d o r y ho r a . En l a pr c t i c a s e o bs e r v a qu e a
pa r t i r d e u n a d e t e r m i n a d a c o n c e n t r a c i n d e l a e n zi m a l a c o n v e r s i n fi n a l o l a e v o l u c i n d e l a
c u r v a d e l s t e r pr o d u c i d o fr e n t e a l t i e m po e s c o n s t a n t e .
A l gu n o s a u t o r e s c o m e n t a n qu e c u a n t o m a yo r s e a l a c o n c e n t r a c i n d e l a e n zi m a s e
pu e d e o bs e r v a r u n a d i s m i n u c i n e n l a e n a n t i o s e l e c t i v i d a d . De t o d a s m a n e r a s e s t e e s u n e fe c t o
pr e s e n t e c u a n d o s e c o m pa r a n d i fe r e n t e s c a n t i d a d e s d e e n zi m a u t i l i za d a s a u n m i s m o t i e m po
d e r e a c c i n , bs i c a m e n t e po r qu e pa r a a l t a s c o n c e n t r a c i o n e s d e e n zi m a l a c o n v e r s i n s u pe r a e l
50% y po r c o n s i gu i e n t e s e e s t s i n t e t i za n d o e l s t e r d e l R-e n a n t i m e r o u n a v e z qu e
pr c t i c a m e n t e s e ha c o n s u m i d o t o d o e l S-e n a n t i m e r o . Es t e d e s c e n s o d e e n a n t i o s e l e c t i v i d a d
n o s e r a t a l y s e po d r a e v i t a r s i m pl e m e n t e pa r a n d o l a r e a c c i n a n t e s .
A u n qu e e s d i fc i l c o m pa r a r e n t r e l a s d i fe r e n t e s e n zi m a s , e n l a t a bl a 1.15 s e pr e s e n t a n
l a s c a n t i d a d e s u t i l i za d a s po r d i v e r s o s a u t o r e s .
Fu e n t e
B i bl i o gr fi c a
Mu s t r a n t a (1992)
A r r o yo y Si n i s t e r r a
(1994)
Ki m yLe e (1996)
Go t o et al. (1996)
Lpe z-B e l m o n t e et
al. (1997)
T sai et al. (1997)
Pr e pa r a d o e n zi m t i c o
C. rugosa (B i o c a t a l ys t )
Candida antrctica
No v o zym e 43 5 (No v o )
C. rugosa (Si gm a )
C. rugosa (A m a n o )
M. Javanicus (A m a n o )
Rhizomucor miehei
Li po zym e IM20 (No v o )
C. rugosa (Me i t o Sa n gyo )
Vo l u m e n d e
r e a c c i n (m i )
40
10
10
-
10
25
Ca n t i d a d u t i l i za d a
(m g)
100-500
100-500
300-500
0.2 g/1
300-700
250
Tabla 1.15: Ca n t i d a d e s u t i l i za d a s d e d i fe r e n t e s pr e pa r a d o s d e l i pa s a s c o m e r c i a l e s .
74 Introduccin
De l a t a bl a 1.15 s e d e s pr e n d e qu e l a c o n c e n t r a c i n d e e n zi m a u t i l i za d a e s t
c o m pr e n d i d a e n t r e 2.5 g/1 y 70 g/1 s i e xc e pt u a m o s l a l t i m a r e fe r e n c i a . Si e n d o u n v a l o r
ba s t a n t e c o m n 30 g/1.
Concentracin de los substratos
Es o t r o d e l o s pu n t o s a o pt i m i za r d e pe n d i e n d o d e l a e n zi m a u t i l i za d a y d e l a r e a c c i n
e n qu e s e a pl i qu e . Se ha n o bs e r v a d o e fe c t o s i n hi bi t o r i o s a m e d i d a qu e s e a u m e n t a n l a s
c o n c e n t r a c i o n e s t a n t o d e l c i d o c o m o d e l a l c o ho l . Ha y qu e t e n e r e n c u e n t a qu e u n e xc e s o d e
c i d o pu e d e d i s m i n u i r e l pH m i c r o a m bi e n t a l a l r e d e d o r d e l c e n t r o a c t i v o d e l a e n zi m a ,
m i e n t r a s qu e u n e xc e s o d e a l c o ho l pu e d e d e s n a t u r a l i za r l a e n zi m a .
La s m xi m a s c o n c e n t r a c i o n e s d e c i d o r e fe r e n c i a d a s e n l a bi bl i o gr a fa ha n s i d o d e
125m M u t i l i za n d o i d n t i c a c o n c e n t r a c i n d e a l c o ho l . (Lpe z-B e l m o n t e et al., 1997). No
o bs t a n t e ge n e r a l m e n t e l a s c o n c e n t r a c i o n e s d e c i d o s u e l e n s e r m e n o r e s , d e l o r d e n d e 50 m M,
y e n a l gu n o s c a s o s e xt r e m a d a m e n t e ba ja s 3m M (Ts a i et al., 1997). La i m po r t a n c i a d e t r a ba ja r
a l a s m a yo r e s c o n c e n t r a c i o n e s po s i bl e s e s c l a r a d e s d e e l pu n t o d e v i s t a d e a pl i c a c i n
i n d u s t r i a l d e l pr o c e s o .
Factores fsicos externos
La t e m pe r a t u r a e s u n o d e l o s fa c t o r e s e xt e r n o s m s e s t u d i a d o s d e bi d o a s u i n fl u e n c i a
e n l a a c t i v i d a d e n zi m t i c a . Ge n e r a l m e n t e u n a u m e n t o d e l a t e m pe r a t u r a s u po n e u n a u m e n t o
d e l a v e l o c i d a d d e r e a c c i n , s i e m pr e qu e n o s e pr o d u zc a l a d e s a c t i v a c i n t r m i c a d e l a
e n zi m a . Si n e m ba r go e s t e e fe c t o e s c o n t r a r i o s i s e s i gu e e l c r i t e r i o d e fa v o r e c e r l a
e n a n t i o s e l e c t i v i d a d . Es t a s e e n c u e n t r a fa v o r e c i d a a t e m pe r a t u r a s ba ja s . A a l t a s t e m pe r a t u r a s
s e pu e d e pr o d u c i r l a "d e fo r m a c i n " d e l c e n t r o a c t i v o , l o qu e s e t r a d u c e e n u n a fl e xi bi l i d a d d e l
r e c o n o c i m i e n t o d e l s u bs t r a t o . Mi e n t r a s qu e a ba ja s t e m pe r a t u r a s e l c e n t r o a c t i v o s e
e n c o n t r a r a m s r gi d o . Po r c o n s i gu i e n t e s e r u n pa r m e t r o a o pt i m i za r .
No o bs t a n t e , ha y o t r o s fa c t o r e s e xt e r n o s qu e pu e d e n d e t e r m i n a r l a t e m pe r a t u r a a
e m pl e a r c o m o e l pu n t o d e e bu l l i c i n d e l d i s o l v e n t e o d e l o s s u bs t r a t o s /pr o d u c t o s qu e
Introduccin 75
d e t e r m i n a r e l pt i m o d e t e m pe r a t u r a . Ge n e r a l m e n t e l a t e m pe r a t u r a u t i l i za d a s e s i t a
a l r e d e d o r d e l o s 40C.
La a gi t a c i n e s u n fa c t o r m e n o s e s t u d i a d o y qu e a pa r e n t e m e n t e e n t r e 300 y 700 r pm
(c o n a gi t a c i n m a gn t i c a ) n o pa r e c e a fe c t a r s i gn i fi c a t i v a m e n t e a l a s pr e s t a c i o n e s d e l a
r e a c c i n e n zi m t i c a .
Tipo de disolvente
El e s t u d i o d e l a n a t u r a l e za d e l d i s o l v e n t e ha s i d o fu e n t e d e m u c ho s t r a ba jo s y s e ha
d e m o s t r a d o l a gr a n i n fl u e n c i a qu e t i e n e s o br e l a a c t i v i d a d y e s t a bi l i d a d d e l a e n zi m a
(Kv i t t i n ge n , 1994; Ca r r e a et al., 1995; Du c r e t ei al., 1998). Es u n he c ho qu e l a a c t i v i d a d
c a t a l t i c a d e l a s l i pa s a s m i c r o bi a n a s e n m e d i o s o r gn i c o s e s m a yo r e n d i s o l v e n t e s n o po l a r e s
qu e e n d i s o l v e n t e s d e n a t u r a l e za m s hi d r o fl i c a , i n c l u s o m i s c i bl e s e n a gu a .
El pa r m e t r o qu e s e u t i l i za pa r a c u a n t i fi c a r l a r e l a c i n e n t r e l a hi d r o fo bi c i d a d y l a
hi d r o fi l i c i d a d e s e l l o g P, qu e c o r r e s po n d e a l c o e fi c i e n t e d e pa r t i c i n d e l d i s o l v e n t e e n t r e e l
s i s t e m a d e d o s fa s e s 1-o c t a n o l /a gu a . En l a t a bl a 1.16 s e r e c o ge n l o s v a l o r e s d e l o g P pa r a
d i v e r s o s d i s o l v e n t e s .
Di s o l v e n t e
A c e t o n a
Di e t i l e t e r
Cl o r o fo r m o
To l u e n o
Pe n t a n o
Ci c l o he xa n o
n -He xa n o
He pt a n o
Is o o c t a n o
De c a n o
Lo g P
-0.25
0.85
2.00
2.50
3.00
3.20
3.50
4.00
4.50
5.60
Ta bl a 1.16.: Va l o r e s d e l o g P pa r a d i s t i n t o s d i s o l v e n t e s (La a n e et al., 1987).
76 Introduccin
El v a l o r d e l o g P po r d e ba jo d e l c u a l n o s e o bs e r v a a c t i v i d a d e n zi m t i c a d e pe n d e r d e l
t i po d e l i pa s a m i c r o bi a n a . Po r e je m pl o , pa r a Li po zym e B VI20 d e No v o No r d i s k (l i pa s a d e
Rhizomucor miehe) s l o a pa r e c e a c t i v i d a d po r e n c i m a d e v a l o r e s d e 2, m i e n t r a s qu e pa r a
Candida rugosa e l v a l o r m n i m o e s d e l o r d e n d e 3. Es t a s v a r i a c i o n e s s e ju s t i fi c a n po r e l he c ho
d e qu e pa r a d i s o l v e n t e s po r d e ba jo d e l v a l o r d e 2 d e l l o g P, l o s d i s o l v e n t e s s o n c a pa c e s d e
s e pa r a r e l a gu a e s e n c i a l d e l a s e n zi m a s , qu e ju e ga u n pa pe l pr i m o r d i a l e n e l m a n t e n i m i e n t o d e
l a c o n fo r m a c i n n a t i v a d e l a e n zi m a (Re s l o w e a /., 1992).
La s d i fe r e n c i a s o bs e r v a d a s pa r a pr e pa r a d o s d i fe r e n t e s n o s l o s e d e be n a d i fe r e n t e
o r i ge n m i c r o bi a n o , s i n o qu e t a m bi n t i e n e n u n a fu e r t e d e pe n d e n c i a d e s i s e t r a t a d e e n zi m a s
i n m o v i l i za d o s o l i br e s . En e l pr i m e r c a s o , e l s o po r t e e s u n fa c t o r m u y i m po r t a n t e ya qu e
m u c ha s v e c e s a c t a d e r e s e r v o r i o d e a gu a , i m pi d i e n d o l a pr d i d a d e l a c a pa d e hi d r a t a c i n . En
e l s e gu n d o c a s o , c u a n d o l o s e n zi m a s s o n l i br e s , t a m bi n ha y qu e t e n e r e n c u e n t a l o s
e s t a bi l i za n t e s , c o n s e r v a n t e s y o t r o s c o m pu e s t o s qu e a c o m pa a n a l a m a yo r a d e e n zi m a s
c o m e r c i a l e s c u ya n a t u r a l e za e s ha bi t u a l m e n t e hi d r o fl i c a y qu e , po r t a n t o , pu e d e n a yu d a r a
pr e s e r v a r e l a gu a qu e t i e n e l a e n zi m a .
La r e l a c i n e n t r e l o g P y l a c o n v e r s i n pa r e c e c l a r a , c u a n t o m a yo r e s l o g P m a yo r e s l a
c o n v e r s i n . No o bs t a n t e , e s t a c o r r e l a c i n e s m u c ho m s d i fu s a a l c o m pa r a r s e c o n l a
e n a n t i o s e l e c t i v i d a d , e n c u yo c a s o n o e xi s t e u n a r e l a c i n c l a r a . Es t u d i o s r e c i e n t e s (Du c r e t et
al., 1998) c o n l i pa s a B d e Candida antrctica a t r i bu ye n d i fe r e n c i a s d e e n a n t i o s e l e c t i v i d a d y
c o n v e r s i n a l a c o n ju n c i n d e d o s fa c t o r e s c o m o s o n e l l o g P y l a a c t i v i d a d d e a gu a d e l
m e d i o , a d e m s d e s u ge r i r e l u s o d e o t r a s c a r a c t e r s t i c a s d e l d i s o l v e n t e , c o m o l a c o n s t a n t e
d i e l c t r i c a , e l n d i c e n o r m a l i za d o d e a c o t a c i n d e e l e c t r o n e s o l a s o l u bi l i d a d d e Hi l d e br a n d
c o m o pa r m e t r o s d e c o m pa r a c i n .
Lo s d i s o l v e n t e s m s u t i l i za d o s s o n i s o o c t a n o y n -he xa n o , e s t e l t i m o pe s e a t e n e r u n
l o g P m e n o r y m e n o r e s pr e s t a c i o n e s (Vzqu e z-Li m a et a /., 1995) e s m u y u t i l i za d o d e bi d o a s u
a m pl i o u s o e n pr o c e s o s i n d u s t r i a l e s (Mu s t r a n t a , 1992).
Introduccin 77
Influencia del agua
El e fe c t o d e l a gu a e n r e a c c i o n e s e n m e d i o o r gn i c o ha s i d o o bje t o d e e s t u d i o e n
m u l t i t u d d e r e a c c i o n e s y e n t o d o t i po d e pr o c e s o s (Vzqu e z-Li m a et al., 1995; Fu r u t a n i et al,
1997; De Ca s t r o y Ga go , 1998), d a n d o l u ga r a u n c o n ju n t o d e s i s t e m a s c u ya fu n c i n e s l a d e
c o n t r o l a r e s t e fa c t o r .
We ht je etal. (1997) r e c o ge n d i v e r s o s s i s t e m a s d e e l i m i n a c i n y c o n t r o l d e l a a c t i v i d a d
d e a gu a pa r a s i s t e m a s e n d i s c o n t i n u o y c o n t i n u o c o n d i fe r e n t e s c o n fi gu r a c i o n e s , po r e je m pl o ,
pa r a u n r e a c t o r d e l e c ho fi jo pr o po n e n a c o pl a r u n s i s t e m a c o m pu e s t o d e u n pr i m e r r e a c t o r s i n
c o n t r o l d e a c t i v i d a d d e a gu a d o n d e s e a l c a n za u n a pa r t e d e l a c o n v e r s i n , s e gu i d o d e u n a
t r a m pa pa r a e l i m i n a r e l a gu a qu e fo r m a u n a fa s e d i fe r e n t e d e l m e d i o y t r a s e s t o u n s e gu n d o
r e a c t o r d e s i l i c o n a pe r m e a bl e s u m e r gi d o e n u n a d i s o l u c i n c o n a c t i v i d a d d e a gu a c o n s t a n t e
d o n d e s e a l c a n za u n a c o n v e r s i n fi n a l d e l o r d e n d e l 95 % (Fi g. 1.13).
Fig. 1.13: Si s t e m a d e c o n t r o l d e a c t i v i d a d d e a gu a d i s e a d o po r We ht je et al. (1997).
Ot r o s a u t o r e s d i s e a n d i v e r s o s s i s t e m a s d e c o n t r o l o e l i m i n a c i n d e a gu a , c o m o s o n
e v a po r a c i n o pe r v a po r a c i n (Va n d e r Pa d t et al., 1993; Kwo n et al., 1995) m e d i a n t e e l
a c o pl a m i e n t o d e c o n d e n s a d o r e s , l a a d i c i n d e t a m i z m o l e c u l a r (Vzqu e z-Li m a et al., 1995;
Ha n y Rhe e , 1998) o a ju s t a n d o e l m e d i o d e r e a c c i n a u n a a c t i v i d a d d e a gu a fi ja d a po r e l
c o n t a c t o c o n u n a s a l d e hi d r a t a c i n c o n o c i d a (Sv e n s s o n et al., 1994; Du d a l y Lo r t i e , 1995).
78 Introduccin
En e l c a s o d e l a e s t e r i fc a c i n d e l o s c i d o s 2-a r i l pr o pi n i c o s , e l c o n t e n i d o d e a gu a
d e l m e d i o ha s i d o o bje t o d e d i s c u s i n po r l o qu e s e r e fi e r e a s u e fe c t o e n l a c o n v e r s i n y e n l a
e n a n t i o s e l e c t i v i d a d . A s , pa r a l a e s t e r i fc a c i n d e l i bu pr o fe n o , Mu s t r a n t a (1992) s e a l a qu e
u s a n d o e n zi m a l i br e , l a pr e s e n c i a d e a gu a d i s m i n u ye l a c o n v e r s i n po r l a r e v e r s i bi l i d a d d e l a
r e a c c i n , a s i m i s m o , c o n l i pa s a d e Candida rugosa, l a e n a n t i o s e l e c t i v i d a d e r a m e n o r c u a n t o
m a yo r e r a e l c o n t e n i d o e n a gu a , e xpl i c a n d o e s t o e n t r m i n o s d e r i gi d e z d e l a e n zi m a . Po r o t r o
l a d o , Ki m y Le e (1996), u t i l i za n d o t a m bi n l i pa s a d e Candida rugosa pa r a l a r e s o l u c i n d e l
i bu pr o fe n o e n c u e n t r a n qu e a a d i e n d o s i l i c a ge l y d i fe r e n t e s po r c e n t a je s d e a gu a a d i s t i n t o s
d i s o l v e n t e s , i n c r e m e n t a n l a e n a n t i o s e l e c t i v i d a d ha s t a 16 v e c e s .
Lpe z-B e l m o n t e et al. (1997) ha n d e s c r i t o r e c i e n t e m e n t e c o n l i pa s a d e Rhizomucor
miehei (Li po zym e IM 20) pa r a l a e s t e r i fc a c i n d e i bu pr o fe n o e n c i c l o he xa n o qu e r e a l i za n d o
u n d i s e o d e e xpe r i m e n t o s fa c t o r i a l e l fa c t o r m s i n fl u ye n t e e n e l r e n d i m i e n t o d e l a r e a c c i n
e r a e l c o n t e n i d o e n a gu a d e l m e d i o , v i n i e n d o e s t e c o n t e n i d o r e gu l a d o po r l a c a pa c i d a d d e l
s o po r t e d e i n m o v i l i za c i n d e c a pt a r pa r t e d e l a gu a fo r m a d a .
Po r o t r o l a d o , Du c r e t et al, (1998) ha c e n u n e s t u d i o r i gu r o s o d e l a e s t e r i fc a c i n d e l
i bu pr o fe n o c o n l i pa s a d e Candida antrctica t i po B (No v o zym 435) c o n d i s t i n t a s a c t i v i d a d e s
d e a gu a y s u i n fl u e n c i a e n l a e n a n t i o s e l e c t i v i d a d o bt e n i d a . En e s t e t r a ba jo s e c o n s t a t a c o m o
c a d a e n a n t i m e r o pr e s e n t a u n c o m po r t a m i e n t o d i s t i n t o a v a r i a c i o n e s e n e l c o n t e n i d o d e a gu a ,
r e s u l t a n d o a s u n a d e pe n d e n c i a e n t r e l a e n a n t i o s e l e c t i v i d a d y e l c o n t e n i d o e n a gu a . A s , c o n
d i s o l v e n t e hi d r o fbi c o s c o n a c t i v i d a d d e a gu a c o n t r o l a d a s e o bt i e n e u n a m a yo r c o n v e r s i n ,
pe r o l o s m e jo r e s r e s u l t a d o s e n t r m i n o s d e e n a n t i o s e l e c t i v i d a d s e o bt i e n e c o n d i s o l v e n t e s m s
hi d r o fl i c o s .
Po r l t i m o , s e a l a r qu e r e c i e n t e m e n t e e l e m pl e o d e l a s i s o t e r m a s d e a d s o r c i n d e a gu a
t a n t o d e e n zi m a s l i br e s c o m o i n m o v i l i za d o s s e ha d e m o s t r a d o c o m o u n a he r r a m i e n t a t i l pa r a
pr e d e c i r l a s n e c e s i d a d e s d e a gu a y e l c o m po r t a m i e n t o d e l o s pr e pa r a d o s e n zi m t i c o s e n m e d i o
o r gn i c o (De l a Ca s a et al., 1996).
Introduccin 79
Tiempo de reaccin
Es t e e s u n fa c t o r m u y v a r i a bl e y qu e d e pe n d e r e n gr a n m e d i d a d e l a c a r ga e n zi m t i c a
u t i l i za d a , y d e o t r o s fa c t o r e s c l a v e c o m o l i pa s a u t i l i za d a , c o n t e n i d o d e a gu a , d i s o l v e n t e ,
t e m pe r a t u r a , e t c . pe r o r e c o pi l a n d o l o s t r a ba jo s s o br e e l t e m a s e pu e d e ge n e r a l i za r a qu e u n
t i e m po m n i m o d e r e a c c i n e s t a r e n t r e l a s 24 y l a s 48 h, m i e n t r a s qu e l a m a yo r a d e c a s o s s e
s i t a e n t r e l a s 100 y 200 ho r a s , pu d i e n d o l l e ga r ha s t a 500 ho r a s d e r e a c c i n .
Modificacin de la enzima
A l gu n o s a u t o r e s pr o po n e n a l gn t i po d e m o d i fi c a c i n d e l a e n zi m a pa r a l a m e jo r a d e
l a a c t i v i d a d e n zi m t i c a . A s , pa r a l a e s t e r i fc a c i n d e l i bu pr o fe n o Go t o et al. (1996)
d e s a r r o l l a n u n bi o c a t a l i za d o r a pa r t i r d e l a i n t e r a c c i n e n t r e l a e n zi m a y u n s u r fa c t a n t e ,
o bt e n i e n d o a u m e n t o s i m po r t a n t e s e n l a c o n v e r s i n pa r a l a s l i pa s a s d e Mucor javanicus y
Candida rugosa pe r o s i n d e s c r i bi r u n a i m po r t a n t e m e jo r a e n l a e n a n t i o s e l e c t i v i d a d . Ot r o s
a u t o r e s t a m bi n d e s c r i be n l a a d i c i n d e s u r fa c t a n t e s pa r a m e jo r a r l a pr o d u c t i v i d a d y
s e l e c t i v i d a d e n l a r e s o l u c i n d e l n a pr o xe n o (Ts a i et a /., 1996a ).
Ot r a po s i bi l i d a d d e s c r i t a e n l a bi bl i o gr a fa e s e l e m pl e o d e l o s d e n o m i n a d o s CLEC
("c r o s s -l i n ke d e n zym e c r ys t a l "). En c o n c r e t o , La l o n d e et al. (1995) d e s c r i be e l u s o d e e s t e
t i po d e c r i s t a l e s d e l i pa s a d e Candida rugosa e n l a r e s o l u c i n d e c i d o s 2-a r i l pr o pi n i c o s ,
o bt e n i e n d o m e jo r a s e n l a e s t a bi l i d a d d e l a e n zi m a y e n l a e n a n t i o s e l e c t i v i d a d d e l a r e a c c i n .
En e s t e c a pt u l o t a m bi n s e pu e d e i n c l u i r l a s m o d i fi c a c i o n e s o r i gi n a d a s a l u t i l i za r l a s
l i pa s a s i n m o v i l i za d a s c o v a l e n t e m e n t e . En e s t e t i po d e i n m o v i l i za c i n s e pr o d u c e s i e m pr e u n a
m o d i fi c a c i n qu m i c a e n a l gu n o o a l gu n o s a m i n o c i d o s d e l a pr o t e n a , l o qu e pu e d e pr o v o c a r
c a m bi o s e n l a a c t i v i d a d y e n a n t i o s e l e c t i v i d a d d e l a e n zi m a (Sn c he z et al., 1996; Mo r e n o et
al, 1997).
Ot r o t i po d e m o d i fi c a c i o n e s s o n l a s o r i gi n a d a s po r e l he c ho d e t r a t a r l a e n zi m a c o n
d i s o l v e n t e s po l a r e s d e c a d e n a c o r t a . A s , Cha m o r r o et al. (1998) d e s c r i be n c o m o e l
t r a t a m i e n t o d e l c r u d o d e l i pa s a d e Candida rugosa pr o po r c i o n a d o po r Si gm a c o n d i s o l v e n t e s
80 Introduccin
o r gn i c o s po l a r e s d e c a d e n a c o r t a (m e t a n o l , e t a n o l , 1 y 2-pr o pa n o l , 1 y 2-bu t a n o l y a c e t o n a )
o r i gi n a m e jo r a s e n l a a c t i v i d a d t a n t o e n r e a c c i o n e s d e hi d r l i s i s c o m o e n r e a c c i o n e s d e
e s t e r i fc a c i n y t r a n s e s t e r i fc a c i n e n l a s qu e pa r t i c i pa e l ke t o pr o fe n o . Lo s a u t o r e s s u gi e r e n
qu e e s t e t r a t a m i e n t o m o d i fi c a l a e n zi m a po r a pe r t u r a d e l a t a pa d e s c r i t a po r Gr o c hu l s ki et al.
(1994).
1.7.6. Re s o l u c i n d e r a m -2-fe n i l -c i c l o l i e xa n o l c o n l i pa s a s
El i n t e r s d e e s t e pr o d u c t o e s d e bi d o a qu e s e t r a t a d e u n a u xi l i a r qu i r a l u t i l i za d o e n
pr o c e s o s d e i n d u c c i n a s i m t r i c a qu e s e pu e d e o bt e n e r d e fo r m a e n a n t i o m r i c a m e n t e pu r a po r
v a e n zi m t i c a y qu e pe r m i t e l a s u bs t i t u c i n d e o t r o s pr o d u c t o s c o m o 8-fe n i l -m e n t o l (No v a k y
Ze m i s , 1985).
En l a bi bl i o gr a fa e xi s t e n po c a s r e fe r e n c i a s e n l a s qu e s e ha ga r e fe r e n c i a a l a
r e s o l u c i n d e e s t e c o m pu e s t o m e d i a n t e l i pa s a s . En c o n c r e t o B a s a v a i a h y Ra o (1994) u s a n d o
e s t e r a s a d e hga d o d e po l l o e n r e a c c i n d e hi d r l i s i s o bt u v i e r o n pu r e za s e n a n t i o m r i c a s
s u pe r i o r e s a l 99 % pa r a c o n v e r s i o n e s e n t r e e l 20 y e l 30 % pe r o c o n t i e m po s d e r e a c c i n d e l
o r d e n d e 10-12 d a s .
Ms r e c i e n t e m e n t e , Ca r pe n t e r et al. (1996) d e s c r i be n l a r e s o l u c i n d e l trans-2-fQnil-
c i c l o he xa n o l u t i l i za n d o Li pa s a A m a n o PS30 (Pseudomonas cepacia) y o bt e n i e n d o r e s u l t a d o s
s u pe r i o r e s a l 99 %d e e xc e s o e n a n t i o m r i c o .
Introduccin 81
1.8. Va l o r a c i n e c o n m i c a d e pr o c e s o s
1.8.1. Es t i m a c i n d e l a s pa r t i d a s n e c e s a r i a s
U n a m e t o d o l o ga d e s c r i t a pa r a l a e v a l u a c i n d e pr o c e s o s qu m i c o s s e d e t a l l a e n l o s
t r a ba jo s d e Vi n (1991) y Pe t e r s y Ti m m e r ha u s (1980). Es t a m e t o d o l o ga c o n s t a d e l o s
s i gu i e n t e s pa s s o s :
1. Estimacin de las ventas: c o n o c i e n d o e l pr e c i o d e l pr o d u c t o e n e l m e r c a d o o bi e n
e s t i m a n d o s u v a l o r a pa r t i r d e l a r e n t a bi l i d a d qu e s e qu i e r a o bt e n e r c o n e l pr o c e s o y
c o n o c i e n d o l o s c o s t e s t o t a l e s . Ot r a o pc i n e s a pa r t i r d e c o e fi c i e n t e s d e gi r o qu e
r e l a c i o n a n l a s v e n t a s c o n e l v a l o r d e l i n m o v i l i za d o (Vi n , 1991).
2. Estimacin de la partida de inmovilizado: i n c l u ye l o s e qu i po s n e c e s a r i o s pa r a l a
c o n s t r u c c i n d e l a pl a n t a y a u n qu e e xi s t e n d i fe r e n t e s m t o d o s a pr o xi m a d o s c o m o
c o e fi c i e n t e s d e gi r o o l a r e gl a d e Wi l l i a m s (Vi n , 1991) l a m e jo r e v a l u a c i n e s d e t e r m i n a r
e l pr e c i o d e m e r c a d o d e l o s e qu i po s qu e s e v a ya n a u t i l i za r e n e l pr o c e s o . En e l t r a ba jo d e
Ha ppe l y Jo r d n (1981) s e pr e s e n t a n a bu n d a n t e s t c n i c a s y d a t o s pa r a e s t i m a r e l v a l o r d e
e s t a pa r t i d a .
3. Estimacin del capital circulante: r e fe r i d o e l c a pi t a l qu e e n t r a e n e l c i c l o d e pr o d u c c i n
pe r o qu e e s r e t o r n a d o i n c l u ye v a l o r d e m a t e r i a s pr i m a s e n e xi s t e n c i a , d e pr o d u c t o s a n n o
c o br a d o s , e n a l m a c n o e n c i c l o d e pr o d u c c i n a s c o m o r e pu e s t o s y e xi s t e n c i a s e n c a ja ,
ba n c o s o v a l o r e s . Su e l e e s t i m a r s e c o m o u n po r c e n t a je d e l i n m o v i l i za d o (Vi n , 1991).
4. Estimacin de costes: l o s c o s t e s s e d i v i d e n e n d o s t i po s qu e a s u v e z s e d i v i d e n e n v a r i o s
s u bt i po s :
a ) Costes de fabricacin: qu e s e d i v i d e n e n :
Co s t e s d i r e c t o s : a s o c i a d o s d i r e c t a m e n t e a l a fa br i c a c i n d e l pr o d u c t o :
- Ma t e r i a pr i m a
- Ma n o d e o br a d i r e c t a
82 Introduccin
- Pa t e n t e s
Co s t e s i n d i r e c t o s : n o a s o c i a d o s a l pr o d u c t o :
- Ma n o d e o br a i n d i r e c t a
- Se r v i c i o s ge n e r a l e s
- Su m i n i s t r o s
- Co n s e r v a c i n
- Se r v i c i o s ge n e r a l e s
- Ma n t e n i m i e n t o
- La bo r a t o r i o
- En v a s a d o
- Expe d i c i n
- Di r e c t i v o s y t c n i c o s
- A m o r t i za c i n
- A l qu i l e r e s
- Im pu e s t o s
- Se gu r o s
b) Costes generales:
- Ga s t o s c o m e r c i a l e s
- Ge r e n c i a
- Ga s t o s fi n a n c i e r o s
- In v e s t i ga c i n y s e r v i c i o s t c n i c o s
La m a yo r a d e l o s c o s t e s s e d e t e r m i n a n e n ba s e a l v a l o r d e l a pa r t i d a d e i n m o v i l i za d o ,
a s i gn n d o l e s u n po r c e n t a je d e e s t a pa r t i d a . Di s t i n t o s c r i t e r i o s d e e v a l u a c i n d e l o s c o s t e s s e
pr e s e n t a n e n l o s t r a ba jo s d e Vi n (1991) y Pe t e r s y Ti m m e r ha u s (1980).
El v a l o r d e l a pa r t i d a d e a m o r t i za c i n s u e l e d e t e r m i n a r s e a pa r t e y c o r r e s po n d e a
r e pa r t i r a l o l a r go d e l o s d i fe r e n t e s e je r c i c i o s e l c o s t e t o t a l d e l a pa r t i d a d e i n m o v i l i za d o .
Exi s t e n d i s t i n t o s c r i t e r i o s d e a m o r t i za c i n , c o n s t a n t e , r e gr e s i v a , s u m a d e d gi t o s , s a l d o
d e c r e c i e n t e qu e s e a pl i c a r n e n fu n c i n d e l a s n e c e s i d a d e s d e l pr o c e s o (Vi n , 1991).
Introduccin 83
1 .8.2. Cl c u l o d e Ne t Ca s h Fl o w CNCF) y Re n t Di s c o u n t e d Ca s h Fl o w (RDCF)
U n a v e z c o n o c i d a s l a s d i s t i n t a s pa r t i d a s n e c e s a r i a s pa r a l a e v a l u a c i n d e l pr o c e s o , l a
r e n t a bi l i d a d d e u n pr o c e s o s e s u e l e e v a l u a r po r e l v a l o r d e l KDCF ("Re n t Di s c o u n t e d Ca s h
Fl o w") qu e e s e l v a l o r d e l i n t e r s pa r a e l c u a l e l v a l o r a c t u a l n e t o (VA N) d e t o d o s l o s i n gr e s o s
y d e s e m bo l s o s e s n u l o pa r a l a i n v e r s i n pr o pu e s t a . En fu n c i n d e e s t e v a l o r s e d e c i d i r s i l a
i n v e r s i n e s l o s u fi c i e n t e m e n t e a t r a c t i v a .
U n a n l i s i s d e t a l l a d o d e l c l c u l o y s i gn i fi c a d o d e l RDCF s e pr e s e n t a e n e l t r a ba jo d e
Ri c ha r t (1977). En ge n e r a l , e l RDCF s e r e l v a l o r d e i qu e ha c e qu e l a e c u a c i n (11) s e
c u m pl a :
a i )
d o n d e i e s e l v a l o r d e l RDCF qu e qu e r e m o s c a l c u l a r , t e s e l v a l o r e n a o s qu e d u r a e l pr o c e s o
(s u v i d a e s pe r a d a ) y NCF ("Ne t Ca s h Fl o w") e l m o v i m i e n t o n e t o d e c a ja pa r a c a d a a o qu e s e
pu e d e c a l c u l a r d e fo r m a s i m pl e c o m o :
NCF = B e n e fi c i o s n e t o s - Ca pi t a l In m o v i l i za d o ^ Ca pi t a l Ci r c u l a n t e
(
**
}
* Su e l e a pl i c a r s e e l a o O
** De s i gn o n e ga t i v o e n e l a o 1 y d e s i gn o po s i t i v o e n e l a o t
B e n e fi c i o s n e t o s = B a s e i m po n i bl e -(100-% d e Im pu e s t o s ^)/100
* Se e m pi e za n a pa ga r e n e l a o 2
B a s e i m po n i bl e = Ve n t a s - Co s t e s - A m o r t i za c i n
pa r a c a d a a o j s e c a l c u l a e l v a l o r d e l NCF qu e d e s pu s s e a c t u a l i za c o n e l fa c t o r l /(l +i y pa r a
c a d a a o . La s u m a d e NCF a c t u a l i za d o s e s l o qu e s e c o n o c e c o m o VA N y e l v a l o r d e i pa r a e l
qu e e l VA N e s c e r o s e c o n o c e c o m o RDCF.
84
Introduccin
84
Introduccin
Objetivos 85
2. OBJETIVOS
El o bje t i v o pr i n c i pa l d e l t r a ba jo e s l a u t i l i za c i n d e l a s l i pa s a s pr o d u c i d a s po r Candida rugosa
m e d i a n t e fe r m e n t a c i n a e s c a l a pi l o t o e n l a r e s o l u c i n d e c o m pu e s t o qu i r a l e s c o n
a pl i c a bi l i d a d e n l a i n d u s t r i a fa r m a c u t i c a .
Es t e o bje t i v o ge n e r a l c o n s t a d e l o s s i gu i e n t e s o bje t i v o s pa r c i a l e s :
1. De s a r r o l l o d e l a m e jo r s e c u e n c i a d e separacin pa r a l a o bt e n c i n d e l a e n zi m a e n e s t a d o
s l i d o a pa r t i r d e l m e d i o d e fe r m e n t a c i n c o n l a m e n o r pr d i d a d e a c t i v i d a d po s i bl e .
2. Estudio econmico d e l a v i a bi l i d a d d e l pr o c e s o d e pr o d u c c i n d e l i pa s a s d e Candida
rugosa m e d i a n t e fe r m e n t a c i n .
3. Caracterizacin y purificacin d e l a s d i fe r e n t e s pr o t e n a s qu e c o n t i e n e e l pr e pa r a d o
s l i d o o bt e n i d o y c o m pa r a c i n c o n l a s d e s c r i t a s pa r a l i pa s a s d e Candida rugosa
c o m e r c i a l e s .
4. U t i l i za c i n d e l a l i pa s a U A B l i br e e n reacciones de sntesis e n m e d i o o r gn i c o y
c o m pa r a c i n d e l a a c t i v i d a d c a t a l t i c a d e l a l i pa s a U A B e n e s t o s m e d i o s c o n l i pa s a s d e
Candida rugosa c o m e r c i a l e s .
5. Diseo de una biocatalizador c o n l i pa s a s U A B i n m o v i l i za d a s e n a l gn s o po r t e qu e
pe r m i t a s u u s o e n m e d i o o r gn i c o y s u r e c u pe r a c i n d e l m e d i o . Co m pa r a c i n c o n l i pa s a s
c o m e r c i a l e s i n m o v i l i za d a s .
6. Pu e s t a a pu n t o d e l o s mtodos analticos y de clculo n e c e s a r i o s pa r a e l s e gu i m i e n t o d e
l a s r e a c c i o n e s d e s n t e s i s d e n a t u r a l e za qu i r a l , a s c o m o d e l a o pt i m i za c i n d e l a s
c o n d i c i o n e s d e r e a c c i n .
86
Objetivos
1. U t i l i za c i n d e l a l i pa s a U A B i n m o v i l i za d a e n l a resolucin de compuestos quirales d e
i n t e r s fa r m a c u t i c o . Re s o l u c i n d e d e r i v a d o s 2-a r i l pr o pi n i c o s y d e l /r a /w-2-fe n i l -
c i c l o he xa n o l m e d i a n t e e s t e r i fi c a c i n e n m e d i o o r gn i c o . De t e r m i n a c i n d e l a s
c o n d i c i o n e s pt i m a s d e r e a c c i n .
8. Di s e o d e u n s i s t e m a en continuo pa r a l a pr o d u c c i n d e c o m pu e s t o s e n a n t i o m r i c a m e n t e
pu r o s m e d i a n t e l i pa s a s U A B y c o m e r c i a l e s . Es t u d i o d e l a e s t a bi l i d a d d e l r e a c t o r ,
d e s c r i pc i n d e u n m o d e l o d e fl u jo y r e u t i l i za c i n d e l a e n zi m a .
Materiales y Mtodos 87
3.1. METODOLOGA EXPERIMENTAL
3.1.1. Fe r m e n t a c i n
3.1.1.1. Mo n t a je e xpe r i m e n t a l d e l a fe r m e n t a c i n
Pa r a e l c r e c i m i e n t o d e l a l e v a d u r a y c o r r e s po n d i e n t e pr o d u c c i n d e l i pa s a s s e
e m pl e a r o n l o s s i gu i e n t e s fe r m e n t a d o r e s :
- U n fe r m e n t a d o r B r a u n B i o l a b d e 1.5 l i t r o s d e c a pa c i d a d m xi m a , c o n 0.5 l i t r o s d e
v o l u m e n d e t r a ba jo .
- U n fe r m e n t a d o r B r a u n B i o s t a t E d e 6.4 l i t r o s d e c a pa c i d a d m xi m a , c o n 5 l i t r o s d e
v o l u m e n d e t r a ba jo .
U n fe r m e n t a d o r B r a u n B i o s t a t U D c o n c u ba d e a c e r o i n o xi d a bl e d e 70 l i t r o s d e v o l u m e n
m xi m o y u n v o l u m e n d e t r a ba jo d e 55 l i t r o s .
El fe r m e n t a d o r po s e e d i v e r s o s m d u l o s d e c o n t r o l d e v a r i a bl e s d e pr o c e s o qu e pe r m i t e n
fi ja r d i fe r e n t e s pu n t o s d e c o n s i gn a . La s v a r i a bl e s s o br e l a s qu e s e t i e n e po s i bi l i d a d d e r e a l i za r
u n a a c c i n d e c o n t r o l s o n :
Te m pe r a t u r a : 30C.
- Po r c e n t a je d e o xge n o d i s u e l t o : 30-40 % d e s a t u r a c i n .
- pH: 6.3.
Co n t r o l d e l a v e l o c i d a d d e a gi t a c i n : 500 r pm pa r a t o d o s l o s c a s o s e xc e pt o e n e l B r a u n
B i o s t a t U D d o n d e s e t r a ba j a 400 r pm .
A s i m i s m o , l a a d i c i n d e l a fu e n t e d e c a r bo n o (c i d o o l e i c o ) s e r e a l i za m e d i a n t e u n a
m i c r o bu r e t a Cr i s o n m i c r o B U R 2031. Pe r m i t e e l e m pl e o d e je r i n ga s d e d i fe r e n t e s v o l m e n e s
u t i l i zn d o s e u n a je r i n ga Ha m i l t o n m o d e l o 1001 TLL d e 1 m i d e c a pa c i d a d t o t a l . Pa r a e l
fe r m e n t a d o r B i o s t a t U D s e e m pl e a u n a je r i n ga d e 2.5 m i d e c a pa c i d a d t o t a l . Di s po n e d e u n a
e n t r a d a RS232 l o qu e pe r m i t e l a c o m u n i c a c i n c o n e l o r d e n a d o r pr i n c i pa l qu e ge s t i o n a r l o s
v o l m e n e s a d i c i o n a d o s y l a fr e c u e n c i a d e a d i c i n .
88 Materiales y Mtodos
Co m o o t r a i n s t r u m e n t a c i n u t i l i za d a c a be s e a l a r :
- Cm a r a d e fl u jo l a m i n a r Te l s t a r B H-10.
- A u t o c l a v e Hi r a yi m a m a n u fa c t u r i n g c o r po r a t i o n HA -30.
- A u t o c l a v e P-S e l e c t a .
- Mi c r o s c o pi o Ol ym pu s B H-2.
- Mi c r o s c o pi o Ze i s s A xi o s ko p.
- Es t u fa d e i n o c u l a c i n d e pl a c a s Me m m e r t : Ed e l s t a r ht Ro s t Fr e i .
3.1.1.2. Me d i o v r e a c t i v o s d e l a fe r m e n t a c i n
Re a c t i v o s d e fe r m e n t a c i n :
- A gu a d e s i o n i za d a
- Ext r a c t o d e m a l t a
- Ext r a c t o d e l e v a d u r a
- Tr i pt o n a
- A ga r ba c t e r i o l gi c o
- KH
2
PO
4
- K
2
HP0
4
- Na
2
HP0
4
.12H
2
0
- (NH4)
2
SO
4
- MgS0
4
-7H
2
O
- NH
4
OH30%
- Fe Cl
3
-6H
2
O
- In o s i t o l
- B i o t i n a
- Ti a m i n a -HCl
- A n t i e s pu m a n t e
c i d o o l e i c o
A d s a -Mi c r o
Pr o n a d i s a
A d s a -Mi c r o
A d s a -Mi c r o
Pa n r e a c pa r a a n l i s i s
Pa n r e a c pa r a a n l i s i s
Pa n r e a c pa r a a n l i s i s
Pa n r e a c pa r a a n l i s i s
Pa n r e a c pu r s i m o
Pa n r e a c pa r a a n l i s i s
Pa n r e a c pu r s i m o
Fl u ka pa r a m i c r o bi o l o ga
Fl u ka pa r a m i c r o bi o l o ga
Fl u ka pa r a m i c r o bi o l o ga
B r a u n B i o t e c h
Si gm a pu r s i m o
El m e d i o d e c u l t i v o e s t fo r m a d o po r u n a s o l u c i n bs i c a d e c o m po s i c i n po r l i t r o : KH
2
PO
4
, 15
g; K
2
HPO
4
, 5.5 g; (NH
4
)
2
SO
4
, 4 g; MgS0
4
.7H
2
0, 1 g; bi o t i n a , 0.008 m g; t i a m i n a .HCl , 0.2 m g;
i n o s i t o l , 0.004 m g y Fe Cl
3
, 10 m g.
Materiales y Mtodos 89
3.1.1.3. Ma n t e n i m i e n t o d e l a l e v a d u r a v s i s t e m a d e i n c u l o s
En e s t e t r a ba jo s e ha u t i l i za d o l a l e v a d u r a Candida rugosa A TCC 14830. La l e v a d u r a
e r a m a n t e n i d a a -20C e n a n i l l o s po r o s o s e n gl i c e r o l , m e d i a n t e e l ki t Mi c r o ba n k d e Pr o -La b
Di a gn o s t i c s . La c e pa e s t r a s pa s a d a a u n a pl a c a d e pe t r i c o n t e n i e n d o a ga r c o n e xt r a c t o d e m a l t a
d o n d e e s i n c u ba d a d u r a n t e 48 h a 30C. Es t a s i e m br a d e pl a c a s s e r e a l i za po r t r i pl i c a d o . A pa r t i r
d e u n a d e l a s pl a c a s s e i n o c u l a u n a bo t e l l a d e 250 m i c o n 50 m i d e v o l u m e n t i l c o n t e n i e n d o 2
g/1 d e c i d o o l e i c o y e l m e d i o e s pe c i fi c a d o . La s bo t e l l a s s e r e a l i za n po r d u pl i c a d o y s u t i e m po
d e i n o c u l a c i n s e fi ja e n 24 h. A pa r t i r d e u n a d e l a s bo t e l l a s s e i n o c u l a e l fe r m e n t a d o r B r a u n
B i o l a b d e 0.5 1 d e v o l u m e n c o n t e n i e n d o 4 g/1 d e c i d o o l e i c o y e l m e d i o e s pe c i fi c a d o . En e s t a
fe r m e n t a c i n , c u ya d u r a c i n e s d e 24 h, n o s e t i e n e c o n t r o l d e l pH n i d e l o xge n o d i s u e l t o . Lo s
0.5 1 d e e s t e fe r m e n t a d o r s i r v e n d e i n o c u l o pa r a e l B r a u n B i o s t a t E, d o n d e s e r e pi t e l a o pe r a c i n
e n d i s c o n t i n u o l l e v a d a a c a bo e n e l fe r m e n t a d o r B r a u n B i o l a b pe r o c o n 5 1 d e v o l u m e n , qu e
s e r v i r n d e i n o c u l o pa r a e l fe r m e n t a d o r pi l o t o B r a u n B i o s t a t U D.
En e s t e fe r m e n t a d o r , u n pr o c e s o e n d i s c o n t i n u o d e 2 g/1 d e c i d o o l e i c o pr e c e d e a l a
o pe r a c i n e n fe d -ba t c h a c a u d a l d e a d i c i n c o n s t a n t e d e 0.2 g/(h-l fe r m e n t a d o r ). Es t e c a u d a l s e
a a d e m e d i a n t e u n a m i c r o bu r e t a pr o gr a m a d a . La d u r a c i n d e l pr o c e s o e n d i s c o n t i n u o e s d e l
o r d e n d e 10 h, m i e n t r a s qu e l a d e l fe d -ba t c h e s d e l o r d e n d e 30 h. En l a s d o s l t i m a s e t a pa s d e l a
fe r m e n t a c i n , s e s i gu e u n c o n t r o l r i gu r o s o d e l o s pa r m e t r o s fs i c o s d e s i s t e m a , c o m o
t e m pe r a t u r a , pH, o xge n o d i s u e l t o y a gi t a c i n , a s c o m o d e l o s pa r m e t r o s bi o l gi c o s , d e l o s
qu e s e s i gu e n bi o m a s a , a c t i v i d a d l i po l t i c a y o bs e r v a c i o n e s a l m i c r o s c o pi o .
U n a d e s c r i pc i n d e t a l l a d a d e l s i s t e m a e xpe r i m e n t a l d e fe r m e n t a c i n y d e l a
i n s t r u m e n t a c i n d e s a r r o l l a d a s e e n c u e n t r a e n l o s t r a ba jo s d e Go r d i l l o (1996) y Sa n z (1998).
90 Materiales y Mtodos
3.1.2. Se pa r a c i n
Pa r a l a s e pa r a c i n d e l a l i pa s a d e l m e d i o d e c u l t i v o s e u t i l i z l a s i gu i e n t e i n s t r u m e n t a c i n :
1) Ce n t r i fu ga c i n : c e n t r fu ga e n c o n t i n u o We s t fa l i a Se pa r a t o r A G (CSA 1-06-475)
t r a ba ja n d o a SOOOg y 20 1/h. Pa r a v o l m e n e s m e n o r e s d e 5 l i t r o s s e u t i l i za r o n l a s
s i gu i e n t e s c e n t r fu ga s :
- Ce n t r fu ga Ko n t r o n A n a l yt i c a l Ce n t r i ko n /H-401.
- Ce n t r fu ga He r a e u s Se pa t e c h Me ga fu ge 1.0.
- Ce n t r fu ga B e c km a n J2-21M/E.
2) Mi c r o fl t r a c i n 0.45 |a m : Mi n i t a n Mi l l i po r e c o n 4 m e m br a n a s PVDF 0.45 u m d e c o r t e .
Pa r a v o l m e n e s m e n o r e s a 5 1 s e pu e d e u t i l i za r u n s i s t e m a t r a d i c i o n a l d e fi l t r a c i n a l v a c o
m e d i a n t e fi l t r o s d e fi br a d e v i d r i o (Wha t m a n GF/F) d e 0.45 u n d e t a m a o d e po r o .
3) U l t r a fl t r a c i n 10 kDa : Ce n t r a s e t t e Pa l i Fi l t r e n c o n 1 m e m br a n a OMEGA 10K d e c o r t e .
Ot r o s s i s t e m a s a l t e r n a t i v o s pa r a v o l m e n e s m e n o r e s s o n l o s s i gu i e n t e s :
- Si s t e m a Mi n i t a n Mi l l i po r e e qu i pa d o c o n 4 m e m br a n a s PMNL d e 10 kDa d e c o r t e pa r a
v o l m e n e s n o s u pe r i o r e s a 5 1.
- Si s t e m a Pr e p/Sc a l e TTF Mi l l i po r e c o n u n PTGC 10 K 2.5 ft
2
Ca r t r i d ge ha s t a 15 1.
4) Pr e c i pi t a c i n d e l a pr o t e n a :
- Pr e c i pi t a c i n c o n e t a n o l : l a m u e s t r a s e t r a t a c o n 2 v o l m e n e s d e e t a n o l a 0C. La s o l u c i n s e
m a n t i e n e c o n s t a n t e m e n t e a gi t a d a a 0C d u r a n t e l a a d i c i n y s e d e ja a gi t a n d o d u r a n t e 1 h. La
pr o t e n a pr e c i pi t a d a s e s e pa r a po r c e n t r i fu ga c i n a SOOOg y e l pe l l e t s e s e c a a t e m pe r a t u r a
a m bi e n t e .
- Pr e c i pi t a c i n c o n s u l fa t o a m n i c o : s e a a d e n a l a m u e s t r a d i v e r s a s c a n t i d a d e s d e s u l fa t o
(Ha r r i s a n d A n ga l , 1989). La s o l u c i n s e m a n t i e n e c o n s t a n t e m e n t e a gi t a d a a 0C d u r a n t e l a
a d i c i n y s e d e ja a gi t a n d o d u r a n t e 1 h. La pr o t e n a pr e c i pi t a d a s e s e pa r a po r c e n t r i fu ga c i n a
SOOOg y e l pe l l e t s e s e c a a t e m pe r a t u r a a m bi e n t e .
5) Li o fl i za c i n : l a s m u e s t r a s s e c o n ge l a n pr e v i a m e n t e c o n n i t r ge n o l qu i d o o u n a m e zc l a d e
n i e v e c a r bn i c a /a c e t o n a y s e l i o fi l i za n d u r a n t e 24 h e n u n l i o fi l i za d o r Vi r t i s Se n t r y 5L.
Materiales y Mtodos 91
3.1.3. Cr o m a t o gr a fa e n FPLC
El e qu i po u t i l i za d o fu e u n FPLC Sys t e m d e Pha r m a c i a B i o t e c h e qu i pa d o c o n d o s
bo m ba s Pha r m a c i a LKB -Pu m p P-500, u n c o n t r o l a d o r Pha r m a c i a LKB Co n t r o l l e r LCC-500
CI, u n d e t e c t o r d e u l t r a v i o l e t a Pha r m a c i a Mo n i t o r U V-M y u n c o l e c t o r d e fr a c c i o n e s
Pha r m a c i a LKB -Fr a c -200, t o d o e l l o c o m a n d a d o po r u n o r d e n a d o r c o n e l s o ft wa r e Pha r m a c i a
FPLC Di r e c t o r 1.03.
3.1.3.1. Cr o m a t o gr a fa d e i n t e r c a m bi o i n i c o
En e s t e c a s o , s e u t i l i za r o n d o s c o l u m n a s ba s a d a s e n e s t e pr i n c i pi o :
- Mi l l i po r e DEA E Me m s e p 1000 (1 m i ).
Co l u m n a Pha r m a c i a FR 5/5 (1 m i ) u t i l i za n d o r e l l e n o Pha r m a c i a So u r c e 15Q.
Pa r a l a s e pa r a c i n po r c r o m a t o gr a fa d e i n t e r c a m bi o i n i c o s e u t i l i za r o n d o s m t o d o s
d i s t i n t o s :
1) Mt o d o e n e s c a l n : s e pr e pa r a ba n d o s l a m po n e s d e n o m i n a d o s A y B d e Tr i s -HCl 20 m M
a pH=7.40. En e l bu ffe r B ha ba a d e m s , Na Cl d e c o n c e n t r a c i n 1 M. Co n e s t o s l a m po n e s
d e s e gu a e l pa t r n d e s c r i t o e n l a fi gu r a 3.1.
2) Mt o d o d e gr a d i e n t e : s e pr e pa r a ba n l o s m i s m o s l a m po n e s pe r o l a e v o l u c i n d e l a
c o n c e n t r a c i n d e Na Cl e r a e n fo r m a d e gr a d i e n t e . Es t e s i s t e m a t a m bi n s e m u e s t r a e n l a
fi gu r a 3.1
La c o n c e n t r a c i n pt i m a d e m u e s t r a i n i c i a l pa r a e s t e t i po d e c r o m a t o gr a fa e s d e 1-10 m g
po l v o l i o fl i za d o /m l d e bu ffe r A , c e n t r i fu ga d o s a l OOOOg pr e v i a m e n t e a l a i n ye c c i n . U n
v o l u m e n d e i n ye c c i n c o r r e c t o s e s i t a e n t r e l o s 100 y 500 u l .
La d e s c r i pc i n d e a m bo s m t o d o s t a l y c o m o s e pr o gr a m c o n e l s o ft wa r e e m pl e a d o s e r e c o ge
e n e l c a pt u l o 8.13.
92
Materiales y Mtodos
1.0 -
0.9 -
0.8 -
0.7 -
0.6 -
o -
5
-
0.4 -
0.3 -
0.2 -
0.1 -
0.0
Mt o d o e n e s c a l n
Mt o d o e n gr a d i e n t e
O 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Ti e m po (m i n )
Fi g. 3.1.: Di s t i n t o s m t o d o s pa r a l a c r o m a t o gr a fa d e i n t e r c a m bi o i n i c o .
3.1.3.2. Cr o m a t o gr a fa d e ge l fi l t r a c i n
En e s t e c a s o , s e u t i l i za r o n d o s c o l u m n a s :
- Co l u m n a Pha r m a c i a HR 10/30 (24 m i ) c o n r e l l e n o Pha r m a c i a Su pe r d e x 75 (s e pa r a c i n
e n t r e 3 y 70 kDa ).
- Co l u m n a Pha r m a c i a Hi Lo a d 26/60 (325 m i ) c o n r e l l e n o Pha r m a c i a Su pe r d e x 200
(s e pa r a c i n e n t r e 10 y 600 kDa ).
La c r o m a t o gr a fa s e r e a l i za ba s i m pl e m e n t e c o n u n c a u d a l fi jo d e u n t a m po n Tr i s -HCl 20 m M
a pH=7.40. La c o n c e n t r a c i n pt i m a d e m u e s t r a pa r a e s t e t i po d e c r o m a t o gr a fa e s d e 1-10
m g po l v o l i o fl i za d o /m l d e bu ffe r A , c e n t r i fu ga d o s a l OOOOg pr e v i a m e n t e a l a i n ye c c i n . U n
v o l u m e n d e i n ye c c i n c o r r e c t o s e s i t a e n t r e l o s 0.5 y 5 m i .
Materiales y Mtodos 93
La d e s c r i pc i n d e l m t o d o e m pl e a d o t a l y c o m o s e pr o gr a m c o n e l s o ft wa r e e m pl e a d o s e
ha l l a e n e l c a pt u l o 8.13.
3.1.3.3. Cr o m a t o gr a fa d e i n t e r a c c i n hi d r o fbi c a
El r e l l e n o u t i l i za d o e n e s t e c a s o fu e d e Phe n yl Se pha r o s e Hi gh Pe r fo r m a n c e d e
Pha r m a c i a B i o t e c h, i n t r o d u c i d o e n d o s c o l u m n a s Pha r m a c i a HR 5/5 (1 m l ) y HR 10/30 (24
m i ) d e pe n d i e n d o d e l v o l u m e n d e m u e s t r a d e s e a d o .
En e s t e c a s o , s e r e qu e r a l a pr e pa r a c i n d e d o s t a m po n e s A y B d e Tr i s -HCl 20 m M a
pH=7.40, c o n e l t a m pn A c o n t e n i e n d o t a m bi n s u l fa t o a m n i c o e n u n a c o n c e n t r a c i n d e 1.7
M. En e s t e c a s o , t r a s 10 m i n u t o s d e i n ye c c i n d e m u e s t r a e n e l t a m pn A , s e s o m e t e a l a
c o l u m n a a u n gr a d i e n t e d e fu e r za i n i c o d e c r e c i e n t e pa s a n d o d e u n 100 % a u n O % d e
t a m pn A , qu e s e s u bs t i t u ye pa u l a t i n a m e n t e po r e l t a m pn B .
La c o n c e n t r a c i n pt i m a d e m u e s t r a pa r a e s t e t i po d e c r o m a t o gr a fa e s d e 1-10 m g
po l v o l i o fi l i za d o /m l d e bu ffe r A , d e ja d o s a gi t a r d u r a n t e 30 m i n u t o s y c e n t r i fu ga d o s a l OOOOg
pr e v i a m e n t e a l a i n ye c c i n . U n v o l u m e n d e i n ye c c i n c o r r e c t o s e s i t a e n t r e l o s 100 a 500 \
pa r a l a c o l u m n a HR 5/5 y 1-5 m i pa r a l a c o l u m n a HR 10/30.
La d e s c r i pc i n d e l m t o d o t a l y c o m o s e pr o gr a m c o n e l s o ft wa r e e m pl e a d o s e ha l l a
e n e l c a pt u l o 8.13.
3.1.4. El e c t r o fo r e s i s
SDS-PA GE (So d i u m d o d e c yl s u l fa t e po l ya c r yl a m i d e ge l e l e c t r o pho r e s i s ) s e l l e v a
c a bo e n c o n d i c i o n e s d e s n a t u r a l i za n t e s d e a c u e r d o c o n l o s pr o t o c o l o s d e s c r i t o s po r La e m m l i
(1970), e n ge l e s a l 12 y 15 % d e po l i a c r i l a m i d a . La s e l e c t r o fo r e s i s s e r e a l i za r o n e n u n Mi n i
Pr o t e a n II c e l l d e B i o r a d .
La s pr o t e n a s fu e r o n v i s u a l i za d a s c o n t i n c i n d e Co o m a s s i e B r i l l i a n t B l u e o Ni t r a t o d e
Pl a t a d e pe n d i e n d o d e l a c o n c e n t r a c i n d e pr o t e n a y d e a c u e r d o c o n l o s pr o t o c o l o s e s t n d a r .
Lo s po l i s a c r i d o s (y gl i c o pr o t e n a s ) fu e r o n t e i d o s c o n r e a c t i v o d e Sc hi ff d e a c u e r d o c o n e l
pr o t o c o l o d e s c r i t o po r Ja y et al. (1990).
94 Materiales y Mtodos
3.1.5. Re a c c i o n e s n o qu i r a l e s
3.1.5.1. Re a c c i o n e s d e hi d r l i s i s
La s r e a c c i o n e s d e hi d r l i s i s e n m e d i o a c u o s o t u v i e r o n l u ga r e n e l fe r m e n t a d o r B r a u n
B i o l a b c o n 0.5 1 d e v o l u m e n d e t r a ba jo , c o n t r o l a n d o l a a gi t a c i n , qu e s e m a n t u v o a 500 r .p.m .
y l a t e m pe r a t u r a , qu e s e m a n t u v o a 40 C.
El r e a c t o r e s t a ba c e r r a d o a l a m bi e n t e pe r o c o n u n a e n t r a d a s u pe r i o r qu e s e a br a pa r a
o bt e n e r l a s m u e s t r a s qu e u n a v e z fi l t r a d a s e r a n i n t r o d u c i d a s e n u n ba o d e a gu a hi r v i e n d o
d u r a n t e 3 m i n u t o s c o n e l fi n d e d e s a c t i v a r l a e n zi m a . U n bl a n c o r e a l i za d o e n l a s c o n d i c i o n e s
d e t r a ba jo n o s u pu s o l a a pa r i c i n d e hi d r l i s i s a pr e c i a bl e .
3.1.5.2. Re a c c i o n e s d e s n t e s i s
La s r e a c c i o n e s d e s n t e s i s e n m e d i o o r gn i c o t u v i e r o n l u ga r e n pe qu e o s r e a c t o r e s d e
25 m i c o n 10 m i d e v o l u m e n d e t r a ba jo c e r r a d o s he r m t i c a m e n t e . La t e m pe r a t u r a s e m a n t u v o
a 40 C y l a s c o n c e n t r a c i o n e s d e l o s r e a c t i v o s fu e r o n d e 100 m M s i n o s e e s pe c i fi c a l o
c o n t r a r i o . La s m u e s t r a s e r a n fi l t r a d a s po r 0.45 ja m a n t e s d e s e r a n a l i za d a s . La s r e a c c i o n e s s e
l l e v a r o n a c a bo e n u n i n c u ba d o r o r bi t a l c o n u n a a gi t a c i n d e 250 r pm .
3.1.6. In m o v i l i za c i n
3.1.6.1. In m o v i l i za c i n s o br e Ce l i t a y Po l i a m i d a
Se d i s u e l v e l a c a n t i d a d n e c e s a r i a d e pr e pa r a d o l i o fi l i za d o pa r a o bt e n e r 15000 U d e
a c t i v i d a d l i po l t i c a e n 1 m i t a m pn Tr i s -HCl 20 m M a pH=7.40. So br e e s t e v o l u m e n s e
a a d e n 1 g d e c e l i t a 545 (Fl u ka ) y po l i a m i d a 11 (Me r c k) r e s pe c t i v a m e n t e , ho m o ge n e i za n d o
c o n t i n u a m e n t e l a m e zc l a s l i d o -l qu i d o . En e s t e m e zc l a , u n a pr o po r c i n pt i m a e s l a d e 1 g
d e s o po r t e /m i d e e n zi m a d i s u e l t o . U n a v e z a a d i d a l a c a n t i d a d t o t a l d e s o po r t e s e l i o fi l i z
ha s t a pe s o c o n s t a n t e . La e n zi m a i n m o v i l i za d a s e gu a r d a a -20C.
Materiales y Mtodos 95
3.1.6.2. In m o v i l i za c i n s o br e Du o l i t e
Se d i s u e l v e l a c a n t i d a d d e s e a d a d e e n zi m a a i n m o v i l i za r (pa r a o bt e n e r 100- 1000 U /g
d e s o po r t e ) e n t a m pn Tr i s -HCl 20 m M a pH=7.40.
El s o po r t e , Du o l i t e A 568, e s hu m e d e c i d o c o n e t a n o l a bs o l u t o a r a zn d e 6 m l /g d e
s o po r t e , y d e s pu s s e l a v a u n a v e z c o n 50 m i d e t a m pn fo s fa t o 0.1 M a pH=7.00 d u r a n t e 30
m i n u t o s y d o s v e c e s c o n e l m i s m o t a m pn pe r o 0.01 M d u r a n t e 30 m i n u t o s . El i m i n a n d o e l
l qu i d o d e l l t i m o l a v a d o ya s e pu e d e a a d i r l a d i s o l u c i n d e l a e n zi m a . Se d e ja a gi t a n d o l a
m e zc l a s u a v e m e n t e (e n u n r o l l e r Mo v i l -Ro d d e P-s e l e c t a ) d u r a n t e 1 h.
Tr a s e s t e pe r o d o s e fi l t r a l a m e zc l a y s e l a v a e l fi l t r o 2 v e c e s c o n a gu a d e s t i l a d a . El
s o po r t e s e d e ja s e c a r a t e m pe r a t u r a a m bi e n t e . La e n zi m a i n m o v i l i za d a s e gu a r d a a -20C.
3.1.6.3. In m o v i l i za c i n s o br e EP100
Se d i s u e l v e l a c a n t i d a d d e s e a d a d e e n zi m a a i n m o v i l i za r (pa r a o bt e n e r 100000 U /g d e
s o po r t e ) e n t a m pn fo s fa t o 20 m M a pH=7.00.
El s o po r t e e s hu m e d e c i d o c o n e t a n o l a bs o l u t o a r a zn d e 3 m l /g d e s o po r t e ,
El i m i n a n d o e l e t a n o l ya s e pu e d e a a d i r l a d i s o l u c i n d e l a e n zi m a . Se d e ja a gi t a n d o l a
m e zc l a s u a v e m e n t e (e n u n r o l l e r Mo v i l -Ro d d e P-s e l e c t a ) d u r a n t e t o d a l a n o c he .
Tr a s e s t e pe r i o d o s e fi l t r a l a m e zc l a y s e l a v a e l fi l t r o 2 v e c e s c o n a gu a d e s t i l a d a . El
s o po r t e s e d e ja s e c a r a t e m pe r a t u r a a m bi e n t e o m e d i a n t e u n d e s e c a d o r . La e n zi m a
i n m o v i l i za d a s e gu a r d a a -20C.
3.1.7. Re a c c i o n e s qu i r a l e s
Da d a u n a r e a c c i n d e s n t e s i s qu i r a l d o n d e u n a m e zc l a r a c m i c a c o m pu e s t a po r l o s
e n a n t i m e r o s R,S r e a c c i o n a c o n u n a a ge n t e e s t e r i fi c a n t e pa r a ge n e r a r d o s e n a n t i m e r o s R y S
d e l s t e r y a gu a , s e d e fi n i e r o n l o s s i gu i e n t e s c o n c e pt o s a l a ho r a d e s e gu i r u n a r e a c c i n qu i r a l :
Co n v e r s i n t o t a l (X):
X = (Jc l OO)
(^ester + Ur H ~ C-
96
Materiales y Mtodos
s i e n d o Ce s t e r l a c o n c e n t r a c i n t o t a l d e s t e r fo r m a d o y C
r
y C
s
l a s c o n c e n t r a c i o n e s d e l o s
e n a n t i m e r o s R y S d e l r e a c t i v o r e s pe c t i v a m e n t e .
En e l c a s o d e r e a c c i o n e s c o n e l e v a d a e n a n t i o s e l e c t i v i d a d s e pu e d e a s u m i r qu e l a
c o n v e r s i n r e s pe c t o a l e n a n t i m e r o qu e r e a c c i o n a (XA ) e s a pr o xi m a d a m e n t e : XA = 2X, e s
d e c i r , s u po n e r qu e t o d a l a c o n v e r s i n s e r e fi e r e a u n o d e l o s d o s e n a n t i m e r o s . A m bo s
v a l o r e s , X y XA t o m a r n v a l o r e s d e s d e Oa 100. En e l c a s o d e e n a n t i o s e l e c t i v i d a d pe r fe c t a y
r e a c c i n c o m pl e t a : X = 50 % y XA = 100 %.
Exc e s o e n a n t i o m r i c o (EE):
e l e xc e s o e n a n t i o m r i c o s i e m pr e s e r e fi e r e a u n o d e l o s d o s e n a n t i m e r o s , y pu e d e r e fe r i r s e a l
pr o d u c t o o a l r e a c t i v o . En e l c a s o e s t u d i a d o , s e r e fe r i r a l e xc e s o e n a n t i o m r i c o d e l r e a c t i v o .
El e xc e s o e n a n t i o m r i c o t o m a r v a l o r e s e n t r e e l O y e l 100 %.
Pu r e za (PV.
Pr =
Cr
Cr +C
-(xl OO)
G
G + G
0100)
l a pu r e za , a l i gu a l qu e e l e xc e s o e n a n t i o m r i c o , t a m bi n s e r e fi e r e a u n o d e l o s d o s
e n a n t i m e r o s . En e l c a s o e s t u d i a d o , s e r e fe r i r a l a pu r e za d e l r e a c t i v o . La pu r e za t o m a r
v a l o r e s e n t r e e l O y e l 100 %.
En a n t i o s e l e c t i v i d a d (E):
e s t e v a l o r r e l a c i o n a l a c o n v e r s i n t o t a l c o n e l e xc e s o e n a n t i o m r i c o pa r a d a r u n v a l o r e n t r e O
pa r a r e a c c i n n o e n a n t i o s e l e c t i v a e i n fi n i t o pa r a u n a r e a c c i n pe r fe c t a m e n t e e n a n t i o s e l e c t i v a .
En t r m i n o s ge n e r a l e s , s e c o n s i d e r a u n a r e a c c i n e n a n t i o s e l e c t i v a a pa r t i r d e v a l o r e s d e E
s u pe r i o r e s a 25.
Materiales y Mtodos 97
3.1.8. Di s e o d e e xpe r i m e n t o s
Po r l o qu e s e r e fi e r e a l a r e a l i za c i n d e l d i s e o d e e xpe r i m e n t o s , s e c o n s t r u y u n
pr o gr a m a e n l e n gu a je Fo r t r a n u t i l i za n d o e l e n t o r n o Mi c r o s o ft Fo r t r a n Po we r s t a t i o n v e r s i n
4.0 pa r a l a r e s o l u c i n d e l a s m a t r i c e s qu e s e o r i gi n a n e n l a bs qu e d a d e l a fu n c i n qu e
o pt i m i za l o s pa r m e t r o s . Es t e s o ft wa r e ha c e u s o d e l a s l i br e r a s IMSL i n c o r po r a d a s e n e l
pr o pi o e n t o r n o . U n e je m pl o d e pr o gr a m a u t i l i za d o s e ha l l a e n l a s e c c i n 8.14.
Pa r a l a o pt i m i za c i n d e l a fu n c i n o bje t i v o s e c o n s t r u y u n pr o gr a m a u s a n d o e l
m i s m o s o ft wa r e , c o m o t a m bi n s e d e s c r i be e n l a s e c c i n 8.14.
3.1.9. Mo n t a je d e l a s r e a c c i o n e s e n c o n t i n u o
Co m o RCFP s e e l i gi u n a c o l u m n a d e a c e r o i n o xi d a bl e qu e e n r e a l i d a d e r a u n
c o l u m n a d e FDPLC (A m i n e x HPX-87H B i o r a d ) v a c a d e r e l l e n o y d e d i m e n s i o n e s 30c m x
7.8m m , c o n l o qu e s e o bt i e n e u n r e a c t o r d e v o l u m e n r e a l d e 14.3 m i .
El m o n t a je c o n s i s t a e n u n a e n t r a d a d e a l i m e n t o c u yo c a u d a l v e n a r e gu l a d o po r u n a
m i c r o bu r e t a pr o gr a m a d a pa r a a a d i r c a n t i d a d e s fi ja s y pr e c i s a s d e a l i m e n t o . La c o l u m n a
e s t a ba he r m t i c a m e n t e c e r r a d a y s u m e r gi d a e n u n ba o t e r m o s t a t i za d o d o n d e s e r e gu l a ba l a
t e m pe r a t u r a . La s m u e s t r a s s e t o m a ba n a l a s a l i d a . De t a l l e s d e l m o n t a je s e pr e s e n t a n e n l a s
fi gu r a s 4.8.7.a /b.
En e l c a pt u l o 8.15 s e pr e s e n t a e l pr o gr a m a d e s a r r o l l a d o pa r a c o n t r o l a r l a m i c r o bu r e t a
d e s d e e l o r d e n a d o r m e d i a n t e e l l e n gu a je B o r l a n d Tu r bo C++ v e r s i n 3.0.
98 Materiales y Mtodos
3.2. MTODOS DE ANLISIS
3.2.1. Fe r m e n t a c i n y pu r i fi c a c i n
3.2.1.1. De t e r m i n a c i n d e l a bi o m a s a po r pe s o s e c o
Pa r a l a d e t e r m i n a c i n d e l pe s o s e c o s e fi l t r a u n v o l u m e n c o n o c i d o d e m u e s t r a a l v a c o
m e d i a n t e u n fi l t r o d e fi br a d e v i d r i o (Wha t m a n GF/F) d e 0.45 u m d e t a m a o d e po r o
pr e v i a m e n t e t a r a d o e n s e c o . Se gu i d a m e n t e , s e l a v a c o n 10 m i d e u n a m e zc l a d e d i o xa n o -
pr o pi n i c o 1:1 (v /v ) pa r a a r r a s t r a r l o s r e s t o s d e c i d o o l e i c o qu e pu e d a c o n t e n e r l a m u e s t r a y
qu e i n t e r fe r i r a n e n l a m e d i d a d e l a bi o m a s a . A c o n t i n u a c i n , s e l a v a l a m u e s t r a c o n 25 m i d e
a gu a d e s t i l a d a y s e c o l o c a a 100 C ha s t a l l e ga r a pe s o c o n s t a n t e (a pr o xi m a d a m e n t e 12 h).
3.2.1.2. Te s t d e a c t i v i d a d l i po l t i c a po r m t o d o t u r bi d i m t r i c o
El m t o d o c o n s i s t e e n e l s e gu i m i e n t o d e l a v a r i a c i n d e l a t u r bi d e z d e u n m e d i o
t a m po n a d o qu e c o n t i e n e u n t r i gl i c r i d o , t r i o l e n a , Ca Cb pa r a fo r m a r l o s ja bo n e s d e l c i d o
gr a s o a m e d i d a qu e a pa r e c e e l c i d o o l e i c o e n e l m e d i o , y u n t e n s o a c t i v o , d e s o xi c o l a t o s d i c o ,
qu e pe r m i t e l a fo r m a c i n d e l a e m u l s i n . La d i s m i n u c i n d e l a t u r bi d e z s e d e be a l a
d e s a pa r i c i n d e l a t r i o l e n a a l s e r hi d r o l i za d o s u e n l a c e s t e r po r a c c i n d e l a s l i pa s a s .
El a n l i s i s s e r e a l i za r e ge n e r a n d o e n 5 m i d e t a m pn t r i s -HCl 200 m M a pH=7.40 l a
e m u l s i n pr o po r c i o n a d a po r B o e hr i n ge r e n s u t e s t d e d e t e r m i n a c i n d e l i pa s a s (Ki t 159697).
A 750 u l d e e s t e s u bs t r a t o s e a a d e n 250 u l d e m u e s t r a , s e a gi t a n pr e v i a m e n t e y s e i n t r o d u c e n
e n u n a c u be t a t e r m o s t a t i za d a a 42 C, y s e r e a l i za n l e c t u r a s d e a bs o r ba n c i a c a d a 30 s e gu n d o s
d u r a n t e 7 m i n u t o s a 340 n m (pr e v i a m e n t e s e r e a l i za u n bl a n c o c o n a gu a d e s t i l a d a ). Se e m pl e
u n Es pe c t r o fo t m e t r o U V-VIS Va r a n Ca r y 3.
Me d i a n t e e l c a l i br a d o (v e r A pn d i c e s 8.1) s e c o n v i e r t e e l v a l o r d e l a pe n d i e n t e (e n s u
pa r t e l i n e a l ) e n u n i d a d e s d e a c t i v i d a d l i po l t i c a /m l e qu i v a l e n t e s a l t e s t d e v a l o r a c i n . Lo s
r e s u l t a d o s o bt e n i d o s d e l v a l o r a c t i v i d a d l i po l t i c a s o n fi a bl e s d e n t r o d e l r a n go d e 0.2 a 0.45
U /m l . Pa r a m u e s t r a s fu e r a d e e s t e r a n go s e r e a l i za n l a s d i l u c i o n e s pe r t i n e n t e s .
Materiales y Mtodos 99
3.2.1.3. A n l i s i s c o l o r i m t r i c o d e l a a c t i v i d a d e s t e r s i c a
Es t e m t o d o s e ba s a e n e l s e gu i m i e n t o d e l a u m e n t o d e a bs o r ba n c i a a 348 n m d e bi d o a
l a fo r m a c i n d e c i d o /?-n i t r o fe n i l pr o pi n i c o c o n s e c u e n c i a d e l a hi d r l i s i s qu e l a s l i pa s a s
pr o d u c e n s o br e e l c o r r e s po n d i e n t e s t e r , e l /?-n i t r o fe n i l pr o pi o n a t o (PNPP).
Re a c t i v o s
1. Di s o l u c i n 200 m M d e /7-n i t r o fe n i l pr o pi o n a t o (PNPP) e n a c e t o n i t r i l o gu a r d a d a a -20 C.
2. Ta m po n fo s fa t o 0.05 M a pH=7.0.
3. A c e t o n i t r i l o .
Pr o c e d i m i e n t o
Se pr e pa r a u n a s o l u c i n qu e c o n t e n ga u n 80 % d e t a m pn fo s fa t o 0.05 M a pH=7.0 y u n 20 %
d e a c e t o n i t r i l o . Se d i l u ye e l PNPP 200 m M 500 v e c e s c o n l a s o l u c i n a n t e r i o r . Se l e e a 348
n m y a 25 C e n c u be t a s d e u l t r a v i o l e t a a d o bl e ha z y s i e m pr e c o m pa r a n d o c o n bl a n c o s d e
hi d r l i s i s . Se e m pl e u n Es pe c t r o fo t m e t r o U V-VIS Va r a n Ca r y 3.
El v o l u m e n d e l e n s a yo e s d e 1 m i , 750 \i\ d e s u bs t r a t o y 250 u l d e m u e s t r a , s e l e e l a
a bs o r ba n c i a d u r a n t e 6 m i n u t o s c a d a 30 s e gu n d o s . La pe n d i e n t e o bt e n i d a s e c o r r e l a c i o n a c o n
l a a c t i v i d a d e s t e r s i c a d e n t r o d e l r a n go d e 0.005 a 0.030 U /m l (v e r A pn d i c e s 8.2).
3.2.1.4. A n l i s i s d e pr o t e n a t o t a l po r e l m t o d o d e Lo wr v
El m t o d o d e Lo wr y (Lo wr y et al., 1951) s e ba s a e n l a r e a c c i n d e l o s a m i n o c i d o s
a r o m t i c o s d e l a s pr o t e n a s c o n u n a m e zc l a d e m o l i bd a t o s d i c o y t u gs t a t o s d i c o e n c i d o
fo s fr i c o (qu e c o n s t i t u ye n e l r e a c t i v o d e Fo l i n -Ci o c a l t e a u ). Lo s a m i n o c i d o s r e d u c e n l a
m e zc l a d e m e t a l o c i d o s , pr o d u c i e n d o u n o s c o m pu e s t o s d e c o l o r a zu l c a r a c t e r s t i c o , c u ya
i n t e n s i d a d e s fu n c i n d e l a c o n c e n t r a c i n d e a m i n o c i d o s .
Re a c t i v o s
A . So l u c i n a c u o s a Na a CCb a l 5 %.
B . So l u c i n a c u o s a d e t a r t r a t o s d i c o po t s i c o a l 1 % e n l a qu e s e d i s u e l v e Cu S04.5H
2
O a l
0.5 %.
100 _ Materiales y Mtodos
C. Re a c t i v o d e Fo l i n -Ci o c a l t e a u 1 N e n
D. So l u c i n e s t n d a r d e a l bm i n a d e s u e r o bo v i n o 400 |i g/m l .
E. So l u c i n d e Na OH 1 N.
Pr o c e d i m i e n t o
1 . Se a a d e n 2 m l d e B e n 48 m l d e A i n m e d i a t a m e n t e a n t e s d e l a r e a l i za c i n d e l a n l i s i s .
2. Se pr e pa r a u n a c u r v a d e c a l i br a d o (v e r A pn d i c e s 8.3) a pa r t i r d e l a s o l u c i n D c o n l a s
s i gu i e n t e s c o n c e n t r a c i o n e s d e a l bm i n a : O, 20, 40, 80, 120, 160, 240 u g/m l .
3. A u n v o l u m e n fi n a l d e m u e s t r a d e 0.5 m i s e a a d e n 0.5 m i d e E.
4. A a d i r 2.5 m i d e l a m e zc l a d e r e a c t i v o s pr e pa r a d a e n 1, a gi t a r y e s pe r a r 10 m i n u t o s .
5. A a d i r r pi d a m e n t e 0.5 m i d e r e a c t i v o C y e s pe r a r 30 m i n (m xi m o 60 m i n ).
6. Le e r l a a bs o r ba n c i a a 750 n m .
3.2.1.5. A n l i s i s d e pr o t e n a t o t a l po r e l m t o d o d e B r a d fo r d
Es t e m t o d o s e ba s a e n e l c a m bi o d e c o l o r d e l r e a c t i v o A zu l d e Co o m a s s i e d e bi d o a l a
a t r a c c i n e l e c t r o s t t i c a d e s u s gr u po s s u l fn i c o s c o n a l pr o t e n a (Pi e r c e , 1989). Se ha
o bs e r v a d o qu e e l r e a c t i v o A zu l d e Co o m a s s i e m u e s t r a gr a n a fi n i d a d po r r e s i d u o s d e a r gi n i n a ,
y t a m bi n s e u n e d e fo r m a d bi l c o n hi s t i d i n a , t i r o s i n a y t r i pt fa n o .
Es t e m t o d o e s e s pe c i a l m e n t e t i l pu e s t o qu e pr e s e n t a u n m e n o r n m e r o d e
i n t e r fe r e n c i a s qu e e l m t o d o d e Lo wr y, s i e n d o r e c o m e n d a bl e e n e l c a s o d e m e d i o s e n l o s
c u a l e s l a c o n c e n t r a c i n d e s a l e s s e a e l e v a d a .
Exi s t e n d o s t i po s d e pr o c e d i m i e n t o s d e pe n d i e n d o d e l i n t e r v a l o d e c o n c e n t r a c i o n e s d e
pr o t e n a a d e t e r m i n a r .
Pr o c e d i m i e n t o e s t n d a r d e e n s a yo : pa r a c o n c e n t r a c i o n e s e n t r e 100 y 1500 u g/m l .
1. A gi t a r pr e v i a m e n t e e l r e a c t i v o .
2. Se pr e pa r a n u n a s e r i e d e c o n c e n t r a c i o n e s c o n o c i d a s d e pr o t e n a d i l u ye n d o u n a s o l u c i n
e s t n d a r d e a l bm i n a e n t r e 75 y 1500 u g/m l .
3. Me zc l a r 0.1 m i d e m u e s t r a o d e pa t r n c o n 5 m i d e A zu l d e Co o m a s s i e e n u n t u bo 16x100
m m . U s a r e l d i s o l v e n t e c o m o bl a n c o . A gi t a r bi e n .
4. Le e r l a a bs o r ba n c i a a 595 n m e n u n t i e m po n o s u pe r i o r a 90 m i n u t o s .
5. Re s t a r l a a bs o r ba n c i a d e l bl a n c o .
Materiales y Mtodos 101
Pr o c e d i m i e n t o d e m i c r o e n s a yo : pa r a c o n c e n t r a c i o n e s e n t r e 1 y 25 n g/m l . Se s i gu e e l m i s m o
pr o c e d i m i e n t o qu e e n l e c a s o e s t n d a r pe r o l o s pa t r o n e s s e pr e pa r a n e n t r e 1 y 25 u g/m l (v e r
A pn d i c e s 8.4) y s e m e zc l a n 1 m i d e l r e a c t i v o A zu l d e Co o m a s s i e c o n 1 m i d e m u e s t r a .
3.2.1.6. De t e r m i n a c i n d e l o s po l i s a c r i d o s t o t a l e s po r e l m t o d o d e l a A n t r o n a
Lo s po l i s a c r i d o s s e s e pa r a n d e l a m u e s t r a (300 ja l ) po r u l t r a fi l t r a c i n m e d i a n t e u n
fi l t r o U l t r a fr e e -MC d e 10 kDa d e c o r t e m o l e c u l a r d e Mi l l i po r e . La m u e s t r a s e c e n t r i fu ga
(SOOOg) ha s t a s e qu e d a d . Lo s po l i s a c r i d o s qu e qu e d a n e n l a s u pe r fi c i e d e l fi l t r o s e r e s u s pe n d e n
c o n 300 fi l d e a gu a d e s t i l a d a y s e c e n t r i fu ga d e n u e v o . Es t e pa s o s e r e pi t e 3 v e c e s pa r a s e pa r a r
a zc a r e s d e ba jo pe s o m o l e c u l a r . En l a r e s u s pe n s i n fi n a l d e l o s po l i s a c r i d o s qu e qu e d a n e n 300
u l s e r e a l i za u n a n l i s i s d e a zc a r e s t o t a l e s po r e l m t o d o d e l a A n t r o n a (Ge r ha r d t e al., 1981).
Es t e m t o d o e s u n a v a r i a c i n d e l t e s t d e Mo l i s c h e n e l c u a l l o s po l i s a c r i d o s s o n
hi d r o l i za d o s m e d i a n t e c i d o s u l fr i c o a m o n o s a e r i d o s pa r a fo r m a r fu r fu r a l e s qu e r e a c c i o n a n
c o n l a A n t r o n a pa r a d a r c o m pu e s t o s c o l o r e a d o s .
Pr o c e d i m i e n t o
Se pr e pa r a u n a d i s o l u c i n d e 1 g/1 d e A n t r o n a e n c i d o s u l fr i c o a l 75 % e n v o l u m e n . La
A n t r o n a s l i d a d e s e a d a s e hu m e d e c e pr e v i a m e n t e c o n e t a n o l a bs o l u t o (5 m l e t a n o l /200 m g
A n t r o n a ). A gi t a r ha s t a d i s o l u c i n (a pr o xi m a d a m e n t e 1 h). Pr e pa r a r pa t r o n e s d e fr u c t o s a d e
c o n c e n t r a c i o n e s e n t r e O y 50 u g/m l . A a d i r 800 ^1 d e l r e a c t i v o d e A n t r o n a a 200 u l d e m u e s t r a o
pa t r n . Po n e r l a s m u e s t r a s e n u n ba o a 100 C d u r a n t e 10 m i n u t o s . Sa c a r l a s m u e s t r a s , d e ja r l a s
e n fr i a r y l e e r l a a bs o r ba n c i a 625 n m . Re s t a r l a a bs o r ba n c i a d e l bl a n c o y c o r r e l a c i o n a r l o s d a t o s
c o n e l c a l i br a d o d e fr u c t o s a (v e r A pn d i c e s 8.5).
102
Materiales y Mtodos
3.2.2. Re a c c i o n e s c o n l i pa s a s
3.2.2.1. A n l i s i s d e c i d o pr o pn i c o po r Cr o m a t o gr a fa d e Ga s e s
Es t e m t o d o pe r m i t e l a d e t e r m i n a c i n d e c i d o pr o pi n i c o e n d i s o l v e n t e s o r gn i c o s .
La c u a n t i fc a c i n e s t e s e r e a l i za m e d i a n t e pa t r n e xt e r n o e n t r e O y 50 m M (v e r A pn d i c e s
8.6).
La s c o n d i c i o n e s d e a n l i s i s s o n l a s s i gu i e n t e s :
In s t r u m e n t a c i n :
- Cr o m a t gr a fo d e ga s e s He wl e t t Pa c ka r d 5890.
- De t e c t o r d e i o n i za c i n d e l l a m a .
- In t e gr a c i n Mi l l e n i u m 2.15.10
Co n d i c i o n e s c r o m a t o gr fi c a s :
- Co l u m n a : 25% NPA G + 2% H
3
PO
4
WA W 100/200, d e 2,7 m x 1/8", d e Su pe l c o .
- Po r t a d o r : Ni t r ge n o .
- Pr e s i n d e r e t r o c e s o : 290 KPa .
- In ye c c i n : 0.5 \.
- Ti e m po d e a n l i s i s : 14 m i n u t o s .
- Te m pe r a t u r a ho r n o : i s o t e r m a a 145 C.
- Te m pe r a t u r a i n ye c t o r : 250 C.
- Te m pe r a t u r a d e t e c t o r : 260 C.
La c o l u m n a d e be pe r m a n e c e r s a t u r a d a c o n c i d o fr m i c o pa r a e v i t a r e l e fe c t o m e m o r i a .
Pr e pa r a c i n d e l a s m u e s t r a s :
La s m u e s t r a s a a n a l i za r d e be n e s t a r fi l t r a d a s po r u n a m e m br a n a d e 0.45 m m . La i n ye c c i n s e
r e a l i za d i r e c t a s i n d i l u c i o n e s .
Materiales y Mtodos 103
3.2.2.2. A n l i s i s d e pr o pi o n a t o d e n -bi i t i l o po r Cr o m a t o gr a fa d e Ga s e s
Es t e m t o d o pe r m i t e l a d e t e r m i n a c i n d e pr o pi o n a t o d e n -bu t i l o e n d i s o l v e n t e s
o r gn i c o s . La c u a n t i fi c a c i n s e r e a l i za m e d i a n t e pa t r n e xt e r n o d e 6 n i v e l e s , d e s d e O ha s t a
100 m M (v e r A pn d i c e s 8.7).
In s t r u m e n t a c i n :
- Cr o m a t gr a fo d e ga s e s He wl e t t Pa c ka r d 5890.
- In ye c t o r a u t o m t i c o He wl e t t Pa c ka r d 7673 A .
- De t e c t o r d e i o n i za c i n d e l l a m a .
- In t e gr a c i n Mi l l e n i u m 2.15.01.
Co n d i c i o n e s c r o m a t o gr fi c a s :
- Co l u m n a : HP-INNOWa x (Cr o s s l i n ke d Po l ye t hyl e n e Gl yc o l ) 30 m x 0.25 m m x 0.25 \im f.
- Po r t a d o r : He .
- In ye c c i n : 1 u i , s pl i t 50:1.
- Ti e m po d e a n l i s i s : 10 m i n u t o s .
- Te m pe r a t u r a ho r n o : i s o t e r m a 40 C.
- Te m pe r a t u r a i n ye c t o r : 250 C.
- Te m pe r a t u r a d e t e c t o r : 275 C.
- Pr e s i n d e r e t r o c e s o : 24 ps i .
- Fl u jo pu r ga d e l s e pt u m : 4.9 m l /m i n .
- Fl u jo d i v i s i n c o n v e n t e o : 52 m l / m i n .
Pr e pa r a c i n d e l a s m u e s t r a s :
La s m u e s t r a s a a n a l i za r d e be n e s t a r fi l t r a d a s pr u n a m e m br a n a d e 0.45 u m . La i n ye c c i n s e
r e a l i za d i r e c t a s i n d i l u c i o n e s .
104 Materiales y Mtodos
3.2.2.3. A n l i s i s d e he xa n o l po r Cr o m a t o gr a fa d e Ga s e s
Es t e m t o d o pe r m i t e l a d e t e r m i n a c i n d e he xa n o l e n d i s o l v e n t e s o r gn i c o s . La
c u a n t i fc a c i n s e r e a l i za m e d i a n t e pa t r n e xt e r n o d e 6 n i v e l e s , d e s d e O ha s t a 100 m M (v e r
A pn d i c e s 8.8).
In s t r u m e n t a c i n :
- Cr o m a t gr a fo d e ga s e s He wl e t t Pa c ka r d 5890.
- In ye c t o r a u t o m t i c o He wl e t t Pa c ka r d 7673 A .
- De t e c t o r d e i o n i za c i n d e l l a m a .
- In t e gr a c i n Mi l l e n i u m 2.15.01.
Co n d i c i o n e s c r o m a t o gr fc a s :
- Co l u m n a : HP-INNOWa x (Cr o s s l i n ke d Po l ye t hyl e n e Gl yc o l ) 30 m x 0.25 m m x 0.25 u m f.
- Po r t a d o r : He .
- In ye c c i n : 1 u i , s pl i t 50:1.
- Ti e m po d e a n l i s i s : 10 m i n u t o s .
- Te m pe r a t u r a ho r n o : i s o t e r m a 40 C.
- Te m pe r a t u r a i n ye c t o r : 250 C.
- Te m pe r a t u r a d e t e c t o r : 275 C.
- Pr e s i n d e r e t r o c e s o : 24 ps i .
- Fl u jo pu r ga d e l s e pt u m : 4.9 m l /m i n .
- Fl u jo d i v i s i n c o n v e n t e o : 52 m l /m i n .
Pr e pa r a c i n d e l a s m u e s t r a s :
La s m u e s t r a s a a n a l i za r d e be n e s t a r fi l t r a d a s po r u n a m e m br a n a d e 0.45 u m . La i n ye c c i n s e
r e a l i za d i r e c t a s i n d i l u c i o n e s .
Materiales y Mtodos 105
3.2.2.4. A n l i s i s d e bu t a n o l po r HPLC
Es t e m t o d o pe r m i t e l a d e t e r m i n a c i n d e bu t a n o l e n m e d i o a c u o s o . La c u a n t i fc a c i n
s e r e a l i za m e d i a n t e pa t r n e xt e r n o d e 8 n i v e l e s , d e s d e O ha s t a 5 g/1 (v e r A pn d i c e s 8.9).
In s t r u m e n t a c i n :
- HPLC He wl e t t Pa c ka r d 1050.
- De t e c t o r d e n d i c e d e r e fr a c c i n He wl e t t Pa c ka r d 1047A
- In t e gr a c i n Mi l l e n i u m 2.15.01.
El u ye n t e :
Co m o fa s e m v i l s e u t i l i za c i d o s u l fr i c o 0.015 M d i s u e l t o e n a gu a Mi l l i Q (r e s i s t e n c i a <18.2
Q) a pH=3.0. El e l u ye n t e e s fi l t r a d o a t r a v s d e 0.45 u m y d e s ga s i fi c a d o m e d i a n t e v a c o .
Co n d i c i o n e s c r o m a t o gr fi c a s :
- Co l u m n a : A m i n e x HPX-87H d e B i o r a d .
- Ca u d a l : i s o c r t i c o 0.6 m l /m i n .
-In ye c c i n : 15 u l ,
- Ti e m po d e a n l i s i s : 30 m i n u t o s .
- Te m pe r a t u r a : 65 C.
Pr e pa r a c i n d e l a s m u e s t r a s :
La s m u e s t r a s a a n a l i za r d e be n e s t a r fi l t r a d a s po r u n a m e m br a n a d e 0.45 u m . La i n ye c c i n s e
r e a l i za d i r e c t a s i n d i l u c i o n e s .
106 Materiales y Mtodos
3.2.2.5. A n l i s i s d e e n a n t i m e r o s d e i bu pr o fe n o po r HPLC
Es t e m t o d o pe r m i t e l a d e t e r m i n a c i n d e l e xc e s o e n a n t i o m r i c o d e u n a m e zc l a d e
e n a n t i m e r o s R y S d e i bu pr o fe n o (v e r A pn d i c e s 8.10) e n m e d i o o r gn i c o .
In s t r u m e n t a c i n :
- Cr o m a t gr a fo d e l qu i d o s He wl e t t Pa c ka r d 1090.
- De t e c t o r DA D a 226 n m .
El u ye n t e :
Co m o fa s e m v i l s e u t i l i za He xa n o , Is o pr o pa n o l , c i d o t r i fl u o r o a c t i c o (1000:10:1).
Co n d i c i o n e s c r o m a t o gr fi c a s :
- Co l u m n a : fa s e n o r m a l Chi r a c e l OD, d e Da i c e l Che m i c a l In d u s t r i e s LTD.
- Ca u d a l : s o c r t i c o d e 1.0 m i po r m i n u t o .
- Vo l u m e n d e i n ye c c i n : 5 u l .
- Ti e m po d e a n l i s i s : 20 m i n u t o s .
- Te m pe r a t u r a : A m bi e n t e .
Pr e pa r a c i n d e l a s m u e s t r a s :
La s m u e s t r a s qu e s e d e s e a n a n a l i za r d e be n e s t a r pr e v i a m e n t e fi l t r a d a s po r u n a m e m br a n a d e
0.45 u m . La i n ye c c i n s e r e a l i za d i r e c t a s i n d i l u c i o n e s .
Materiales y Mtodos 107
3.2.2.6. A n l i s i s d e e n a n t i m e r o s d e l c i d o 2-fe n i l -pr o pi n i c o po r HPLC
Es t e m t o d o pe r m i t e l a d e t e r m i n a c i n d e l e xc e s o e n a n t i o m r i c o d e u n a m e zc l a d e
e n a n t i m e r o s R y S d e l c i d o 2-fe n i l -pr o pi n i c o (v e r A pn d i c e s 8.11) e n m e d i o o r gn i c o .
In s t r u m e n t a c i n :
- Cr o m a t gr a fo d e l qu i d o s He wl e t t Pa c ka r d 1090.
- De t e c t o r DA D a 220 n m .
El u ye n t e :
Co m o fa s e m v i l s e u t i l i za He xa n o , Is o pr o pa n o l , c i d o t r i fl u o r o a c t i c o (1000:10:1).
Co n d i c i o n e s c r o m a t o gr fc a s :
- Co l u m n a : fa s e n o r m a l Chi r a c e l OD, d e Da i c e l Che m i c a l In d u s t r i e s LTD.
- Ca u d a l : i s o c r t i c o d e 1.0 m i po r m i n u t o .
- Vo l u m e n d e i n ye c c i n : 5 |i l .
- Ti e m po d e a n l i s i s : 15 m i n u t o s .
- Te m pe r a t u r a : A m bi e n t e .
Pr e pa r a c i n d e l a s m u e s t r a s :
La s m u e s t r a s qu e s e d e s e a n a n a l i za r d e be n e s t a r pr e v i a m e n t e fi l t r a d a s po r u n a m e m br a n a d e
0.45 u m . La i n ye c c i n s e r e a l i za d i r e c t a s i n d i l u c i o n e s .
108 Materiales y Mtodos
3.2.2.7. A n l i s i s d e e n a n t i m e r o s d e l r a ;i s --2-fe n i l -l -c c l o he xa n o l po r HPLC
Es t e m t o d o pe r m i t e l a d e t e r m i n a c i n d e l e xc e s o e n a n t i o m r i c o d e u n a m e zc l a d e
e n a n t i m e r o s (1R,2S) y (2R,1S) d e l fr a s -2-fe n i l -l -c i c l o he xa n o l (v e r A pn d i c e s 8.12) e n
m e d i o o r gn i c o .
In s t r u m e n t a c i n :
- Cr o m a t gr a fo d e l qu i d o s He wl e t t Pa c ka r d 1090.
- De t e c t o r DA D a 215 n m .
El u ye n t e :
Co m o fa s e m v i l s e u t i l i za He xa n o , Is o pr o pa n o l (100:2).
Co n d i c i o n e s c r o m a t o gr fc a s :
- Co l u m n a : fa s e n o r m a l Chi r a c e l OD, d e Da i c e l Che m i c a l In d u s t r i e s LTD.
- Ca u d a l : s o c r t i c o d e 1.0 m i po r m i n u t o .
- Vo l u m e n d e i n ye c c i n : 10 u l .
- Ti e m po d e a n l i s i s : 15 m i n u t o s .
- Te m pe r a t u r a : A m bi e n t e .
Pr e pa r a c i n d e l a s m u e s t r a s :
La s m u e s t r a s qu e s e d e s e a n a n a l i za r d e be n e s t a r pr e v i a m e n t e fi l t r a d a s po r u n a m e m br a n a d e
0.45 |i m . La i n ye c c i n s e r e a l i za d i r e c t a s i n d i l u c i o n e s .
Resultados
109
4.1. PRODUCCIN DE LA LIPASA UAB
4.1.1. Es t r a t e gi a d e fe r m e n t a c i n
La s l i pa s a s U A B d e Candida rugosa s e pr o d u c e n m e d i a n t e fe r m e n t a c i n e n fe d -ba t c h
s i gu i e n d o e l s i gu i e n t e s i s t e m a : s e r e a l i za r o n i n o c u l e s s u c e s i v o s ha s t a l l e ga r a l fe r m e n t a d o r
B r a u n B i o s t a t U D d e 50 1 d e v o l u m e n d e t r a ba jo . Di c ho s i n o c u l e s s e l l e v a r o n a c a bo e n
d i s c o n t i n u o m i e n t r a s qu e e n e l fe r m e n t a d o r d e pr o d u c c i n a l pr o c e s o d i s c o n t i n u o s i gu i u n a
o pe r a c i n fe d -ba t c h d e c a u d a l d e a d i c i n c o n s t a n t e d e c i d o o l e i c o . La e l e c c i n d e e s t a
e s t r a t e gi a d e m o s t r s e r l a pt i m a d e s d e e l pu n t o d e v i s t a d e s i m pl i c i d a d o pe r a c i o n a l y d e
pr o d u c c i n d e l i pa s a s c u a n d o s e c o m pa r a c o n o pe r a c i o n e s e n d i s c o n t i n u o y c o n t i n u o
(Go r d i l l o , 1996). En t o d o s l o s c a s o s e l c i d o o l e i c o fu e u t i l i za d o c o m o fu e n t e d e c a r bo n o y
c o m o i n d u c t o r pa r a l a pr o d u c c i n d e l a e n zi m a pu e s t o qu e e s t u d i o s pr e v i o s ha ba n
d e m o s t r a d o qu e e r a e l m e jo r d e l o s s u bs t r a t o s pr o ba d o s (Obr a d o r s et al., 1993).
En l a Fi gu r a 4.1.1 s e pr e s e n t a u n s e gu i m i e n t o d e l o s pu n t o s d e o pe r a c i n c l a v e s d e l
pr o c e s o , m i e n t r a s qu e e n l a Fi gu r a 4.1.2 s e pr e s e n t a l a e v o l u c i n d e l o s pa r m e t r o s c l a v e s d e
l a fe r m e n t a c i n , bi o m a s a (X) y a c t i v i d a d l i po l t i c a (L) d u r a n t e u n pr o c e s o fe d -ba t c h e n pl a n t a
pi l o t o . Ta m bi n s e pr e s e n t a n l a s c o n c e n t r a c i o n e s i n i c i a l e s d e c i d o o l e i c o (S).
Pl a c a Pe t r i Pr e -i n c u l o
B o t e l l a s (50 m i )
So =2 g/1
B r a u n B i o l a b (0.5
1) Di s c o n t i n u o
S
0
=4 g/1
Xf=4. 1 g/1
Lj=2.8 U /m l
B r a u n B i o s t a t ED
(5 1) Di s c o n t i n u o
S
0
=4 g/1
Xf=3.6g/l
Lf=15.7U /m l
B r a u n B i o s t a t U D
(50 1) Di s c o n t i n u o
So =2 g/1
Xf=2.6 g/1
Lf=10.5 U /m l
Fe d -ba t c h
q=0.2 g/(h-l fe r m .)
Xf=6.3 g/1
Lf=143.4 U /m l
Fi g. 4.I.I.: Ev o l u c i n d e l o s pa r m e t r o s c l a v e s d e fe r m e n t a c i n e n e l s i s t e m a d e i n o c u l e s pa r a
l a pr o d u c c i n e n pl a n t a pi l o t o d e l i pa s a s po r Candida rugosa.
no Resultados
200 -| 7 -
180 -
160 -
f 140-
"1
f
12
"
g 100 -
1
J: 80 -
1
60-
40 -
20 -
n
6 -
5 -
S3 A _
w ^
1
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2 -
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4
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B A TCH i FED-B A TCH ,*
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200
- 160
- 140
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12
1
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- 60 ^
- 40 '
- 20
n
- 180
- 160
- 140
- 120
- 100
- 80
- 60
- 40
- 20
A
1
"c s
O
1
"o
OH
!
Ti e m po (h)
Fi g. 4.1.2.: Se gu i m i e n t o d e u n fe d -ba t c h d e pr o d u c c i n d e l i pa s a s po r Candida rugosa e n
B i o s t a t U D (q=0.2 g/(h-l fe r m )).
Lo s v a l o r e s o bt e n i d o s pa r a e s t a e s t r a t e gi a d e o pe r a c i n s u po n e n u n a e l e v a d a
pr o d u c t i v i d a d c o m pa r a n d o c o n e xpe r i m e n t o s e n d i s c o n t i n u o t a n t o e n t r m i n o s d e a c t i v i d a d
l i po l t i c a /g d e bi o m a s a c o m o e n e l c a s o d e a c t i v i d a d l i po l t i c a /(v o l u m e n d e
fe r m e n t a d o r t i e m po ), a l c a n za n d o l o s r e s u l t a d o s d e :
22.7-10
3
U d e a c t i v i d a d pr o d u c i d a s e n t o t a l /g d e bi o m a s a :
4.04-10
3
U d e a c t i v i d a d pr o d u c i d a s e n d i s c o n t i n u o /g d e bi o m a s a
35.3-10
3
U d e a c t i v i d a d pr o d u c i d a s e n fe d -ba t c h/g d e bi o m a s a
3.18-10
3
U d e a c t i v i d a d pr o d u c i d a s e n t o t a l /(l fe r m e n t a d o r -h d e o pe r a c i n )
0.88-10
3
U d e a c t i v i d a d pr o d u c i d a s e n d i s c o n t i n u o /O fe r m e n t a d o r h o pe r a c i n ba t c h)
4.02-10
3
U d e a c t i v i d a d pr o d u c i d a s e n fe d -ba t c h/(l fe r m e n t a d o r -h o pe r a c i n fe d -ba t c h)
Resultados 111
Ta m bi n e s i m po r t a n t e d e s t a c a r qu e l a pa r a d a d e l a a d i c i n d e l c i d o o l e i c o s e r e a l i za
e n u n m o m e n t o e n e l c u a l t o d a v a n o s e ha d e t e n i d o l a pr o d u c c i n y e l c r e c i m i e n t o d e l a
bi o m a s a e s pr c t i c a m e n t e l i n e a l , l o qu e i n d i c a qu e d i c ho c r e c i m i e n t o d e l m i c r o o r ga n i s m o
t o d a v a n o s e e n c u e n t r a l i m i t a d o po r l a e s c a s e z o fa l t a d e s u bs t r a t o . El m o t i v o d e d e t e n e r e n
e s t e pu n t o l a fe r m e n t a c i n e s e l d e e v i t a r l a a pa r i c i n e n c o n c e n t r a c i o n e s e l e v a d a s d e
pr o d u c t o s fi n a l e s c o m o po l i s a c r i d o s u o t r a s pr o t e n a s qu e s u e l e n pr o d u c i r s e e n fa s e s
a v a n za d a s d e l c r e c i m i e n t o c u a n d o e m pi e za a ha be r l i m i t a c i n d e s u bs t r a t o . Es t o s c o m pu e s t o s
i n t e r fi e r e n fu e r t e m e n t e e n l a s e pa r a c i n , pu r i fi c a c i n y u t i l i za c i n po s t e r i o r d e l a s l i pa s a s , po r
l o qu e s e pr e fi r i d e t e n e r l a fe r m e n t a c i n e n u n m o m e n t o e n e l c u a l t o d a v a n o e r a n
i m po r t a n t e s . En pa r t i c u l a r , e s n o t a bl e l a i n t e r fe r e n c i a qu e t i e n e n l o s po l i s a c r i d o s e n
o pe r a c i o n e s d e c r o m a t o gr a fa y fi l t r a c i n , c o m o s e c o m e n t a r e n e l a pa r t a d o 4.3.
4.1.2. De t e r m i n a c i n d e l a l e y d e a d s o r c i n d e l a s l i pa s a s s o br e e l
c i d o o l e i c o
U n fe n m e n o i m po r t a n t e qu e t i e n e l u ga r e n l a pr o d u c c i n d e l i pa s a s po r Candida
rugosa, c u a n d o c r e c e u t i l i za n d o c i d o o l e i c o c o m o s u bs t r a t o , e s l a a d s o r c i n d e l a e n zi m a
s o br e l a i n t e r fa s e o r gn i c o -a c u o s a fo r m a d a d e bi d o a l a i n m i s c i bi l i d a d d e l c i d o o l e i c o e n l a
fa s e a c u o s a m a yo r i t a r i a . El he c ho d e qu e e n zi m a s l i po l t i c o s t e n ga n t e n d e n c i a a a d s o r be r s e a
l a i n t e r fa s e o r gn i c o -a c u o s a e s t a m pl i a m e n t e r e fe r e n c i a d o (B r gs t r o m y B r o c km a n , 1984) y
pr o v o c a qu e l a e n zi m a pr o d u c i d a po r e l m i c r o o r ga n i s m o s e e n c u e n t r e r e pa r t i d a e n t r e l a fa s e
a c u o s a y l a fa s e o r gn i c a . Lo s a n l i s i s d e a c t i v i d a d l i po l t i c a s e r e a l i za n s o br e m u e s t r a s
fi l t r a d a s y l i br e s d e bi o m a s a y d e c i d o o l e i c o c o n l o qu e l a m e d i d a s l o r e fl e ja l a c a n t i d a d d e
e n zi m a pr e s e n t e e n l a fa s e a c u o s a .
De c a r a a m e jo r a r e l m o d e l o m a t e m t i c o d e pr o d u c c i n d e l a l i pa s a i n c l u ye n d o e s t e
fe n m e n o , s e d e s a r r o l l u n s i s t e m a pa r a d e s c r i bi r l a l e y fs i c a d e a d s o r c i n d e l a s l i pa s a s
s o br e e l c i d o o l e i c o . En e s t e s i s t e m a s e i ba n a a d i e n d o a l fe r m e n t a d o r c a n t i d a d e s v a r i a bl e s
d e c i d o o l e i c o . El fe r m e n t a d o r c o n t e n a e l m e d i o ha bi t u a l d e fe r m e n t a c i n e s t r i l y u n a
c a n t i d a d c o n o c i d a d e l i pa s a d e Candida rugosa, o bs e r v n d o s e l a d i s m i n u c i n d e l a a c t i v i d a d
l i po l t i c a a l pr o d u c i r s e e l fe n m e n o d e a d s o r c i n . El fe r m e n t a d o r u t i l i za d o fu e u n B r a u n
B i o s t a t E d e 5 1 d e c a pa c i d a d c u ya ge o m e t r a e s s i m i l a r a l o s u t i l i za d o s e n e l pr o c e s o d e
112
Resultados
fe r m e n t a c i n ya qu e e s t u d i o s a n t e r i o r e s d e e s t e fe n m e n o e n bo t e l l a s a gi t a d a s d e m o s t r a r o n
u n a fu e r t e d e pe n d e n c i a d e e s t e fe n m e n o c o n l a s pr o pi e d a d e s Te o l gi c a s d e l s i s t e m a
bs i c a m e n t e po r l o qu e s e r e fi e r e a a gi t a c i n y a i r e a c i n (Go r d i l l o , 1996).
La l e y d e La n gm u i r ha s i d o a m pl i a m e n t e e m pl e a d a pa r a l a d e s c r i pc i n d e s i s t e m a s d e
e s t e t i po (Ma l c a t a e al., 1992; Gi t l e s e n et a /., 1997). Di c ha l e y pa r a n u e s t r o s i s t e m a t e n d r a l a
s i gu i e n t e e xpr e s i n :
K
1 + Kl Lpaq
(1)
d o n d e Lip
org
s e r a l a c o n c e n t r a c i n d e s o l u t o (a c t i v i d a d e n zi m t i c a ) a d s o r bi d o e n l a i n t e r fa s e ,
A s e r a e l e qu i v a l e n t e a l a c o n c e n t r a c i n d e a d s o r be n t e , e n n u e s t r o c a s o e l r e a i n t e r fa c i a l
ge n e r a d a po r l a e m u l s i n d e c i d o o l e i c o , y Lip
aq
s e r a l a c o n c e n t r a c i n d e s o l u t o e n l a fa s e
a c u o s a n o a d s o r bi d a , v a l o r qu e s e pu e d e d e t e r m i n a r a n a l t i c a m e n t e . Co m o pr i m e r a
a pr o xi m a c i n s e r e a l i z u n a s i m pl i fi c a c i n d e l a e c u a c i n (1), c o n s i d e r a n d o qu e e l s o l u t o
a d s o r bi d o e r a s l o pr o po r c i o n a l a l a c o n c e n t r a c i n d e s o l u t o n o a d s o r bi d o , e s d e c i r ,
d e s pr e c i a n d o Ks\
'aq
(2)
La e xpr e s i n d e l r e a i n t e r fa c i a l pa r a u n a s c o n d i c i o n e s d e t r a ba jo y pa r a u n o s v a l o r e s
c o n s t a n t e s d e d e n s i d a d , v i s c o s i d a d y t e n s i n i n t e r fa c i a l qu e s e m a n t i e n e n pa r a c a d a t i po d e
s u bs t r a t o v i e n e d a d a po r :
A =
K'-S
K'j+S
(3)
El ba l a n c e d e a c t i v i d a d l i po l t i c a v i e n e d a d o po r :
(4) Lptot = Lipaq + L
Resultados
113
Su bs t i t u ye n d o (3) e n (2) y t e n i e n d o e n c u e n t a (4):
Lipa, _
Lip
1
1 +
Ka-S
(5)
K'j+S
Pa r a l a d e t e r m i n a c i n d e l a s c o n s t a n t e s KJ y K's e r e a l i za r o n t r e s e xpe r i m e n t o s a
d i fe r e n t e s a c t i v i d a d e s l i po l t i c a s i n i c i a l e s e n l a s qu e s e i ba a a d i e n d o c i d o o l e i c o y s e
o bs e r v a ba l a e v o l u c i n d e l c o c i e n t e Lip
a
g/Lip
to
t. En l a Fi gu r a 4.1.3. s e r e pr e s e n t a n l o s d a t o s
e xpe r i m e n t a l e s o bt e n i d o s , y e n l a Ta bl a 4.1.1 s e r e c o ge n l o s d a t o s a ju s t a d o s pa r a l a o bt e n c i n
Li p
t o t
= 35.4 U /m l
Li p,
o t
= 26.2U /m l
Li p
t o t
= 13.6 U /m l
\ i i r
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0
A c i d o o l e i c o (g/1)
Fi g. 4.I.3.: Co m po r t a m i e n t o d e l a l e y d e a d s o r c i n s i m pl i fi c a d a pa r a d i s t i n t o s v a l o r e s d e l a
a c t i v i d a d l i po l t i c a t o t a l i n i c i a l .
114
Resultados
Liptot (U /m l )
35.4
26.2
13.6
K
d
63
41
3.6+0.4
K'
d
148
6+2
l .Od bO.3
Tabla 4.1.1.: Va l o r e s d e Kd y K'd o bt e n i d o s m e d i a n t e e l a ju s t e d e l o s v a l o r e s d e l a Fi g. 4.1.3.
Si l a e c u a c i n (5) d e s c r i bi e s e c o r r e c t a m e n t e e l fe n m e n o , l o s v a l o r e s d e Kd y K'd
t e n d r a n qu e s e r i gu a l e s pa r a c u a l qu i e r v a l o r d e Lip
!0
, y e l c o c i e n t e Lip
a
q/Lip
tot
t e n d r a qu e s e r
c o n s t a n t e s i s e m a n t i e n e c o n s t a n t e l a c o n c e n t r a c i n d e c i d o o l e i c o . La fi gu r a 4.1.4 r e c o ge u n
e xpe r i m e n t o e n e l qu e s e v a r i l a a c t i v i d a d l i po l t i c a t o t a l m a n t e n i e n d o c o n s t a n t e l a
c o n c e n t r a c i n d e c i d o o l e i c o . En e l l a s e o bs e r v a c o m o l a r e l a c i n Lip
aq
/Lip
to
t v a r a c o n l a
a c t i v i d a d l i po l t i c a i n t r o d u c i d a e n e l fe r m e n t a d o r pa r a u n a c o n c e n t r a c i n d e c i d o o l e i c o
c o n s t a n t e (0.5 g/1).
"
LO -
0.9 -
0.8 -
0.7 -
0.6 -
0.5 -
0.4 -
0.3 -
0.2 -
0.1 -
0.0 -
O 10 12 14
Li p (U /m l )
F
t o t
v
Fi g. 4.I.4.: Ev o l u c i n d e l c o c i e n t e Lip
aq
/Lip
M
pa r a u n a c o n c e n t r a c i n c o n s t a n t e d e c i d o
o l e i c o d e 0.5 g/1.
Resultados
115
A s pu e s , pa r e c e c l a r o qu e l a s i m pl i fi c a c i n c o n s i d e r a d a e n l a e c u a c i n (5) n o e s
r e pr e s e n t a t i v a d e l s i s t e m a , y qu e e l po r c e n t a je d e a d s o r c i n r e pr e s e n t a d o po r e l c o c i e n t e
Lip
aq
/Liptot v a r a s e n s i bl e m e n t e c o n l a c o n c e n t r a c i n d e e n zi m a t o t a l d e l m e d i o , e s d e c i r , qu e
l a l i pa s a i n fl u ye d e fo r m a c l a r a e n s u pr o pi a a d s o r c i n , po s i bl e m e n t e d e bi d o a u n e fe c t o d e
e s t a bi l i za c i n d e l a e m u l s i n d e c i d o o l e i c o (Ki e r ke l s et al., 1994).
A n t e e s t e c o m po r t a m i e n t o s e pa s a c o n s i d e r a r l a e c u a c i n d e La n gm u i r c o m pl e t a . A
pa r t i r d e l a e c u a c i n (1) y u s a n d o l a s m i s m a s e s t r a t e gi a s qu e pa r a o bt e n e r l a e c u a c i n (5) s e
o bt i e n e l a e c u a c i n (6):
Lip
Lip*>
1
1 +
Ki-S
(6)
K'd+S
Es t a e c u a c i n r e pr e s e n t a l a l e y d e La n gm u i r c o m pl e t a pa r a e s t e s i s t e m a . Ha y qu e
s e a l a r qu e e n e s t a e c u a c i n , l po r c e n t a je d e l i pa s a a d s o r bi d a d e pe n d e d e d o s v a r i a bl e s : l a
c o n c e n t r a c i n d e c i d o o l e i c o y l a c o n c e n t r a c i n d e l i pa s a t o t a l , t a l y c o m o s e d e d u c e d e l o s
v a l o r e s v a r i a bl e s d e l a s c o n s t a n t e s d e l a t a bl a 4.1.1. Po r c o n s i gu i e n t e , l a s gr fi c a s qu e
r e pr e s e n t a r n l o s pe r fi l e s d e a d s o r c i n s e r n t r i d i m e n s i o n a l e s . En l a Fi gu r a 4.1.5 s e m u e s t r a l a
r e pr e s e n t a c i n d e l o s pu n t o s e xpe r i m e n t a l e s a s c o m o l a s u pe r fi c i e d e a ju s t e d e d i c ho s pu n t o s
m e d i a n t e l a e c u a c i n (6). En l a gr fi c a qu e d a m a n i fi e s t a l a d e pe n d e n c i a d e l a l e y d e a d s o r c i n
d e l a c o n c e n t r a c i n d e c i d o o l e i c o y d e l a l i pa s a a c u o s a .
El a ju s t e d e l o s v a l o r e s e xpe r i m e n t a l e s a l a e c u a c i n (6) ge n e r t r e s n u e v o s
pa r m e t r o s , Kj, KS y K'd, qu e s e r n l o s qu e d e fi n a n l a l e y d e a d s o r c i n pa r a e s t e s i s t e m a y
c u yo s v a l o r e s fu e r o n l o s s i gu i e n t e s :
K\ = 8.0 1.0

3
= 0.28 0.05 m l /U
116 Resultados
1.0
Pu n t o s s o br e l a s u pe r fi c i e
o Pi m o s ba jo l a s u pe r fi c i e
Fi g. 4.I.5.: Re pr e s e n t a c i n d e l o s pu n t o s e xpe r i m e n t a l e s y a ju s t e d e l o s m i s m o s m e d i a n t e l a
e c u a c i n (6) qu e r e pr e s e n t a l a e c u a c i n d e a d s o r c i n d e La n gm u i r c o m pl e t a pa r a e s t e s i s t e m a .
La bo n d a d d e l a ju s t e s e r e fl e ja c l a r a m e n t e e n l a i m po r t a n t e d i s m i n u c i n d e l e r r o r d e
a ju s t e d e l o s pa r m e t r o s c o n r e s pe c t o a l o s d e t e r m i n a d o s m e d i a n t e l a e c u a c i n s i m pl i fi c a d a ,
s i t u n d o s e e n v a l o r e s i n fe r i o r e s a l 20% pa r a t o d o s l o s c a s o s . Po r t a n t o , pa r e c e c l a r o qu e u n a
e c u a c i n d e La n gm u i r c o m pl e t a d e s c r i be e l s i s t e m a d e u n a m a n e r a s a t i s fa c t o r i a y qu e e s t o s
pa r m e t r o s pu e d e n s e r i n t r o d u c i d o s e n e l m o d e l o m a t e m t i c o d e d e s c r i pc i n d e l pr o c e s o .
Es c o n o c i d o e l he c ho d e qu e l a s e n zi m a s o l a s pr o t e n a s e n ge n e r a l t i e n d e n a ge n e r a r
fe n m e n o s d e a d s o r c i n e n m u l t i c a pa (Le e y Pa r k, 1996). Se l l e ga a u n pu n t o d e s a t u r a c i n a
pa r t i r d e l c u a l l a s pr o t e n a s s e s i gu e n a d s o r bi e n d o s o br e s i m i s m a s , u n a v e z o c u pa d o s t o d o s
l o s pu n t o s d e a d s o r c i n s o br e e l s o l u t o . En n u e s t r o c a s o , e s t e fe n m e n o s e t e n d r a qu e t r a d u c i r
e n qu e e l s i s t e m a r e s po n d i e r a m e jo r a u n a ju s t e d e l t i po m u l t i c a pa c o m o d e s c r i be l a e c u a c i n
(7) pr o pu e s t a po r B r u n a u e r et al, (1938) y c o n o c i d a c o m o l e y d e B .E.T.
Resultados
117
Lip,'org K-Lip,'aq
(Lips - Lip
aq
)[ 1 + (#4 - 1)
Lips
Le yd e B .E.T. (7)
d o n d e Lip
s
r e pr e s e n t a e l v a l o r d e s a t u r a c i n a pa r t i r d e l c u a l s e pr o d u c e e l fe n m e n o
m u l t i c a pa . Si n e m ba r go , e n e l s i s t e m a e s t u d i a d o , y pa r a e l r a n go d e a c t i v i d a d e s l i po l t i c a s y
c o n c e n t r a c i o n e s d e c i d o o l e i c o e s t u d i a d a s , n o s e o bs e r v d i c ho c o m po r t a m i e n t o c o m o s e
o bs e r v a e n l a Fi gu r a 4.1.6. En d i c ha fi gu r a s e r e pr e s e n t a e n l n e a s d i s c o n t i n u a s e l
c o m po r t a m i e n t o t e r i c o t pi c o pa r a u n fe n m e n o m u l t i c a pa d e s c r i t o po r l a l e y d e B ET.
o
o.
7
^ 6
t'~
N
i
5
I 4- 1
3 -
2 -
1 -
Pu n i o s e xpe r i m e n t a l e s
Pr e d i c c i n La n gm u i r
Pr e d i c c i n m u l t i c a pa

10 15
i
20
l
25
I
30 35
Li p
a q
(U /m l )
Fi g. 4.I.6.: Pr e d i c c i n d e l e y d e a d s o r c i n c o n fe n m e n o m u l t i c a pa c o n r e s pe c t o a l e y d e
La n gm u i r y c o m pa r a c i n c o n l o s pu n t o s e xpe r i m e n t a l e s .
118 Resultados
Ot r a c o m pr o ba c i n r e a l i za d a fu e d e t e r m i n a r l a i n fl u e n c i a qu e po d a t e n e r l a pr o pi a
bi o m a s a e n l a a d s o r c i n . Da d a l a n a t u r a l e za l i pd i c a d e l a m e m br a n a c e l u l a r , po d r a
pr o d u c i r s e e l fe n m e n o d e a d s o r c i n d e l a e n zi m a s o br e l a s pr o pi a s c l u l a s . Pa r a e l l o , s e hi zo
c r e c e r Candida rugosa s o br e ga l a c t o s a , s u bs t r a t o e n e l qu e l a pr o d u c c i n d e l i pa s a e s m n i m a ,
r e c u pe r n d o s e l a bi o m a s a po r c e n t r i fu ga c i n . La bi o m a s a c e n t r i fu ga d a s e r e s u s pe n d i e n
m e d i o
:
d e c u l t i v o s i n fu e n t e d e c a r bo n o d e m a n e r a qu e s e o bt u v i e r o n c o n c e n t r a c i o n e s
v a r i a bl e s d e bi o m a s a . Pa r a c a d a u n a d e e s t a s c o n c e n t r a c i o n e s s e a a d i u n a s o l u c i n d e
a c t i v i d a d l i po l t i c a c o n o c i d a , a n a l i zn d o s e l a a c t i v i d a d r e m a n e n t e e n l a s o l u c i n a c u o s a . Lo s
r e s u l t a d o s s e pr e s e n t a n e n l a fi gu r a 4.1.7.
Co m o s e o bs e r v a e n d i c ha fi gu r a e l fe n m e n o d e l a a d s o r c i n d e l a l i pa s a s o br e l a
bi o m a s a t i e n e l u ga r e n e l s i s t e m a pe r o c o n v a l o r e s n o s u pe r i o r e s a l 15 %. La a d s o r c i n d e l a
l i pa s a s e n l a i n t e r fa s e bi o m a s a -a c u o s a e s m u c ho m e n o r qu e e n l a i n t e r fa s e o r gn i c o -a c u o s a
fo r m a d a po r e l c i d o o l e i c o , e n l a qu e e l % d e a d s o r c i n l l e ga ba a a l c a n za r e l 60 %. De bi d o a
e s t a s m a r c a d a s d i fe r e n c i a s n o s e c o n s i d e r e s t e e fe c t o e n l a e xpr e s i n fi n a l d e l a l e y d e
a d s o r c i n .
.i
la
3
1.0 4
0.9 -
0.8 -
0.7 -
0.6 -
0.5 -
0.4 -
0.3 -
0.2 -
0.1 -
0.0 -
C

\
~ -- -- -, - . . . ,
* " -
t i l )
1 2 3 4 5
B i o m a s a (g/1)
Fi g. 4.I.7.: A d s o r c i n d e l a l i pa s a s o br e l a s c l u l a s d e Candida rugosa e n a u s e n c i a d e c i d o
o l e i c o pa r a d i s t i n t a s c o n c e n t r a c i o n e s d e bi o m a s a .
Resultados 119
En c o n s e c u e n c i a s e e l i gi l a e c u a c i n (6) c o n l o s pa r m e t r o s d e t e r m i n a d o s
a n t e r i o r m e n t e , pa r a d e s c r i bi r l a a d s o r c i n d e l a s l i pa s a s d e Candida rugosa s o br e c i d o
o l e i c o . La l e y t e n d r a l a s i gu i e n t e e xpr e s i n :
Lipa,, _ 1
Lip* S'S
1
( 8)
(1.1 +S) (1 + 0.28
La e c u a c i n (8) fu e v a l i d a d a e l i m i n a n d o d e l a ju s t e e xpe r i m e n t o s c o m pl e t o s d e d i s t i n t o s
v a l o r e s d e laLip
to
t (l o s c o r r e s po n d i e n t e s a l a s fi gu r a s 4.1.3 y 4.1.4). A l r e a l i za r e s t a o pe r a c i n
s e o bs e r v qu e l o s c a m bi o s e n l o s pa r m e t r o s e r a n m n i m o s , a s c o m o e l e r r o r r e l a t i v o m e d i o
d e e s t i m a c i n (MRE). La v a r i a c i n d e e s t o s pa r m e t r o s s e r e c o ge e n l a t a bl a 4.1.2 y fu e
m a r c a d a m e n t e m e n o r qu e e n e l c a s o d e u s a r u n a l e y d e a d s o r c i n l i n e a l (Ta bl a 4.1.1).
Pu n t o s c o n s i d e r a d o s
To d o s (48)
To d o s e xc e pt o Li p
t o
t =35.4 U /m l (35)
To d o s e xc e pt o Li pt o t =26.2 U /m l (32)
To d o s e xc e pt o Li p
t o
t =13.6 U /m l (40)
Ki
8.0 1.0
9.0 1.0
8.0 1.0
8.0 1.0
K'd (g/1)
1.1 0.1
1.20.1
1.0 0.1
1.10.1
K
3
(m l /U )
0.28 0.05
0.29 + 0.05
0.28 0.05
0.25 0.05
M.R.E.
0.11
0.11
0.10
0.13
Tabla 4.1.2.: Va r i a c i n d e l a s c o n s t a n t e s d e l a e c u a c i n (8) y d e l e r r o r m e d i o r e l a t i v o d e
a ju s t e (MRE) a l e l i m i n a r e xpe r i m e n t o s c o m pl e t o s d e u n a a c t i v i d a d l i po l t i c a d e t e r m i n a d a .
Co m o c o n c l u s i n , l a l e y d e a d s o r c i n c o m pl e t a d e s c r i t a po r l a e c u a c i n (8) s e i n c l u y
e n e l m o d e l o m a t e m t i c o d e l pr o c e s o pa r a c o n o c e r l a a c t i v i d a d l i po l t i c a t o t a l e xt r a c e l u l a r
pr e s e n t e e n e l m e d i o (a c u o s a + a d s o r bi d a ). Es t a l e y e s t v a l i d a d a pa r a l a s a c t i v i d a d e s
l i po l t i c a s y c o n c e n t r a c i o n e s d e c i d o o l e i c o ha bi t u a l e s pr e s e n t e s e n l a s fe r m e n t a c i o n e s e n
fe d -ba t c h. El c o n o c i m i e n t o d e e s t e v a l o r pe r m i t i r , po r e je m pl o , po d e r r e a l i za r ba l a n c e s d e
a c t i v i d a d l i po l t i c a t o t a l e xt r a c e l u l a r .
120 Resultados
4.1.3. Co n c l u s i o n e s
Co m o c o n c l u s i o n e s a e s t e a pa r t a d o s e pu e d e n d e s t a c a r :
Se ha d i s e a d o u n s i s t e m a d e pr o d u c c i n d e l i pa s a s m e d i a n t e o pe r a c i n e n fe d -ba t c h a
e s c a l a pl a n t a pi l o t o (501).
Se ha d e t e r m i n a d o l a pr o d u c t i v i d a d d e l s i s t e m a d e fe r m e n t a c i n e m pl e a d o , r e s u l t a n d o
s u pe r i o r a l o s s i s t e m a s e n d i s c o n t i n u o y c o n t i n u o u t i l i za d o s a n t e r i o r m e n t e .
Es t a l i pa s a s e d e n o m i n a r l i pa s a U A B .
Se ha d e t e r m i n a d o l a e xpr e s i n d e l a l e y d e a d s o r c i n d e La n gn u r d e l a l i pa s a U A B
s o br e c i d o o l e i c o ba jo l a s c o n d i c i o n e s d e o pe r a c i n , pe r m i t i e n d o s u i n c l u s i n e n e l
m o d e l o m a t e m t i c o qu e d e s c r i be l a pr o d u c c i n d e l a s l i pa s a s U A B d e Candida rugosa.
Resultados 121
4.2. SEPARACIN DE LA LIPASA UAB
4.2.1. Obt e n c i n d e u n c o n c e n t r a d o l qu i d o d e l i pa s a s U A B
La l i pa s a pr o d u c i d a po r Candida rugosa e s u n a e n zi m a e xt r a c e l u l a r , s i bi e n y
d e pe n d i e n d o d e l a s c o n d i c i o n e s d e o pe r a c i n pu e d e e n c o n t r a r s e m a yo r i t a r i a m e n t e e n e l i n t e r i o r
d e l a c l u l a (Go r d i l l o , 1996). En e s t e t r a ba jo s l o s e ha r r e fe r e n c i a a l a pu r i fi c a c i n y
r e c u pe r a c i n d e l a e n zi m a e xt r a c e l u l a r .
La o pe r a c i n e n fe d -ba t c h a ba ja v e l o c i d a d d e a d i c i n c o n s t a n t e d e c i d o o l e i c o (q=0.2 g
c i d o o l e i c o /(h-l d e fe r m e n t a d o r )) ha r e s u l t a d o s e r l a m s pr o d u c t i v a e n t r m i n o s d e a c t i v i d a d
l i po l t i c a t o t a l pr e s e n t e e n e l m e d i o d e c u l t i v o . Es t a a c t i v i d a d e n zi m t i c a s e c i fr a e n t o r n o a l a s
100-150 U /m l , s i e n d o l a c o n c e n t r a c i n d e pr o t e n a t o t a l c o r r e s po n d i e n t e e n t r e 60-100 u g/m l y l a
bi o m a s a fi n a l pr e s e n t e e n u n r a n go d e 6-8 g/1. El e c t r o fo r e s i s d e e s t e c a l d o d e c u l t i v o pe r m i t e n
e s t i m a r e n t r e u n 20 y u n 30% e l c o n t e n i d o e n l i pa s a e n r e fe r e n c i a a l a pr o t e n a t o t a l (Go r d i l l o et
al., 1995).
El d i s e o d e l a s d i fe r e n t e s e t a pa s pa r a l a s e pa r a c i n d e l a l i pa s a U A B e xt r a c e l u l a r d e l
m e d i o d e c u l t i v o s e r e pr e s e n t a e n l a Fi gu r a 4.2.1. Es t e pr o c e s o c o n s t a d e u n a c e n t r i fu ga c i n
pr e v i a a SOOOg (We s t fa l i a Se pa r a t o r A G), e n l a qu e s e e l i m i n a l a m a yo r a d e l a bi o m a s a d e l
m e d i o , s e gu i d o d e u n a m i c r o fi l t r a c i n po r 0.45u ,m (Mi n i t a n Mi l l i po r e ) c o n o bje t o a s e gu r a r l a
t o t a l e l i m i n a c i n d e l a bi o m a s a . Es t e l qu i d o c l a r i fi c a d o s e e s t e r i l i z qu m i c a m e n t e m e d i a n t e l a
a d i c i n d e .a zi d a s d i c a (0.02%), l a a d i c i n d e l a m i s m a n o s u po n e n i n gu n a pr d i d a d e a c t i v i d a d
po r pa r t e d e l a e n zi m a . Te n i e n d o e n c u e n t a qu e l a l i pa s a c o m e r c i a l d e Candida rugosa (Si gm a
1754,t i po VE) t i e n e u n pe s o m o l e c u l a r a pr o xi m a d o d e 60 kDa (Ra et al, 1993), r e s u l t a d o qu e
s e c o n fi r m a po r e l e c t r o fo r e s i s e n n u e s t r a s fe r m e n t a c i o n e s (Go r d i l l o et al, 1995), l a s i gu i e n t e
e t a pa c o n s i s t i e n u n a u l t r a fi l t r a c i n u t i l i za n d o m e m br a n a s d e l OkDa d e c u t -o ff, e n e s t a e t a pa s e
c o n c e n t r a ba e l v o l u m e n d e fe r m e n t a c i n 40 v e c e s , e s t e c o n c e n t r a d o s e d i l u a ha s t a s u v o l u m e n
i n i c i a l m e d i a n t e l a a d i c i n d e t a m po n Tr i s -HCl 20 m M pH = 7.4, pt i m o pa r a l a l i pa s a U A B
(Go r d i l l o et al, 1995). Vo l v i n d o s e a u l t r a fi l t r a r po r l OkDa c o n u n a r e d u c c i n d e l v o l u m e n d e
40 v e c e s o bt e n i n d o s e e l c o n c e n t r a d o fi n a l d e l i pa s a s . En e s t a l t i m a e t a pa , s i m i l a r a u n a
122 Resultados
d i a fi l t r a c i n , s e c o n s e gu a l a pr c t i c a e l i m i n a c i n d e l a s s a l e s d e l m e d i o d e fe r m e n t a c i n a s
c o m o l a e l i m i n a c i n d e l a m a yo r a d e pr o t e n a n o l i po l t i c a d e pe s o m o l e c u l a r i n fe r i o r a 10 kDa .
Di a fi l t r a c i n
Tr i s -HCl
20 m M
pH=7.40
Sa l e s
Pr o t e n a <10000D
Fi g. 4.2.I.: Se pa r a c i n d e l a l i pa s a U A B d e s d e e l c a l d o d e fe r m e n t a c i n ha s t a l a o bt e n c i n d e u n
c o n c e n t r a d o l qu i d o d i a l i za d o .
En l a t a bl a 4.2.1 s e pr e s e n t a n l o s r e n d i m i e n t o s r e fe r e n t e s a a c t i v i d a d l i po l t i c a o bt e n i d o s
e n l a s d i fe r e n t e s e t a pa s n u m e r a d a s d e l pr o c e s o y l a a c t i v i d a d l i po l t i c a e s pe c fi c a pa r a u n
e xpe r i m e n t o e n fe d -ba t c h e s t n d a r e n u n fe r m e n t a d o r B r a u n B i o s t a t E d e 5 1 d e v o l u m e n . Lo s
r e s u l t a d o s o bt e n i d o s ha n s i d o c o r r o bo r a d o s c o n e l u s o d e fe r m e n t a d o r e s d e e s c a l a pi l o t o c o m o
l o s B r a u n B i o s t a t ED d e 15 1 o B r a u n B i o s t a t U D d e 501 d e v o l u m e n .
El pu n t o c r t i c o e n e l e s c a l a d o d e l pr o c e s o d e s e pa r a c i n e s , s i n l u ga r a d u d a s , l a e t a pa d e
u l t r a fi l t r a c i n , pa r a e l l o s e t r a ba jo c o n t r e s s i s t e m a s e n fu n c i n d e l v o l u m e n d e qu e s e t r a t a r a :
a ) Si s t e m a Mi n i t a n Mi l l i po r e e qu i pa d o c o n 4 m e m br a n a s PMNL d e 10 kDa d e c o r t e pa r a
v o l m e n e s n o s u pe r i o r e s a 5 1.
Resultados 123
b) Si s t e m a Pr e p/Sc a l e TTF Mi l l i po r e c o n u n PTGC 10 K 2.5 ft
2
Ca r t r i d ge ha s t a 15 1 d e
v o l u m e n .
c ) Si s t e m a Ce n t r a s e t t e Pa l i Fi l t r e n c o n u n a m e m br a n a Om e ga 10K ha s t a 1001 d e v o l u m e n .
En t o d o s e s t o s s i s t e m a s e l c o r t e e l e gi d o d e 10 kDa a s e gu r l a r e c u pe r a c i n t o t a l d e l a a c t i v i d a d
l i po l t i c a c o m o s e pu e d e o bs e r v a r e n l a Ta bl a 4.2.1.
Pu n t o d e pr o c e s o
Fi n a l Fe r m e n t a c i n
Ca l d o c e n t r i fu ga d o
Fi l t r a c i n 0.45 u m
Pr i m e r r e t e n i d o 10 kDa
Pr i m e r fi l t r a d o 10 kDa
Re d i s o l u c i n e n t a m pn
Se gu n d o r e t e n i d o 10 kDa
Se gu n d o fi l t r a d o 10 kDa
A c t . Li po l t i c a
(U /m i )
98
125
120
3810
0
23 __,
5010
0
Pr o t e n a
t o t a l
....M/m D.....
146
173
169
3547
53
113
3270
27
Vo l .
O)
5.0
4.1
4.1
0.128
4.0
4.0
0.100
3.900
A c t . Li po l t i c a
e s pe c .
ffi /m g)
671
723
710
1074
0
088
1532
0
Re n d i m i e n t o
e n a c t . l i p.
(%)
100
104.6
100.4
99.5
_
100.4
102.2
-
Tabla 4.2.1.: B a l a n c e d e a c t i v i d a d l i po l t i c a e n l o s pu n t o s d e l pr o c e s o d e d o wn -s t r e a m pa r a l a
o bt e n c i n d e l i pa s a s d e Candida rugosa.
A l fi n a l d e l pr o c e s o d e c e n t r i fu ga c i n s e o bs e r v a u n a u m e n t o d e a pr o xi m a d a m e n t e u n
5% e n l a a c t i v i d a d l i po l t i c a pr o ba bl e m e n t e d e bi d o a l a l i be r a c i n d e l a m a yo r a d e l a e n zi m a qu e
s e e n c u e n t r a a d s o r bi d a s o br e l a bi o m a s a y qu e e s t u d i o s pr e v i o s ha ba n e s t i m a d o c o m o m xi m o
e n u n 15% d e l t o t a l (Ca pt u l o 4.1). Po r l o qu e r e s pe c t a a l ba l a n c e d e pr o t e n a t o t a l e n l a Fi gu r a
4.2.2 s e r e c o ge e l m i s m o .
Se gu n d o
fi l t r a d o
(10 kDa )
15%
Pr d i d a d e
pr o t e n a
7%
Pr i m e r
fi l t r a d o
(10 kDa )
31%
Se gu n d o
r e t e n i d o
(pr o d u c t o
fi n a l )
47%
Fig,:4.2.2,: B a l a n c e d e pr o t e n a t o t a l e n l a s d o s o pe r a c i o n e s d e u l t r a fl t r a c i n a t r a v s d e 10 kDa .
124 Resultados
En d i c ha fi gu r a s e o bs e r v a qu e s e ha e l i m i n a d o e n e l fi l t r a d o a pr o xi m a d a m e n t e u n 47%
d e pr o t e n a t o t a l pr e s e n t e i n i c i a l m e n t e e n e l c a l d o d e c u l t i v o d e pe s o m o l e c u l a r i n fe r i o r a 10 kDa ,
s i e n d o l a pr d i d a d e pr o t e n a t o t a l a pr o xi m a d a m e n t e d e l 7%. Es t a pr d i d a s e pu e d e ju s t i fi c a r e n
ba s e a u n po s i bl e fe n m e n o d e a d s o r c i n s o br e l a s pl a c a s d e u l t r a fi l t r a c i n , n o o bs t a n t e e s t e e s
u n pr o bl e m a qu e , e n pr i n c i pi o , n o e s pr e o c u pa n t e ya qu e e s t a pr o t e n a a d s o r bi d a n o t i e n e c a r c t e r
l i po l t i c o c o m o l o d e m u e s t r a e l he c ho d e qu e n o s e o bs e r v a n pr d i d a s d e a c t i v i d a d l i po l t i c a a l
fi n a l d e l pr o c e s o .
A d e s t a c a r qu e e l ba l a n c e d e a c t i v i d a d l i po l t i c a s e c i e r r a e n e l pu n t o fi n a l c o n u n v a l o r
d e l 100% l o qu e d e m u e s t r a l a gr a n e s t a bi l i d a d d e l a e n zi m a , ya d e m o s t r a d a e n a n t e r i o r e s t r a ba jo s
(Go r d i l l o etal., 1995) y l a v a l i d e z d e l pr o c e s o d i s e a d o .
4.2.2. Obt e n c i n d e u n a l i pa s a U A B s l i d a
En e s t e a pa r t a d o s e s i gu i e r o n t r e s e s t r a t e gi a s c l s i c a s pa r a l a o bt e n c i n d e u n s l i d o qu e
c o n t e n ga l a l i pa s a c o n l a m e n o r pr d i d a po s i bl e d e a c t i v i d a d l i po l t i c a .
4.2.2.1. Pr e c i pi t a c i n c o n e t a n o l
El u s o d e d i s o l v e n t e s o r gn i c o s pa r a l a pr e c i pi t a c i n d e pr o t e n a s e s t a m pl i a m e n t e
r e fe r e n c i a d o (De u t s c he r 1988). El e t a n o l ha s i d o u t i l i za d o c o m o a ge n t e pr e c i pi t a n t e c o n l i pa s a s
c o m e r c i a l e s d e Candida rugosa (Si gm a t i po VII) o bt e n i n d o s e r e s u l t a d o s qu e v a n d e s d e e l 84%
d e r e c u pe r a c i n d e pr o t e n a y e l 93% d e a c t i v i d a d l i po l t i c a (Ve e r a r a ga v a n y Gi bbs , 1989), a l
45% d e r e c u pe r a c i n d e pr o t e n a y e l 84% d e a c t i v i d a d (Ra et al., 1993). Si bi e n n o s e t i e n e
c o n o c i m i e n t o d e l a pr e c i pi t a c i n d e l i pa s a s d e Candida rugosa c o n d i s o l v e n t e s o r gn i c o s a pa r t i r
d e l c a l d o d e c u l t i v o s i e xi s t e n r e fe r e n c i a s pr o d u c i d a s po r o t r o s m i c r o o r ga n i s m o s . A s l a l i pa s a
pr o d u c i d a po r Trichosporon fermentan WU-C12 s e r e c u pe r d e l c a l d o d e c u l t i v o m e d i a n t e
pr e c i pi t a c i n c o n a c e t o n a o bt e n i n d o s e u n a r e c u pe r a c i n d e pr o t e n a d e l 14% y u n a
r e c u pe r a c i n d e a c t i v i d a d l i po l t i c a d e l 80% (Che n et a /., 1994).
Si n e m ba r go , e n e l c a s o d e l a l i pa s a U A B pr o d u c i d a ba jo l a s c o n d i c i o n e s d e
fe r m e n t a c i n a n t e r i o r m e n t e c o m e n t a d a s , e s t o s bu e n o s r e s u l t a d o s n o s e r e pi t i e r o n y s e pr o d u je r o n
Resultados 125
i m po r t a n t e s pr d i d a s d e a c t i v i d a d l i po l t i c a y d e pr o t e n a t o t a l . En l a Ta bl a 4.2.2. s e pr e s e n t a n
e s t o s r e s u l t a d o s pa r a u n a pr e c i pi t a c i n t pi c a .
Mu e s t r a
In i c i a l
Pe l l e t
So br e n a d a n t e
A c t i v i d a d
l i po l t i c a (U /m l )
3500
1060
47
Vo l u m e n
(m i )
22
22
43
A c t i v i d a d l i po l t i c a
t o t a l (U )
77000
23320
2021
Re n d i m i e n t o
(%)
-
30.3
2.6
Tabla 4.2.2.: Re c u pe r a c i o n e s d e a c t i v i d a d l i po l t i c a c o n e t a n o l .
Pa r a l a d e t e r m i n a c i n d e l o s v a l o r e s pr e s e n t e s e n l a t a bl a 4.2.2 y d a d a l a i n t e r fe r e n c i a d e l
e t a n o l e n l o s a n l i s i s d e pr o t e n a t o t a l y d e a c t i v i d a d l i po l t i c a , s e e l i m i n e l e t a n o l d e l a s
m u e s t r a s m e d i a n t e e v a po r a c i n e n r o t o v a po r y d e s pu s s e r e s u s pe n d i e r o n l o s s l i d o s e n e l
m i s m o v o l u m e n d e t a m pn . La l i pa s a e s e s t a bl e a e s t a s o pe r a c i o n e s , po r t a n t o , l a s i m po r t a n t e s
pr d i d a s d e a c t i v i d a d l i po l t i c a r e fl e ja d a s e n l a t a bl a 4.2.2 t e n a n qu e s e r d e bi d a s a l e t a n o l , c o n l o
qu e e s t e s i s t e m a d e r e c u pe r a c i n n o e r a e l i d n e o pa r a l a l i pa s a U A B .
4.2.2.2. Pr e c i pi t a c i n c o n s u l fa t o a m n i c o
El s u l fa t o a m n i c o e s o t r o d e l o s a ge n t e s pr e c i pi t a n t e s c l s i c o s pa r a pr o t e n a s (Ha r r i s y
A n ga l , 1989). El s u l fa t o a m n i c o fu e a a d i d o e n d i s t i n t a s pr o po r c i o n e s c o n r e s pe c t o a l v a l o r d e
s a t u r a c i n . La r e c u pe r a c i n d e a c t i v i d a d l i po l t i c a y pr o t e n a t o t a l pa r a d i c ho s po r c e n t a je s d e
s a t u r a c i n s e r e pr e s e n t a e n l a Fi gu r a 4.2.3. La s c o n d i c i o n e s pt i m a s d e s e pa r a c i n s e
c o n s i gu i e r o n pa r a e l 60 % d e s a t u r a c i n e n s u l fa t o a m n i c o , e n e l qu e s e pr o d u c a u n a
r e c u pe r a c i n s u pe r i o r a l 70 % c o n r e s pe c t o a l a a c t i v i d a d l i po l t i c a , y d e l 55% c o n r e s pe c t o a l a
pr o t e n a . Es t o s r e s u l t a d o s a u n s i e n d o m e jo r qu e l o s o bt e n i d o s c o n l a pr e c i pi t a c i n c o n e t a n o l s e
e n c u e n t r a n l e jo s d e l o s o bt e n i d o s c o n l i pa s a s d e Fusarium heterosporum, d e l o r d e n d e l 93%
(Shi m a d a e a /., 1993) pe r o m e jo r e s qu e l o s o bt e n i d o s c o n Pseudomonas aeruginosa IGB 83, d e l
o r d e n d e l 15% e n c u a n t o a r e c u pe r a c i n d e l a a c t i v i d a d l i po l t i c a (Pa l m e r o s et al, 1993).
126 Resultados
En e s t e s i s t e m a , l a c a n t i d a d d e s u l fa t o a m n i c o a a a d i r pa r a c o n s e gu i r u n a d e t e r m i n a d a
pr o po r c i n 82 d e s u l fa t o a m n i c o r e s pe c t o a l v a l o r d e s a t u r a c i n v i e n e d a d a po r l a e c u a c i n (1):
6
100-0.3S
v
'
e n e s t e c a s o Si =0 y S2
==
60, po r l o qu e l a c o n c e n t r a c i n d e s u l fa t o a m n i c o pt i m a pa r a l a
pr e c i pi t a c i n d e l i pa s a s d e Candida rugosa r e s u l t a s e r d e 390 g/1.
100
90 H
'S' 80 -
o

70 -
1 3 60 -
S 50 H
*O
a 40 H
I
t
30 -
20 -
1 0 -
O
10 20 30 40 50 60 70
Su l fa t o a m n i c o (%)
80
100
- 90

-70 g
1
- 60 B .
- 50
- 40
- 30
-20
- 10
O
90
Fi g. 4.2.3.: Re c u pe r a c i n d e a c t i v i d a d l i po l t i c a y pr o t e n a t o t a l e n l a pr e c i pi t a c i n c o n s u l fa t o
a m n i c o .
En e s t e c a s o , l o s v a l o r e s d e r e c u pe r a c i n d e a c t i v i d a d l i po l t i c a ya e r a n pa r e c i d o s a l o s
d e s c r i t o s po r Ra et al. (1993) y e s t e s i s t e m a po d a s e r u n a po s i bi l i d a d pa r a l a r e c u pe r a c i n
pt i m a d e l a l i pa s a e n fo r m a d e s l i d o .
Resultados 127
4.2.2.3. Li o fl i za c i n d i r e c t a
Ot r a po s i bi l i d a d d e o bt e n c i n d e pr e pa r a d o s s l i d o s d e l i pa s a s e s u n a l i o fl i za c i n d i r e c t a
d e l c o n c e n t r a d o l qu i d o d e l i pa s a s . Es t e s i s t e m a s e d e s a r r o l l c o n ge l a n d o pr e v i a m e n t e e l
c o n c e n t r a d o c o n u n a m e zc l a d e n i e v e c a r bn i c a y a c e t o n a y po s t e r i o r l i o fl i za c i n d u r a n t e 24
ho r a s . La l i o fl i za c i n d i r e c t a d e l c o n c e n t r a d o d e c a l d o d e c u l t i v o , s i gu i e n d o e l d i s e o
a n t e r i o r m e n t e c o m e n t a d o , pr o v o c u n a pr d i d a d e a c t i v i d a d l i po l t i c a pr xi m a a l 25%.
Es c o n o c i d o qu e l a a d i c i n d e a zc a r e s pr e v i o s a l a l i o fi l i za c i n c o n s i gu e u n a m a yo r
e s t a bi l i za c i n d e l a s pr o t e n a s e n ge n e r a l (Mo n s a n y Du r a n d , 1971). De he c ho e n l o s pr e pa r a d o s
c o m e r c i a l e s d e l i pa s a d e Candida rugosa, s e d e t e c t a n c a n t i d a d e s i m po r t a n t e s d e a zc a r e s .
Co n c r e t a m e n t e , e n l a l i pa s a c o m e r c i a l d e Si gm a e l 70% d e l pr e pa r a d o c o m e r c i a l e s l a c t o s a . A n t e
e s t e he c ho s e e s t u d i l a i n fl u e n c i a qu e d i v e r s a s c o n c e n t r a c i o n e s d e l a c t o s a a a d i d a s a l
c o n c e n t r a d o d e l i pa s a s pu d i e r a t e n e r c o n r e s pe c t o a l a pr d i d a d e a c t i v i d a d l i po l t i c a e n e l
pr o c e s o d e l i o fl i za c i n .
En l a Fi gu r a 4.2.4 s e o bs e r v a c o m o a l v a r i a r l a c o n c e n t r a c i n d e l a c t o s a s e pr o d u c e u n
i m po r t a n t e a u m e n t o d e l a r e c u pe r a c i n d e l a a c t i v i d a d l i po l t i c a e n l a l i o fl i za c i n . Si n e m ba r go ,
pa r a n o ge n e r a r u n a n o t a bl e d i s m i n u c i n d e l a a c t i v i d a d e s pe c fi c a po r a u m e n t o d e l a c a n t i d a d d e
s l i d o s e e l i gi c o m o pt i m o e l v a l o r d e 10 g/1 d e l a c t o s a c o n e l qu e s e o bt e n a n r e c u pe r a c i o n e s
d e l 90 % d e a c t i v i d a d . Co m o s e o bs e r v a e n l a fi gu r a 4.2.4, po r e n c i m a d e e s t a c o n c e n t r a c i n e l
po r c e n t a je d e r e c u pe r a c i n a u m e n t a m u y l i ge r a m e n t e , c o n l o qu e l o n i c o qu e s e c o n s e gu i r a e s
u n a d i s m i n u c i n d e l a a c t i v i d a d e s pe c fi c a d e l pr e pa r a d o s l i d o . En e s t e pr e pa r a d o l i o fi l i za d o
fi n a l , c o r r e s po n d i e n t e a 10 g/1 d e l a c t o s a , e l % d e l a c t o s a fi n a l e s d e l o r d e n d e l 50% d e l s l i d o
qu e s e o bt i e n e .
128
Resultados
100
E
3
~ 95 -
^
a ,
'
-g
I
U
90 -
85 -
80 -
75
10 20 30 40
Lactosa (g/1)
r~
50
Fi g. 4.2.4.: Re c u pe r a c i n d e l a a c t i v i d a d l i po l t i c a e n l a l i o fl i za c i n e n pr e s e n c i a d e l a c t o s a .
En l a Ta bl a 4.2.3 s e r e c o ge n , a m o d o d e r e s u m e n , l o s r e s u l t a d o s o bt e n i d o s c o n l o s t r e s
s i s t e m a s e n t r m i n o s d e r e c u pe r a c i n . A l a v i s t a d e l o s a n t e r i o r e s r e s u l t a d o s y d e l a fa c i l i d a d
o pe r a c i o n a l d e u n s i s t e m a d e l i o fl i za c i n s e e l i gi e s t e m t o d o pa r a l a o bt e n c i n d e l i pa s a s e n
fo r m a s l i d a a pa r t i r d e l c o n c e n t r a d o l qu i d o .
Mtodo de obtencin de lipasa en
forma slida
Precipitacin con etanol
Precipitacin con sulfato amnico
Lioflizacin directa
% recuperacin
de act. lipoltica
-30
-70
-90
% recuperacin
de protema
-27
-55
-100
Factor de
purificacin
1.11
1.27
0.90
Tabla 4.2.3.: Re s u m e n d e m t o d o s d e o bt e n c i n d e l i pa s a s l i d a d e Candida rugosa a pa r t i r d e l
c o n c e n t r a d o l qu i d o .
Resultados 129
Si n e m ba r go , ha y qu e t e n e r e n c u e n t a qu e l o s fa c t o r e s d e pu r i fi c a c i n e r a n m e jo r e s e n e l
c a s o d e l a pr e c i pi t a c i n c o n s u l fa t o a m n i c o , c o m o s e o bs e r v a e n l a t a bl a 4.2.3, d e bi d o a qu e e n
e l pr o c e s o d e l i o fi l i za c i n n o ha y e l i m i n a c i n d e pr o t e n a t o t a l , m i e n t r a s qu e e n l o s pr o c e s o s d e
pr e c i pi t a c i n s i e m pr e s e pr o d u c e u n fe n m e n o d e s e l e c t i v i d a d ha c i a a l gu n a d e l a s pr o t e n a s
pr e s e n t e s .
Re s pe c t o a l a l i o fi l i za c i n c a be d e c i r qu e l a i n c l u s i n d e l a c t o s a e n l a l i o fi l i za c i n , pe s e a
t e n e r u n e fe c t o be n e fi c i o s o e n l a r e c u pe r a c i n d e a c t i v i d a d l i po l t i c a , n o s e i n c o r po r a l
pr o t o c o l o ge n e r a l d e s e pa r a c i n , d e bi d o a qu e e n m u c ho s c a s o s i n t e r e s a ba d e t e r m i n a r e l gr a d o d e
gl i c o s i l a c i n d e l a s pr o t e n a s y l a l a c t o s a s u po n a u n a i n t e r fe r e n c i a i m po r t a n t e d i fc i l d e e l i m i n a r
c o m pl e t a m e n t e , a s pu e s , n o fu e i n c l u i d a e n l a m a yo r a d e l o s c a s o s .
4.2.3. Co n c l u s i o n e s
Co m o r e s u m e n a l c a pt u l o , s e l l e g a l a s s i gu i e n t e s c o n c l u s i o n e s :
Se ha d i s e a d o u n s i s t e m a d e d o wn s t r e a m pa r a l a o bt e n c i n d e u n c o n c e n t r a d o l qu i d o d e
l i pa s a U A B c o n r e c u pe r a c i o n e s d e a c t i v i d a d c e r c a n a s a l 100%.
En e s t e pr o c e s o s e pr o d u c e u n a d i s m i n u c i n d e l a c o n c e n t r a c i n d e pr o t e n a d e l o r d e n d e l
50%, c o r r e s po n d i e n d o a pr o t e n a s d e pe s o m o l e c u l a r i n fe r i o r a 10 kDa .
- Pa r a c o n s e gu i r u n pr e pa r a d o s l i d o s e pr o ba r o n t r e s t c n i c a s c l s i c a s , pr e c i pi t a c i n c o n
d i s o l v e n t e o r gn i c o , c o n s u l fa t o a m n i c o y l i o fi l i za c i n , s i e n d o e s t e l t i m o e l qu e o r i gi n
m e jo r e s r e s u l t a d o s e n r e c u pe r a c i n d e a c t i v i d a d (90%).
La l a c t o s a d e m o s t r s e r u n bu e n e s t a bi l i za n t e pa r a l a l i pa s a U A B , a u n qu e n o s e u s po r
ge n e r a r i n t e r fe r e n c i a s e n l a c a r a c t e r i za c i n d e l a l i pa s a U A B .
130
Resultados
Resultados 131
4.3. ESTIMACIN ECONMICA DEL PROCESO DE
PRODUCCIN DE LIPASAS UAB
4.3.1. Pa r t i d a s qu e c o m po n e n l a e s t i m a c i n e c o n m i c a
Pa r a d e t e r m i n a r s i e s t e pr o c e s o e r a r e n t a bl e e c o n m i c a m e n t e d e a c u e r d o c o n l o s
pr e c i o s a c t u a l e s d e l a l i pa s a d e Candida rugosa, s e pa s a d e t e r m i n a r l a s d i s t i n t a s pa r t i d a s qu e
c o r r e s po n d e n a e s t e t i po d e e s t u d i o s . En e s t e e s t u d i o s e c o n s i d e r t r a ba ja r c o n u n v o l u m e n d e
fe r m e n t a c i n d e 1 m
3
a l r i t m o d e 1 fe r m e n t a c i n po r s e m a n a y u n a v i d a m e d i a d e l pr o c e s o d e
10 a o s .
4.3.1.1. Ve n t a s fV)
El pr e c i o d e l a l i pa s a d e Candida rugosa pr o po r c i o n a d o po r l a e m pr e s a A m a n o , qu e l o
c o m e r c i a l i za a pa r t i r d e 100 gr a m o s , e s d e 375 pt a s /g. Es t a l i pa s a t i e n e u n a a c t i v i d a d
e s pe c fi c a e n t r e 30-40 v e c e s i n fe r i o r a l a pr o d u c i d a e n n u e s t r o l a bo r a t o r i o e n pl a n t a pi l o t o ,
s i e n d o s u pr i n c i pa l c o m po n e n t e a zc a r e s qu e s e u s a n pa r a s u e s t a bi l i za c i n .
Co n e s t o s d a t o s d e pu e d e e s t i m a r e l pr e c i o o bt e n i d o c o n l a pr o d u c c i n pr o pu e s t a ,
t e n i e n d o e n c u e n t a qu e a pr o xi m a d a m e n t e s e pr o d u c e n 0.5 g pr o d u c t o /1 fe r m e n t a d o r :
1 m
3
x 50 fe r m e n t a c i o n e s x 1000 1 x 0.5 g/1 x 375 pt a s / g x 30 = 281.3 MM/a o (V)
4.3.1.2. In m o v i l i za d o fl )
El pr e c i o d e l a pa r t i d a m a qu i n a r i a y e qu i po s s e pu e d e c a l c u l a r t e n i e n d o e n c u e n t a l o s
s i gu i e n t e s pr e c i o s :
Equ i po s :
Si s t e m a d e i n o c u l a c i n : 0.5 MM
- B r a u n B i o s t a t ED 15 1: 14 MM .
- B r a u n B i o s t a t U D 1 m
3
: 3 5 MM
Resultados 132
- Ce n t r fu ga e n c o n t i n u o 20 1/h: 5 MM
- Si s t e m a fi l t r a c i n /u l t r a fl t r a c i n 1 m
3
: 1.5 MM
- Me m br a n a s fi l t r a c i n 0.45 u m : 6 x 0.15 MM = 0.9 MM
- Me m br a n a s u l t r a fl t r a c i n 10 kDa : 6 x 0.15 MM = 0.9 MM
- Li o fi l i za d o r 141/24 h: 1.7 MM
A n a l t i c a :
- pHs t a t o = 0.8 MM
- Mi c r o s c o pi o = 0.7 MM
- Es pe c t r o fo t m e t r o = 0.5 MM
En t o t a l , Ma qu i n a r i a y a pa r a t o s : X = 61.5 MM.
El pr e c i o d e l a pa r t i d a d e i n m o v i l i za d o s e c a l c u l a r c o n e l m t o d o d e l o s po r c e n t a je s d e s c r i t o
po r Vi n (1991). En e s t e m t o d o e l v a l o r d e l i n m o v i l i za d o s e d i v i d e e n u n a s e r i e d e pa r t i d a s
qu e c o r r e s po n d e n a po r c e n t a je s d e l v a l o r d e Ma qu i n a r i a y a pa r a t o s .
Instalacin: e n t r e 0.35X y 0.50X, pa r a a pa r a t o s pe qu e o s c o m o e s e l c a s o s e c o ge r e l
v a l o r m n i m o , e s d e c i r : 0.35X = 21.5 MM.
- Tuberas: e n t r e 0.10X y 0.60X qu e c o r r e s po n d e n a s l i d o s y fl u i d o s , e n e s t e c a s o ,
c o ge r e m o s u n v a l o r i n t e r m e d i o : 0.35X = 21.5 MM.
- Instrumentacin: e n t r e 0.05X y 0.30X, d e d o n d e s e t o m a r e l m n i m o d a d o qu e l o s
e qu i po s c o m pr a d o s i n c o r po r a n i n s t r u m e n t a c i n : 0.05X = 3.1 MM.
- Aislamiento: e n t r e 0.03X y 0.10X, e l v a l o r m n i m o d a d o qu e n o s e t i e n e n t e m pe r a t u r a s
e l e v a d a s e n e s t o s pr o c e s o s : 0.03X = 1.8 MM.
Instalacin elctrica: e n t r e 0.10X y 0.20X, s e t o m a r u n v a l o r i n t e r m e d i o , 0.15X = 9.2
MM.
- Edificios: e n t r e 0.20X y 0.30X pa r a i n s t a l a c i o n e s i n t e r i o r e s , s e t o m a r e l v a l o r i n t e r m e d i o
0.25X=15.4MM.
Servicios auxiliares: e n t r e 0.25X y 0.70X, e l v a l o r m s ba jo pa r a e s t e t i po d e e m pr e s a
qu e n e c e s i t a po c o s s e r v i c i o s t i po v a po r o a gu a d e r e fr i ge r a c i n : 0.25X = 15.4 MM.
Resultados
133
Co n l a s u m a d e t o d a s e s t a s pa r t i d a s s e o bt i e n e e l capital fsico (Y):
Y = 87.9 MM
El pr o ye c t o y d i r e c c i n d e o br a s e c a l c u l a c o m o 0.20Y =17.6 MM, s u m a n d o e s t e v a l o r a l
c a pi t a l fs i c o s e o bt i e n e e l capital directo (Z):
Z = 105.5 MM
a l o s qu e s e a pl i c a n l o s ga s t o s d e :
Contratista: e n t r e 0.04Z y 0.1 OZ, s e t o m a r e l v a l o r m n i m o d e bi d o a l a e s c a s a
c o m pl e ji d a d d e l a pl a n t a : 0.04Z = 4.2 MM.
Imprevistos: e n t r e 0.10Z y 0.30Z, s e t o m a r e l v a l o r m n i m o d a d a l a e xpe r i e n c i a qu e s e
t i e n e d e l pr o c e s o : 0.10Z = 10.6 MM.
Co n e l l o s e o bt i e n e u n v a l o r fi n a l pa r a l a pa r t i d a d e inmovilizado (I) d e 181.8 MM.
U t i l i za n d o l a r e gl a d e La n g d e s c r i t a po r Vi n (1991) s e pu e d e o bt e n e r u n a e s t i m a c i n d i r e c t a
d e l c a pi t a l i n m o v i l i za d o a pa r t i r d e l a pa r t i d a d e m a qu i n a r i a y a pa r a t o s :
I = Co e fi c i e n t e d e La n g fa c t o r d e c o r r e c c i n X
To m a n d o l o s v a l o r e s r e c o m e n d a d o s po r Vi n s e o bt i e n e :
I = 4.74 x 0.6 x 61.5 = 174.9 MM
po r t a n t o , e n e s t e c a s o e s u n a m u y bu e n a a pr o xi m a c i n .
4.3.1.3. Co s t e s
El s i s t e m a d e e v a l u a c i n d e l o s c o s t e s t a m bi n s e ba s a e n u n c l c u l o d e t a l l a d o d e l a s
pa r t i d a s qu e l o s c o m po n e n . Lo s c o s t e s s e s u e l e n d i v i d i r e n d o s gr a n d e s bl o qu e s , l o s
d e n o m i n a d o s c o s t e s d e fa br i c a c i n (M) qu e s o n l o s d i r e c t a m e n t e a s o c i a d o s c o n l a pr o d u c c i n
y l o s ga s t o s ge n e r a l e s (G) qu e n o d e pe n d e n d e l a pr o d u c c i n .
Resultados 134
Pa r a e s t e s i s t e m a :
a) Costes de fabricacin (M):
1) Materias primas (MI): l o s r e a c t i v o s n e c e s a r i o s y s u pr e c i o d e m e r c a d o s e r e c o ge n e n l a
t a bl a 4.3.1.
Co m pu e s t o
K
2
HPO
4
KH
2
PO4
MgSC-4
(NH4)
2
SO
4
NH
3
30 %
A c i d o o l e i c o
Pr e c i o u n i t a r i o (pt a s )
71 145/50 Kg
53528/50 Kg
8708/25 Kg
39353/50 Kg
27459/60 1
9380/41
Ca n t i d a d (Kg/a o )
275
750
50
200
250 (I/a o )
400
Pr e c i o (pt a s /a o )
392000
803000
17000
157000
114000
4216000
Tabla 4.3.1.: Ev a l u a c i n d e l c o s t e d e l a s m a t e r i a s pr i m a s pa r a l a pr o d u c c i n d e l i pa s a U A B .
De s pr e c i a n d o e l pr e c i o d e l r e s t o d e r e a c t i v o s (a gu a d e s t i l a d a , v i t a m i n a s , Fe Cl s y
a n t i e s pu m a n t e ) s e o bt i e n e u n t o t a l d e 5.7 MM/a o .
2) Mano de obra directa (M2): c o n s i d e r a n d o e l e l e v a d o n i v e l d e i n s t r u m e n t a c i n d e l o s
e qu i po s pr e s e n t e s , s e pu e d e e s t i m a r e n 5 e l n m e r o d e pe r s o n a s n e c e s a r i a s pa r a d e s a r r o l l a r
e l pr o c e s o . Co n s i d e r a n d o u n v a l o r m e d i o d e 4 MM/pe r s o n a y a o s e t i e n e u n v a l o r d e 20
MM.
3) Patentes (M3): e n t r e 1 y 5 % d e l a s v e n t a s , e n e s t e c a s o , u n v a l o r m e d i o d e l 3% o r i gi n a r a
M3 = 0.03V = 8.5 MM.
4) Mano de obra indirecta (M4): e n t r e 15 y 45 % d e l v a l o r d e l a m a n o d e o br a d i r e c t a , e n
e s t e c a s o s e t o m a e l v a l o r m n i m o po r e l t i po d e e m pr e s a : M4 = 0.15M2 = 3 MM.
5) Servicios generales (M5): e s t a pa r t i d a s e r m u y ba ja e n n u e s t r o c a s o , y s l o ha br a qu e
t e n e r e n c u a n t a e l v a po r n e c e s a r i o e n l a e s t e r i l i za c i n . Se d e s pr e c i e n r e l a c i n c o n e l
r e s t o d e t r m i n o s .