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Daruich M. Nahir, Gallardo Noelia


Labor Biochemie - Gruppe 8
Versuch 1 Versuch 2 Versuch 3
03.12.2013






Studiengang Biotechnologie WS 2010/11
(BTB3)




Biochemie-Praktikum


Protokoll

Versuchsthema 10: Immunchemische Methoden

am 03. Dezember 2013


Von


Daruich, Gallardo


Gruppe 8

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Daruich M. Nahir, Gallardo Noelia
Labor Biochemie - Gruppe 8
Versuch 1 Versuch 2 Versuch 3
03.12.2013
Einleitung
Die Immunchemie untersucht die Struktur von Antigenen, Antikrpern und die
chemischen Grundlagen der Immunreaktionen.

Als Antigen-Antikrper-Reaktion wird in der Biochemie, der Immunologie und in
verwandten Wissenschaften ein Bestandteil der Immunreaktion bezeichnet, bei
dem sich ein Komplex aus Antigen und Antikrper bildet. Dieser wird als Antigen-
Antikrper-Komplex oder auch Immunkomplex bezeichnet.

Alle Techniken der Bestimmung des Komplexes beruhen auf der Przipitation von
Antigen und Antikrper, wenn beide Reaktionspartner in annhernd gleichen
Konzentrationen vorhanden sind.

Im Labor bilden sich sichtbare Komplexe nur unter optimalen Bedingungen. Sie
knnen als sogenanntes Przipitat (oder Trbung) ausgefllt werden. Diese sind
die sogenannte Immunprzipitation Techniken. Nutzbar ist diese Technik zur
Quantifizierung des Antigens, in seltenen Fllen auch des Antikrpers.

Fr den Nachweis von speziellen Antigenen und Reaktionen, die Ouchterlony-
Doppelimmundiffusion wird benutzt. Diese Immundiffusion Technik ist ein
einfaches und bewhrtes Verfahren.

Versuch 1: Antikrper und Protein-Antigen bilden Komplexe, die
przipitieren
Aufgabe: Die Ausfllung von Antigen mit Hilfe eines spezifischen
Antikrpers untersuchen.
Materialen
Protein:
Albumin (human) 1mg/mL in PBS
BSA 1mg/mL in PBS
Peroxidase (HRP) 1mg/mL in PBS
Antikrper:
anti-Albumin Antiserum v. Kaninchen.
anti-HRP (Kaninchen)
Reagenzlsung A: (Polyethylenglykol-PEG 4000, 4%)


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Teil 1:Albumin/anti-Albumin
Durchfhrung
In je 5 Mikrogefe (1,5 mL) geben:
- 400 L Reagenzlsung A
- 15 L anti-Albumin Antiserum
Folgendes geben

1) 50 L hu-Albumin (0,2 mg/mL)
2) 50 L hu-Albumin (0,4 mg/mL)
3) 50 L hu-Albumin (1 mg/mL)
4) 50 L hu-Albumin (2 mg/mL)
5) 50 L hu-Albumin (4 mg/mL)
5 min warten und abzentrifugieren
Die Trbung beurteilen.
Ergebnisse und Beobachtungen
Am Anfang, vor der Reaktion, alle die Mikrogefe waren farblos. Danach 5 Minuten
wurde eine weie Trbung beobachten. In dem nchsten Bild kann man das sehen:

Abb.1: Trbung von den verschiedenen gebildeten Immunkomplexen Albumin/anti-Albumin. Von links nach rechts: hu-
Albumin 0,2 mg/mL, hu-Albumin 0,4 mg/mL, hu-Albumin 1 mg/mL, hu-Albumin 2 mg/mL und hu-Albumin 4 mg/mL.

Zuletzt wurden alle die Mikrogefe zentrifugieren und eine weie Niederschlag wurde
gebildet. Der Maximalen Przipitation in den quivalenzbereich wurde in dem Mikrogef
mit 1 mg/mL hu-Albumin beobachtet. Es ist wichtig sagen, dass es auch in dem
Mikrogef mit 2 mg/mL hu-Albumin eine groe Menge von Niederschlag gibt. Deshalb
wird diese Konzentration auch wahrscheinlich in den quivalenzbereich gefunden.
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Abb.2: Niederschlag von den verschiedenen gebildeten Immunkomplexen Albumin/anti-Albumin. Von links nach rechts: hu-
Albumin 0,2 mg/mL, hu-Albumin 0,4 mg/mL, hu-Albumin 1 mg/mL, hu-Albumin 2 mg/mL und hu-Albumin 4 mg/mL.
Teil 2: Peroxidase/anti-Peroxidase

Durchfhrung
In 4 Mikrogefe (1,5 mL) je

- 300 L Reagenzlsung A
- 5 L anti-Peroxidase (POD) Antiserum
folgendes geben:
- 50 L HRP (0,02 mg/mL)
- 50 L HRP (0,04 mg/mL)
- 50 L HRP (0,1 mg/mL)
- 50 L HRP (0,2 mg/mL)

Eine Kontrolle wie folgendes stellen: 50 L HRP (0,01 mg/mL) + 15 L H
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O (statt
anti-POD).
10 min warten.
Die Trbung beurteilen
Scharf abzentrifugieren.
Den gesamten berstand in ein weiteres Mikrogef geben.
100 L POD-Substrat zum Pellet und zum getrennten berstand dazu pipettieren.
Ergebnisse und Beobachtungen
Am Anfangs des Versucht alle die Proben waren farblos. Nach 10 Minuten,Trbung wurde
erscheint (aber ganz wenig). Nach zentrifugieren, Niederschlag wird am Boden
aufgekommen und man konnte deutlich die maximale Przipitation in den 4. Mikrogef
(Konzentration von Antigen 0,2 mg/mL) sehen.
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Abb. 3: Niederschlge nach zentrifugieren (von unten gesehen). Von links nach rechts: Kontrolle, HRP (0,02 mg/mL), HRP
(0,04 mg/mL), HRP (0,1 mg/mL), HRP (0,2mg/mL).



Abb. 4: Niederschlge nach zentrifugieren (von vorne gesehen). Von liks nach rechts: Kontrolle, HRP (0,02 mg/mL), HRP
(0,04 mg/mL), HRP (0,1 mg/mL), HRP (0,2mg/mL).


Nach Zugabe von POD-Substrat, der Niederschlag wurde blau und der berstand bleibt
gleich. Dass kann man durch das Vorhandensein eines Komplexes im Niederschlag, die
gefrbt wird, erklren.
Maximale
Przipitation
Maximale
Przipitation
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Abb. 5: Niederschlge nach Zugabe von POD-Substrat. Alle die Proben wurden blau. Von liks nach rechts: Kontrolle, HRP
(0,02 mg/mL), HRP (0,04 mg/mL), HRP (0,1 mg/mL), HRP (0,2mg/mL).

Versuch 2: Quantitative Bestimmung von Proteinen mittels
Immunturbidimetrie
Aufgabe: Eine Standardkurve der Transferrinkonzentration im Trbunstest
erstellen.
Durchfhrung
In 9 Halbmikrokvetten geben:
- 500 L Reagenzlsung A
- 40 L anti-Transferrin IgG Fraktion
Folgendes geben

1) 50 L Tf (0 mg/mL) (=Nullwert)
2) 50 L Tf (0,01 mg/mL)
3) 50 L Tf (0,025 mg/mL)
4) 50 L Tf (0,05 mg/mL)
5) 50 L Tf (0,075 mg/mL)
6) 50 L Tf (0,1 mg/mL)
7) 50 L Tf (0,2 mg/mL)
8) 50 L Tf (0,4 mg/mL)
9) 50 L Tf (1,0 mg/mL)
Min 3x mit einem T-Mischspatel mischen.
Nach 5 min. die Extinktion bei 340 nm gegen die Kontrolle messen.
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Ergebnisse und Beobachtungen
Folgende kann man den linearen Messbereich sehen, hier sind die gebildete
Immunkomplexe fr die verschiedene Konzentrationen von Antigen in der Bereich wo es
ein Antikrper berschuss gibt. Hier fhrt die Antikrperberschuss zu Trimeren mit 1
Antigen und 2 Antikrpern.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle beschrieben:

Tab.1: Extinktion der Immunkomplexe Transferrin/anti-Transferrin IgG bei 340 nm in der linearen Zone.
Probe Konzentration [mg/mL] E
340

1 (Kont.) 0,000 0,000
2 0,010 0,040
3 0,025 0,192
4 0,050 0,567

und in dem folgende Grafik analysieren:


Abb.6: Bestimmung von Transferrin mittels Immunturbidimetrie (Trbung von Transferrin/anti-Transferrin IgG) bei 340 nm in
der linearen Zone.

Folgende ist es die Tabelle mit den Werten fr die gesamte Kurve (Heidelberger-Kurve):











y = 11.68x - 0.0485
R = 0.9661
0.000
0.100
0.200
0.300
0.400
0.500
0.600
0.000 0.010 0.020 0.030 0.040 0.050 0.060
E
3
4
0
(
T
r

b
u
n
g
s
m
e
s
u
n
g
)

Transferrinkonzentration [mg/mL]
Standkurve der Transferrin-Konzentration
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Tab.2: Extinktion der Immunkomplexe Transferrin/anti-Transferrin IgG bei 340 nm.
Probe Konzentration [mg/mL] E
340

1 (Kont.) 0 0,000
2 0,010 0,040
3 0,025 0,192
4 0,050 0,567
5 0,075 0,627
6 0,100 0,729
7 0,200 1,722
8 0,400 2,740
9 1,000 1,274

Diese Werten sind in dem folgende Grafik analysieren:


Abb.7: Bestimmung von Transferrin mittels Immunturbidimetrie (Trbung von Transferrin/anti-Transferrin IgG) bei 340 nm



0.000
0.500
1.000
1.500
2.000
2.500
3.000
0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200
E
3
4
0
(
T
r

b
u
n
g
s
m
e
s
u
n
g
)

Transferrinkonzentration [mg/mL]
Heidelberger-Kurve der Transferrin-
Konzentration
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Versuch 1 Versuch 2 Versuch 3
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Versuch 3: Radiale Immundiffusion nach Ouchternoly

Teil 1: Bestimmung des Titers eines Antiserums.

Aufgabe: Titer von anti-Humanalbumin (Antiserum) bestimmen.

Durchfhrung

In ein Gel Lscher wie unten stanzen.

In das mittlere Loch 20 L das Antigen Albumin (1 mg/mL) pipettieren.
In die Lcher 1-6 20 L folgende Antikrperverdnnung geben:
- 1. Loch: anti-Albumin Antiserum 1:8 verdnnt mit PBS:
- 2. Loch: 1:16 verdnnt.
- 3. Loch: 1:32 verdnnt.
- 4. Loch: 1:64 verdnnt.
- 5. Loch: 1:128 verdnnt.
- 6. Loch: 1:256 verdnnt.
Die Schale schlieen und ber 2 Tage bei RT inkubieren.
Die Ergebnisse im Dunkelfeld abfotografieren.

Ergebnisse und Beobachtungen
Unsere Ergebnisse kann man deutlich im folgenden Bild sehen.

Abb.8:Radiale Immundiffusion nach Ouchterlony, Bestimmung des Titers von anti-Humanalbumin mit Albumin.
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Versuch 1 Versuch 2 Versuch 3
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Die Bildung des Przipitates im Agarosegel wird bis die Verdnnung 1:32 erreicht. Das
heit, die Grenze der Reaktionsfhigkeit ist die Lsung 1:32 verdnnt.

Teil 2:Bestimmung der Kreuzaktivitt eines anti-Albuminserums
Aufgabe: Bestimme, ob das Anti-Humanalbumin Antiserum kreuzreagiert mit dem
Rinderserumalbumin.
Durchfhrung
In ein Gel Lscher wie unten stanzen.





In das mittlere Loch 20 L einer BSA-Lsung (0,5 mg/mL).
In Loch 1 (siehe Diagramm unten) das anti-Humanalbumin Antiserum 1:2 (=1+1) mit PBS
verdnnt.
In Loch 2 Humanalbumin 1 mg/mL.
In Loch 3 anti-Humanalbumin Antiserum 1:8 (=1+7) mit PBS verdnnt.
Ergebnisse und Beobachtungen
Unser Ergebnis kann man deutlich im folgenden Bild sehen:

Abb.8:Radiale Immundiffusion nach Ouchterlony, Kreuzreaktivitt von anti-Humanalbumin mit Rinderalbumin (BSA-Lsung
0,5 mg/mL).

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Versuch 1 Versuch 2 Versuch 3
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Es gibt eine Kreuzreaktivitt zwischen Humanalbumin und die verdnnte Antikrper anti-
Humanalbumin Antiserum 1:2. In dieser Kreuzreaktivitt sind beide Proteine
immunologisch identisch, das heit dass die Proteine alle die Antigenen Determinanten
teilen. Deshalb ist es die gleiche Molekl und der Niederschlag die folgende Form hat:

Abb.9:Radiale Immundiffusion nach Ouchterlony, Kreuzreaktivitt. Proteine immunologisch identisch.
Teil 3: Bestimmung der Blutgruppe im AB0- und Rhesus-System

Aufgabe 1: Die eigene Blutgruppe im AB0- und Rhesus-System mittels Test-
Antikrper durch Agglutination bestimmen.

Durchfhrung

In 3 Vertiefungen einer Tpfelplatte jeweils ein Tropfen (ca. 50 L) Anti-A (blaue
Lsung), Anti-B (gelbe Lsung), Anti-D (=anti-Resus-Faktor, farblose Lsung)
vorlegen.
Eines Bluttropfens herausnehmen.
10 L Vollblut aus der Fingerbeere zu den Antikrpern geben.
Mit einem T-Rhrspatel vermischen und das Ergebnis beurteilen.

Ergebnisse und Beobachtungen
Folgende Bilder zeigen unsere Ergebnisse:


Abb. 9: Blutgruppen Bestimmung. Studentin A: Daruich. Nur die Anti-D Antikrper hat agglutiniert. Das heit, die Blutgruppe
dieser Studentin ist O Rhesus Positiv.
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Versuch 1 Versuch 2 Versuch 3
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Abb. 8: Blutgruppen Bestimmung. Studentin B: Gallardo. Keine Antikrper haben agglutiniert. Das heit, die Blutgruppe
dieser Studentin ist O Rhesus Negativ.