UNIVERSITATEA DE MEDICIN!

"I FARMACIE
IULIU HA#IEGANU
CATEDRA DE MICROBIOLOGIE





CRISTIAN HODRN!U

CECILIA BOBO" PETRIC! CIOBANCA
LAURA SIMON

















MICROBIOLOGIE

CAIET DE LUCR!RI PRACTICE
PENTRU UZUL
STUDEN#ILOR FACULT!#II DE MEDICINA DENTARA





EDITURA RISOPRINT
2010
1
LUCRAREA NUM!RUL 1. M!SURI DE PROTEC"IE N LABORATORUL
DE MICROBIOLOGIE. STERILIZAREA #I DEZINFEC"IA


M!SURI DE PROTEC#IE N LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE


1. n laboratorul de microbiologie este obligatorie purtarea echipamentului de protec%ie: halate
albe, dar n anumite situa%ii &i m'nu&i, m'&ti, ochelari, pantaloni &i pantofi, destina%i utiliz'rii
doar n boxa de lucru.
2. n laboratorul de microbiologie nu se m'nnc',nu se bea &i nu se fumeaz'.
3. Nu se duc la fa%' nici minile &i nici diferite obiecte (manipularea batistei se
va face doar dup' sp'larea minilor cu ap' &i s'pun).
4. Materialele contaminate &i cele sterile se manipuleaz' cu mult' aten%ie n condi%ii aseptice
pentru a evita contaminarea suprafe%elor de lucru,a mediilor de cultur', sau infectarea
persoanelor care lucreaz' n laborator. Se lucreaz' n apropierea becului de gaz, flac'ra acestuia
fiind necesar' pentru sterilizarea ansei bacteriologice sau a orificiului de deschidere al diferi%ilor
recipien%i.
5. Ansa bacteriologic', instrument indispensabil n laboratorul de microbiologie se sterilizeaz'
nainte &i dup' ntrebuin%are prin nc'lzire pn' la incandescen%'.
6. Pipetele gradate &i pipetele Pasteur vor fi sterilizate prin flambare numai nainte de
ntrebuin%are, dup' utilizare acestea vor fi puse n vase cilindrice care con%in solu%ie
sulfocromic'.
7. Baloanele, eprubetele &i pl'cile Petri cu produse patologice sau culturi bacteriene care nu mai
sunt utilizate, vor fi puse n recipiente speciale pentru infecte n vederea steriliz'rii.
8. n cazul n care masa de lucru este contaminat' cu bacterii, aceasta va fi acoperit' cu o solu%ie
dezinfectant', care va fi l'sat' 24 de ore.
9. Minile se spal' frecvent cu ap' &i s'pun, aceast' opera%iune fiind obligatorie &i la terminarea
lucrului.
10. nainte de p'r'sirea laboratorului se vor nchide toate sursele de ap', gaz &i curent electric.













2




STERILIZAREA "I DEZINFEC#IA

Sterilizarea const' n distrugerea &i/sau ndep'rtarea tuturor microorganismelor de pe
suprafa%a &i din interiorul unor obiecte.
Dezinfec$ia const' n distrugerea &i/ sau ndep'rtarea anumitor microorganisme (n special
patogene) de pe suprafa%a &i din interiorul unor obiecte.
Asepsia reprezint' ansamblul de m'suri &i mijloace prin care este prevenit' contaminarea
cu microorganisme a materialelor dar &i a organismelor vii.
Sterilizarea se poate face - prin c'ldur'
- cu substan%e chimice
- cu radia%ii ionizante
- prin filtrare

1. Sterilizarea prin c%ldur% folose&te ( c'ldura uscat'
( c'ldura umed'
Materialele (reutilizabile) ce urmeaz' s' fie sterilizate prin c'ldur' vor fi supuse unui
procedeu de preg'tire n vederea steriliz'rii. Dup' cur'%are, sp'lare &i uscare, obiectele sunt
mpachetate n hrtie. Obiectele cu deschidere mic', nainte de a fi mpachetate vor fi ndopate cu
dop de vat' (baloane, eprubete, cilindri). Pipetele (att cele gradate, ct &i pipetele Pasteur) vor fi
prev'zute la cap't cu dop de vat'. Dac' obiectele au con%inut material infec%ios, nainte de
prelucrarea preliminar', vor fi sterilizate prin autoclavare pentru distrugerea microorganismelor.

Sterilizarea prin c'ldur' uscat' ( nc'lzirea la incandescen%'
( sterilizarea cu aer supranc'lzit
nc!lzirea la incandescen"! se aplic' ansei bacteriologice, nainte &i dup' fiecare
utilizare; prin men%inerea ansei n flac'r' pn' la incandescen%' microorganismele sunt carbonizate.
Sterilizarea cu aer supranc!lzit (n cuptorul Pasteur) se aplic' obiectelor din sticl' sau
por%elan, dup' ce au fost preg'tite corespunz'tor.
Cuptorul Pasteur sau Poupinelul este un dul'pior metalic cu pere%i dubli ntre care circul' aerul
cald), iar n interior este prev'zut cu rafturi pe care sunt a&ezate obiectele ce urmeaz' s' fie
sterilizate. Este nc'lzit electric &i este prev'zut cu un termoreglator, termometru &i ceas.
Condi$iile de sterilizare la Poupinel sunt:
( temperatura 180C
& timp 1 or%
Temperatura de 180 C este necesar' deoarece puterea de p'trundere a c'ldurii uscate este mai
mic', iar la temperaturi inferioare, sterilizarea este incomplet'.
! Nu se pot steriliza prin acest procedeu: obiecte metalice, obiecte din cauciuc sau care au garnituri
din cauciuc &i nici lichidele.
Controlul sterilizarii se face prin :
- urm'rirea temperaturii &i a timpului;
3
- procedeu suplimentar- urm'rirea aspectului ambalajelor de hrtie &i a
dopurilor de vat' (la 170C hrtia &i vata r'mn albe, sterilizarea fiind
incomplet' iar la 200C hrtia &i vata se carbonizeaz' &i nu mai ofer'
protec%ie).





Obiectele sterilizate sunt p'strate pn' la utilizare n dulapuri pentru sticl'rie steril'.
Dac' nu au fost utilizate n timp de o s'pt'mn', trebuie sterilizate din nou nainte de
utilizare.
Sterilizarea prin c'ldur' umed'
(sterilizarea cu vapori de ap' sub presiune
(autoclavarea)
- este cea mai sigur' metod' de sterilizare &i este practicat' ori de cte
ori o permite materialul.
- n autoclave se sterilizeaz' medii de cultur', material infec%ios,
obiecte metalice, obiecte de cauciuc, aparatele pentru filtrare,
materiale textile etc.
- ! NU se pot steriliza medii de cultur' care au n compozi%ia lor
ingrediente denaturabile termic.

Condi$iile de sterilizare la autoclav sunt:
( presiune 1 atm echivaleaz' cu temperatura de
120C, timp de 30 de minute.
( la 2 atm temperatura vaporilor de ap% atinge
134C (se indic' pentru materialul infec%ios ).
Autoclavul este un cazan nc'lzit electric (cu gaz la modelele vechi) cu pere%i dublii, grei &i
rezisten%i, prev'zut cu un capac care se nchide ermetic. n interior se g'se&te un gr'tar pe care sunt
a&ezate obiectele ce urmeaz' s' fie sterilizate. Cazanul este prev'zut cu manometru, robinet de
admisie a apei, robinet de evacuare a apei din cazan, robinet de vapori pentru evacuarea aerului &i a
vaporilor &i supap' de siguran%' care se deschide automat dac' presiunea din cazan cre&te peste un
nivel critic.
Controlul steriliz%rii la autoclave se face prin:
- procedee fizice;
- procedee chimice;
- procedee biologice.
Procedee fizice se urm're&te timpul &i presiunea din autoclav.
Procedee chimice se folosesc substan%e cu punct de topire apropiat de 120 C, substan%a se
introduce n cazan odat' cu obiectele &i se sterilizeaz' la terminarea autoclav'rii. Dac' sterilizarea a
fost corect', substan%a se reg'se&te topit' &i solidificat'.
Procedeele biologice- folosesc fiole de Stearotest 120 (suspensie sporulat' de Bacillus
stearotermophylus n mediu nutritiv &i cu indicator de pH culoare violet &i apect limpede) care se
4
introduc n autoclav cu obiectele pentru sterilizat &i se recupereaz' la terminarea autoclav'rii, se
pun la 37C &i apoi se citesc rezultatele (controlul): men%inerea aspectului nemodificat denot' o
sterilizare corect' n timp ce virajul n galben ( acidifiere ) &i o u&oar' opalescen%' indic' sterilizare
incomplet' (au r'mas spori viabili).
2. Sterilizarea cu substan$e chimice:
Substan%ele folosite pot fi
(glutaraldehid' 2%
( peroxid de hidrogen stabilizat (6%)
( acidul peracetic (concentra%ii diferite )
Timpul de contact al substan%ei cu substratul tratat difer' n func%ie de produs; vor trebui
respectate recomand'rile produc'torului privitoare la condi%iile de lucru, att pentru o sterilizare
corect', ct &i pentru evitarea accidentelor.
Sterilizarea cu oxid de etilen'
- se folose&te numai atunci cnd nu exist' un alt mijloc de sterilizare
adecvat;
- metoda este delicat', iar erorile de procedur' pot s' conduc' fie la o
sterilizare ineficient', fie la accidente (toxice ), la personalul care
realizeaz' sterilizarea sau la bolnavii la care se utilizeaz' materialul
astfel sterilizat;
- dup' sterilizare materialul trebuie supus tratamentului de desorb%ie;
- oxidul de etilen' este toxic prin: inhalare, contact, pe cale
parenteral', prin reac%ia cu diferi%i compu&i chimici (cu policlorura de
vinil elibereaz' etilenclorhidrin');
- !oxidul de etilen' este inflamabil &i exploziv!
Parametrii pentru sterilizare sunt:
( temperatur%-37C, presiune subatmosferic%,-
timp de 180 minute sau
& temperatur%-55C, presiune subatmosferic%
timp de 60 de minute

3. Sterilizarea prin radia$ii ionizante:
( razele gama sunt cele mai penetrante;
( ionizarea compu&ilor celulari prin expulzarea electronilor conduce la moartea
microorganismelor;
( razele gama pot fi ob%inute dintr-o surs' de: cobalt 60,cesiu 137;
( este o metod' de sterilizare la rece folosit' pentru: medicamente,instrumentar
confec%ionat din material degradabil termic;

radia%iile ultraviolete sunt utilizate pentru sterilizarea aerului din nc'peri &i a
suprafe%elor de lucru.

4. Filtrarea:
( metod' de sterilizare la rece;
( microorganismele sunt re%inute de o substan%' poroas';
( este aplicat' solu%iilor denaturabile termic;
5
( se poate face prin cre&terea presiunii sau prin aspirare realizat' de
pompa de vid sau trompa de ap'.
Pentru a fi evitat' colmatarea porilor filtrului, filtrarea se va face n maxim 20 de minute,
for%a de aspirare fiind mai mic' la nceput &i crescnd treptat pe m'sur' ce decurge filtrarea;
lichidele vscoase sunt diluate cu ser fiziologic; dup' filtrare este obligatoriu controlul sterilit'%ii
solu%iei (filtratul este ns'mn%at pe medii de cultur' adecvate, este termostatat &i poate fi considerat
steril dac' n 48-72 de ore nu se dezvolt' nici o colonie).

Tipuri de filtre folosite
( Filtre Chamberland (bujii/ lumn'ri) confec%ionate din
por%elan poros ars
- se noteaz' (n func%ie de dimensiunile porilor) de la L1- L13. Filtrele
L3- L13 re%in bacteriile.
- se folosesc adaptate la baloane Kitasato.
( Filtre de sticl'
- sunt discuri de sticl' neutr' &i poroas' turnate ntr-o plnie (suport de
sticl'),
- se noteaz' G0- G5,
- filtrele G5 (cu pori de cca 1) re%in bacteriile.
( Filtre Seitz
- sunt confec%ionate din azbest &i celuloz',
- se monteaz' ntr-o plnie metalic',
- se folosesc adaptate la baloane Kitasato,
- pot modifica pH-ul lichidului filtrat &i pot adsorbi principii activi.
( Membranele filtrante
- sunt confec%ionate din nitrat sau acetat de celuloz', policlorur' de
vinil,
- sunt montate n suporturi din plastic,
- se adapteaz' la seringi de construc%ie special',
- cre&terea presiunii se ob%ine prin ac%ionarea seringii,
- diametrul porilor variaz' ntre 10- 4000 nm.

Dezinfec$ia se poate face prin - c'ldur'
- radia%ii
- substan%e chimice
1. Dezinfec$ia prin c%ldur% folose&te ( c'ldur' uscat',
( c'ldur' umed'

Dezinfec%ia prin c'ldur' uscat' ( flambarea este utilizat' n laborator n timpul
lucrului &i const' n trecerea rapid' &i repetat' a obiectelor (din sticl' sau por%elan) prin flac'ra
becului de gaz nainte &i dup' ntrebuin%are.
Dezinfec%ia prin c'ldur' umed' ( fierberea
( pasteurizarea
( tindalizarea
6

Fierberea se realizeaz' n fierb'toare nc'lzite electric sau la flac'r':
- se face la 100C (adausul de carbonat de sodiu poate conduce la
cre&terea temperaturii spre 110 C) timp de 30 de minut,
7



- sunt distruse formele vegetative. Sporii bacterieni rezist' ns'
la fierbere,
- n laboratorul de microbiologie se folose&te pentru
instrumentarul de utilizare imediat' (foarfece, pense, etc.).
Pasteurizarea:
- folosit' mai mult n industrie (pasteurizarea laptelui, a berii),
- distruge formele vegetative prin distrugerea proteinelor
(ncepe de la 56C),
- produsul este nc'lzit n baia de ap'.
( 30 de minute la 60- 65C
sau
( 15 minute la 70- 75C
sau
( cteva secunde la 85- 90C
- dup' nc'lzire se r%ce'te brusc la 4C
Tindalizarea este un procedeu de dezinfec%ie frac%ionat':
- se adreseaz' solu%iilor care se denatureaz' la fierbere,
- temperatura folosit' este inferioar' celei de 100C (60- 80C),
- solu%ia se nc%lze'te n baia de ap% 1-3 ore pe zi, 3-8 zile
consecutive iar ntre nc%lziri se p'streaz' la temperatura
laboratorului (21C); dup% ultima nc%lzire se r%ce'te brusc
la 4C,
- la temperatura laboratorului, sporii (eventual prezen%i)
germineaz', iar formele vegetative vor fi distruse de o nou'
nc'lzire,
- controlul se realizeaz' prin inoculare pe medii de cultur' &i
termostatare n condi%ii adecvate.
Dezinfec"ia prin vapori curen"i de ap! se face n oala lui Koch sau autoclav cu
robinetul de vapori deschis &i distruge numai formele vegetative; se aplic' solu%iilor
denaturabile la temperaturi mai mari de 100C.

2.Dezinfec$ia cu radia$ii ultraviolete este indicat' pentru:
( suprafe%ele de lucru,
( aerul din boxele de lucru (laboratoare).
- este o metod' complementar' m'surilor de cur'%enie &i
dezinfec%ie chimic'
- condi%iile generale de eficacitate:
( sunt folosite l'mpi fixe sau mobile cu tuburi de UV ntre 15-
30W prev'zute s' func%ioneze n prezen%a omului (radia%ie indirect'- f'r'
emisie de ozon ),
2
( tuburile de raze UV trebuie s' fie permeabile selectiv
pentru radia%ia cu putere bactericid' maxim' (2537 ),
( spa%iul trebuie supus prealabil unei cur'%enii maxime,
temperatura mediului s' fie ntre 15-30 C, cu umiditate de maximum 60%.

- condi%iile speciale :
( pentru suprafe!e
- sunt utilizate aparate cu radia%ie direct',
- dezinfec%ia se face n absen%a omului,
- durata de expunere trebuie s' fie corect' (3-4 doze letale pe
suprafa%a tratat').
( pentru aer
- num'rul l'mpilor se calculeaz' n func%ie de aerul dezinfectat
de c'tre fiecare lamp' (debitul de aer, volumul nc'perii, viteza
de schimb a aerului),
- nu este admis' expunerea direct' a persoanelor la radia%ia
l'mpii de dezinfec%ie (pentru radia%ia direct' este obligatoriu
echipamentul de protec%ie- ochelari, masc', m'nu&i de
cauciuc),
- ! aparatele achizi%ionate vor fi nso%ite de documenta%ia
tehnic' !

3. Dezinfec$ia chimic% poate fi clasificat' n:
- dezinfec%ie de nivel nalt
- dezinfec%ie de nivel mediu
- dezinfec%ie de nivel sc'zut
Dezinfec%ia de nivel nalt:
- distruge toate microorganismele, cu excep%ia unui num'r redus
de spori bacterieni,
- timpul de contact trebuie s' fie de cel pu%in 20 de minute,
- substan%ele utilizate:
( glutaraldehida (2%),
( peroxidul de hidrogen stabilizat
(6%),
( acidul peracetic ( concentra%ii
diferite),
( hipocloritul de sodiu( 5,25%).
Dezinfec%ia de nivel mediu:
- distruge Mycobacterium tuberculosis, forme vegetative ale
bacteriilor, fungi, virusuri,
- ! nu distruge sporii bacterieni,
- timpul de contact necesar este de 10 minute,
- substan%e utilizate:
( fenoli
3
( iodofori
( alcooli
( compu&i pe baz' de clor

Dezinfec%ia de nivel sc'zut:
- distruge majoritatea bacteriilor n form' vegetativ' unele
virusuri &i unii fungi,
- ! nu distruge sporii bacterieni,
- ! nu distruge Mycobacterium tuberculosis,
- timpul de contact necesar este de 10 minute,
- substan%e utilizabile ( fenoli
( iodofori
( s'ruri cuaternare de amoniu
( alcooli 70-90
( hipoclorit de sodiu (5, 25%)
Substan%e dezinfectante:
! fenolii
- au ac%iune bactericid' &i fungicid',
- ! nu ac%ioneaz' asupra sporilor,
- ac%iunea antiviral' este foarte sc'zut',
- se folosesc doar la dezinfec%ia suprafe%elor &i a
aerului.
! halogenii
- elibereaz' clor, brom, iod
- substan%e care elibereaz' clor
( dicloroizocianuratul de sodiu
( hipoclori%ii
Se folosesc pentru tratarea apei &i dezinfec%ia zonelor de preparare a alimentelor.
Stabilizarea solu%iilor se face cu substan%e alcaline.
- substan%e care elibereaz' iod
( iod- ac%iune neselectiv' cu instalare rapid'-vizeaz'
bacterii &i virusuri (Lugol-solu%ie apoas'; tinctur' de iod-solu%ie
hidroalcoolic'),
( iodoforii-distrug bacterii (inclusiv M. tuberculosis)
&i virusuri; ac%iunea antifungic' virusuri; ac%iunea antifungic' este
variabil', iar asupra sporului bacterian au ac%iune slab'.

! compu#ii cuaternari de amoniu:
- sunt detergen%i &i emulsionan%i,
- solubili n ap' &i alcool,
- stabili,
- f'r' miros &i nu p'teaz',
- ac%iune bactericid' (nu &i sporicid'),
- ! nu distrug M. tuberculosis!
4
- ac%iune selectiv' fungicid',
- ac%iunea asupra virusurilor este realizat' numai la concentra%ii de
peste 1% &i este selectiv'.

! clorhexidina
- biguanid care se prezint' sub form' de s'ruri
(acetat sau gluconat de clorhexidin'),
- ac%iune bactericid' ( minus M. tuberculosis),
- nu au ac%iune sporicid',
- ac%iune antiviral' variabil'.
! alcoolul etilic &i izopropilic
- se folosesc n solu%ie apoas' ( pentru adsorb%ia pe bacterii),
- concentra%ii biocide 30-50 % pentru alcoolul izopropilic 50-70%
pentru alcoolul etilic,
- distrug bacteriile (inclusiv BK), fungii,
- ac%iunea antiviral' vizeaz' predilect virusurile
nvelite,
- nu prezint' ac%iune sporicid'.
! aldehidele - formaldehida, glutaraldehida, succinaldehida
- pot fi folosite pentru dezinfec%ie nalt' sau
sterilizare
- formaldehida ( solu%ie apoas' 37% sau solu%ie alcoolic'
4,5%)
- are ac%iune bactericid' ( inclusiv BK),
sporicid', fungicid', virulicid'.
- glutaraldehida
- este un dezinfectant nalt &i sterilizant chimic
- solu%iile apoase sunt acide (activitate sporocid' redus') &i pot fi
activate la forma alcalin' (pH 7,5- 8,5), dar stabilitatea este doar de
14- 28 de zile (datorit' polimeriz'rii moleculelor de
glutaraldehid'),
- are spectru larg,
!a c t i v i t a t e a n u e s t e i n f l u e n ! a t " d e p r e z e n ! a
materialului organic.
! peroxidul de hidrogen #i compu#ii nrudi"i
- concentra!ia 3% se folose#te pentru dezinfec!ia de rutin" #i ca
antiseptic,
- peroxidul de hidrogen stabilizat (conc. 6%) este un
dezinfectant de nivel nalt,
- are un spectru larg - bactericid (inclusiv BK),
sporicid, fungicid, virulicid.



5







1. nc!lzirea la incandescen"! 2. Cuptorul Pasteur (Poupinel)




3. Autoclavul




6








NOTE PERSONALE



































7










LUCRAREA NUM#RUL 2. PREPARATE MICROSCOPICE

PREPARATUL NATIV
COLORA$IA SIMPL#
COLORA$IA GRAM


Bacteriile au dimensiuni mici, de ordinul micrometrilor. Datorit" acestui fapt,
aprecierea propriet"!ilor lor morfologice (dar #i de colorabilitate) necesit" realizarea de
preparate microscopice.
Un preparat microscopic se poate face - direct din produsul patologic
- din cultur" bacterian"
Examenul microscopic direct din produsul patologic, de obicei are o valoare pur
orientativ", dar exist" #i excep!ii de exemplu:
- un frotiu dintr-o secre!ie uretral" care eviden!iaz" diplococi
reniformi Gram negativi n interiorul polimorfonuclearelor, ne ofer" practic
diagnosticul de uretrit" gonococic".
sau
- un preparat nativ examinat pe fond ntunecat care a fost efectuat
din serozitatea prelevat" de la nivelul unei leziuni (#ancru dur) situat" pe
mucoasa genital" #i care pune n eviden!" bacterii spiralate, foarte mobile
(executnd mi#c"ri caracteristice de rota!ie, transla!ie, flectare #i n#urubare)
ne ofer" n mod cert diagnosticul de sifilis primar.
Mult mai multe informa!ii ne ofer" ns" un preparat microscopic care a fost f"cut
dintr-o cultur" bacterian". Un astfel de preparat ne ofer" informa!ii privitoare la propriet"!ile
morfo-tinctoriale ale bacteriilor. Examinarea acestor propriet"!i constituie una din etapele
care trebuie parcurse pentru identificarea unei bacterii izolat" dintr-un produs patologic.
Propriet"!ile morfo-tinctoriale sunt:
- mobilitatea (prezent" numai la bacteriile ciliate #i poate fi
apreciat" numai n preparatul nativ care folose#te bacterii
viabile),
- dimensiunile bacteriilor,
- forma bacteriilor,
8
- a#ezarea n frotiu (frotiul sau preparatul colorat folose#te
bacterii omorte n cursul procesului de fixare),
- prezen!a (eventual") a unor structuri neobligatorii ( cum ar fi
capsula sau sporii),
- tinctoriabilitatea sau colorabilitatea bacteriilor- care poate fi
apreciat" strict n colora!iile combinate (Gram #i Ziehl-
Neelsen).

TIPURI DE PREPARATE MICROSCOPICE
1. preparatul nativ.
2. frotiul (preparatul colorat).

1. Preparatul nativ - se poate face- din produsul patologic
sau
- din cultura bacterian"
% preparatul nativ este singurul care ne ofer" informa!ii privitoare la
mobilitatea bacteriilor, deoarece folose#te bacterii viabile; pentru alte
elemente ns" frotiul este mult mai util.
% pentru realizarea unui preparat nativ se va depune cu ajutorul pipetei
Pasteur pe mijlocul unei lame de microscop o pic"tur" dintr-o cultur"
bacterian" ntr-un mediu lichid (sau din produsul patologic lichid) dup" care
se acoper" cu lamela #i se examineaz" la microscop folosind obiective uscate
(pot fi folosite obiective cu puterea de m"rire de 10, 20 sau 40).
n cazul culturilor bacteriene de pe medii solide, pe lama de microscop
se depune o pic"tur" de ser fiziologic n care se emulsioneaz" cu ansa
bacteriologic" o colonie bacterian"; n continuare se procedeaz" la fel ca #i la
preparatul din cultura bacterian" pe mediul lichid; pentru examenul
microscopic pe fond ntunecat se folose#te un condensator paraboloid.
2. Frotiul ( preparatul colorat)- se poate face: - din produsul patologic,
- din cultura bacterian".
% frotiul folose#te bacterii omorte n cursul procesului de fixare, deci
pot fi urm"rite toate celelalte aspecte exceptnd mobilitatea.
% pentru realizarea unui frotiu dintr-o cultur" bacterian" pe mediu lichid
sau din produsul patologic lichid, pe mijlocul lamei de microscop se depune
cu pipeta Pasteur o pic"tur".
% pentru frotiurile din produse patologice semisolide sau din culturi
bacteriene pe medii solide, pe mijlocul lamei de microscop se depune o
pic"tur" de ser fiziologic n care se descarc" (cu emulsionare) ansa
bacteriologic" pe care s-a nc"rcat o colonie bacterian" (sau respectiv un mic
fragment din produsul patologic semisolid).
Timpii de execu!ie ai frotiului sunt: - etalarea
- uscarea
- fixarea
- colorarea
9
- prin etalare se n!elege ntinderea frotiului de-a lungul lamei
lamei de microscop (se face cu ajutorul ansei bacteriologice).
- uscarea se realizeaz" la temperatura laboratorului sau, pentru o uscare
rapid", preparatul se poate trece prin flac"ra becului de gaz, evitnd ns" nc"lzirea exagerat"
a acestuia.
- fixarea se poate face prin metode fizice care constau n trecerea frotiul
tangent la flac"r" sau chimice utilizate pentru anumite colora!ii speciale. Prin fixare:
- bacteriile sunt omorte (preparatul devenind astfel neinfec!ios),
- bacteriile ader" de lama de microscop #i nu se vor desprinde n
cursul opera!iunilor de colorare #i sp"lare,
- colorarea.


TIPURI DE COLORA&II FOLOSITE:
1. colora!ii simple,
2. colora!ii combinate,
3. colora!ii speciale.
1. Colora"ia simpl! are valoare limitat", de obicei strict orientativ".
- frotiul fixat se acoper" cu un singur colorant (oricare ar fi el- albastru
de metilen sau safranin") care se las" s" ac!ioneze timp de 2 minute,
- colorantul este ndep"rtat cu jet de ap",
- preparatul se usuc" (se prefer" uscarea rapid" la flac"r"),
- se pune pe preparat o pic"tur" de ulei de imersie (ulei de cedru),
- se examineaz" la microscop cu obiectivul de imersie dup" aducerea
condensatorului n pozi!ia cea mai n nalt".
Toate frotiurile sau preparatele colorate se examineaz" cu obiectivul de imersie, folosind ulei
de cedru
2. Colora"iile combinate: Gram,Ziehl-Neelsen, permit referiri la colorabilitatea
(tinctorialitatea) bacteriilor.

COLORA$IA GRAM- permite diferen!ierea bacteriilor n:
- Gram pozitive,
- Gram negative.
Timpii colora!iei Gram (se porne#te ca la oricare alt" colora!ie de la preparatul
fixat):
% violet de gen!ian" 2min,
% solu!ie Lugol 2 min (pentru mordansare),
% alcool- aceton" 20 sec. (pentru decolorare sau diferen!iere),
% safranin" sau fuxin" diluat"-2 min.
ntre to!i ace#ti timpi, preparatul se spal" la jet de ap". Dup" ce a fost ndep"rtat" #i
safranina, preparatul se usuc" #i apoi se examineaz" la microscopul optic cu obiectivul de
imersie.
Mecanismul colora!iei Gram are la baz" o reac!ie care se desf"#oar" ntre colorant
#i componentele peretelui celular bacterian.
10
La bacteriile Gram negative, lipidele din peretele celular se extrag n timpul
decolor"rii cu alcool- aceton". n felul acesta permeabilitatea peretelui bacterian cre#te, iar
complexul cristal violet-iod, p"r"se#te celula care se va putea recolora n ro#u cu safranin".
La bacteriile Gram pozitive (la care peretele difer" ca #i structura #i compozi!ie
chimic" de cel al bacteriilor Gram negative), n timpul decolor"rii cu alcool- aceton",
peretele se deshidrateaz", permeabilitatea sa scade, iar complexul cristal violet-iod r"mne n
celul" care p"streaz" culoarea violet.










Microscopul optic


Secre!ie uretral"-col.simpl"-albastru de metilen Streptococi-cultur"-col.Gram

11

Bacillus-cultur"-col.Gram Clostridium tetani-col.Gram








Col.Gram-bacili Gram negativi Pneumococi-prod.patol. Col.Gram-Sarcina


Col.Gram-amprent" de splin"-Bacillus anthracis Stafilococi-cultur"-col.Gram
12


NOTE PERSONALE
























LUCRAREA NUM#RUL 3. PREPARATE MICROSCOPICE
COLORA$IA ZIEHL-NEELSEN. COLORA$II SPECIALE


COLORA$IA ZIEHL-NEELSEN- permite diferen!ierea direct n produsul
patologic a mycobacteriilor de alte bacterii (se bazeaz" pe proprietatea de acido-alcoolo
rezisten!" care este caracteristic" mycobacteriilor).
Timpii colora!iei Ziehl- Neelsen sunt :
13

fucsin" concentrat" 5 minute (se acoper" lama n ntregime),

- se nc"lze#te la flac"ra becului de gaz pn" la emisia de vapori,
evitndu-se ns" fierberea colorantului !

acid sulfuric 20%- 30 secunde,

alcool etilic 96%- 30 secunde,

albastru de metilen- 2 minute.

ntre ace#ti timpi preparatul se spal" la jet de ap". Dup" ce se ndep"rteaz" albastrul
de metilen se usuc" rapid #i se examineaz" la microscop folosind obiectivul de imersie.
Pe un frotiu din sput" astfel colorat, mycobacteriile apar ca #i bacili acido-alcoolo
rezisten!i (ro#ii!) n timp ce toate celelalte bacterii, celulele epiteliale, celulele inflamatorii
sau detritusurile celulare apar colorate n albastru (pentru interpretare se va vedea capitolul
Diagnosticul de laborator al tuberculozei).
Mecanismul colora!iei Ziehl- Neelsen:
Are la baz" realizarea ntre fucsina concentrat" #i acizii micolici din peretele celular al
Mycobacteriilor a unor leg"turi prin paritate molar", foarte stabile #i rezistente la ac!iunea de
decolorare a acidului #i alcoolului.
Colora!iile combinate nu sunt utilizate pentru toate bacteriile. Pentru bacterii cum ar
fi Chlamydia, Rickettsia, Treponema, Leptospira #i altele sunt utilizate colora!ii speciale.

COLORA$IILE SPECIALE sunt utilizate pentru eviden!ierea structurilor
neobligatorii ale bacteriilor sau/#i n cazul bacteriilor pentru care nu se utilizeaz" o colora!ie
combinat"
COLORA$II PENTRU SPORI

% Colora"ia Schaeffer- Fulton (cu verde malahit 5% #i safranin")
- se porne#te de la frotiul fixat.
Timpii colora!iei
- verde malahit- 5 min. (preparatul se nc"lze#te deasupra b"ii
de ap" sau la flac"r", dar numai pn" la emisia de vapori),
- sp"larea la jet de ap"- 30 sec.,
- safranin"- 20 sec.,
- sp"lare, uscare #i examinare cu obiectivul de imersie.
Sporii (att endosporii, ct #i sporii liberi) se coloreaz" n verde, n timp ce
formele vegetative (sporangiile) apar colorate n ro#u.
% Colora"ia Dorner (cu fucsin" #i nigrosin")
- se ncarc" cultura bacterian" pe ans" #i apoi se suspend" ct
mai omogen n cteva pic"turi de ap" distilat" steril" (ntr-o
eprubet" steril"),
- se adaug" 4-5 pic"turi de fucsin" concentrat" (Ziehl),
- amestecul se nc"lze#te n baia de ap" 10 minute,
- cu ansa bacteriologic" se preia din amestec #i se suspend" ntr-
o pic"tur" de nigrosin" depus" n prealabil pe o lam" de microscop,
- etalarea frotiului se face cu ajutorul unei alte lame de microscop
ntr-un strat ct mai sub!ire,
14
- preparatul se las" s" se usuce la temperatura camerei,
- se pune ulei de cedru,
- se examineaz" la microscop cu obiectivul de
imersie.

COLORA$II PENTRU CAPSUL#

% Colora"ia Burri (modificat" Giens) este o colora!ie negativ",ntruct capsula
n sine nu se coloreaz".
- cultura bacterian" se omogenizeaz" ntr-o pic"tur" de tu# de
China,
- frotiul se etaleaz" ntr-un strat sub!ire #i omogen,
- se usuc" #i se fixeaz",
- se coloreaz" cu safranin" 2 minute,
- colorantul se scurge de pe preparat,
- se usuc", se pune o pic"tur" de ulei de cedru #i se examineaz" la
microscop cu obiectivul de imersie.
Bacteriile apar colorate n ro#u, nconjurate de un halou necolorat (capsula) pe fondul
negru al preparatului, dat de tu#ul de China.

Colora"ia cu albastru de toluidin! este o colora!ie pozitiv" care permite

colorarea efectiv" a capsulei.

COLORA$IA PENTRU CILI

% Colora"ia Zettnov
- frotiul se fixeaz" cu formol 1%- 10 minute,
- se mordanseaz" cu tanin 5% la care se adaug"
tartrat de stibiu (pic"tur" cu pic"tur" pn"
cnd se tulbur" solu!ia de tanin),
- se nc"lze#te la 60C timp de 2 ore,
- se spal" cu ap" distilat" cald",
- se coloreaz" la cald cu sulfat de argint
amoniacal pn" la culoarea cenu#iu- negru,
- examinarea microscopic" se face cu obiectivul
de imersie. Cilii apar colora!i n negru.


ALTE COLORA$II SPECIALE

% Colora"ia Neisser se folose#te pentru eviden!ierea corpusculilor
metacromatici Babe#- Ernst (caracteristici bacilului difteric).
- frotiul se face din cultura dezvoltat" pe mediul Lffler, se
etaleaz", se usuc" #i se fixeaz".
Timpii colora!iei:
15
-solu!ie alcoolic" de albastru de metilen 2 p"r!i
+ solu!ie alcoolic" de cristal violet 1 parte- 5
minute,
- sp"lare cu ap" distilat",
- solu!ie de Lugol- lactat- 1 minut,
- sp"lare cu ap" distilat",
- solu!ie de crisoidin"- 30 secunde,
- colorantul se scurge! iar uscarea preparatului se face prin
tamponare cu hrtie de filtru.
Se examineaz" la microscop cu obiectivul de imersie. Corpusculii metacromatici
Babe#- Ernst se coloreaz" n albastru- violet , iar corpul bacterian n galben- brun.

Colora"ia Fontana-Tribondeau (impregnarea argentic!)- folosit"

pentru spirochete.
- se folosesc frotiuri uscate, dar nefixate !
- preparatul se acoper" cu solu!ie Rugge de trei
ori cte 30 de secunde- se scurge,
- acid tanic 5%- 30 secunde- se nc"lze#te u#or,
f"r" s" se ajung" la emisie de vapori,
- sp"lare cu ap" distilat",
- azotat de argint amoniacal- 1 minut- se
nc"lze#te tot f"r" emisie de vapori,
- sp"lare cu ap" distilat", uscare,examinare la microscop cu
obiectivul de imersie.
Spirochetele apar colorate n brun- negru pe un fond galben.

% colora"ia Giemsa (pentru spriochete, chlamydii, rickettsii),
% colora"ia Machiavello ( rickettsii),
% colora"ia Gimenez ( rickettsii, chlamydii).











Produs patologic-col. Ziehl-Nelsen
16


Leptospira, col. Fontana Tribondeau Bacili, col. Giemsa


B.subtilis-col.safranin" #i verde malahit pt. spori Klebsiella-col.Burri pt. capsul"


Rickettsia-amprent" de sac vitelin col.Gimenez Chlamidia col.Machiavello





17
NOTE PERSONALE






































18
LUCRAREA NUM#RUL 4. MEDII DE CULTUR#. INOCULAREA
PROBELOR PATOLOGICE. CARACTERELE CULTURILOR
BACTERIENE


MEDII DE CULTUR#. INOCULAREA PROBELOR PATOLOGICE


Multiplicarea n laborator a bacteriilor din ambiental,se nume#te cultivare bacterian".
Bacteriile sunt cultivate n scopuri diferite:
-izolarea unei specii,dintr-un amestec de specii bacteriene,
-identificarea bacteriei izolate #i pe baza caracterelor de cultur",
-ob!inerea de produse biologice in scop diagnostic,profilactic sau terapeutic.
Un mediu de cultur" poate fi definit ca fiind substratul care ofer" bacteriei sub o
form" direct asimilabil", toate substan!ele indispensabile nutri!iei #i cre#terii sale, n condi!ii
fizico-chimice optime de pH, umiditate, presiune osmotic" #i temperatur".
Totalitatea bacteriilor care se dezvolt" pe mediul de cultur" constituie o cultur"
bacterian".
Pornind de la diversitatea de scopuri pentru care sunt cultivate bacteriile,este evident
c" #i mediile de cultur" sunt foarte diferite,dar pentru ca un mediu de cultur" s" poat" fi
utilizat,este obligatoriu ca el s" ndeplineasc" urm"toarele condi!ii :
- s" asigure substan!ele nutritive necesare cre#terii #i multiplic"rii
- s" asigure condi!iile de pH,presiune osmotic",aerare sau anaerobioz".
- s" fie sterile.

" INGREDIENTELE folosite la prepararea unui MEDIU DE CULTUR#:
ap!
s!ruri minerale
substan"e nutritive
" Peptone-ob!inute din proteine prin hidroliza acid", alcalin" sau
enzimatic",
" Infuzii sau extracte de carne-bulionul nutritiv,
" Amestecurile de proteine native-oul, serul sanguin, sngele
defibrinat.

agen"ii de solidificare
o Agar-agar (extract de alge) se prezint" sub form" de f#ii sau pulbere
de culoare g"lbuie-nc"lzit n ap" la 90C, se dizolv", iar solu!ia astfel
ob!inut", prin r"cire sub 45C se solidific"; agarul are proprietatea de
re!ine un volum foarte mare de ap", de 50 de ori volumul s"u. Pentru
prepararea mediilor solide se utilizeaz" agar 2%. Pentru mediile
semimoi agar 0,5-1%, iar n cazul anumitor medii pentru anaerobi agar
4%.
19
o al"i agen"i de solidificare gelatina, care este ns" solid" doar la
temperaturi mai mici de 25C; gelul de siliciu; oul coagulat-pentru
mediul Lwenstein-Yensen sau serul coagulat pentru mediul Lffler.

alte ingrediente:
o indicatorii colorimetrici de pH-albastru de bromtimol,ro#u fenol.
o
agen"ii selectivi-chimioterapice sau alte substan!e,colorante sau nu-
cristalul violet,verdele briliant,azida de sodiu.
o
agen"ii reduc!tori-la prepararea mediilor pentru bacterii anaerobe,ca
de exemplu tioglicolatul de sodiu.
o
substrate pentru teste biochimice- amino-acizi,zaharuri.

" CLASIFICAREA MEDIILOR DE CULTUR#:

Dup! starea fizic!:

o Solide
o Lichide

Dup! compozi"ie:
o
Medii uzuale-lichide-apa peptonat" #i bulionul nutritiv,
-solide-agarul nutritiv.
o
Medii cu proteine native-lichide-bulion ser,bulion snge,
-solide-agar ser, agar snge, agar #ocolatiu.
o
Medii de mbog!"ire-sunt medii n faz" lichid"
-mediul Chapman lichid, cu 15% Nacl,pentru stafilococi,
-mediul OCST, pentru Corynebacterium diphteriae,
-mediul cu selenit acid de sodium,pentru salmonelle ,
-apa peptonat" cu pH bazic,8,5,pentru vibrioni.
o
Medii selective-con!in agen!i selectivi,care inhib" multiplicarea
anumitor grupe de bacterii.
-mediul Chapman solid, cu7,5% Nacl,pentru stafilococi,
-mediul Tinsdale, pentru Corynebacterium diphteriae,
-mediul Lwenstein Yensen,pentru Mycobacterium
tuberculosis,
-mediul Sabouiraud,pentru fungi,
-medii selective cu lactoz" pentru Enterobacteriaceae
Drigalski,Levin,Leiffson,Mac Conkey,Istrate Meitert,CLED.
o
Medii pentru bacterii anaerobe
-lichide bulion thioglicolat de sodium,Brewer,Tarozzi,
-semisolide Veillon,
-solide cultivarea se face dup" tehnjca Ott Nagler,Willis
Hobbs.
o
Medii pentru teste biochimice- con!in un singur substrat-zahar sau
amino-acid, la care se adaug" sau nu, indicator colorimetric de pH.

"NS#MN$AREA MEDIILOR DE CULTUR#

20
ns"mn!area se poate face n medii de cultur" lichide,pe suprafa!a mediilor solide sau
n profunzimea mediilor semisolide.
Produsele patologice pot frecvent s" con!in" mai multe specii bacteriene, care trebuie
izolate n cultur" pur". Acest deziderat poate fi atins prin utilizarea tehnicii de inoculare prin
epuizarea inoculului pe suprafa!a mediului din placa Petri. Inoculul se descarc" pe un sector
limitat al mediului, apoi cu ansa bacteriologic" se traseaz" 4-5 striuri paralele, se sterilizeaz"
ansa #i se repet" opera!iunea, pn" cnd sunt inoculate toate sectoarele din placa Petri. Pe
ultimele sectoare,dup" incubare se vor dezvolta colonii izolate a c"ror morfologie va putea fi
analizat".
Pentru realizarea antibiogramei prin metoda difuzimetric", dar #i n alte situa!ii cum
ar fi de exemplu urocultura cantitativ",se inoculeaz" n pnz" suprafa!a mediului, fie prin
inundare cu ajutorul pipetei Pasteur,fie cu ajutorul unui tampon mbibat cu cultur" bacterian"
cu care se #terge suprafa!a mediului pe cel pu!in dou" direc!ii perpendiculare.
Pentru inoculare n profunzimea mediilor semisolide se folose#te ansa dreapt", cu
care se n!eap" toat" coloana mediului.
Pentru inocul"ri n mediile lichide se poate folosii fie ansa bacteriologic",fie pipeta
Pasteur- n cazul culturilor sau a produselor patologice lichide.

CARACTERELE CULTURILOR BACTERIENE

"N MEDII LICHIDE
Se vor urm"rii elementele:

Turbiditatea- marea majoritate a bacteriilor tulbur" uniform mediile

lichide.

Sedimentul- prezent sau absent,grunjos,de exemplu la culturile de

streptococi realizate n bulion glucozat, sau floconos, la enterobacterii.

Pelicula- prezent" sau absent", complect" sau incomplect" ca #i un

inel aderent de peretele eprubetei exemple de bacterii care formeaz"
pelicul" complet": Bacillus subtilis, Bacillus cereus, .Pseudomonas
aeruginosa.

Culoareabacteriile care sintetizeaz" pigmen!i cu eliberare

extracelular": Pseudomonas aeruginosa modific" culoarea mediului de
cultur".

Mirosul este caracteristic pentru culturile anumitor specii bacteriene-

Pseudomonas aeruginosa degaj" un miros aromatic, Citrobacter degaj"
un miros de varz" alterat", anaerobii un miros fetid.

"ASPECTUL COLONIILOR PE MEDII SOLIDE

Relieful bombat-colonii S- sau aplatizat colonii R.

Suprafa"a-neted" #i lucioas"-colonii S,sau rugoas"-colonii R.

Conturul-bine delimitat-colonii S,festonat-colonii R.

M!rimea-de la colonii punctiforme pentru streptococi, haemophili, la

colonii mari pentru Klebsiella.
21

Pigmentarea- pigmenti nedifuzibili, cu pigmentarea strict a coloniilor-

auriu la Staphylococcus aureus, galben citrin la Sarcina, ro#u la
Serratia marcescens; pigmen!i difuzibili la Pseudomonas aeruginosa-
galbenverzui (fluoresceina) #i albastru(piocianina).

Consisten"a-cremoas"- colonii S; uscat" friabil"-colonii R; mucoid",

gelatinoas".

Aderen"a- u#or deta#abile-colonii S, aderente #i greu deta#abile

colonii R.

Hemoliza- se urm"re#te pe mediile cu snge #i depinde de tipurile de

hemolizine sintetizate de c"tre bacterii.

" Majoritatea bacteriilor implicate n producerea infec!iilor umane la
izolarea lor din produsul patologic pe mediile de cultur", formeaz" colonii
de tip S, excep!ie fac Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium
diphteriae, Bacillus anthracis.


NOTE PERSONALE


























22










1.Inocularea n medii lichide cu pipeta Pasteur 2. Inocularea cu ansa dreapt" n medii semisolide
#i cu ansa bacteriologic"

1 2


3.Epuizarea inoculului pe suprafa!a mediilor 4. Inocularea n pnz"
n pl"ci Petri
23










PROPRIET#$ILE BIOCHIMICE ALE BACTERIILOR

Studierea propriet"!ilor biochimice (sau metabolice) ale bacteriilor izolate din
produsele patologice reprezint" o etap" esen!ial" pentru diagnosticul etiologic.
Se consider" c" sunt necesare, cel pu!in pentru anumite bacterii, baterii complete de
teste biochimice, pentru a putea ncadra tulpina izolat" n gen #i specie (de exemplu, n cazul
Enterobacteriaceaelor sunt necesare 24-28 de teste pentru un diagnostic precis de specie).
Aprecierea propriet"!ilor metabolice necesit" utilizarea unor medii de cultur" speciale,
preparate cu un anumit substrat. Dup" inocularea tulpinii bacteriene pe mediu #i o incubare
corespunz"toare, se apreciaz" dac" bacteria are sau nu capacitatea de a metaboliza substratul
respectiv. Dup" analiza testelor utilizate pot fi f"cute aprecieri diagnostice.
n func!ie de dotarea tehnic" a laboratorului pot fi folosite medii preparate artizanal
sau kituri performante pentru astfel de teste. Chiar dac" utilizarea kiturilor reduce mult
timpul necesar diagnosticului , mediile preparate artizanal (n buc"t"ria de medii) urm"resc n
fapt acela#i aspect- este sau nu metabolizat un substrat dat.
Testele metabolice folosite pentru identificarea bacteriilor pot fi grupate n:
% teste rezultate din metabolismul energetic bacterian:
- precizarea tipului de respira!ie,
- proba oxid"rii #i ferment"rii,
- cercetarea catalazei,
24
- reducerea nitra!ilor la nitri!i,
- testul oxidazelor.
% testele rezultate din tipurile de fermenta"ie:
- testul ro#u metil,
- testul Voges- Proskauer,
- testul beta-galactozidazei,
- testul ferment"rii carbohidra!ilor.
% testele rezultate din metabolizarea compu'ilor azota"i:
- testul indol,
- studierea decarboxilazelor amino- acizilor,
- eviden!ierea producerii de hidrogen sulfurat,
- eviden!ierea fenilalanindesaminazei,
- testul ureazei.
% teste rezultate din necesit!"ile nutritive minimale:
- utilizarea citratului de sodiu pe mediul Simmons,
- utilizarea acetatului de sodiu.

PRECIZAREA TIPULUI DE RESPIRA&IE
Tulpina bacterian" se ns"mn!eaz" n geloza Veillon prin incorporare. Se incubeaz"
(24 de ore la 37C).
- Bacteriile - strict aerobe (ex: B. subtilis) se dezvolt" strict la
suprafa!a mediului,
- strict anaerobe (ex: Clostridiile) se dezvolt" strict n
profunzimea mediului,
- aerob- anaerob facultative se dezvolt" n toat"
coloana mediului (ex: enterobacteriile).

PROBA OXID'RII (I FERMENT'RII
% Se prepar" o geloz" dreapt" cu substratul (glucoz") #i cu un indicator colorimetric de pH
(albastru de bromtimol).
% Tulpina bacterian" se ns"mn!eaz" prin n!epare cu ansa dreapt" n toat" coloana mediului
% Se incubeaz" (18 ore la 37C).
% Pentru citirea reac!iei se urm"re#te culoarea mediului. Degradarea substratului conduce la
formarea de acizi, care vireaz" indicatorul colorimetric.
Bacteriile - care degradeaz" glucoza pe cale oxidativ"
(ex: Pseudomonas aeruginosa) vireaz" culoarea mediului n
galben numai la suprafa!".
- care degradeaz" glucoza pe cale fermentativ"
(ex: Clostridiile) vireaz" culoarea mediului n galben numai n
profunzime.
- care degradeaz" glucoza pe cale oxidativ" #i
fermentativ" (ex: enterobacteriile) vireaz"
culoarea n galben n toat" coloana mediului.

25
REDUCEREA NITRA&ILOR LA NITRI&I
% Tulpina bacterian" se ns"mn!eaz" n ap" peptonat" suplimentat" cu nitrat de potasiu
0,1%.
% Se incubeaz" (24ore la 37C).
% Acumularea nitri!ilor n mediu se pune n eviden!" cu ajutorul unei substan!e indicatoare
(amestec de acid sulfanilic n acid acetic- 0,8 g la 100 ml acid acetic 30%- alfanaftilamina n
acid acetic- 0,5 g la 100 ml acid acetic 30%). Testul pozitiv (ex: enterobacterii) duce la un
viraj spre ro#u a indicatorului.

TESTUL CATALAZEI
% Tulpina bacterian" testat" (1colonie) se emulsioneaz" ntr-o pic"tur" de ap" oxigenat".
Apari!ia efervescen!ei demonstreaz" prezen!a enzimei, care scindeaz" apa oxigenat"
(ex:stafilococii).

TESTUL OXIDAZELOR
% Citocromoxidaza (prezent" de ex. la Pseudomonas aeruginosa)se poate pune n eviden!"
folosind benzi indicatoare (solu!ie alcoolic" de alfanaftol #i solu!ie apoas" 1% de clorhidrat
de dimetilparafenilendiamin").
% Se umecteaz" banda indicatoare cu ap" distilat", dup" care o colonie din tulpina testat" se
descarc" cu ansa bacteriologic".Testul pozitiv se traduce prin apari!ia unei culori albastre.

TESTUL RO(U METIL
% Urm"re#te fermentarea substratului (cu sc"derea pH-ului sub 5).
% Tulpina bacterian" testat" se ns"mn!eaz" n ap" peptonat" glucozat".
% Se incubeaz" 18 ore la 37C.
% Developarea reac!iei se face cu cteva pic"turi de reactiv (solu!ie alcoolic" de ro#u fenol-
0,1g n 300ml alcool).
- testul pozitiv (ex. enterobacterii cu excep!ia Klebsiella, Enterobacter, Serratia,
Hafnia, Pantoea) se traduce prin apari!ia culorii ro#ii= pH sub 5.
- testul negativ culoare galben"= pH peste 5.

TESTUL VOGES-PROSKAUER
% Urm"re#te fermenta!ia acetoinic" a glucozei.
% Tulpina bacterian" se ns"mn!eaz" n ap" peptonat" glucozat".
% Se incubeaz" 18 ore la 37C.
% Se alcalinizeaz" cu hidroxid de potasiu 40%.
% Se adaug" o solu!ie alcoolic" 5% de alfanaftol (f"r" s" se amestece cu cultura).
% Se interpreteaz" dup" cteva minute.
- testul pozitiv (ex. Klebsiella, Pantoea, Enterobacter, Serratia, Hafnia) este marcat
prin apari!ia unui inel ro#u- violaceu la interfa!a de contact.

TESTUL BETAGALACTOZIDAZEI
% Betagalactozidaza este o enzim" care particip" la metabolizarea lactozei. Al"turi de ea la
scindarea substratului particip" ns" #i permeaza.
26
% Pentru a evita erorile de interpretare, n loc de lactoz" se folose#te un alt substrat-ortho-
nitrophenilgalactozidul (enzim" se produce numai n prezen!a substratului, fiind o enzim"
inductiv").
% Tulpina bacterian" se cultiv" pe agar lactozat.
% Se preleveaz" cu ansa bacteriologic" o colonie care se suspend" n 1-2 ml de ser fiziologic
% Se adaug" substratul (rondel" impregnat" cu ortho- nitro phenilgalactozid).
% Citirea rezultatului se face dup" nc"lzire n palm".
- testul pozitiv (ex E. coli) este semnificat de apari!ia unei culori galbene.

FERMENTAREA ZAHARURILOR
% Mediul de cultur" folosit este apa peptonat" la care s-a ad"ugat substratul.
(un anumit zahar)- fie glucoza, fie zaharoza, fie lactoza, fie manitol) n propor!ie de 1%,
precum #i un indicator colorimetric de pH.
% Tulpina bacterian" testat" se ns"mn!eaz" n mediu.
% Se termostateaz" 18 ore la 37C.
- testul pozitiv (acidifierea mediului ) se traduce prin apari!ia virajului de culoare.

TESTUL INDOL
% Urm"re#te eviden!ierea triptofanazei (scindeaz" triptofanul n indol, acid piruvic #i
amoniac).
% Se face o cultur" de 24 ore la 37C n ap" peptonat".
% Reactivul indol (impregnat n benzi indicatoare sau solu!ie picurat" n cultur"/ con!ine 5g
paradimetilaminobenzaldehida n 75 ml alcool etilic 96% suplimentat cu 25ml acid
clorhidric concentrat.
- testul pozitiv (ex. E. coli) este indicat de apari!ia culorii ro#u- violaceu.

DECARBOXILAZELE AMINO-ACIZILOR (lizina, arginina, ornitina)
% Tulpina bacterian" testat" se ns"mn!eaz" n ap" peptonat" suplimentat" cu aminoacid (un
singur substrat) #i indicator colorimetric de pH.
% Se incubeaz" 24 ore la 37C.
- testul pozitiv (prezen!a decarboxilazei) este relevat de virajul indicatorului
corespunz"tor zonei bazice (prin decarboxilarea amino- acizilor rezultnd compu#i alcalini).

PRODUCEREA DE HIDROGEN SULFURAT
% Cisteindesulfhidraza descompune aminoacizii cu sulf prezen!i n peptonele folosite la
prepararea mediului de cultur".
% Mediul de cultur" este un agar drept, suplimentat cu acetat de plumb, tulpina bacterian"
testat" se ns"mn!eaz" prin n!epare cu ansa dreapt" n toat" coloana mediului.
% Se incubeaz" 18 ore la 37C.
- testul pozitiv (ex Salmonella, Proteus) este relevat de culoarea neagr" a mediului,
datorat" form"rii sulfurii de plumb.

EVIDEN&IEREA FENILALANINDESAMINAZEI

27
% Enzima scindeaz" fenilalanina cu formare de acid fenilpiruvic.
% Mediul de cultur" este un agar nclinat preparat cu substratul (fenil-alanina).
% Tulpina bacterian" testat" se ns"mn!eaz" pe panta agarului.
% Se incubeaz" 18 ore la 37C.
% Developarea reac!iei se face cu clorur" feric".
- testul pozitiv (ex. Proteus, Providencia, Morganella)- se traduce prin nverzirea
mediului #i a coloniilor (acidul fenilpiruvic d" reac!ia de culoare cu clorur" feric").

TESTUL UREAZEI
% Enzima scindeaz" ureea cu formare de amoniac (compus bazic) #i dioxid de carbon.
% Mediul de cultur" con!ine substratul (urea) #i un indicator colorimetric de pH.
% Tulpina bacterian" testat" se inoculeaz" n mediu.
% Se incub" 18 ore la 37C.
- testul pozitiv (ex. Proteus, Yersinia) este indicat de virajul corespunz"tor zonei
bazice.

UTILIZAREA CITRATULUI DE SODIU PE MEDIUL SIMMONS
% Se prepar" un mediu minimal cu citrat de sodiu care se solidific" n eprubet" n pozi!ie
nclinat" (mediul con!ine #i indicator colorimetric).
% Se inoculeaz" pe panta agarului.
% Se incubeaz" 18 ore la 37C.
- testul pozitiv (ex. Salmonella, Providencia) este indicat de dezvoltarea coloniilor
bacteriene #i de virajul culorii mediului.

UTILIZAREA ACETATULUI DE SODIU
% Mediul minimal preparat va con!ine acetat de sodiu #i indicatorul colorimetric.
% Se procedeaz" ca #i la testul anterior.
- testul pozitiv (ex. E. coli) este indicat de acela#i aspect ca #i n cazul utiliz"rii
citratului.


Bacillus-agar nutritiv-col.R Pseudomonas aeruginosa-agar nutritiv-pigmen!i
difuzibili


Staphylococcus aureus-agar snge Streptococcus pyogenes-agar snge
28
hemoliz" beta #i alfa


Drigalsky-col.lactozo pozitive-E.coli Drigalsky-col.lactozo negative-Salmonella


Drigalsky-Klebsiella-cameleonaj Drigalsky-Proteus-invazie


Levin-col.lactozo pozitive-E.coli Levin col.lactozo negative-Salmonella


29

Lwenstein-Yensen mediul Tarozzi agar snge-tehnica Ot


Staphylococcus aureus-Chapman Sarcina pe agar nutritiv



teste biochimice n eprubete-medii artizanale API-kit de teste biochimice


NOTE PERSONALE










30




















LUCRAREA NUM#RUL 5. ANTIBIOGRAMA


ANTIBIOGRAMA


Defini"ie

Prin antibiogram", se n!elege determinarea sensibilit"!ii unei tulpini bacteriene, care a
fost izolat" dintr-un produs patologic, fa!" de diferitele chimioterapice.
Instituirea terapiei cu antibiotice r"mne, pentru medicul practician, o problem" de
mare responsabilitate medical", fiind necesar" cunoa#terea ctorva reguli, care s" asigure
succesul terapiei cu antibiotice:
- antibiograma se face dup" stabilirea diagnosticului etiologic,
- tratamentul se realizeaz" n func!ie de rezultatele antibiogramei, alegnd
chimioterapicele fa!" de care bacteria izolat" are cea mai mare sensibilitate,
- dintre dou" sau mai multe chimioterapice cu eficacitate asem"n"toare, se va
alege cel mai pu!in toxic pentru conturarea schemei terapeutice,
- dac" se impune asocierea a dou" sau mai multe chimioterapice,se va !ine
obligatoriu seama de efectul sum"rii lor #i se vor asocia numai cele care
ac!ioneaz" sinergic,
31
- se va !ine seama obligatoriu de st"rile fiziologice #i patologice preexistente
episodului infec!ios, evitndu-se chimioterapicele cu toxicitate crescut" la
gravide #i l"uze, precum #i cele hepato sau nefrotoxice la bolnavi cu
afec!iuni cronice hepatice sau respectiv renale.
Exist" mai multe metode de efectuare a antibiogramei:

Metoda dilu"iilor n medii lichide:

Are ca scop determinarea concentra!iei minime inhibitorii (CMI) a fiec"rui antibiotic,
care se exprim" n g/ml. CMI este concentra!ia cea mai mic" de antibiotic care inhib"
multiplicarea bacterian". Se fac dilu!ii succesive de antibiotic n mediu lichid #i se adaug"
cte o pic"tur" din inoculul bacterian. Se incubeaz" la 37C #i se cite#te concentra!ia cea mai
mic" de antibiotic la care nu s-a dezvoltat bacteria (ultima eprubet" limpede indic" limita de
sensibilitate a microorganismului fa!" de chimioterapic). Ad"ugnd la mediu un indicator de
pH (ro#u fenol) se poate reduce timpul de citire a rezultatelor la 3-6 ore deoarece virarea
culorii mediului n urma modific"rii pH-ului datorit" dezvolt"rii microbiene (pH acid) apare
mai rapid dect tulburarea mediului.

Metoda difuzimetric! n pl!ci Petri

Este o metod" de lucru comod",n condi!iile unui rulaj mare de probe,dar prezint"
dezavantajul de a nu putea s" stabileasc" concentra!ia minim" inhibitorie.
Tehnica:
Cultura bacterian" de 24 de ore se dilueaz", apoi se ns"mn!eaz" n pnz" pe
suprafa!a unei geloze Mueller-Hinton, con!inut" ntr-o plac" Petri. Se las" s" se usuce
suprafa!a mediului lng" flac"r" cu capacul cutiei ntredeschis #i, pe mediul uscat, se depun
Tuburi
1 2 3 4 5 6 7 8 9 M
Mediu n ml
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Sol. Streptomicin"
200/ml
1 1 1 1 1 1 1 1 1
Cultura de testat
diluat"
Cte o pic"tur" n fiecare tub
Dilu!iile finale de
streptomicin"
100 50 25 12,5 6,25 3,1 1,56 0,78 0,39 ..
32
cu o pens" microcomprimate con!innd diferite chimioterapice. Antibioticul difuzeaz" n
geloz" conform unui gradient de concentra!ie . Dup" o incubare de 18-24 de ore la 37C se
interpreteaz" antibiograma, m"surnd- n mm- diametrul zonelor de inhibi!ie din jurul
microcomprimatelor de chimioterapice. Valorile ob!inute se compar" cu valori din tabele
pentru tulpini standard. O tulpin" poate fi sensibil", intermediar sensibil" sau rezistent".
Sensibilitatea sau rezisten!a unei bacterii fa!" de antibiotice este o proprietate de
tulpin" #i nu de specie.

Metoda E-test

Este o metoda care mbin" avantajul metodei difuzimetrice- comoditatea (u#or de
utilizat n condi!iile unui rulaj mare de probe), cu avantajul pe care-l ofer" metoda dilu!iilor
(capacitatea de a stabili concentra!ia minim" inhibitorie- CMI).
Se lucreaz" pe medii de cultur" n pl"ci Petri (la fel ca #i metoda difuzimetric"), ns"
n locul microcomprimatelor de chimioterapice, folose#te benzi impregnate cu
chimioterapice. Concentra!ia de chimioterapice (notat" pe band") descre#te de la extremitatea
ce prezint" simbolul chimioterapicului spre extremitatea opus".
Se incubeaz" tot 18 ore la 37 C, iar la citirea rezultatelor se urm"re#te locul n care
zona de inhibi!ie ntlne#te banda. n punctul respectiv se cite#te CMI.
Pentru interpretarea rezultatelor se iau n considerare strict zonele de inhibi!ie pe care
nu s-a dezvoltat nici m"car o singur" colonie bacterian".

Alte metode
Pentru bacteriile anaerobe,se folose#te metoda difuzimetric" n dublu strat de agar.
Pentru Mycobacterium tuberculosis,antibiograma se lucreaz" direct pe mediul
Lwenstein Yensen.




Metoda difuzimetric! n pl!ci Petri
1. Pseudomonas aeruginosa 2. Pseudomonas aeruginosa


3. Klebsiella pneumoniae 4. Escherichia coli
33


5. Escherichia coli BLSE 6. Serratia marcescens


E-test : Streptococcus pneumoniae


NOTE PERSONALE











34


































LUCRAREA NUM#RUL 6. REAC$II ANTIGEN-ANTICORP

ANTIGENUL = orice substan!" care este capabil" s" declan#eze n organism un
r"spuns imun, sau in vitro s" neutralizeze anticorpii specifici.
! R"spunsul imun poate fi de natur" umoral" (cu formarea de anticorpi specifici) sau
celular". R"spunsul imun celular se poate manifesta #i n sens negativ, ca #i toleran!"
imunologic".
35
! O substan!" poate fi recunoscut" drept proprie (self) de un organism sau drept str"in"
(non-self) de un lat organism; n consecin!", antigenul (in vivo) exist" numai n raport
cu organismul receptor.
! Atributele antigenului sunt :
Antigenicitatea = capacitatea substan!ei de a se combina cu anticorpii
respectivi, indiferent dac" are sau nu capacitatea de a stimula formarea lor.
Imunogenicitatea = capacitatea antigenului de a stimula formarea anticorpilor.
! Aglutinogenele sunt antigene particulate care particip" la reac!iile de aglutinare.
! Precipitogenele sunt macromolecule (n solu!ie) #i particip" la reac!iile de
precipitare.

ANTICORPII (Imunoglobulinele) = glicoproteine sintetizate ca #i r"spuns la un
stimul antigenic. Limfocitul B activat de stimulul antigenic trece printr-o serie de etape pn"
la stadiul de plasmocit, principala celul" care secret" imunoglobulinele-anticorpi.
! Aglutininele apar!in clasei de imunoglobuline M #i particip" la reac!iile de aglutinare.
! Precipitinele apar!in clasei de imunoglobuline G #i particip" la reac!iile de precipitare.
! Ca atare pentru ob!inerea de aglutinine se practic" imuniz"ri de scurt" durat", iar
pentru precipitine imuniz"ri de lung" durat".

REAC$IILE ANTIGEN-ANTICORP
Cnd un antigen #i anticorpul s"u specific se apropie de latul n mediul apos, cei doi
reactan!i intr" sub influen!a unor for!e de atrac!ie. Leg"tura care se formeaz" este o leg"tur"
de tip van der Waals.
Pentru formarea complexului antigen-anticorp este necesar ca cei doi reactan!i s" se
apropie la o distan!" de 0,1-0,2 nm.

Reac"ia de aglutinare bacterian!

Aglutinarea bacterian" este o reac!ie antigen-anticorp de agregare, n care antigenul
este reprezentat de celule bacteriene sau fragmente de celule bacteriene n suspensie (antigen
particulat). Sub ac!iunea anticorpilor specifici, complexele imune antigen-anticorp, formeaz"
re!ele tridimensionale n prezen!a unor electroli!i din mediu #i n anumite condi!ii de
temperatur" #i pH, constituind agregate vizibile. Reac!ia de aglutinare se folose#te att n
identificarea unor bacterii pe baza propriet"!ilor antigenice, ct #i pentru eviden!ierea
anticorpilor aglutinan!i din serul de bolnav.
Tehnici de efectuare a reac!iei de aglutinare
Aglutinarea pe lam". Se folose#te preponderent n diagnosticul bacteriologic, pentru
identificarea rapid" pe baza propriet"!ilor antigenice a unor tulpini izolate din produsul
patologic #i mai pu!in n diagnosticul serologic.
Se depune pe o lam" curat" #i degresat" o pic"tur" de ser imun #i al"turi o pic"tur" de
solu!ie salin" fiziologic". Din cultura bacterian" de 18-24 de ore pe geloz" nutritiv", ob!inut"
pornind de la o colonie izolat", se ia cu ansa o cantitate mic" care se suspend" omogen n
pic"tura de ser imun, apoi se repet" opera!ia n pic"tura de solu!ie salin" fiziologic". n cazul
unei coresponden!e antigen-anticorp, n pic"tura de ser imun, bacteriile vor fi aglutinate sub
36
form" de grunji fini, albi, vizibili cu ochiul liber. n pic"tura de solu!ie salin" fiziologic"
(aglutinare martor) bacteriile r"mn n suspensie omogen"; n cazul n care apare aglutinare,
aceasta este nespecific", spontan", dat" de obicei de culturi n faza R.
Aglutinarea pe lam" se poate folosi #i n diagnosticul serologic, n scop de triaj. Dac"
o astfel de reac!ie se pozitiveaz", se va continua obligatoriu cu reac!ia de aglutinare n tuburi
(cantitativ").
Aglutinarea n tuburi este o reac!ie cantitativ", care se folose#te predilect pentru
diagnosticul serologic; se efectueaz" n 6 epubete n care se realizeaz" dilu!ii cresc"toare (n
ser fiziologic) din serul de cercetat, la care se adaug" aceea#i cantitate de antigen standard.
Titrul reac!iei este reprezentat de dilu!ia cea mai mare de ser la care se mai observ"
aglutinarea, cu caracteristicile sale, de aglutinare somatic", sau respectiv flagelar".

Schema reac!iei de aglutinare n tuburi.


n aglutinarea bacterian", dup" natura #i localizarea antigenului care particip" la
reac!ie, exist" dou" tipuri principale de aglutinare: somatic" sau aglutinare O #i ciliar" sau
aglutinare H.
Aglutinarea O sau somatic" este data de antigenul O, somatic, care intr" n
constitu!ia peretelui celular. Antigenul O este de natur" glucido-lipido-polipeptidic",
termostabil, alcoolo-rezistent #i distrus de formol.
Aglutinarea O apare sub forma unor grunji fini, care nu disociaz" la o agitare
brutal": apare mai lent, necesitnd incubare de 2 ore la 52 C n baia-marin", urmat" de 20 de
ore la temperatura camerei. n aglutinarea O bacteriile se unesc ntre ele prin alipirea cap la
cap (aglutinare polar").
Aglutinarea H, flagelar" este dat" de antigenul H, prezent la bacteriile mobile,
antigen de natur" proteic", termolabil, distrus de alcool, rezistent la formol. Aglutinarea H
apare sub forma unor flocoane care formeaz" un sediment abundent lax, care dispare la
agitare brutal"; aglutinarea H apare mai rapid, fiind suficient" o incubare de 2 ore la 52 C
n baia-marin". n aglutinarea H bacteriile se unesc prin flageli.
Cele mai importante reac!ii de aglutinare folosite n diagnosticul serologic al bolilor
infec!ioase sunt: reac!ia Widal n febra tifoid" #i febrele paratifoide, reac!ia Wright n
Epr ube t a
nr.
1 2 3 4 5 6( martor)
Sol.salin"
fiziologic"
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
S e r d e
c e r c e t a t
dil.1/10
0,5 dilu!ii succesive
Antigen
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
D i l u ! i i
finale ale
serului
1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 -

37
bruceloz" #i reac!ia Weil-Felix n tifosul exantematic #i alte rickettsioze. n reac!ia Widal se
folosesc att antigenele O ct #i H de la Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A #i
Salmonella paratyphi B pentru a eviden!ia anticorpii corespunz"tori din serul de bolnav.
Reac!ia de aglutinare pasiv" sau aglutinarea pe suport se utilizeaz" atunci cnd
antigenul este o solu!ie molecular". n urma fix"rii pe un suport particulat acesta devine
aglutinabil n prezen!a serului imun. Astfel de reac!ii se pot executa dupa tehnici variate, care
sunt n func!ie de natura particulelor utilizate ca suport #i de modul n care se face leg"tura
antigenului de particulele respective. Reac!iile se pot folosi att la identificarea unui antigen,
ct #i la cercetarea anticorpilor corespunz"tori folosind un antigen cunoscut.
Particulele folosite sunt fie inerte ca: latex, polistiren, bentonit", colodiu, fie se
folosesc hematii umane de grup O sau hematii de animal- n acest caz vorbim de
hemaglutinare pasiv". Dac" antigenul este polizaharidic, el poate fi u#or adsorbit pe hematii
native. Dac" antigenul este de natur" proteic", adsorb!ia lui pe hematii se face numai dup" ce
n prealabil acestea au fost tratate cu acid tanic (hematii tanate) sau cu al!i fixatori
(glutaraldehida).
Exemple de reac!ii de aglutinare pasiv" n care antigenul este adsorbit de particule
inerte de latex polistiren.
- n eviden!ierea factorului reumatoid (FR= imunoglobuline anticorp care
apare fa!" de Ig G proprii, constituite majoritar din Ig M.)
Testul latex mai poate fi utilizat:
- pentru a detecta antigene de Haemophylus, pneumococ sau antigen de
meningococ n LCR, ser, secre!ie faringian".
- pentru cercetarea anticorpilor anti-ADN n diagnosticul de lupus eritematos
diseminat, atunci cnd particulele de latex sunt acoperite de ADN.
Exemple de aglutinare pasiv" n care antigenul este adsorbit pe hematii:
- pentru testarea anticorpilor antitoxici #i a anticorpilor ce apar fa!" de
diferite antigene bacteriene ( antigene O, antigene polizaharidice, etc.)
- n diagnosticul tiroiditei Hashimoto (boal" autoimun") folosind hematii
tanate sensibilizate cu extract tiroidian.
- n diagnosticul poliartritei reumatoide, reac!ia de hemaglutinare pasiv"
Waaler-Rose. Principiul acestui test const" n proprietatea (capacitatea) pe
care o au eritrocitele de berbec sensibilizate cu hemolizin" (anticorpi
antihematii de berbec) de a fi aglutinate de seruri care con!in factor
reumatoid.
Ca o reac!ie derivat" din hemaglutinarea pasiv", se folose#te ast"zi tot mai mult
reac!ia de inhibare a hemaglutin"rii pasive. O astfel de reac!ie se folose#te n diagnosticul
imunologic al sarcinii pentru cercetarea gonadotrofinei corionice. ntr-un prim timp urina
femeii este pus" n contact cu un ser imun antigonadotrofin". n caz de sarcin", gonadotrofina
corionic" este prezent" n urin" #i n consecin!" va avea loc reac!ia cu anticorpii
corespunz"tori din serul imun. ntr-un al doilea timp, amestecul este ad"ugat unei suspensii
de hematii tanate, sensibilizate la gonadotrofin". Dac" anticorpii antigonadotrofin" din serul
imun utilizat n primul timp au r"mas liberi, vor aglutina hematiile #i reac!ia va demonstra
absen!a gonadotrofinei n urin"- deci diagnostic negativ de sarcin". Dac", din contr",
anticorpii antigonadotrofin" din serul imun au fost satura!i de gonadotrofina prezent" n urina
38
femeii ns"rcinate, aglutinarea hematiilor sensibilizate cu gonadotrofin" nu va mai avea loc
(inhibarea hemaglutin"rii), diagnosticul de sarcin" fiind n acest caz pozitiv.
n imunologia bacterian" reac!ia se folose#te mai ales pentru a preciza punctul
dominant dintr-o grupare determinat" de un antigen.

Reac"ia de precipitare

Este o reac!ie antigen-anticorp de agregare, n care antigenul este reprezentat de
macromolecule n solu!ie coloidal". Punerea n contact a antigenului cu anticorpul
corespunz"tor duce la formarea unor coplexe antigen-anticorp care precipit" atunci cnd
elementele ce particip" n reac!ie se g"sesc n propor!ie optim". Are mai multe variante n
func!ie de mediul n care se desf"#oar" reac!ia. &innd cont de faptul c" n reac!ia de
precipitare, antigenul, ca solu!ie coloidal", poate fi bine caracterizat chimic (polizaharizi
bacterieni purifica!i, proteine bacteriene, antigene sintetice #i semisintetice), aceasta confer"
reac!iei un mare grad de specificitate #i sensibilitate, pretndu-se foarte bine #i la analize
imunochimice de fine!e.
Tehnici de efectuare a reac!iei de precipitare:
1. Precipitarea inelar"-antigenul #i serul imun sunt puse n contact n tuburi cu
diametrul mic, tuburi capilare, n a#a fel nct s" nu se amestece, ci s" formeze o interfa!" de
contact la nivelul c"reia, prin creerea unei zone de concentra!ie optim" de antigen-anticorp,
s" par" un inel de precipitare (are caracter istoric, nu se mai folose#te n prezent).
n diagnosticul bolilor infec!ioase, pot fi men!ionate:
- reac!ia Ascoli- se utilizeaz" n diagnosticul retrospectiv al anthraxului.
- reac!ia Vincent-Bellot- n diagnosticul meningitei cerebro-spinale epidemice.
- identificarea de grup a streptococilor.

2. Reac!ia de floculare este o reac!ie n care precipitarea apare prin amestecul
antigenului cu serul imun (n toat" masa amestecului) sub form" de flocoane. Aceast" reac!ie
se utilizeaz" n principal pentru titrarea toxinelor bacteriene #i a serurilor antitoxice pornindu-
se de la observa!ia c" flocularea apare prima dat" n eprubeta n care exist" o propor!ie
optim" de antigen #i anticorp (reac!ia de floculare Ramon). n felul acesta, cunoscnd titrul
serului se determin" cu u#urin!" valoarea antigenic" a toxinei #i invers.
Tehnica de lucru const" n repartizarea ntr-o serie de eprubete a unor cantit"!i crescnde de
ser antitoxic (Ac) peste care se adaug" o cantitate constant" de toxin" (Ag).



39

Eprubetele se pun n baia marin" la 52 C #i se urm"re#te (la intervale de 5 minute) care
este prima eprubet" n care apare flocularea. Aceasta va reprezenta practic unirea unor
cantit"!i echivalente de antigen #i anticorp.
S" lu"m ca exemplu titrarea valorii antigenice a toxinei difterice: se lucreaz" dup" schema de
mai sus cu un ser antidifteric care are un titru cunoscut de 100/ UA/ml.
Dac" reac!ia apare ini!ial n tubul 3 care con!ine 0,3 ml ser antitoxic, deci 30 unit"!i
antitoxice, !innd cont de faptul c" o limit" floculant" este neutralizat" de o unitate antitoxic",
nseamn" c" 30 unit"!i antitoxice au neutralizat 30 de limite floculante; toxina titrat" are
valoare de 30 de limite floculante (limita floculant" este unitatea de m"sur" in vitro pentru
toxina difteric").
3. Precipitarea n gel utilizeaz" gel de agar sau agaroz" (agar hidrolizat #i purificat)
ca mediu n care unul sau ambele elemente care ntr" n reac!ie (antigen - anticorp) difuzeaz",
diametrul moleculelor de antigen #i anticorp fiind mai mic dect diametrul porilor gelului.
ntlnirea celor dou" elemente n propor!ie optim" duce la apari!ia unei linii sau zone opace
de precipitare, vizibile n gelul transparent.
Se poate realiza dup" urm"toarele tehnici:
a) difuzia simpl" ( difuzeaz" numai unul dintre reactan!i, cel"lalt g"sindu-se nglobat
n mediul de difuzie).
- metoda Oudin: ntr-o eprubet" se pune o coloan" de gel n a c"rei mas" este
inclus serul precipitant: la suprafa!" se toarn" solu!ie de antigen care
difuzeaz" n mediu #i n raport cu capacitatea de difuziune a fiec"rei
frac!iuni antigenice se formeaz" la ntlnirea cu anticorpii benzi de
precipitare.
- metoda difuziei radiale Mancini: se utilizeaz", de exemplu, pentru
determinarea cantitativ" din serul de bolnav a unor frac!iuni proteice, cum ar
fi IgG, IgM, IgA (imunograma) sau a C3, transferinei, etc. Imunograma
reprezint" cea mai frecvent" utilizare a difuziei radiale n laboratorul clinic.
Reac!ia este realizat" prin nglobarea anticorpilor n mediul de difuzie.
b) dubla difuzie (difuzeaz" ambii reactan!i)
- metoda Ouchterlony: pe o plac" de sticl" se toarn" agaroz" 1% n solu!ie
tampon, n care dup" solidificare, se fac godeuri. n godeul central, se
pune serul imun (Ac), iar n celelalte godeuri, se pun diferite Ag. Se
incubeaz" n camera umed" cteva zile. Dac" exist" coresponden!" ntre
Ag #i Ac se formeaz" linii de precipitare, num"rul lor fiind n func!ie de
Epr ube t a
nr.
1 2 3 4 5
S e r
antidifteric
100 U.A/
ml
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Sol.sal.fiz.
0,9 0,8 0,7 0,6 0,5
Toxina de
cercetat
1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
40
complexitatea antigenului. Metoda poate fi aplicat" pentru identificarea
unor antigene bacteriene, virale, proteine patologice care apar n serul
bolnavilor (proteina C reactiv", )-fetoproteina) #i alte proteine de diverse
provenien!e. Un tip particular de dubl" difuzie l reprezint" metoda Elek
pentru eviden!ierea tulpinilor toxigene de bacil difteric.
c) difuzia n cmp electric
% imunoelectroforeza (IEF) este o metod" care asociaz" principiul
electroforezei (EF) cu principiul difuziunii n gel. Astfel, ntr-un prim timp, se
efectueaz" o EF n gel de agaroz" prin care, datorit" mobilit"!ilor electroforetice
diferite, componentele unui amestec antigenic complex (a#a cum sunt n mod
obi#nuit antigenele naturale) se separ" foarte bine. n al doilea timp, se adaug" un ser
imun corespunz"tor #i se las" s" reac!ioneze, n dubl" difuzie, cu antigenele separate.
Cnd are loc ntlnirea antigenului cu anticorpul corespunz"tor n propor!ii
convenabile, apare un arc de precipitare. Fiecare frac!iune proteic" are un arc
carcteristic ca pozi!ie #i morfologie. IEF poate fi asociat" cu colora!ii speciale pentru
a identifica mai bine frac!iunile antigenice. Aceast" metod", permi!nd o analiz"
am"nun!it" a constituien!ilor antigenici, este foarte util" n:
- determinarea num"rului de frac!iuni prezente ntr-un antigen complex;
- determinarea clasei de Ig #i a altor proteine din plasma sangvin", cu ajutorul
unui ser imun anti ser de om.
- controlul purific"rii unor preparate antigenice:
% contraimunelectroforeza (CIEF): datorit" nc"rc"rii electrice diferite,
antigenul #i anticorpul migreaz" n sens contrar ntr-un cmp electric, #i la locul de
ntlnire cu anticorpul corespunz"tor (care se deplaseaz" prin electroendosmoz"), se
produce n gel o linie de precipitare. Metoda se folose#te pentru determinarea unor
antigene a c"ror migrare n cmp electric se face spre anod (antigenele virusului
hepatitei B-HBs, )-fetoproteina, polizaharide #i alte antigene polimicrobiene). Pe o
lam" pe care s-a turnat gel de agaroz", se taie 3-4 #iruri de perechi de godeuri egale la
distan!" de 0,3-0,5 cm ntre ele. Lama este pus" n cuva de electroforez" #i n
godeurile fiec"rui #ir plasate spre catod se introduc probele de cercetat (Ag), n timp
ce, n godeurile plasate c"tre anod se introduce serul imun corespunz"tor. La
ntlnirea celor 2 elemente se formeaz" o linie sau un arc de precipitare. Durata
migr"rii este de aproximativ o or".

Reac"ii antigen-anticorp cu participarea complementului

Participarea complementului (C) n reac!iile imune a fost ini!ial detectat" prin
capacitatea de a induce liza bacteriilor sensibilizate de anticorpi (bacterioliza respectiv
imunohemoliza).
Reac!ia de bacterioliz"
n cazul n care antigenul care intr" n reac!ie este o celul" bacterian", sub ac!iunea
anticorpului specific #i a C, bacteria sufer" o serie de modific"ri, care n final duc la liza
celulei. Prima observa!ie de acest fel a fost f"cut" pentru vibrionul holeric #i i s-a dat
41
denumirea de fenomenul de bacterioliz" sau de vibrioliz" a lui Pfeiffer, putnd fi eviden!iat in
vivo sau in vitro.
Fenomenul de bacterioliz" a mai fost demonstrat #i pentru al!i bacili Gram negativi:
bacil piocianic, bacil dizenteric, etc.
Bacterioliza, ca orice fenomen de citoliz", necesit" participarea tuturor
componentelor complementului.

Efectul bactericid al complementului
n prezen!a anticorpilor specifici, complementul poate exercita un efect bactericid asupra
unor bacterii Gram negative. n vivo acest efect, care poate fi declan#at #i pe cale alternativ",
se pare c" rezult" din ac!iunea combinat" a complementului #i lizozimului asupra peretelui
celular bacterian.

Fenomenul de imunhemoliz"
n prezen!a anticorpilor specifici antihematie (hemolizina sau ser hemolitic) #i a C,
hematiile sunt lizate. Acest fenomen de hemoliz" imun" st" la baza determin"rii activit"!ii C
prezent n ser, plasm", lichide extravasculare.
n titrarea activit"!ii hemolitice a C se ia n considera!ie dilu!ia cea mai mare de C,
care lizeaz" 50% din hematii n prezen!a unei cantit"!i optime de anticorpi antihematie,
notndu-se DH50 ( doza hemolitic" pentru 50% dintre hematii).
Fenomenul de imunhemoliz" este utilizat, cu rol de indicator, n RFC.

Reac!ia de fixare a complementului (RFC)

n cazul n care reac!iile antigen anticorp au loc n prezen!a C, acesta se fixeaz"
numai pe complexul imun format. Fixarea C pe complexul antigen-anticorp poate fi indirect
eviden!iat", prin fenomenul de imunhemoliz", utiliznd sistemul hemolitic drept indicator.
La RFC particip" dou" sisteme antigen-anticorp:
a)primul sistem Ag-Ac (sistemul de cercetat) este format din serul de cercetat care con!ine
anticorpii (diagnostic serologic) #i antigenul standard.
b)al doilea sistem Ag-Ac (sistemul de referin!" sau sistemul hemolitic) are rolul de a
eviden!ia fixarea complementului pe primul sistem Ag-Ac. Este format din eritrocite de
oaie #i hemolizin" (anticorpi antieritrocite).
ntre cele dou" sisteme oscileaz" C.
n prezen!a anticorpilor n serul de cercetat, se formeaz" complexe antigen-anticorp pe
care se fixeaz" complementul, care se consum" din mediul de reac!ie. Pentru partea a duoa a
reac!iei (cnd se adaug" sistemul hemolitic) nu mai r"mne complement liber, astfel nct
hematiile r"mn intacte (nelizate), reac!ia fiind interpretat" ca #i pozitiv".
Dac" n serul de cercetat nu se g"sesc anticorpi specifici pentru antigenul standard,
complementul nu are unde s" se fixeze #i r"mne liber n mediul de reac!ie, astfel nct n
partea a doua a reac!iei se poate fixa pe sistemul hemolitic, #i determin" liza eritrocitelor;
reac!ia este interpretat" ca #i negativ".
RFC se execut" n doi timpi:
42
1. Se pun n reac!ie serul de cercetat, antigenul #i C, incubndu-se la 37C timp de
o or", sau la +4C timp de 20 de ore, conform procedeului utilizat.
2. Se adaug" apoi sistemul indicator ( sistemul hemolitic) cu o nou" incubare la
37C, dup" care reac!ia se cite#te apreciind prezen!a sau absen!a hemolizei
( reac!ie negativ", sau respectiv pozitiv").
RFC se poate utiliza pentru identificarea unui antigen necunoscut, cu ajutorul
serurilor standard cunoscute, dar mai ales n scopul test"rii anticorpilor necunoscu!i (ser de
bolnav) folosind antigene standard cunoscute.
Materialele necesare reac!iei sunt:
1. Ser de bolnav inactivat 30 de minute la 56C nainte de reac!ie pentru distrugerea
complementului propriu.
Serurile standard utilizate pentru identific"ri de antigene se trateaz" la fel.
2. Antigene cunoscute sau de cercetat, pot fi reprezentate de suspensii bacteriene,
extracte bacteriene, suspensii virale, extracte de !esuturi, etc.
Antigenele trebuie titrate pentru a stabili valoarea antigenic" sau titrul (cantitatea
minim" de antigen, care n prezen!a anticorpilor specifici fixeaz" complementul).
3. Complementul: n mod obi#nuit se folose#te serul de cobai (care con!ine cantit"!i mari
#i n general uniforme de complement), fie proasp"t recoltat, fie conservat prin
diverse procedee. Pentru a alege cantitatea optim" care trebuie pus" n reac!ie,
complementul se titreaz" n prealabil, ori de cte ori se execut" RFC.
Exist" mai multe procedee de titrare a complementului, din care exemplific"m o
tehnic" folosit" n serologia sifilisului.
ntr-o serie de tuburi se pun cantit"!i crescnde de complement diluat 1/10, ncepnd
de la 0,1 pn" la 0,5. Se adaug" solu!ie salin" fiziologic" pn" la cantitatea de 1,5 ml
pe tub #i apoi cte 1 ml sistem hemolitic. Se agit" #i se incubeaz" 30 de minute la
termostat, dup" care se cite#te. Cantitatea minim" de complement care produce liza
complet" a hematiilor reprezint" titrul complementului, sau 1 unitate complement. n
reac!ia de fixare se folose#te cantitatea din tubul imediat urm"tor; de exemplu dac"
liza total" a hematiilor a avut loc n tubul 4, titrul complementului este 0,25, iar n
reac!ie se lucreaz" cu 0,3ml.
4. Hematii de oaie: se recolteaz" steril n balon cu perle de sticl" #i se defibrineaz"
mecanic prin agitare. Se spal" cu solu!ie salin" fiziologic" prin 3-4 centrifug"ri
repetate, dup" care se face o suspensie n solu!ie salin" fiziologic", la concentra!ia
necesar".
5. Serul hemolitic anti-oaie (hemolizina) se prepar" prin injectare repetat" la iepure a
unei suspensii de hematii de oaie. El este titrat de institutul produc"tor, titrul fiind
indicat pe eticheta fiolelor.
Pentru a prepara sistemul hemolitic necesar reac!iei se amestec" cantit"!i egale de
suspensie de hematii n concentra!ia necesar", conform procedeului utilizat #i
hemolizina diluat" conform titrului. Amestecul se !ine 30 de minute la 37C nainte de
repartizare n reac!ie.



43
Tehnici RFC:
1.Tehnica Wassermann: utilizat" n diagnosticul serologic al sifilisului (reac!ia Bordet-
Wassermann), n bruceloz", tuse convulsiv", etc.
2.Tehnica Ida Bengston: folosit" n diagnosticul leptospirozelor, rickettsiozelor, a
infec!iilor cu chlamydii, etc, are avantajul c" stabile#te cantitatea anticorpilor (titrul serului)
lucrndu-se cu dilu!ii succesive de ser de bolnav.
Se lucreaz" pe probe perechi de seruri (prima recoltat" la debutul bolii, a doua n
convalescen!"), urm"rindu-se cre#terea titrului de anticorpi de cel pu!in 4 ori n proba a
doua. Titrul reac!iei este dat de dilu!ia cea mai mare de ser de bolnav care mai fixeaz"
complementul, n prezen!a antigenului specific.
3.Tehnica Breadstreet #i Taylor care se folose#te n infec!iile virale, infec!ii cu
mycoplasme, febra Q, etc. Utilizeaz" o titrare special" a complementului n prezen!a
dilu!iilor de hemolizin", procedeu numit n tabl" de #ah. RFC este efectuat" pe pl"ci sau
micropl"ci cu godeuri, incubarea f"cndu-se dup" tehnica la rece.





Reactii Antigen Anticorp cu reactanti marcati

Sensibilitatea reac!iilor antigen-anticorp poate fi m"rit" legnd de anticorp ( mai rar
de antigen) un marker u#or de identificat, care s" nu interfereze cu propriet"!ile imunologice
ale reactan!ilor. Acest marker poate fi:
a) o substan!" fluorescent" (izocianat de fluorescein"), n tehnica imunofluorescen!ei;
b) izotopi radioactivi (de obicei I
125
), n metoda radioimunotest"rii;
c) o enzim" (peroxidaza, *-galactozidaza, fosfataza alcalin") n testele imunoenzimatice.

Reac"ia de imunofluorescen"! (IF)

Prin cuplarea unei substan!e fluorescente cu anticorpii se ob!in anticorpi fluorescen!i,
care, fixndu-se pe antigenul omolog, conduc la formarea de complexe antigen-anticorp
fluorescente, observabile prin examinarea la microscop n lumin" ultraviolet".
a) metoda direct": anticorpii monospecifici sunt conjuga!i cu substan!a fluorescent".
Materialul testat pentru prezen!a antigenului se etaleaz" pe lam", dup" care se
incubeaz" cu anticorpii marca!i. Excesul de anticorpi se ndep"rteaz" prin
sp"lare, preparatul uscat fiind apoi examinat n lumin" ultraviolet". Complexele
antigen-anticorp marcat, apar ca zone fluorescente, u#or vizibile.
IF direct" este o metod" rapid" de diagnostic n unele infec!ii bacteriene #i mai
ales virale, permi!nd eviden!ierea diverselor antigene n !esuturi.
Dezavantajul procedeului direct const" n necesitatea unui num"r mare de seruri
marcate, fiecare ser cu o singur" specificitate.
b) metoda indirect": comport" doi timpi:
44
- preparatul care con!ine antigen se incubeaz" cu anticorpii specifici,
nemarca!i;
- vizualizarea complexului imun format se face prin prin ad"ugarea unui
indicator fluorescent, care este serul antiimunglobulin" marcat.
Rezult" c" n IF indirect" anticorpul specific nemarcat, pe lng" func!ia de anticorp
fa!" de antigenul c"utat, ndepline#te totodat" rolul de antigen fa!" de anticorpul marcat cu
substanta fluorescenta (serul antiimunglobulinic).
IF indirect" are avantajul c" un singur ser imun antiglobulinic marcat, serul
antiimunglobulin" uman", serve#te la detectarea diverselor sisteme antigen-anticorp.
IF indirect" are o larg" aplicare permi!nd:
- eviden!ierea antigenelor .
- detectarea anticorpilor .
IF este o metod" foarte sensibil", cu condi!ia ca reactivii utiliza!i s" fie purifica!i #i
riguros controla!i, pentru a se exclude erorile cauzate de fluorescen!a nespecific".
IF se aplic" n bacteriologie pentru identificarea streptococilor de grup A, n
diagnosticul infec!iilor cauzate de neiseerii, mycoplasme, hemofili, bordetelle, n sifilis, etc.
IF n diagnosticul rapid al infec!iilor virale - pentru diagnosticul rabiei, IF este
metoda de elec!ie.
Radioimunotestarea (RIA)
Ini!ial aplicat" pentru test"ri de hormoni #i enzime, RIA s-a extins #i n diagnosticul
bolilor infec!ioase, fiind una din cele mai sensibile #i precise metode de detectare #i dozare a
antigenelor #i anticorpilor.
Se practic" fie marcarea cu I
125
(mai rar C
14
, H
3
) a unuia din reactan!i (antigen sau
anticorp), fie radiomarcarea unui indicator (serul antiglobulinic), care reac!ioneaz" cu
complexul imun primar, dup" care se m"soar" radioactivitatea complexului format. RIA
combin" specificitatea imunologic" cu sensibilitatea radiochimiei.
Reac!iile se pot lucra fie n faza lichid", fie n faza solid", cnd unul din reactan!i este
fixat pe un suport solid inert (tuburi, discuri sau pl"ci din polistiren).
RIA se folose#te pentru detectarea enterotoxinei stafilococice, a toxinei botulinice tip
A, pentru eviden!ierea polizaharidului capsular la pneumococi, a P. aeruginosa n
infec!ii urinare, etc.
n infec!iile virale : diagnosticul gripei, a infec!iilor herpetice, sau cu poxvirusuri #i
n deosebi n diagnosticul hepatitelor cu virus B.
Teste imunenzimatice
Antigenul sau anticorpul se cupleaz" cu enzime cu o mare activitate: peroxidaza din
hrean (frecvent folosit"), fosfataza alcalin", etc., rezultnd complexe care re!in att activitatea
imunologic", ct #i cea enzimatic". Complexul imun va fi detectat prin aprecierea activit"!ii
enzimei fa!" de un substrat specific.
Se cunosc diverse tehnici, n diagnosticul bolilor infec!ioase aplicndu-se preferen!ial
ELISA (enzyme-linked-immunosorbant-assay) cu diferite variante.
a) tehnica indirect", des folosit" pentru detectarea anticorpilor, executat" pe un suport
solid inert de obicei tuburi sau pl"ci din polistiren.
- antigenul cunoscut este adsorbit pe suport. Dup" incubare antigenul nelegat
e ndep"rtat prin sp"lare.
45
- ad"ugarea serului de cercetat ,incubare, sp"lare.
- ad"ugarea serului antiglobulin", marcat enzimatic, incubare, sp"lare.
- ad"ugarea substratului pentru enzim".
Reac!ia se cite#te dup" apari!ia reac!iei de culoare ce poate fi m"surat"
spectrofotometric, sau citit" cu ochiul liber.
b) tehnica sandwich pentru detectarea antigenelor, se practic" tot pe suport solid:
- anticorpii cunoscu!i se adsorb pe un suport, incubare, sp"lare;
- ad"ugarea probei cu antigen de cercetat, incubare, sp"lare;
- ad"ugarea anticorpilor specifici marca!i, incubare, sp"lare;
- ad"ugarea substratului pentru enzim".
Citirea reac!iei de culoare ce apare se face cu ochiul liber, sau spectrofotometric.

Tehnica ELISA este folosit" pentru:
- detect"ri de antigene, bacteriene, sau virale (toxina difteric", toxinele E.coli,
toxinele stafilococice, brucelle, yersinii, treponeme, rickettsii,
herpesvirusuri, virusuri hepatice, etc),
- mai ales pentru detect"ri de anticorpi antibacterieni (n salmoneloze,
bruceloza, rickettsioze, etc.) sau antivirali (n hepatitele B, C, #i n infec!ia
cu virusul HIV).



Principiul reac!iei de aglutinare pe lam" Reac!ie de aglutinare pe lam" - pozitiv"



46

















Principiul reac!iei de fixare a complementului




Testul Elek

47


Reac!ia de imunelectroforez"


Reac!ia de contraimunelectroforez"


48

Principiul reac!iei de imunofluorescen!"
Reac!ia direct" Reac!ia indirect"





Tehnica ELISA
ELISA indirect" ELISA sandwich





Imagini de imunofluorescen!"


Candida Chlamydia trachomatis


49






Boala Lyme Treponema








NOTE PERSONALE















50
























LUCRAREA NUM#RUL 7. SCHEMA DIAGNOSTICULUI ETIOLOGIC
N INFEC$IILE BACTERIENE. RECOLTAREA PROBELOR
PATOLOGICE



Schema diagnosticului de laborator in infectiile bacteriene

I. Diagnosticul direct (bacteriologic)

1. Recoltarea probelor patologice

2. Examenul microscopic direct
- preparat nativ
- frotiu

3. Izolarea pe medii de cultura
51

4. Identificarea :

a. Cercetarea propriet"!ilor morfotinctoriale (preparate microscopice)
b. Cercetarea caracterelor de cultur" (n medii lichide #i pe medii
solide)
c. Cercetarea propriet"!ilor biochimice
d. Cercetarea propriet"!ilor antigenice
e. Cercetarea propriet"!ilor de patogenitate
f. Lizotipia fagic" n cazul n care este necesar"

5. Antibiograma

II. Diagnosticul indirect
- serologic
- biologic






Recoltarea probelor patologice

Probele patologice pot fi produse biologice prezente n mod normal n organism #i care
prezint" modific"ri n cursul mboln"virilor (snge, lcr, urin", materii fecale) sau produse ce
apar numai n cursul mboln"virilor (puroi, lichid pleural, sput", lichid articular).
Se mai pot recolta: apa potabil", apa de canal, ap" de mb"iere, alimente, tampoane de
nc"rc"tur" bacterian" de pe suprafe!e, aeromicroflor".

Reguli de baz" pentru recoltarea probelor patologice:
- prelevarea probei se face steril,
- se va evita contaminarea probelor patologice cu agen!i infec!io#i din mediul extern,
- pentru recoltarea probelor patologice trebuie cunoscut:
1. De unde se pot recolta probele patologice. Selectarea probei se face n raport cu
patogenia infec!iei (poarta de intrare, c"ile de dieminare, c"ile de eliminare).
2. Cnd este momentul potrivit pentru recoltare, n raport cu evolu!ia bolii. Se va
recolta naintea tratamentului chimioterapic.
3. Cum trebuie recoltat, adic" care este tehnica corect" pentru prelevare.
4. Ct trebuie recoltat, deci care este cantitatea minim" necesar" pentru a putea face
diagnosticul de laborator.
Conservarea prelevatelor:
52
- se prefer" ns"mn!area pe medii de cultur" ct mai repede posibil,
- dac" condi!iile nu permit ns"mn!area:
! se utilizeaz" medii de conservare #i transport
! se va respecta temperatura de conservare
! 4 C, aceast" temperatur" nu permite multiplicarea bacteriilor - pentru
urina, materii fecale, sputa, puroi
! 37 C- pentru unele bacterii (Neisseria meningithidis)- LCR, snge
Etichetarea probei este obligatorie. Se vor men!iona:

numele, prenumele, vrsta, sexul,

natura prelevatului, data #i ora recolt"rii,

tipul de analiz" cerut (bacteriologic, virusologic, biochimic, parazitologic),

diagnosticul clinic de prezum!ie,

numele si prenumele medicului care solicit" analiza respectiv".

Recoltarea probelor patologice din tractul respirator

Secre!iile respiratorii vor fi recoltate n raport cu localizarea infec!iei.
1. Secre!ia faringian" : se recolteaz" cu ajutorul tamponului faringian, diminea!a
nainte de toaleta cavit"!ii bucale, cu ajutorul tamponului faringian.
Indica!ii: faringite, angine, scarlatin", difterie.
2. Secre!ia nazal" se recolteaz" cu tamponul; se indic" n rinite #i sinuzite.
3. Secre!ia conjunctival" se recolteaz" cu tamponul; se indic" n conjunctivite.
4. Secre!ia otic" se recolteaz" cu tamponul; se indic" n cursul otitelor.
5. Secre!iile traheobron#ice se recolteaz" prin aspirare; se indic" n infec!iile tracului
respirator inferior.
6. Sputa se recolteaz" n: bron#ite, bronhopenumonii, suspiciunea de tuberculoz". Se
procedeaz" la recoltarea matinal" dup" cl"tirea cavit"!ii bucale cu ser fiziologic
steril.

Recoltarea probelor patologice de la nivelul tractului digestiv

1. Lichidul de v"rs"tur" se recolteaz" n cursul gastroenteritelor, toxiinfec!iilor
alimentare.
2. Materiile fecale pot fi recoltate pentru examenul bacteriologic (coprocultur"),
parazitologic (coproparazitologic), virusologic, biochimic.
Pentru coprocultur" se recolteaz" materiile fecale din scaunul de emisie spontan", cu ajutorul
coprocoltorului sau direct din rect cu ajutorul sondei Nelaton.
Indica!iile coproculturii vizeaz" dizenteria, holera, salmonelozele #i diferite alte
gastroenterite.
3. Bila se recolteaz" pentru bilicultur", dar #i pentru examin"ri biochimice #i
parazitologice. Pentru recoltare se folose#te sonda Einhorn. Bilicultura este
indicat" n cursul colecistopatiilor.

53
Recoltarea probelor patologice de la nivelul tractului urogenital

1. Urina se recolteaz" prin metoda jetului ntrerupt (dup" toaleta local" #i eliminarea
primei por!iuni), ntr-un recipient steril.
Indica!ii: cistite, cistopielite, leptospiroze, suspiciune de TBC urogenital", n prima
s"pt"mn" de evolu!ie a febrei tifoide.
2. Secre!ia uretral" se recolteaz" de la b"rba!i n cursul uretritelor.
3. Secre!ia vaginal" se recolteaz" pe masa ginecologic", cu ajutorul tampoanelor, n
cursul colpitelor #i cervicitelor.

Recoltarea sngelui

Necesit" utilizarea sistemelor de unic" folosin!" #i se indic" n: scop bacteriologic-
hemocultur", pentru examen serologic, pentru examen virusologic, pentru examin"ri
parazitologice.

Recoltarea lichidului cefalorahidian

Recoltarea se face prin punc!ie lombar" (ns"mn!ndu-se ct mai repede posibil pe
medii prenc"lzite la 37C sau dac" ns"mn!area imediat" nu este posibil" se va asigura
men!inerea temperaturii de 37C pn" n momentul inocul"rii pe medii).
Indica!ii: meningite

Recoltarea exudatelor din seroase

Lichidul pleural, peritoneal, sinovial, se recolteaz" n cursul pleureziilor,
peritonitelor, sinovitelor, prin punc!ionarea p"r!ii declive a regiunii.

Recoltarea puroiului

Se face fie prin punc!ie utiliznd fie o sering" cu ac gros (din infec!ii profunde), fie
cu ajutorul pipetei Pasteur din infec!ii superficiale.

Recoltarea fragmentelor de "esuturi

Se realizeaz" prin biopsie, indicndu-se examinare bacteriologic" #i histologic".

Recoltarea produselor de necropsie

Se face ct mai rapid dup" deces. Pentru fiecare produs se folose#te un alt set de
instrumente #i un alt set de instrumente steril.

ns!mn"area probelor patologice
54

Izolarea agentului patogen este esen!ial" pentru stabilirea diagnosticului.
Pentru izolarea bacteriilor din probele patologice se ns"mn!eaz" pe medii de cultur"
sau n medii de cultur" (lichide sau semisolide).
Tehnicile folosite sunt urm"toarele:
1. epuizarea inoculului pe suprafa!a mediului de cultur" din placa Petri este
metode de elec!ie pentru ob!inerea coloniilor izolate. Inoculul se depune pe un
sector limitat al pl"cii cu ajutorul ansei bacteriologice sau cu ajutorul
tamponului. Ansa bacteriologic" sterilizat" #i r"cit" permite dispersarea
inoculului pe un alt sector al mediului, prin trasarea a 4-5 striuri paralele ntre
ele. Dup" sterilizarea ansei pornind de la striurile anterioare #i perpendicular
pe ele vor fi trasate alte cteva striuri paralele. Opera!ia va fi repetat" pn" la
epuizarea suprafe!ei mediului.
2. ns"mn!area n profunzimea mediilor solide se realizeaz" prin n!eparea cu
ansa bacteriologic" dreapt".
3. ns"mn!area n medii lichide se poate face cu ajutorul ansei bacteriologice
sau a pipetei Pasteur.
4. ns"mn!area n pnz" se poate face cu ajutorul tamponului sau a ansei
Drigalski #i este util" pentru realizarea antibiogramelor, dar #i pentru lizotipia
fagic".









ns"mn!area n medii lichide cu ajutorul pipetei Pasteur ns"mn!area n profunzimea mediilor
#i a ansei bacteriologice solide cu ajutorul ansei bacteriologice drepte
55



ns"mn!area pe suprafa!a mediilor solide din pl"ci Petri ns"mn!area n pnz" pe suprafa!a mediilor de
prin metoda epuiz"rii inoculului cultur" solide din pl"ci Petri











NOTE PERSONALE
56












































57

LUCRAREA NUM#RUL 8. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL
INFEC$IILOR PRODUSE DE BACILII GRAM POZITIVI

BACILI GRAM POZITIVI AEROBI NESPORULA$I

GENUL CORYNEBACTERIUM

Genul Corynebacterium reune#te un grup de bacterii care prezint" urm"toarele
caracteristici: sunt bacili Gram pozitivi, u#or ncurba!i, cu una sau ambele extremit"!i
m"ciucate, a#eza!i n palisade, imobili, nesporula!i, necapsula!i, aerobi, uneori microaerofili
sau facultativ anaerobi.
Corynebacterium diphteriae, agentul cauzal al difteriei, a fost acceptat ca #i specie tip,
nu numai datorit" importan!ei sale ca #i agent patogen ala difteriei, dar #i pentru
caracteristicile sale bine definite, care-i contureaz" biologia.
Difteria este o boal" infec!ioas" grav", care n forma ei tipic", se manifest" printr-o
leziune la poarta de intrare, cel mai frecvent la nivelul amigdalelor, unde produce un exsudat
fibrinos aderent, falsa membran!. Acesta se asociaz" cu fenomene toxice generale, datorate
difuz"rii n organism a unei toxine puternice pe care o produce bacilul. Producerea toxinei
este corelat" cu starea de conversie lizogen" (dac" bacilul difteric este lizogenizat cu
bacteriofagul tox).
Dac" bacteriofagul care infecteaz" celula bacterian" poart" gena tox+, fenomenul de
replicare al ADN-lui viral n interiorul bacteriei se nso!e#te de producerea unei proteine, care
se elibereaz" extracelular, #i care este toxina difteric".
Speciile genului Corynebacterium sunt :

Corynebacterium diphteriae cu tipurile: gravis, mittis, intermedius (agentul

etiologic al difteriei),

Corynebacterium hoffmani, Corynebacterium xerosis, difteromorfi, bacterii

comensale la nivelul mucoaselor #i tegumentelor.

Diagnosticul bacteriologic:
7.Recoltarea probelor patologice.
Se face cu ajutorul a trei tampoane (se recolteaz" exsudatul faringian).
2. Examenul microscopic direct
Din primul tampon faringian se fac dou" frotiuri, unul fiind colorat Gram, iar cel"lalt
n colora!ia special" Neisser. Frotiul colorat Gram eviden!iaz" bacili Gram pozitivi, a#eza!i n
palisade. Frotiul colorat Neisser serve#te la eviden!ierea corpusculilor metacromatici Babe#-
Ernst.
3.Izolarea
Produsul patologic se ns"mn!eaz" pe mediul Lffler, pe mediu cu telurit de potasiu
(Tinsdale) pe care bacilul difteric se dezvolt" sub form" de colonii mici, brune, nconjurate
de un halou negru. Pe mediul Lffler coloniile sunt de tip R cu contur neregulat #i au aspect
de floare de margaret" (pentru tipul gravis).
4. Identificarea
58
4.1. Caracterele morfotinctoriale : sunt reprezentative n frotiul efectuat de pe mediul
Lffler bacili Gram pozitivi, drep!i sau u#or ncurba!i, cu una sau ambele extremit"!i
m"ciucate. n colora!ia Neisser se eviden!iaz" corpusculii metacromatici Babe#-Ernst
(corpusculii se coloreaz" n albastru violet iar corpul bacterian n galben brun).
4.2. Caractere de cultur"
n medii lichide tipul gravis las" mediul limpede #i formeaz" pelicul", tipul mittis
tulbur" uniform mediul, iar tipul intermedius formeaz" un inel aderent #i sediment granular.
Pe mediul Gundel-Tietz : tipul gravis formeaz" colonii de 1-2 mm cu marginea
crenelat" cu suprafa!a neregulat" #i de consisten!" friabil", care dau aspectul de floare de
margaret";tipul mittis formeaz" colonii de m"rimi variabile cu suprafa!" convex" #i lucioas",
conturul regulat #i de consisten!" cremoas"; tipul intermedius formeaz" colonii de talie
variabil", ce prezint" o suprafa!" u#or acuminat", marginile circulare #i de consisten!"
semicremoas". Pe mediul Tinsdale, diftericii formeaz" colonii negre, nconjurate de un halou
brun, n timp ce pseudodiftericii formeaz" tot colonii negre dar f"r" halou.
4.3. Caractere biochimice
Sunt utile pentru diferen!ierea diftericului de pseudodifterici dar #i pentru
identificarea tipurilor de difterici (se urm"re#te fermentarea amidonului, glicogenului #i a
dextrinei).
Bacilul difteric (toate tipurile) produce hidrogen sulfurat #i nu scindeaz" ureea.
Pseudodiftericii scindeaz" ureea, n schimb nu produc hidrogen sulfurat.
4.4. Propriet"!i de patogenitate.
Factorul de patogenitate este reprezentat de toxina difteric", sintetizat" de c"tre
tulpinile lizogene. Toxina difteric" ac!ioneaz" prin blocarea sintezei proteice.
Testele de patogenitate pot fi realizate in vitro (testul Eleck), sau in vivo prin
inocularea la cobai. Inocularea la cobai se realizeaz" prin administrarea subcutanat" a unei
culturi de 48h de bacil difteric. Se folosesc animale protejate #i neprotejate. Cobaiul
neprotejat (prin ser antidifteric) moare n 1-4 zile de la inoculare prezentnd ca #i leziuni
caracteristice : edem gelatinos la locul inocul"rii, rev"rsate sanguinolente n seroase #i
congestia suprarenalelor (cu aspect de cirea#").
Inocularea toxinei la cobai a permis stabilirea unit"!ii de m"sur" in vivo pentru toxina
difteric", care este reprezentat" de doza limit" mortal" (DLM).Un DLM de toxin" difteric"
reprezint" acea cantitate de toxin" care omoar" un cobai n greutate de 250g n timp de 4 zile
cu leziunile caracteristice descrise anterior.
Diagnosticul indirect-
Serologic- se realizeaz" prin reac!ia de hemaglutinare pasiv"
Biologic- este utilizat pentru testarea st"rii de imunitate n colectivit"!i. Const" n IDR Shick:
se inoculeaz" intradermic toxina #i se cite#te reac!ia dup" 24 de ore. Apari!ia unui eritem la
locul inocul"rii este o reac!ie pozitiv" care dovede#te lipsa anticorpilor antitoxici #i deci
susceptibilitatea persoanei respective la infec!ie; aceste persoane se vaccineaz" cu anatoxin"
difteric". Lipsa eritemului (reac!ie negativ") este datorat" neutraliz"rii toxinei de c"tre
anticorpi specifici, fapt ce indic" prezen!a imunit"!ii.
Profilaxia n difterie se bazeaz" pe administrarea vaccinului antidifteric (anatoxina difteric"
n trivaccinul DTP, sau n bivaccinul DT).

59


BACILI GRAM POZITIVI AEROBI SPORULA$I

GENUL BACILLUS

Bacteriile din genul Bacillus sunt bacterii Gram pozitive, cu capetele t"iate drept,
dispuse n lan!uri, aerobe, n general mobile (Bacillus anthracis este ntotdeauna imobil),
sporulate (diametrul sporului, care are o localizare central", este mai mic dect diametrul
bacteriei, astfel c" celula bacterian" nu este deformat").
Genul cuprinde specii nepatogene (Bacillus subtilis, Bacillus stearotermophilus,
Bacillus polimixa, Bacillus megaterium ,etc) iar singura specie patogen" este Bacillus
anthracis.
To!i reprezentan!ii acestui gen sunt foarte r"spndi!i n natur" datorit" sporului care le
confer" rezisten!" n mediul exterior; sunt germeni telurici g"sindu-se n special n sol, dar
numeroase specii de Bacillus pot fi g"site n ap", aer sau pe materiale de origine animal" #i
vegetal".
Bacillus subtilis de regul" este o specie saprofit", ns" a fost izolat n cursul
conjunctivitelor, iridociclitelor, sinuzitelor cronice #i al infec!iilor urinare.
Bacillus cereus n cazul n care se nmul!e#te excesiv n alimente se poate constitui
n agent etiologic al unor toxiinfec!ii alimentare (fosfolipaza C hidrolizeaz" lecitina din
alimente #i produce fosforilcolin" activ"). Specia a mai fost izolat" n cursul bacteriemiilor cu
localiz"ri meningeale #i pulmonare.
Bacillus anthracis este agentul etiologic al antraxului- o antropozoonoz", care poate
mbr"ca diferite forme clinice:
- antrax cutanat se poate prezenta ca #i :
o
pustula malign" (96% din cazuri), cu localizare predilect" la nivelul fe!ei #i a
membrelor; la locul de inoculare apare o vezicul" cu con!inut serosanguinolent,
urmat" de o ulcera!ie mic" care se usuc" #i d" na#tere unei cruste de culoare neagr",
de unde #i denumirea de c"rbune cutanat. Regiunea subiacent" leziunii prezint" un
edem gelatinos, nedureros.
o
edemul malign este forma cea mai grav" de manifestare a c"rbunelui cutanat #i se
caracterizeaz" printr-un edem extins, febr" ridicat" #i stare toxic".
- antrax visceral
o
forma pulmonar", datorat" inhal"rii sporilor, apare la persoane ce se ocup" cu
prelucrarea pieilor #i evolueaz" ca o bronhopneumonie cu sput" sanguinolent".
o
forma gastro-intestinal" este datorat" ingestiei de carene sau de alte produse
contaminate cu Bacillus anthracis.
o
meningita c"rbunoas", de#i este rar", conduce la o mortalitate de practic 100%.
Diagnosticul este bacteriologic
1. Recoltarea: n formele cutanate se recolteaz" serozitate din vezicule; n infec!ia
pulmonar" se recolteaz" sput"; n infec!iile digestive se recolteaz" materii fecale #i n
meningit"- LCR. De la animalele moarte, suspecte de infec!ie c"rbunoas", se recolteaz"
!esuturi.
60
2. Examenul microscopic direct: eviden!iaz" bacili Gram pozitivi, mari, capsula!i,
izola!i sau dispu#i sub form" de lan!uri scurte.
3. Izolarea. Bacteria este pu!in preten!ioas", dezvoltndu-se u#or pe medii uzuale.
Probele patologice se ns"mn!eaz" pe geloz" nutritiv" #i geloz" snge pe care Bacillus
anthracis se dezvolt" sub form" de colonii rugoase (de tip R) cu margini neregulate, care au
aspect de cap de meduz" sau coam" de leu (pe mediile cu snge coloniile sunt nehemolitice).
4. Identificarea:
4.1. Propriet"!i morfotinctoriale: n frotiu colorat Gram se eviden!iaz" bacili Gram pozitivi cu
capetele t"iate drept, prezentnd aspectul be!elor de bambus. Dispozi!ia sporului este
central", iar diametrul mai mic dect al celulei vegetative face ca aceasta s" nu fie deformat".
n frotiul colorat cu safranin" #i verde malahit se pot pune n eviden!" sporangiile
(formele vegetative) colorate n ro#u precum #i sporii colora!i n verde.
4.2. Caractere de cultur" cre#te bine pe medii uzuale n condi!ii de aerobioz".
o
agar nutritiv colonii mari, alb-cenu#ii, cu suprafa!" rugoas", margini neregulate #i
prezentnd prelungiri laterale ca ni#te #uvi!e de p"r care confer" coloniilor un aspect
caracteristic; sunt coloniile de tip R; n culturile atenuate la 42,5C pot s" apar"
colonii de tip S (tulpini atenuate).
o
agar snge acela#i aspect al coloniilor, nehemolitice.
o
bulion nutritiv tulpinile de tip R las" mediul de cultur" limpede #i formeaz" un
depozit floconos
4.3. Caractere biochimice zaharolitic, slab proteolitic, lichefiaz" gelatina.
4.4. Propriet"!i antigenice prezint" un antigen capsular de natur" polipeptidic" #i dou"
antigene de perete celular, unul de natur" polipeptidic" #i cel"lalt de natur" polizaharidic".
4.5. Caractere de patogenitate
Toxina este format" din antigenul protectiv (PA) #i din : fie factorul letal (LF) fie
factorul edema!iant (EF); antigenul protectiv se leag" de receptori #i transloc" n citosol LF
sau EF.
In vitro demonstrarea patogenit"!ii unei su#e de Bacillus anthracis se poate realiza prin
teste imunocromatografice.
Inocularea subcutanat" la #oarece determin" septicemie mortal" n 24-48 h, iar la
necropsie se constat" prezen!a unui edem gelatinos la locul inocul"rii precum #i congestia
organelor interne. Splina este hipertrofic", iar amprentele din splin" n colora!ia Gram pun n
eviden!" bacili Gram pozitivi capsula!i
5. Profilaxia folose#te vaccinarea antic"rbunoas" cu vaccinul de tip rPA (un recombinant
al antigenului protectiv) exprimat ntr-o su#" de Bacillus subtilis WB600.
6. Tratamentul chimioterapic folose#te betalactamine #i quinolone.

BACILI GRAM POZITIVI ANAEROBI SPORULA&I (I ALTE BACTERII
ANAEROBE

Bacteriile anaerobe apar!in la numeroase familii #i genuri. Anaerobii nesporula!i
domin" speciile aerobe la nivelul c"ilor aeriene #i digestive superioare, a colonului, vaginului
#i a unit"!ilor pilosebacee. Anaerobii nesporula!i sunt att coci ct #i bacili, Gram pozitivi #i
Gram negativi:
61
- bacili Gram pozitivi nesporula!i din genurile Actinomyces, Bifidobacterium,
Eubacterium, Propionibacterium,
- bacili Gram negativi nesporula!i din genurile Bacteroides, Megamonas,
Porphyromonas, Prevotella, Tissierella, Fusobacterium, Leptitrichia,
- coci Gram pozitivi nesporula!i din genurile Peptococcus, Peptostreptococcus,
Ruminococcus, Coprococcus, Sarcina,
- coci gram negativi nesporula!i din genurile Veillonella, Acidaminococcus,
Megasphaera.
Astfel de anaerobi nesporula!i sunt implica!i n general n producerea infec!iilor de
vecin"tate (corelate cu localizarea acestora la nivelul diferitelor cavit"!i ale organismului).

BACILI GRAM POZITIVI ANAEROBI SPORULA$I

GENUL CLOSTRIDIUM

Bacteriile din genul Clostridium sunt bacili Gram pozitivi, sporula!i avnd spori ovali
sau sferici, terminali sau subterminali, care deformeaz" bacteria; sunt anaerobi stric!i, mobili
sau imobili.
Bacteriile strict anaerobe sunt bacterii sensibile la ac!iunea oxigenului, acesta fiind
toxic pentru ele. n genul Clostridium sunt clasificate specii patogene care sintetizeaz"
exotoxine care reprezint" principalii factori de patogenitate: Clostridium tetani, Clostridium
botulinum #i Clostridiile gangrenei gazoase: Clostridium perfringens, Clostridium
sporogenes, Clostridium novy (oedematiens), Clostridium hystoliticum #i Clostridium
septicum.

Clostridium tetani
Clostridium tetani este un bacil Gram pozitiv, sporulat, cu sporul dispus terminal,
ceea ce-i confer" un aspect de b"! de chibrit. Exist" mai multe tipuri antigenice, ns" toate
sintetizeaz" acela#i tip de toxin". Ac!iunea toxinei tetanice se manifest" la nivelul sistemului
nervos central, unde blocheaz" sinapsele inhibitorii #i determin" contractura muscular"
(tetanosul complet).
Bacilii r"mn cantona!i la poarta de intrare, reprezentat" prin plaga mpuns",
sintetizeaz" #i elibereaz" exotoxina, care difuzeaz" n organism. La 3-10 zile de la
p"trunderea n organism a bacililor, se declan#eaz" sindromul tetanic. Debutul se face prin
trismus (contractura mu#chilor maseteri), apoi apar contrac!iile musculare tonico-clonice, iar
n final se instaleaz" tetanosul complet. Decesul se datore#te spasmului laringian care duce la
asfixie.
Profilaxia tetanosului se face prin vaccinare cu anatoxin" tetanic" (trivaccinul DTP
sau divaccinul DT, intr" n schema de vaccin"ri obligatorii). n prezen!a pl"gilor cu poten!ial
tetanigen se procedeaz" la toaleta chirurgical" #i la rapel cu ATPA (anatoxina tetanic"
purificat" #i adsorbit").
Pentru diagnosticul de laborator se recolteaz" puroi din plag", care se ns"mn!eaz"
pe medii pentru anaerobi (agar snge n tehnica Ott). Frotiul colorat Gram eviden!iaz" bacili
Gram pozitivi cu sporul dispus terminal. Formeaz" colonii g"lbui-cenu#ii care au tendin!a de
62
confluare dac" concentra!ia de agar a mediului este mai mic" de 4%. n mediile lichide
formeaz" sediment (datorat sporilor), iar culturile degaj" un miros caracteristic de corn ars.
Este hemolitic #i slab proteolitic #i zaharolitic.
Antibiograma, efectuat" prin metoda difuzimetric" n dublu strat de agar, finalizeaz"
diagnosticul.

Clostridium botulinum
Clostridium botulinum este un bacil Gram pozitiv mobil datorit" cililor peritrichi, cu
sporul dispus subterminal.
Este o bacterie r"spndit" n solul tuturor regiunilor geografice. Are mai multe tipuri
antigenice, fiecare dintre tipurile antigenice sintetiznd #i elibernd o toxin" proprie. Tipurile
antigenice A, B, E #i F produc botulismul la om. Toxina botulinic" are neurotropism, iar
mecanismul s"u de ac!iune const" n blocarea transmiterii nervoase, prin inhibarea secre!iei
de acetilcolin".
Botulismul se datore#te ingestiei de alimente conservate care au fost contaminate cu
spori de Clostridium botulinum. n condi!iile de anaerobioz" oferite de conserv", sporii
germineaz", iar formele vegetative se multiplic", secretnd #i elibernd exotoxina care se
acumuleaz" n alimentul conservat. Datorit" produc!iei abundente de gaze, astfel de conserve
sunt puternic bombate. Ingestia accidental" a unui astfel de aliment conduce la consumul
unei cantit"!i de toxin" preformat" #i de bacili care ajun#i n tubul digestiv vor continua s"
elibereze toxina. n cteva ore apar primele manifest"ri ale botulismului, cu tulbur"ri de
vedere, datorate paraliziei mu#chilor globilor oculari. Se instaleaz" tulbur"ri de degluti!ie.
De#i botulismul este o toxiinfec!ie alimentar", manifest"rile digestive sunt minore sau
absente. n lipsa serului antibotulinic specific de tip antigenic se ajunge la exitus n 24-36
ore, prin paralizia centrilor bulbari.
Clostridium botulinum se prezint" ca #i bacili Gram pozitivi cu spori dispu#i
subterminal. Pe mediile solide (pentru anaerobi) formeaz" colonii neregulate cu suprafa!a
granular" #i cu o margine n extensie continu". Exercit" hemoliz" pe mediile cu snge. De
regul", ns" diagnosticul intoxica!iei botulinice se face prin eviden!ierea toxinei #i
determinarea tipului acesteia. Toxina se caut" n lichidul de sp"l"tur" gastric" sau de
v"rs"tur", n con!inutul intestinal sau n lichidul din conserva incriminat". Pentru aceasta se
procedeaz" la o reac!ie de neutralizare in vivo, prin inocularea la #oareci de laborator. Se
folosesc 10 #oareci, din care 2 r"mn ca #i martori #i nu se protejeaz" cu ser antibotulinic.
Ceilal!i vor forma 4 perechi, fiecare dintre aceste perechi urmnd a se proteja cu un alt ser
antibotulinic specific de tip ( A, B, E #i F). Fiecare animal se inoculeaz" cu filtratul
alimentului incriminat. Animalele protejate prin serul antibotulinic specific de tip antigenic
supravie!uiesc, n timp ce celelalte animale, inclusiv martorii, mor. Dac" mor toate animalele
se poate exclude botulismul.

Clostridiile gangrenei gazoase
Gangrena gazoas" apare ca o complica!ie a pl"gilor contaminate cu p"mnt unde se
realizeaz" condi!ii de anaerobioz" necesare germin"rii sporilor #i se caracterizeaz" prin
necroza #i putrefac!ia !esuturilor afectate, la aceste semne locale ad"ugndu-se #i semne
generale. Infec!ia este, de fapt, polimicrobian", la producerea ei participnd specii anaerobe,
63
aerob-anaerob facultative #i chiar aerobe. Bacteria prezent" ntotdeauna este Clostridium
perfringens, dar genul Clostridium cuprinde #i alte specii carepot s" se asocieze cu specia
amintit" n declan#area gangrenei gazoase: Clostridium septicum, Clostridium novy,
Clostridium sporogenes, Clostridium hystoliticum. Clostridium perfringens poate fi agentul
etiologic #i al unor toxiinfec!ii alimentare sau enterite necrozante.
Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic #i de urgen!".
Recoltarea intereseaz" exudatele din plag", fragmente de !esuturi necrozate, snge,
puroi.
Examenul microscopic direct din produsul patologic are o mare valoare diagnostic".
Pe frotiul colorat Gram se remarc" un polimorfism bacterian accentuat, eviden!iindu-se bacili
mari Gram pozitivi, izola!i, n perechi sau lan!uri scurte, cu spor central, subterminal sau f"r"
spori (Clostridium perfringens sporuleaz" numai n culturi vechi), unii dintre ei capsula!i
(Clostridium perfringens).
Izolarea se face pe medii pentru anaerobi #i este necesar ca fiecare specie s" fie
izolat" n cultur" pur" pentru a se putea trece la etapa urm"toare. Pentru izolare se folosesc
medii pentru anaerobi (Nagler, Willis-Hobbs n tehnica Ott).
Identificarea necesit" parcurgerea tuturor etapelor (pe geloz" glucozat" cu g"lbenu#
de ou mediul Nagler, Clostridium perfringens produce reac!ia Nagler, datorit" alfatoxinei,
o lecitinaz", care difuzeaz" n jurul coloniilor #i descompune lecitino-vitelina din ou
producnd un precipitat care opacific" mediul). Unele specii sunt zaharolitice (Clostridium
perfringens, Clostridium novy, Clostridium sporogenes), n timp ce altele sunt proteolitice
(Clostridium hystoliticum, Clostridium septicum).
Antibiograma se execut" prin tehnica difuzimetric" n condi!ii de anaerobioz" (n
dublu strat).
Tratamentul gangrenei gazoase trebuie instituit de urgen!" #i const" n administrarea
de ser antigangrenos polivalent, antibiotice #i desigur, ngrijirea chirurgical" a pl"gii
(eliminarea !esuturilor necrozate, drenarea colec!iilor nchise etc).

NOTE PERSONALE















64












LUCRAREA NUM#RUL 9. COCII

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFEC&IILOR PRODUSE DE COCII GRAM
POZITIVI

GENUL STAPHYLOCOCCUS

Genul Staphylococcus apar!ine familiei Staphylococcaceae.
Stafilococii sunt coci Gram pozitivi, a#eza!i n ciorchine, imobili #i nesporula!i. Genul
Staphylococcus este compus din circa 38 de specii, dintre care 18 specii se izoleaz" de la om.
Stafilococii sunt agen!i etiologici n peste 80% din infec!iile supurative ntlnite n
practica medical". Manifest" afinitate pentru !esutul dermic #i pentru anexele pielii, fapt care
explic" de ce stafilococii provoac" mai ales infec!ii la nivelul tegumentelor #i anexelor pielii,
ns" ei pot invada practic orice !esut sau organ.
Principalele specii ale genului sunt Staphylococcus aureus, S. epidermidis #i S.
saprophiticus.
n specia Staphylococcus aureus sunt clasifica!i stafilococii coagulazo-pozitivi, frecvent
hemolitici, care determin" majoritatea infec!iilor stafilococice umane.
Num"rul #i virulen!a stafilococilor, care constituie inoculul bacterian p"truns n !esuturi
#i capacitatea intact" a mecanismelor de ap"rare ale gazdei invadate, sunt factorii care
determin" evolu!ia procesului infec!ios incipient. Dac" inoculul este moderat cantitativ #i
calitativ, atunci mecanismele de ap"rare reu#esc s" elimine n cteva zile inoculul, iar !esutul
#i va restabili func!iile fiziologice. Orice condi!ie patologic", care modific" echilibrul
natural, se constituie n cauz" favorizant" a unei infec!ii stafilococice.
Localiz"rile #i manifest"rile infec!iei stafilococice:
1. Tegumente #i !esut celular subcutanat: foliculite, furuncule, hidrosadenite, abcese,
flegmoane.
2. &esut osos #i articular: osteomielite #i artrite.
3. Rinofaringe #i cavit"!i pneumatice adiacente: faringite, angine, sinuzite, otite supurate,
mastoidite.
4. Tub digestiv: enterocolita infantil" #i toxiinfec!ii alimentare.
5. Aparat genital: mastite, metrite, anexite, septicemii postabortum.
65
6. Aparat urinar: prostatite, cistite, pielonefrite, abcese renale.
7. Aparat cardiovascular: flebite, pericardite, endocardite.
8. Sistem nervos central: meningite #i abcese cerebrale.
9. Fanere: panari!ii #i abcese.
10. Sindromul de #oc toxicoseptic (TSST), cauzat de o toxin" stafilococic" particular"
numit" Toxic Shock Syndrome Toxin.
De#i majoritatea localiz"rilor infec!iei stafilococice sunt reprezentate prin cazuri
individuale de boal", sunt #i situa!ii cnd infec!ia evolueaz" epidemic:
1. Infec!ia nosocomial" care este condi!ionat" de existen!a purt"torului de stafilococ
coagulozo-pozitiv (la nivelul rinofaringelui) ntr-o colectivitate de receptivi (mediu de
spital).
Infec!iile cu Staphylococcus aureus meticilino-rezistent, cu rezisten!" multipl" la
antibiotice (betalactamine, macrolide, aminoglicozide, cotrimoxazol), sunt greu de
controlat n condi!iile evolu!iei n mediul spitalicesc.
2. Toxiinfec!ia alimentar" ap"rut" n unit"!ile de alimenta!ie colectiv" cnd un aliment
contaminat cu o tulpin" enterotoxigen" este p"strat n condi!ii termice
necorespunz"toare. Stafilococii ncep s" se multiplice la temperatura de +5C,
sintetizeaz" #i elibereaz" enterotoxina, care se acumuleaz" n aliment #i care rezist" la
prelucr"rile termice culinare, f"r" a schimba ns" caracteristicile organoleptice ale
alimentului.
Toxiinfec!ia debuteaz" n 2-6 ore cu gre!uri, v"rs"turi, cefalee #i scaune diareice apoase.
Evolu!ia este de scurt" durat" (24-48 ore), restabilirea st"rii de s"n"tate f"cndu-se odat"
cu eliminarea enterotoxinei din organism.
Unii stafilococi coagulazonegativi se ncadreaz" n categoria oportuni#tilor. Acest
aspect s-a conturat n rela!ie direct" cu utilizarea pe scar" larg" a procedurilor medicale
invazive (sonde, catetere) #i a inser!iilor protetice (#unturi, valve cardiace, proteze vasculare
#i articulare). Staphylococcus epidermidis se constituie n cauz" major" de infec!ii
nosocomiale n sec!iile de nou-n"scu!i #i oncologie dar #i n serviciile cardiologice (infec!ii
de pace-maker, endocardita asociat" cu valve protetice). Staphylococcus saprophiticus
constituie un agent etiologic implicat n infec!ii urinare la femei tinere, iar la b"rba!i n
uretrite nespecifice #i prostatite.
Diagnosticul de laborator folose#te metodele diagnosticului direct bacteriologic.
Recoltarea probelor patologice se face n func!ie de localizarea infec!iei.
Examenul direct din produsul patologic are valoare orientativ" n anumite situa!ii #i
poate eviden!ia n colora!ia Gram coci Gram pozitivi, a#eza!i mai frecvent izolat #i mai rar
sub aspectul caracteristic n ciorchine (este util" din puroi, urin", lcr, snge).
Izolarea: se efectueaz" pe geloz"-snge iar n cazul probelor patologice
polimicrobiene sau pentru alimente se utilizeaz" mediul Chapman (mediu hiperclorurat cu
manitol).
Identificarea :
! propriet!"i morfotinctoriale: n frotiul colorat Gram se pun n eviden!" coci
Gram pozitivi a#eza!i n ciorchine.
! propriet!"i de cultur!: pe mediul Chapman, S. aureus degradeaz" manitolul #i
provoac" virarea culorii mediului din roz-ro#u n galben; pe geloz" snge S.
66
aureus se dezvolt" sub form" de colonii S nconjurate de un halou de liz" )
(incomplet"), de tip cald sau * (dublu conturat" la temperatura laboratorului
ap"rnd un al doilea halou de liz" cu clarificarea total" a mediului)de tip cald-
rece; pe geloz" nutritiv" se pot observa colonii de tip S, frecvent pigmentate n
galben-auriu.
! propriet!"i biochimice: stafilococii produc catalaz", degradeaz" glucoza pe
cale oxidativ" #i fermentativ"; Staphylococcus aureus degradeaz" manitolul pe
mediul Chapman, n timp ce S. epidermidis nu utilizeaz" substratul amintit.
! propriet!"i antigenice: antigene polizaharidice #i polipeptidice (proteina A cu
ac!iune anticomplementar", antifagocitar" #i alergizant").
! propriet!"ile de patogenitate ale S. aureus se bazeaz" pe capacitatea acestora de a
elibera enzime #i toxine, a c"ror activitate poate fi eviden!iat" prin teste de patogenitate
in vivo sau in vitro.
Determinan!ii de patogenitate sunt enzime extracelulare #i toxine stafilococice.
1. Enzime extracelulare:
- hialuronidaza descompune acidul hialuronic din !esuturi #i favorizeaz"
extinderea stafilococilor n !esuturile nvecinate.
- coagulaza, principalul factor de patogenitate la S. aureus, determin" formarea
din plasm" a unui coagul mpiedicnd ac!iunea n focarul infec!ios a factorilor
de ap"rare; la S. aureus este prezent" coagulaza liber" eviden!iabil" prin reac!ia
n tuburi #i coagulaza legat" eviden!iabil" prin reac!ia pe lam".
- fibrinolizina sau stafilochinaza lizeaz" re!eaua de fibrin", permi!nd progresia
stafilococilor n !esuturile nvecinate; se poate pune n eviden!" folosind un
mediu de cultur" preparat cu plasm" uman" oxalatat" (mediul opac se va
clarifica n jurul coloniei.
- lipazele active pe lipide plasmatice #i tegumentare sunt esen!iale pentru
metabolismul stafilococilor, explicnd colonizarea predilect" a tegumentelor,
unde glandele sebacee sunt mai bine reprezentate.
- nucleazele scindeaz" acizii nucleici.
2. Toxine stafilococice:
- hemolizinele cu ac!iune hemolitic" #i dermonecrotic" se pun n eviden!" n culturi
pe medii cu snge.
- leucocidinele cu ac!iune exclusiv" #i selectiv" asupra neutrofilelor.
- enterotoxinele, elaborate n mai multe variante antigenice, sunt identificabile prin
reac!ie de imunodifuzie n gel (A #i D implicate n toxiinfec!iile alimentare, B
incriminat" n enterocolite postantibiotice).
- toxina epidermolitic" #i exfoliativ" este produs" de stafilococi apar!innd grupului
2 fagic #i ac!ioneaz" prin distrugerea cementului intercelular, aflux lichidian #i
ruperea desmozomilor cu desprinderea straturilor superficiale ale epidermului.
! lizogenie 'i lizotipie fagic!. Susceptibilitatea tulpinilor de stafilococ la ac!iunea litic" a
bacteriofagilor este important" pentru caracterizarea anumitor particularit"!i ale
diferitelor su#e (bacteriile din grupul 2 fagic au afinitate pentru !esutul dermic, cele din
grupul 3 fagic sunt penicilino #i meticilino rezistente, etc.). Lizotipia fagic" se urm"re#te
67
pe agar nutritiv pe care s-a ns"mn!at n pnz" tulpina de identificat, care a fost apoi
supus" ac!iunii diferi!ilor fagi.
Antibiograma finalizeaz" diagnosticul #i este esen!ial" pentru conturarea unei
scheme terapeutice eficiente. Administrarea la ntmplare a antibioticelor poate conduce la
selectarea unor tulpini multirezistente.
n cazul infec!iilor tegumentare recidivante se poate indica prepararea #i
administrarea autovaccinului.

GENUL STREPTOCOCCUS

Genul Streptococcus cuprinde coci Gram pozitivi grupa!i n perechi sau lan!uri de
dimensiuni variabile, catalazo-negativi, imobili, nesporula!i. Streptococii sunt prezen!i n ap",
aer, sol sau ca #i comensali la nivelul tegumentelor sau mucoaselor la om #i la animale.
Clasificarea streptococilor se poate face dup" mai multe criterii, cele mai importante
fiind: producerea sau nu a hemolizei pe geloz" snge #i structura antigenic" determinat" de
antigenele din peretele bacterian.
% dup" aspectul hemolizei pe geloz"-snge, se disting:
- streptococi ) hemolitici , pe geloza snge n jurul coloniilor apare un halou
ngust de hemoliz" incomplet", cu nverzirea mediului #i a coloniilor; acest
aspect fiind datorat unui reductant al hemoglobinei. Streptococi ) hemolitici
sunt streptococii viridans (comensali la nivelul faringelui) #i pneumococii
(Streptococcus pneumoniae).
- streptococi )
'
hemolitici, care pe geloza snge exercit" o hemoliz" clar", ns" la
examinarea microscopic" a zonei de hemoliz" pot fi puse n eviden!" #i hematii
intacte (aspect ntlnit la streptococii de grup B).
- streptococi * hemolitici, pe geloza snge coloniile sunt nconjurate de o zon" de
hemoliz" total", clar", aspect caracteristic pentru streptococii de grup A #i G.
- streptococi + hemolitici, care nu exercit" hemoliz" pe geloza snge
(Streptococcus faecium, Streptococcus fecalis).
% dup! propriet!"ile antigenice (criteriul Lancefield) streptococii pot fi
clasifica!i n grupe antigenice, notate prin litere majuscule de la A la W (cu excep!ia literelor I
#i J). Sunt cunoscu!i #i streptococi care nu prezint" antigenul de grup #i care nu pot fi grupa!i
dup" acest criteriu. Acest criteriu are la baz" antigenele polizaharidice din peretele celular.
Reprezentan!ii grupei A pot fi la rndul lor mp"r!i!i n peste 60 de tipuri antigenice, pe baza
proteinei M, care con!ine 2 determinan!i, unul cu specificitate de tip (se contureaz" tipurile
antigenice), iar cel"lalt nontip specific, strns asociat proteinei M, #i denumit MAP. Acest
determinant este r"spunz"tor de reac!iile imunologice cu !esuturile gazdei.
Infec"ii streptococice
! Infec!ii cu streptococi de grup A (Streptococcus pyogenes):

infec!ii acute: respiratorii #i cutanate.

o
infec!iile respiratorii: acute neeruptive = faringita #i anginele
acute eruptive = scarlatina
o
infec!ii cutanate: intertrigo (infec!ia unui pliu), impetigo (dermatit"
buloas"), ectima (un impetigo al adultului cu localizare la membrele
68
inferioare), erizipelul (o dermo-hipodermit" acut" localizat" mai frecvent"
la membrele inferioare #i caracterizat" prin febr"-39C, frison, placarde
cutanate eritematoase #i adenopatie regional").

complica!ii precoce supurative:

o
dup" infec!ii respiratorii pot s" apar" limfadenita cervical", pleurezii,
pneumonii, mastoidite, otite, sinuzite.
o
dup" infec!ii cutanate celulite, miozite, fasceite necrozante (sindromul
Meleney).

complica!ii tardive nesupurative:

o
dup" infec!ii respiratorii: cardita reumatismal", reumatismul articular acut,
purpura reumatoid", eritem nodos, coreea Sydenham.
! Infec!ii cu streptococi de grup B (Streptococcus agalactiae):

infec!ii neonatale, la nou-n"scu!ii din mame infectate sau urmare a contamin"rii

nosocomiale.

bacteriemii urmare a endometritei sau a supura!iei pl"gii cezariene.

pneumonii, endocardite, artrite, celulite la indivizii imunosupresa!i.

septicemia se asociaz" frecvent cu avortul septic.

alte infec!ii: otite, traheobron#ite, infec!ii urinare, etc.

! Infec!ii cu streptococi de grup D (Streptococcus faecalis) #i cu Enterococcus:

infec!ii urinare, genitale #i perineale, endocardite, supura!ii ale pl"gilor chirurgicale,

otite #i sinuzite, apendicite #i peritonite, infec!ii biliare.
! Infec!ii cu streptococi de grup C #i G (comensali ai faringelui):

infec!ii ale tractului respirator superior, infec!ii cutanate, infec!ii genitale, artrite
purulente, meningite.
! Infec!ii cu Streptococcus pneumoniae:

pneumonia lobar" acut",

alte infec!ii: meningite purulente, bron#ite, pleurezie, pericardite, sinovite, faringite,

infec!ii oculare, artrite, endocardite, peritonite.
! Infec!ii cu streptococi orali:
endocardite, pneumopatii, valvulopatii (specificul infec!iilor orale este tratat separat
la capitolul Microbiologia cavit"!ii orale).
Diagnosticul de laborator al infec"iilor streptococice

Diagnosticul bacteriologic:
Recoltarea probelor patologice se face n func!ie de localizarea infec!iei.
Examenul microscopic direct se face n frotiul colorat Gram. Uneori nu are utilitate,
alteori poate da informa!ii orientative, n timp ce n unele situa!ii poate avea o mare valoare
diagnostic" (de exemplu n cursul unei pneumonii, un frotiu din sput" care pune n eviden!"
diplococi Gram pozitivi capsula!i avnd form" de vrf de lance, ne orienteaz" spre
diagnosticul unei pneumonii pneumococice).
Izolarea

pe agar snge pentru majoritatea streptococilor.

pe agar nutritiv pentru enterococi.

69

pe agar #ocolatiu (sau agar snge), cu incubare n atmosfer" cu 10% CO2, pentru
pneumococi.
Identificarea
! propriet!"i morfotinctoriale: coci Gram pozitivi, n lan!uri de lungimi
variabile;pentru Streptococcus pyogenes aspectul frotiului este caracteristic din
culturile dezvoltate n bulion glucozat.
! propriet!"i de cultur!:Streptococcus pyogenes formeaz" pe agar snge colonii de tip
S, punctiforme, nconjurate de o zon" de hemoliz" complet" (betahemoliz");n bulion
glucozat las" mediul limpede #i formeaz" un sediment grunjos.
Streptococcus pneumoniae formeaz" colonii de tip S
(tulpinile capsulate), nconjurate de o zon" de hemoliz" ) de culoare verzuie pe geloza
snge #i respectiv galben-verzuie pe geloza #ocolatie.
Enterococii formeaz" colonii de tip S nehemolitice pe geloza
snge, n timp ce pe mediul bil"-esculin" apar negre ca urmare a hidrolizei esculinei.
! propriet!"i biochimice:sunt lipsite de importan!" pentru identificarea streptococilor
piogeni; sunt utile pentru identificarea enterococilor #i pneumococilor.
enterococii (#i streptococii fecali) se dezvolt" la temperaturi ntre 10-40C, n timp ce
pneumococii necesit" temperatura de 37C (cu incubare n atmosfera cu 10% CO2).
enterococii se dezvolt" pe medii cu: 6,5% NaCl, 40% bil" #i 0,1% albastru de
metilen; pneumococii nu se dezvolt" pe astfel de medii #i n plus se lizeaz" n
prezen!a bilei.
pneumococii sunt extrem de sensibili la ac!iunea optochinului.
! propriet!"i antigenice:
grupele antigenice importante pentru patologia uman" sunt: A, B, C, D, F, G.
apartenen!a la grupul antigenic se poate face prin:
- testul la Bacitracin" care permite ncadrarea n grupul antigenic A.
- testul CAMP pentru ncadrarea n grupul antigenic B (tulpinile streptococice din
acest grup produc factorul CAMP #i m"resc zona de hemoliz" produs" de o
tulpin" de stafilococ utilizat" la realizarea testului).
- coaglutinarea
- latex-aglutinarea folose#te anticorpi antigrup streptococic fixa!i pe particule de
latex.

pneumococii au peste 80 de tipuri antigenice identificabile prin reac!ii de aglutinare

sau prin testul de umflare a capsulei a lui Neufeld.
! propriet!"i de patogenitate:

pentru Streptococcus pyogenes: toxina eritrogen", streptolizinele O #i S (oxigen-labil"

#i respectiv oxigen-stabil"), hialuronidaza, streptochinaza (fibrinolizina),
nucleazele,proteinazele (proteinaza C cu ac!iune toxic" pe cord).

la pneumococi: capsula #i pneumolizina (o hemolizin")

Antibiograma este obligatorie pentru to!i streptococii, n pofida faptului c"
streptococii de grup A sunt ntotdeauna sensibili la penicilina de grup G.
Diagnosticul indirect:
70
Se face prin reac!ia ASLO care pune n eviden!" prezen!a anticorpilor antistreptolizin" O. Un
titru care dep"#e#te 200 unit"!i ASLO se va interpreta ca #i infec!ie streptococic" recent" #i va
impune profilaxia complica!iilor.


DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFEC&IILOR PRODUSE
DE COCII GRAM NEGATIVI

GENUL NEISSERIA

Genul Neisseria cuprinde diplococi Gram negativi, imobili, de aspect reniform,
a#eza!i n diplo. Sunt bacterii care produc catalaz" #i oxidaz".
Genul reune#te att specii patogene ct #i specii comensale. Neisseriile patogene sunt
reprezentate prin Neisseria gonorhoeae (gonococul) #i Neisseria meningithidis
(meningococul).
Neisseria gonorhoeae determin" infec!ii cu transmitere sexual", care la b"rbat se
manifest" ca #i uretrit" acut", care gre#it tratat" sau netratat" devine subacut", #i n evolu!ie
se complic" cu prostatit", epididimit" #i orhit". Pe termen lung, urmare a disemin"rii
hematogene se poate instala artrita. La femeie cel mai frecvent apare cervicita #i colpita f"r"
manifest"ri clinice evidente. n timp, infec!ia se complic" cu salpingit", ovarit" #i sterilitate.
(i la femeie se poate instala artrita ca #i complica!ie tardiv".
La nou-n"scut exist" posibilitatea instal"rii infec!iei consecutiv str"baterii filierei pelvi-
genitale materne, fapt care conduce la instalarea unei oftalmii purulente, care are ca #i
consecin!" cecitatea.
Diagnosticul de laborator
Recoltarea probelor patologice:

la b"rbat se recolteaz" secre!ie uretral" diminea!a, nainte de mic!iune, folosind fie

ansa bacteriologic", fie tamponul uretral.

la femeie recoltarea se face la nivelul colului uterin, din fundul de sac vaginal
posterior #i de la nivelul orificiului de deschidere al glandelor Bartholin.
Examenul microscopic direct este util numai din secre!ia uretral". Se poate face fie
n colora!ia simpl" cu albastru de metilen, fie n colora!ia Gram. Se pun n eviden!" diplococi
reniformi, Gram negativi (n colora!ia Gram) #i numeroase polimorfonucleare. n infec!iile
subacute diplococii apar fagocita!i, iar n infec!iile cronice lipsesc polinuclearele, #i cu
destul" dificultate se pot pune n eviden!" diplococii care colonizeaz" celule sau fragmente de
celule epiteliale.
Izolarea se realizeaz" pe geloz" #ocolatie, sau pe geloz" Muller-Hinton suplimentate
cu hidrolizat de lactalbumin"; se incubeaz" 48 h la 36C n atmosfer" cu 10% CO2.
Identificarea se bazeaz" pe propriet"!ile morfotinctoriale (diplococi reniformi Gram
negativi), caracterele de cultur" (colonii mici, de tip S, gri, transparente), propriet"!ile
biochimice (produce oxidaz", catalaz", degradeaz" glucoza dar nu #i maltoza), propriet"!ile
de patogenitate (cu prezen!a endotoxinei, a pililor care asigur" colonizarea mucoaselor, a
capsulei polizaharidice).
71
Antibiograma este obligatorie pentru conturarea schemei terapeutice.

Neisseria meningithidis este un agent etiologic specific uman, izolabil din
rinofaringele purt"torilor s"n"to#i, iar n cazul bolii clinic manifeste de la nivelul lichidului
cefalorahidian.
Meningococii p"trund n organismul uman pe cale aerogen" #i determin" ini!ial o
rinofaringit" subclinic" sau clinic manifest". Dac" dep"#esc bariera mucoas" p"trund n snge
#i determin" bacteriemie. Sub ac!iunea factorilor de ap"rare nespecific" interferoniii, sau
specific" anticorpii antimeningocici infec!ia se poate opri n acest stadiu. n condi!ii de
sc"dere a rezisten!ei generale organismului, meningococii dep"#esc bariera hemato-
encefalic" #i se localizeaz" la nivelul nveli#urilor meningeale, determinnd meningita
meningococic".
Diagnosticul de laborator se face pe baza examenului direct bacteriologic.
Recoltarea probelor patologice:

se recolteaz" LCR prin punc!ia coloanei lombare (nainte de instituirea tratamentului

chimioterapic),

n meningitele bacteriene, n general, #i n cea meningococic" n special, LCR este

purulent (spre deosebire de meningitele virale n care LCR este clar #i doar u#or
hipertensiv n meningita bacilar" aspectul LCR este asem"n"tor cu cel din
meningitele virale).
Examenul microscopic direct:

citologic preliminar realizeaz" num"r"toarea celulelor #i folose#te camere de

num"rare care se folosesc #i pentru leucocite (se face pe LCR necentrifugat).

pe LCR centrifugat se completeaz" examenul citologic n frotiuri colorate Giemsa sau

n colora!ie simpl" cu albastru de metilen (n meningitele bacteriene predomin"
polimorfonuclearele, n timp ce n meningitele virale, dar #i n meningita bacilar",
predomin" limfocitele). Pentru excluderea definitiv" a etiologiei bacilare se face
frotiu n colora!ia Ziehl-Neelsen. Informa!ii esen!iale se ob!in n frotiul colorat Gram:
n cazul infec!iei meningococice frotiul pune n eviden!" diplococi reniformi Gram
negativi predominent fagocita!i.
Izolarea se face pe geloz" Muller-Hinton sau geloz" #ocolatie (medii prenc"lzite la
37C), incubndu-se n atmosfer" cu 10%CO2.
Identificarea se bazeaz" pe cercetarea propriet"!ilor morfotinctoriale (frotiul colorat
Gram eviden!iaz" diplococii Gram negativi), cercetarea caracterelor de cultur"
(colonii de tip S, nepigmentate #i nehemolitice, de dimensiuni foarte mici care se
prezint" sub aspectul pic"turilor de rou"), pe propriet"!ile biochimice (cu producerea
catalazei #i a oxidazelor, metabolizarea glucozei #i maltozei) #i a propriet"!ilor
antigenice identificabile prin latex aglutinare #i imunofluorescen!" (serogrupele fiind
notate cu litere majuscule A, B, C, 29E, X, Y, Z, W135), #i a propriet"!ilor de
patogenitate (endotoxina, capsula, proteinele de membran" extern" #i pilii).
Antibiograma se realizeaz" prin metoda difuzimetric" pe geloz" #ocolatie.

NOTE PERSONALE

72





























LUCRAREA NUM#RUL 10. BACILII GRAM NEGATIVI


Bacilii Gram negativi se grupeaz" n func!ie de capacitatea de a metaboliza glucoza n:
-bacili Gram negativi fermentativi- degradeaz" glucoza pe cale oxidativ" #i
fermentativ".
-bacili Gram negativi nefermentativi- degradeaz" glucoza pe cale strict
oxidativ".

BACILI GRAM NEGATIVI FERMENTATIVI

FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE cuprinde numeroase genuri #i specii (uneori
tipuri #i subtipuri antigenice). n familia Enterobacteriaceae sunt clasificate att bacterii cu
patogenitate cert" (Salmonella, Shigella, Yersinia pestis), ct #i bacterii comensale la nivelul
73
tubului digestiv al omului #i al animalelor, care ns", n anumite condi!ii favorizante pot s"
manifeste evidente caractere de patogenitate (E. coli, Proteus, Klebsiella, etc.).
Toate Enterobacteriaceaele sunt bacili Gram negativi care la izolarea din
produsul patologic pe medii de cultur" formeaz" de obicei colonii de tip S, pentru ca, dup" un
num"r variabil de pasaje s" poat" forma #i colonii R. n medii lichide, de obicei, dau o
turbiditate uniform", posibil pelicul" incomplet" ca #i un inel aderent de peretele eprubetei
(culturi vechi) #i sediment. Fa!" de aceste caracteristici comune, uneori sunt ntlnite
particularit"!i utile diagnosticului. Ex: Proteus- prezint" proprietatea de a migra pe mediile
gelozate (invazie la culturile n pl"ci Petri, c"!"rarea la cultivarea pe agar nclinat); Klebsiella
pneumoniae #i Klebsiella oxytoca formeaz" colonii mucoide #i prezint" frecvent fenomenul
cameleonajului (n aceea#i plac"- se ntlnesc #i colonii lactozo-pozitive #i colonii lactozo-
negative); Serratia marcescens formeaz" n anumite condi!ii colonii pigmentate n ro#u.
Pentru c" exist" #i al!i bacili Gram negativi care nu fac parte din familia
Enterobacteriaceae, dar care au propriet"!i de cultur" asem"n"toare, pentru ca o tulpin"
bacterian" care a fost izolat" dintr-un produs patologic s" poat" fi ncadrat" n familia
Enterobacteriaceae, trebuie s" ndeplineasc" #i urm"toarele caracteristici de metabolism.
- s" degradeze oxidativ #i fermentativ glucoza
- s" reduc" nitra!ii la nitri!i
- testul citocromoxidazei s" fie negativ
ncadrarea ulterioar" n gen #i mai apoi n specie se bazeaz" #i pe alte propriet"!i
biochimice (stabilirea apartenen!ei la o anumit" specie necesit" studierea a 24-28 de
propriet"!i biochimice diferite).
Principalele genuri ale familiei sunt: Escherichia, Shigella, Salmonella, Citrobacter,
Proteus, Providencia, Morganella, Klebsiella, Pantoea, Enterobacter, Serratia, Hafnia,
Yersinia, Edwardsiella, Tatumella, Cedecea, Erwinia, etc.
Chiar #i dup" utilizarea unor baterii complete de teste biochimice, n cazul unor
bacterii, stabilirea apartenen!ei la o anumit" specie se poate face numai pe baza structurii
antigenice (ex: Salmonella), prin practicarea de reac!ii de aglutinare pe lam".
La Enterobacteriaceae sunt prezente:
- antigenul somatic (O) prezent la nivelul peretelui celular ( parte din el
constituind endotoxina)
- antigenul flagelar (H) prezent n cilii bacteriilor mobile ( deci absent la cele
neciliate)
- antigenul de nveli# (K) prezent ca #i antigen capsular la Klebsiella,
antigenul Vi la unele serotipuri de Salmonella sau alte antigene de suprafa!".

GENUL SHIGELLA

Dizenteria bacilar" (scaune diareice muco-sangvinolente care pot fi nso!ite de febr"
38C, colici abdominale #i tenesme) este produs" de specii ale genului Shigella.
Shigelele p"trund n organism pe cale digestiv", iar la nivel intestinal se ata#eaz"
nespecific de enterocite #i produc modificarea citoscheletului, apoi dou" proteine codificate
plasmidic determin" endocitoza bacterian", iar liza fagozomului permite shigelelor s"
invadeze #i s" se multiplice n citoplasm"; alte dou" proteine tot cu codificare plasmidic"
74
favorizeaz" r"spndirea intercelular"; moartea celulei survine prin inhibi!ia sintezei proteice,
consecin!a fiind ulcera!iile mucoasei ap"rute pe fond inflamator.
% Shigella dizenteriae cu tipurile:
- S. Shiga (1)
- S. Schmitzii (2)
- Grupa Large- Sachs (3-10)
% Shigella flexneri - 6 tipuri, mai multe subtipuri, 2 variante
% Shigella boydi- 18 tipuri antigenice
% Shigella sonnei- 1 tip antigenic dar n dou" variante S #i R (la aceast" specie
varia!ia de faz" se produce dup" 1-2 pasaje)
n dizenterie se folosesc metodele diagnosticului bacteriologic:
1. Recoltarea probelor patologice: materii fecale din scaunul de emisie spontan".
Transportul probei la laborator trebuie f"cut ct mai repede.
!NU se face examen microscopic direct din materiile fecale! (n scop de diagnostic
bacteriologic)
2. Izolarea se face prin ns"mn!are pe medii selective cu lactoz" (McConkey, Levin,
Leiffson, Drigalski, CLED etc) pe care bacilii dizenterici se dezvolt" sub form" de colonii
lactozo negative.
3. Identificarea
- propriet!"ile morfotinctoriale: bacili Gram negativi
imobili
- propriet!"ile de cultur! : colonii S lactozo negative
- propriet!"ile biochimice : pozitiveaz" testul ro#u metil, nu produc
hidrogen sulfurat, testul indol este negativ (diferen!iere de tulpini de Escherichia coli), testul
Voges-Proskauer este negativ, nu produce ureaz", nu utilizeaz" citratul de sodiu, nu utilizeaz"
acetatul de sodiu (diferen!iere de Escherichia coli), nu produce fenilalanindezaminaz".
- propriet!"ile antigenice se urm"resc prin reac!ia de aglutinare pe
lam" folosind seruri polivalente #i ulterior monovalente pentru stabilirea apartenen!ei la tip
#i eventual subtip- (S.flexneri).
- propriet!"i de patogenitate- toate Shigelele ac!ioneaz"
enteroinvaziv, a#a nct este inutil s" fie efectuat testul keratoconjunctivitei la cobai (testul
Serreny).
4. Antibiograma- finalizeaz" diagnosticul etiologic.

GENUL SALMONELLA

Genul Salmonella cuprinde bacterii mobile, care fermenteaz" glucoza cu producere
de gaz, producere de acid din manitol #i sorbitol, hidrogen sulfurat, lizindecarboxilaz" #i
folosesc citratul ca #i unic" surs" de carbon.
n accep!iunea actual" genul Salmonella reune#te dou" specii: Salmonella enterica
care include 6 subspecii enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae, indica #i
Salmonella bongori. Pentru a evita confuziile care ar putea porni de la taxonomia veche,
pentru serovaruri s-a p"strat numele anterior atribuit speciilor n schema Kauffmann-White.
De exemplu: Salmonella serovar Typhimurium sau Salmonella serovar Enteritidis.
75
Bolile produse se numesc salmoneloze care pot fi clasificate n:
Salmoneloze majore
- Salmoneloze minore

% Salmoneloze majore
-Febra tifoid"- produs" de S.typhi
-Febra paratifoid" A- S.paratyphi A
-Febra paratifoid" B- S.paratyphi B

% Salmoneloze minore
-Toxiinfec!ii alimentare-produse de serovarurile enterotoxigene de Salmonella
serovar Typhimurium,serovar Enteritidis.
-Gastroenterite - pot fi produse de toate celelalte salmonele cu excep!ia celor
incriminate n etiologia salmonelozelor majore.
-St"rile septicopiemice- produse de salmonelele din grupa C (predilect
Salmonella cholerae suis)

Diagnosticul de laborator folose#te n toate salmonelozele metodele
diagnosticului direct (bacteriologic) #i strict pentru febrele tifo-paratifoide #i metodele
diagnosticului serologic (Reac!ia Widal).
Diagnosticul bacteriologic
1. Recoltarea probelor patologice n toate salmonelozele se recolteaz" materii fecale
iar n febrele tifoparatifoide n prima s"ptamn" de boal" se recolteaz" snge (pentru
hemocultur") #i urin" (pentru urocultur"), din s"pt"mna a II-a- materii fecale (pentru
coprocultur") n timp ce pentru depistarea purt"torilor de bacil tific se recolteaz" bil" (pentru
bilicultur").
2. Examenul microscopic direct al probelor patologice este inutil n cazul materiilor
fecale; din alte produse patologice- are valoare orientativ".
3. Izolarea:se inoculeaz" produsul patologic pe medii de mbog"!ire #i pe medii
selective cu lactoz". Din mediile de mbog"!ire (ex- mediul cu selenit acid de sodiu) se
execut" pasaje tot pe medii selective cu lactoz" pe care salmonelele formeaz" colonii lactozo
negative; acestea se izoleaz" n cultur" pur" pentru identificare.
4. Identificarea utilizeaz!:
- propriet!"i morfotinctoriale - bacili Gram negativi (mobili)
- propriet!"i de cultur! - colonii S lactozo- negative
- propriet!"i biochimice - fermenteaz" glucoza cu producere de gaz, producere
de acid din manitol #i sorbitol, hidrogen sulfurat, lizindecarboxilaz" #i
folosesc citratul ca #i unic" surs" de carbon
- propriet!"i antigenice
% antigenul somatic O- s-au descris peste 67 de factori O (factori
majori de specificitate). Ag O este caracteristic de grup.
- grupele serologice (antigenice) au fost notate cu
litere majuscule din alfabetul latin, de la A- Z #i apoi prin simbolul O al antigenului somatic
#i num"rul factorului respectiv (O51, O52.).
76
- unele serogrupe au un singur factor major, altele
(mai complexe) au mai mul!i factori majori de specificitate.
% antigenele de nveli# (K) sub aceast" denumire sunt grupate
antigenele dispuse la suprafa!a peretelui celular. n schema Kauffman-White este specificat
doar antigenul Vi prezent n mod constant la S. typhi #i care confer" inaglutinabilitate
somatic".
% antigenele flagelare (H) sunt caracteristice de tip. Varia!ia
antigenelor H este cunoscut" sub denumirea de varia!ie de faz". La culturile
d e S a l mo n e l l a s e d i s t i n g a n t i g e n e H p r o p r i i ( d e f a z "
1) #i antigen H comune (de faz" 2).
- o celul" are antigen H numai de faz" 1 sau
numai de faz" 2.
- o cultur" de Salmonella poate fi format"
din celule numai de faz" 1 sau numai de faz" 2 (culturi monofazice) sau din celule cu
antigene H de ambele faze (culturile difazice).
- antigenele H de faz" 1 au fost notate cu
litere mici din alfabetul latin de la a-z #i apoi cu z #i un indice z1, z2).Antigenele H de faz"
2 au fost notate prin complexe de cifre sau litere ( 1,2; 1,5; 1,7; 1,9;enx).
Identificarea antigenelor se bazeaz" pe practicarea reac!iilor de aglutinare pe lam" (se
folosesc n ordine - ser polivalent anti O, serul Vi -dac" nu a aglutinat cu serul anti O-, seruri
antiO de grup, seruri anti H de faz" 1 #i apoi seruri anti H de faz" 2.) Enumerarea
antigenelor O #i H de faz" 1 #i de faz" 2 d" formula antigenic".
5. Antibiograma - finalizeaz" diagnosticul bacteriologic.

Diagnosticul indirect ( R. Widal)- se practic" n febrele tifoparatifoide
Reac!ia urm"re#te eviden!ierea n serul bolnavilor a aglutininelor antitifoparatifice (n
paralel pentru antigenul somatic #i cel flagelar). R. Widal complet" nsumeaz" 3 reac!ii de
aglutinare somatic" #i alte trei de aglutinare flagelar" (deci 6 reac!ii de aglutinare n tuburi)
Pentru interpretarea rezultatelor se va !ine seama de faptul c"
- aglutininele ating n ser titrul maxim n s"pt"mna III, IV
de boal",
- tratamentul chimioterapic asociat cu cortizonice, aplicat n primele
zile de boal", mpiedic" cre#terea titrului aglutininelor (deci nu se mai justific" practicarea R.
Widal).


OPORTUNI(TII FAMILIEI ENTEROBACTERIACEAE

GENUL ESCHERICHIA - cuprinde bacterii comensale, constituen!i obi#nui!i ai
microbiocenozei colonului la om #i animale, dar care n anumite condi!ii pot manifesta
evidente caractere de patogenitate
Popula!iile de E. coli echipate cu factori de patogenitate, se pot constitui n agen!i
etiologici ai unor infec!ii enterale #i extraenterale.
77
Infec!ii extraenterale: infec!ii ale c"ilor respiratorii superioare, infec!ii ale c"ilor
biliare, meningite #i septicemii.
Sindroame diareice produse de tulpini de:
E. coli enteroinvaziv (EIEC), pozitiveaz" testul Sereny #i
determin" o simptomatologie asem"n"toare cu cea produs" de
Shigella.
E. coli enterotoxigen (ETEC) elaboreaz" enterotoxine #i
determin" o simptomatologie asem"n"toare cu cea din holer".
E. coli enteropatogen (EPEC), a fost incriminat" n etiologia
unor pusee epidemice de diaree malign" la copii sub 1 an.
EPEC ader" de enterocit, citoscheletul celular se modific", iar
membrana enterocitului mbrac" bacteriile aderente ntr-un
suport caracteristic ca o cup"; aderarea la membran" faciliteaz"
formarea de microcolonii. n final, adeziunea celular" este
amplificat" de participarea diferitelor proteine #i se ajunge la
#tergerea microvililor; sindromul diareic se explic" prin
dispari!ia microvililor cu reducerea capacit"!ii de retroresorb!ie
a mucoasei.
E. coli enterohemoragic (EHEC) produce, ca urmare a
conversiei lizogene, toxine a c"ror ac!iune conduce la colite
hemoragice #i sindrom hemolitic uremic (anemie hemolitic",
insuficien!" renal").
E. coli enteroagregativ (EAggEC) invadeaz" !esuturile,
produce o enterotoxin" termolabil" f"r" activitate hemolitic" #i
determin" sindroame diareice acute #i cronice.
E.coli difuz aderent (DAEC) cu ac!iune difuz aderent" #i
invaziv" celular", care st" la originea sindromului diareic
produs de patotipul men!ionat.
Escherichia coli
- Sunt bacili Gram negativi mobili
- Formeaz" pe mediile selective cu lactoz" colonii lactozo-pozitive (exist" #i excep!ii)
- Se remarc" un fenomen de disjunc!ie colonial" marcat (poate forma colonii S dar #i R,
mucoide, gelatinoase sau uleioase)
- Pozitiveaz" testul indol, se dezvolt" pe mediu minimal cu acetat de sodiu, pozitiveaz"
testul ro#u metil, glucoza este fermentat" cu producere de gaze
- Are antigene somatice, de nveli# #i flagelare
- Prezint" factori de patogenitate: factori de virulen!", factori de aderen!" (atg K88,
K89), factori de colonizare (CFA I, CFA II, P987, E 8775, CFA III), antigene de suprafa!",
factori de toxicitate (endotoxina, hemolizinele, enterotoxinele) care pot fi eviden!ia!i prin
teste de laborator.
- Antibiograma este esen!ial" pentru conturarea schemei terapeutice.

GENUL KLEBSIELLA

78
Este o grupare constituit" din enterobacterii imobile, capsulate, cu activitate intens"
asupra zaharurilor pe care le metabolizeaz" cu producere de acizi #i gaze; produ#ii finali de
fermenta!ie a glucozei fiind acetoina #i 2,3 butandiolul, deci pozitiveaz" testul Voges
Proskauer (nu toate speciile).
Speciile ntlnite frecvent n patologia uman" se dezvolt" pe mediile cu citrat de sodiu,
produc lizindecarboxilaz" #i ureaz".
Genul reune#te 10 specii, specia tip fiind Klebsiella pneumoniae, implicat" n
producerea de infec!ii nosocomiale (intraspitalice#ti) la adul!i se izoleaz" din infec!ii
urinare #i respiratorii, iar la copii mai frecvent din enterite. Pentru Klebsiella pneumoniae #i
Klebsiella oxytoca sunt caracteristice coloniile mucoide precum #i fenomenul cameleonajului
( colonii lactozo-pozitive al"turi de altele lactozo-negative).

GENURILE ENTEROBACTER (I PANTOEA

Cuprind bacterii mobile, care fermenteaz" glucoza (cu producerea de gaze), lactoza,
ramnoza #i sorbitolul. Produce acetilmetilcarbinol #i pozitiveaz" astfel reac!ia Voges-
Proskauer.
Pe mediile gelozate formeaz" colonii de tip S; pe mediile slab selective (Mc Conkey)
formeaz" colonii lactozo-pozitive; Enterobacter sakazakii #i Pantoea agglomerans produc n
48-96 ore un pigment galben caracteristic.
Pantoea agglomerans #i Enterobacter sakazaki sunt izolate din infec!ii nosocomiale
(E. sakazaki- meningite #i septicemii neonatale).

GENUL SERRATIA

Genul Serratia reune#te multe specii implicate n producerea de infec!ii ce intereseaz"
c"ile urinare, c"ile respiratorii #i sistemul nervos central; specia Serratia marcescens
declan#eaz" infec!ii nosocomiale, ce vizeaz" tractul urinar, c"ile respiratorii, uneori apari!ia
septicemiilor. Sunt caracteristice coloniile pigmentate n ro#u.
Sunt enterobacterii mobile, care degradeaz" glucoza cu producere de gaze, produce
decarboxilaze, proteaze #i lipaze. Testul Voges-Proskauer este pozitivat n mod constant.

GENURILE PROTEUS, PROVIDENCIA (I MORGANELLA

Cuprind bacili Gram negativi care au ca #i caracteristic" definitorie producerea de
fenilalanindezaminaz".
% Proteus produce hidrogen sulfurat, produce ureaz" #i nu utilizeaz" citratul de sodiu, are
proprietatea de a migra pe mediile gelozate, manifestat" ca #i invazie pe mediile de cultur" n
pl"ci Petri #i respectiv c"!"rare cnd se ns"mn!eaz" n apa de condensie a unui agar nclinat
(formeaz" colonii lactozo-negative).Este agent etiologic al infec!iilor tractului urinar (dup" E.
coli se izoleaz" cel mai frecvent din astfel de infec!ii). Este una dintre bacteriile ce se
izoleaz" frecvent din infec!iile nosocomiale.
79
% Providencia, care se izoleaz", de asemenea, din infec!iile urinare, difer" de Proteus
prin faptul c" nu migreaz" pe mediile gelozate, nu produce hidrogen sulfurat, dar utilizeaz"
citratul de sodiu.
% Morganella se izoleaz" din infec!ii localizate la p"r!ile moi.

GENUL YERSINIA

Are ca #i specie tip Yersinia pestis (agentul etiologic al pestei), bacterie cu
patogenitate cert".
Dintre celelalte specii oportuniste ale genului, specia Yersinia enterocolitica este
implicat" n producerea de sindroame diareice, prin mecanism mixt enteroinvaziv #i
enterotoxigen;este implicat" n producerea infec!iilor nosocomiale.

FAMILIA VIBRIONACEAE

GENUL VIBRIO

Cuprinde bacili Gram negativi, ncurba!i n form" de virgul", nesporula!i, necapsula!i,
mobili. Mai multe specii sunt patogene pentru om #i pentru animalele marine. Specia tip este
Vibrio cholerae- agentul etiologic al holerei. Infec!ia apare mai frecvent n urma consumului
de ap" contaminat" #i evolueaz" ca un sindrom diareic cu scaune apoase datorat ac!iunii
enterotoxinei.
Vibrionii p"trund n organism pe cale digestiv" #i dac" reu#esc s" dep"#easc" bariera
acidit"!ii gastrice, colonizeaz" mucoasa intestinal", secretnd #i elibernd enterotoxina.
Aceast" este format" din dou" fragmente notate A #i B; prin fragmentul B toxina se fixeaz" la
receptorii enterocitului, dup" care este mobilizat fragmentul A care str"bate membrana
citoplasmatic" a enterocitului; trecnd prin dublul strat lipidic membranar, prin reducerea
unor leg"turi de sulf se formeaz" peptidul activ A1, care pe fa!a intern" a membranei
citoplasmatice activeaz" adenilatciclaza, rezultatul fiind o cre#tere marcat" a nivelului
intracelular al cAMP, fapt n urma c"ruia enterocitul este comutat din celul" cu rol major
absorbant n celul" secretorie de ap" #i electroli!i. Se declan#eaz" o diaree apoas", nso!it" de
v"rs"turi ce sunt datorate irita!iei produse pe centrul vomei. Pierderile hidrice n 24 ore sunt
de 15-20 litri, producndu-se hemoconcentra!ie care conduce la pr"bu#irea valorilor tensiunii
arteriale. Simptomatologia clinic" este completat" cu alte manifest"ri care sunt datorate
pierderilor electrolitice. Pentru bolnav este esen!ial tratamentul patogenetic care se refer" la
reechilibrarea hidroelectrolitic", completat cu tratamentul etiologic (administrarea de
chimioterapice tetracicline).
Diagnosticul de laborator este bacteriologic:
1. Recoltarea probelor patologice: materii fecale, lichid de v"rs"tur" probe din apa
potabil", apele de canal #i materialele contaminate
2. Examenul microscopic direct din produsul patologic: n preparatul nativ se
eviden!iaz" bacili mobile, iar n frotiul colorat Gram - bacili Gram negativi cu form"
caracteristic" de virgul".
80
3. Izolarea: Produsul patologic este inoculat n ap" peptonat" cu pH bazic (9,2). Din
pelicula dezvoltat" la suprafa!a mediului la 6 #i 12 ore se execut" pasaje pe mediul selectiv
BSA, pe care v. holeric formeaz" colonii S translucide.
4. Identificarea parcurge toate etapele iar elementele utile pentru diagnostic sunt:
bacili Gram negativi n form" de virgul", colonii transparente de tip S pe mediul BSA (pe
agar nutritiv la 18h coloniile sunt opace), pozitiveaz" testul indofenoloxidazei, reduce nitra!ii
la nitri!i, fermenteaz" glucoza, zaharoza #i manoza, produce lizin #i ornitindecarboxilaz",
produce gelatinaz", pozitiveaz" testul striului.
Este important antigenul somatic O pe baza c"ruia au fost conturate serogrupe.
Vibrionii holerici apar!in grupului O1, n cadrul c"ruia (cu ajutorul unor factori
specifici) s-au conturat trei serotipuri (Ogawa, Inaba, Hykojima) #i dou" biotipuri (holeric
clasic #i El-Tor) diferen!iabile prin teste de laborator.
Principalul factor de patogenitate este enterotoxina.
5. Antibiograma finalizeaz" diagnosticul (sensibilitate la tetracicline).


NOTE PERSONALE






















81
LUCRAREA NUM#RUL 11. BACILI GRAM NEGATIVI
NEFERMENTATIVI. COCOBACILI GRAM NEGATIVI. BACTERII
ACIDO-ALCOOLO REZISTENTE.


Bacilii Gram negativi glucozo-nefermentativi reprezint" o grupare constituit"
artificial pornind de la necesit"!ile identific"rii n laboratorul de microbiologie clinic".
Se contureaz" 4 grupe principale de identificare fenotipic":

Bacili nefermentativi zaharolitici, oxidazo-pozitivi "i indol-negativi:

Pseudomonas, Burkholderia, Brevundimonas, Ralstonia, Rhizobium radiobacter,
Alcaligenes xylosoxidans supsp. Xylosoxidans, Ochrobactrum anthropi,
Flavobacterium spp., Pseudomonas-similari Grup 2, Shewanella spp., Sphingomonas
paucimobilis.

Bacili nefermentativi azaharolitici, oxidazo-pozitivi "i indol-negativi:

Pseudomonas alcaligenes, P. pseudoalcaligenes, Alcaligenes spp., Alcaligenes faecalis
tip II, etc.

Bacili nefermentativi zaharolitici sau azaharolitici, oxidazo-pozitivi "i

indol-pozitivi : Chryseobacterium meningosepticum, Flavobacterium grup IIb,
Empedobacter brevis, etc.

Bacili nefermentativi oxidazo-negativi : Chryseomonas, Flavimonas,

Stenotrophomonas.


GENUL PSEUDOMONAS

Are ca #i specie tip Pseudomonas aeruginosa (bacilul piocianic) foarte r"spndit" n
natur": sol, ape naturale st"t"toare sau de scurgere, vegetale. n condi!ii de igien" deficitar"
poate fi izolat" #i din spitale (cauz" frecvent" de infec!ii nosocomiale). Se mai poate izola din
alimente, instala!ii sanitare, instrumentar medical, solu!ii medicamentoase #i chiar antiseptice
slabe. Infec!iile produse de Pseudomonas aeruginosa sunt: infec!ii urinare, infec!ii
respiratorii, sindroame diareice, otite, osteomielite, suprainfec!ia arsurilor.
Diagnostic de laborator direct bacteriologic
1. Recoltarea probelor patologice- se face n func!ie de localizarea infec!iei
2. Examenul microscopic direct eviden!iaz" bacili Gram negativi. Preparatul nativ
arat" mobilitatea lor.
3. Izolarea- pe medii uzuale (geloz" nutritiv")
4. Identificarea parcurge toate etapele:
- propriet!"ile morfotinctoriale: sunt bacili Gram negativi scur!i a#eza!i
izolat sau in diplo, uneori formnd lan!uri scurte.
82
- propriet!"i de cultur!: pe geloz" nutritiv" formeaz" colonii S, R sau
gelatinoase, uneori mucoide. Sintetizeaz" o serie de pigmen!i (piocianina
cu specificitate de specie, fluorescein"), care difuzeaz" n mediu de
cultur" schimbnd culoarea acestuia).
- propriet!"i biochimice: glucoza este degradat" pe cale oxidativ",
utilizeaz" citratul de sodiu ca #i unic" surs" de carbon, cre#te pe medii cu
NaCl 6,5%, produce catalaz" #i citocromoxidaz", lichefiaz" gelatina #i
coaguleaz" laptele.
- propriet!"i antigenice: prezint" antigene somatice #i flagelare.
- propriet!"i de patogenitate: are endotoxin", o exotoxin" A care inhib"
sinteza proteic", enterotoxina termostabil", enzime proteolitice (elastaz",
proteaz", colagenaz", lecitinaza C), hemolizine.

5. Antibiograma este obligatorie! Administrarea incorect" a chimioterapicelor,
permite apari!ia tulpinilor multiplu rezistente la ac!iunea lor!

AL&I BACILI GRAM NEGATIVI NEFERMENTATIVI

Alcaligenes - infec!ii urinare, infec!ii respiratorii, meningite, septicemii.

Burkholderiae izolat din septicemii, endocardite, infec!ii urinare, meningite,
bronhopenumonii, pl"gi infectate.

Brevundimonas implicat n infec!ii ale c"ilor urinare, infec!ii vaginale, infec!ii de cateter.

Capnocytophaga implicat n boala parodontal" juvenil".

Cryseobacterium izolat n cursul meningitelor #i a infec!iilor ap"rute dup" utilizarea
sistemelor de hemodializ".

Empedobacter - infec!ii urmare a utiliz"rii sistemelor de hemodializ"!

Stenotrophomonas endocardite, meningite, conjunctivite, pneumonii #i septicemii.

Sphingomonas infec!ii urinare, celulite cronice, meningite, septicemii, infec!ii
postoperatorii, contamineaz" apele din piscine.


COCOBACILII GRAM NEGATIVI

GENUL HAEMOPHILUS

83
Genul Haemophilus cuprinde cocobacili Gram negativi imobili #i nesporula!i, uneori
capsula!i, care necesit" pentru cre#tere factorii X (hemina) #i V (NAD sau NADP).
Specia tip este Haemophilus influenzae, un oportunist cantonat la nivelul faringelui, a
c"rui putere invaziv" poate fi declan#at" fie de un factor exterior infec!ios (gripa, rujeola), fie
de un traumatism local, fie prin prezen!a unor adezine bacteriene (capsula #i pilii).
Specia prezint" mai multe tipuri antigenice, notate prin literele mici din alfabetul
latin; tipul antigenic b este implicat n producerea de meningite, ap"rute mai frecvent dup"
infec!ii ale c"ilor respiratorii, dar #i epiglotite la copii cu vrste ntre 2-7 ani, bron#ite,
pneumonii, uneori otite #i sinuzite.
Haemophilus parainfluenzae este un comensal al tractului respirator superior care
foarte rar poate fi izolat din infec!ii ale acestui tract.
Haemophilus ducreyi este agentul etiologic al #ancrului moale, o boal" cu
transmitere sexual".
Haemophilus aegyptius produce conjunctivite n sezonul cald.
Diagnosticul de laborator se bazeaz" pe eviden!ierea din produsul patologic a
cocobacililor Gram negativi, frecvent capsula!i (pentru H. ducreyi a#ezarea n lan!uri este
caracteristic").
Se dezvolt" pe medii de cultur" ce con!in snge (agar snge, agar #ocolatiu)
suplimentate cu factori de cre#tere, incubndu-se n atmosfer" cu 10% CO2. Dac" se
ns"mn!eaz" n spoturi de stafilococ pe geloz" snge, se poate eviden!ia fenomenul de
satelitism (coloniile de Haemophilus se dezvolt" n jurul coloniilor de stafilococ).
Stabilirea apartenen!ei la unul din cele 6 serotipuri se poate face prin latex aglutinare
sau tehnici imunoenzimatice de tip ELISA.
Antibiograma finalizeaz" obligatoriu diagnosticul.


GENUL BORDETELLA

Genul Bordetella cuprinde cocobacili Gram negativi, uneori capsula!i, care necesit"
pentru cultivare medii de cultur" speciale (mediul Bordet-Gengou).
Speciile genului sunt Bordetella pertusis, Bordetella parapertusis care produc tusea
convulsiv" #i Bordetella bronhiseptica care se izoleaz" n cursul formelor atipice de tuse
convulsiv".
Dup" recoltarea probelor patologice (secre!ie traheal" #i bron#ic"), #i izolarea pe
mediul Bordet-Gengou, stabilirea diagnosticului bacteriologic se bazeaz" pe parcurgerea
etapelor identific"rii.
Diagnosticul serologic folose#te reac!ia de aglutinare n tuburi.
Preven!ia se bazeaz" pe vaccinare, utilizndu-se trivaccinul diftero-tetano-pertusis.


BACILI ACIDOALCOOLO REZISTEN$I
GENUL MYCOBACTERIUM


84
Bacteriile clasificate n acest gen sunt bacili de dimensiuni mici, imobili, aerobi,
necapsula!i #i nesporula!i.
Sunt bacterii acido alcoolo-rezistente, proprietate care le este conferit" de prezen!a la
nivelul peretelui lor celular a acizilor micolici.

Genul cuprinde numeroase specii care pot fi clasificate dup" cum urmeaz":
1. Mycobacterii care nu se dezvolt" pe medii de cultur" acelulare:
o Mycobacterium leprae (bacilul lui Hansen), agentul etiologic al leprei umane.
o Mycobacterium leprae murium care este agentul etiologic al leprei
#obolanilor.
2. Mycobacterii care se dezvolt" lent (n s"pt"mni) pe medii de cultur" #i care sunt
patogene pentru om #i unele animale:
o Mycobacterium tuberculosis (bacilul lui Koch), agentul etiologic al
tuberculozei umane.
o Mycobacterium bovis, agentul etiologic al tuberculozei bovideelor, dar care
accidental poate s" produc" #i mboln"viri umane.
o Mycobacterium africanum , tot un patogen uman.
o Alte specii: M. muris, M.microtti.
3. Mycobacterii care se dezvolt" lent (n s"pt"mni) sau rapid (n cteva zile) pe medii
de cultur" #i care pot fi saprofite, patogene sau condi!ionat patogene.
Grupa I-a : Mycobacteriile fotocromogene. Coloniile se dezvolt" n 6
s"pt"mni pe mediile de cultur", #i se pigmenteaz" n galben portocaliu dup"
fotoinduc!ie (expunere la lumin"). Exemplu: Mycobacterium kansasi (infec!ii
cutanate #i meningite).
Grupa a II-a : Mycobacteriile scotocromogene. Coloniile se dezvolt" n 6
s"pt"mni pe mediile de cultur" #i se pigmenteaz" n galben portocaliu la
ntuneric. Exemple: Mycobacterium scrofulaceum, M. xenopi (adenopatii
submaxilare purulente).
Grupa a III-a : Mycobacteriile necromogene. Coloniile se dezvolt" n 6
s"pt"mni pe mediile de cultur" #i nu se pigmenteaz". Exemplu: M. avium-
intracellulare (izolat frecvent de la bolnavii de SIDA).
Grupa a IV-a : Mycobacterii cu cre#tere rapid". Coloniile se dezvolt" n cteva
zile pe mediile de cultur". Exemple: M. fortuitum, M. phlei (determin"
abcese).

Diagnosticul de laborator n tuberculoz!:
Diagnosticul bacteriologic:
1. Recoltarea probelor patologice se face n func!ie de localizarea infec!iei, cel mai
frecvent recoltndu-se sputa (pentru c" localizarea pulmonar" este cea mai
frecvent"; alte localiz"ri sunt urogenital", cutanat", osteoarticular", pleural",
meningeal").
2. Examenul microscopic direct folose#te frotiul colorat Ziehl-Neelsen (a se vedea
preparatele microscopice). Mycobacteriile apar n frotiu ca #i bacili acido-alcoolo
rezisten!i, dispu#i izolat, n gr"mezi sau n litere majuscule (V, Y, W), pe fondul
85
albastru dat de toate celelalte elemente prezente n frotiu (alte bacterii, celule
inflamatorii, celule epiteliale sau detritusuri celulare, fibrin"). n afara acestei
colora!ii, mai poate fi folosit" #i colora!ia fluorescent" auramin"-rodamin".
3. Izolarea se face pe mediul selectiv Lwenstein-Yensen (culturi la 37C timp de 6
s"pt"mni).
4. Identificarea:
- propriet!"i morfotinctoriale : bacili acido-alcoolo rezisten!i.
- caractere de cultur! : colonii R (rugoase), conopidiforme pentru
M.tuberculosis #i respectiv aplatizate la M. bovis.
- propriet!"i biochimice: produce catalaz", testul la niacin" este pozitiv
pentru M.tuberculosis #i negativ la M.bovis.
- propriet!"i de patogenitate :se demonstreaz" prin fenomenul lui Koch
(consecutiv inocul"rii la cobai).

5. Antibiograma se lucreaz" pe mediul Lwenstein-Yensen.
Diagnosticul indirect biologic:
Se face prin intradermoreac!ia (IDR) la tuberculin" (PPD). PPD = proteina purificat"
#i adsorbit".
IDR testeaz" hipersensibilitatea de tip tardiv la tuberculin" #i presupune inocularea
strict intradermic" pe fa!a anterioar" a antebra!ului stng a 0,1 ml PPD ce con!ine 2 unit"!i de
tuberculin".
Reac!ia se cite#te preliminar la 24 h #i definitiv la 72 h prin m"surarea diametrului
papulei dermice (ro#ea!" cu denivelare) ap"rute la locul inocul"rii. Un diametru mai mare de
10 mm se interpreteaz" ca IDR pozitiv (prezen!a limfocitelor T angajate n r"spunsul imun),
n timp ce diametrul sub 10 mm impune interpretarea IDR ca #i negativ #i consecutiv acestui
fapt vaccinare BCG.
Este absolut contraindicat s" se fac" testarea IDR n cazul n care exist" cea mai mic"
suspiciune de infec!ie bacilar" n evolu!ie.


NOTE PERSONALE












86






LUCRAREA NUM#RUL 12. SPIROCHETE (I ALTE BACTERII
NECOLORABILE GRAM (RICKETTSIA, CHLAMYDIA,
MYCOPLASMA). ELEMENTE DE PARAZITOLOGIE


Spirochetele sunt bacterii sub!iri cu o form" helicoidal" foarte mobile datorit"
prezen!ei unui aparat mobil intracelular,reprezentat prin filamentele axiale.

GENUL TREPONEMA- cuprinde numeroase specii care pot fi comensale sau patogene
pentru om. Specia tip este Treponema pallidum, agentul etiologic al unei boli cu transmitere
sexual", strict uman"- sifilisul, care evolueaz" n 3 faze:
- sifilisul primar- caracterizat prin apari!ia #ancrului dur la locul de inoculare, leziune
nso!it" de adenopatie inghinal". Netratat #ancrul se vindec" spontan n 4-6
s"pt"mni.
- sifilisul secundar- caracterizat prin rozeole cutanate #i pl"ci mucoase, leziuni datorate
unei disemin"ri a treponemelor pe cale sangvin" #i limfatic".
- sifilisul ter!iar (tardiv) cu leziuni grave cardio-vasculare, cutanate (gome),
neurologice ( paralizie general"), osoase.
Sifilisul congenital este datorat transmiterii transplacentare a infec!iei treponemice de la
mam" la f"t. Rezultatul fiind avortul fetal n trimestrul al doilea de sarcin". Dac" totu#i
sarcina este dus" pn" la termen,se instaleaz" sifilisul congenital,cu leziuni incompatibile de
obicei cu supravie!uirea,iar dac" totu#i noul n"scut supravie!uie#te,va prezenta leziuni foarte
grave la nivelul creierului,leziuni oculare #i hepatice.
Diagnosticul este diferen!iat n func!ie de faza bolii. Dac" n perioada primar" este
posibil #i foarte util diagnosticul direct, n perioada secundar" #i mai ales ter!iar" se utilizeaz"
predilect metodele serologice.

Diagnosticul bacteriologic
Recoltarea intereseaz" serozitatea din #ancrul dur. Este recomandabil ca recoltarea
s" se fac" la laborator pentru a facilita examinarea microscopic" direct".
Examenul microscopic direct din produsul patologic este de mare valoare #i
reprezint" practic singura metod" de diagnostic,avnd n vedere faptul c" treponemele nu se
pot cultiva pe medii de cultur" acelulare.
% preparatul nativ - ntre lam" #i lamel", examinat la microscopul cu
fond ntunecat eviden!iaz" bacterii fine, helicoidale cu 10-12 ture de spir" regulate #i
egale, str"lucitoare, deosebit de mobile #i care prezint" mi#c"rile caracteristice de
flectare,rota!ie,in#urubare #i transla!ie, executnd mi#c"ri de rota!ie, transla!ie #i flexiune.
87
%colora!ia Burri se realizeaz" prin amestecarea pe
lam" a unei pic"turi din serozitate cu o pic"tur" de tu# de China. Se ntinde frotiul, se usuc" #i
se examineaz" la microscop cu obiectivul de imersie: treponemele apar
albe, str"lucitoare #i refringente pe fondul ntunecat al preparatului.
% colora!ia Giemsa eviden!iaz" treponemele prezentnd morfologia
caracteristic" #i colorate n albastru violaceu.

colora!ia Fontana-Tribondeau eviden!iaz" bacterii spiralate, cu ture

de spir" fine #i dese, colorate n brun-negru pe fondul galben al
preparatului.

tehnica Levaditi-Manuelian, reprezint" o impregnare argentic"

a!esuturilor, care n preparat se coloreaz" n galben, n timp ce
spirochetele apar colorate n brun-negru.
Izolarea. Cultivarea pe medii a T. pallidum nu este posibil", dar bacteriile pot fi
men!inute viabile, n laborator, pe mediul Nelson-Meier timp de 72 ore.
Diagnosticul indirect- serologic - const" n reac!ii antigen-anticorp folosite pentru
eviden!ierea anticorpilor antitreponemici:
Reac!iile cu antigene netreponemice au o specificitate mai redus" #i din acest motiv se
folosesc din ce n ce mai pu!in:

RFC Bordet-Wasserman este o reac!ie care nu se mai folose#te.

testul VDRL ( Venelar Disease Research Laboratory), este o reac!ie de floculare care
folose#te antigenul cardiolipinic. Microcristalele de colesterol nc"rcate cu
cardiolipin" ntr" n reac!ie cu anticorpii din serul bolnavilor, iar pozitivarea reac!iei
se traduce prin apari!ia unor flocoane, concomitent cu limpezirea mediului de reac!ie.
Reac!ii cu antigene treponemice: sunt sensibile #i specifice:

testul de imobilizare a treponemelor,

reac!ia de hemaglutinare pasiv" a T. pallidum,

reac!ia de imunoaderen!",

reac!ia de imunofluorescen!" indirect",

reac!ia de fixare a complementului cu antigene treponemice.

GENUL BORRELIA

Genul Borrelia cuprinde bacterii de form" spiralat", cu ture de spir" largi #i cu
extremitatea terminat" n L. Se transmit prin artropode. Genul reune#te mai multe specii
printre care:
- Borrelia recurentis, transmis" prin p"duche, agent etiologic al febrei recurente, boal"
care se caracterizeaz" prin numeroase accese febrile urmate de remisiuni.
- Borrelia burgdorferi, transmis" prin c"pu#a, agentul etiologic al boreliozei Lyme.
Boala evolueaz" tristadial:
a)n faza primar" se instaleaz" eritemul migrator, caracterizat prin placarde
maculo-papuloase care apar la 3-30 zile de la contaminare #i care evolueaz"
centrifug; frecven!a mai mare a leziunilor vizeaz" zona toracelui.
b)n faza secundar", care se instaleaz" dup" cteva s"pt"mni sau luni, bacteriile
pot fi izolate din snge #i LCR; manifest"rile clinice sunt tegumentare,
88
neuromeningeale (meningit" cu lichid clar), radiculare (afectarea nervilor
cranieni provoac" paralizie facial" la frig), articulare (cu interesarea unei
singure articula!ii mari cot, genunchi), cardiace (cu bloc atrio-ventricular),
oculare.
c)n faza ter!iar", care apare dup" luni sau ani de la debut, sunt caracteristice
manifest"ri articulare, cardio-vasculare #i nervoase, cu posibilitatea instal"rii
tumorilor cerebrale.
Transmiterea materno-fetal" este posibil" pe parcursul evolu!iei bolii.
Diagnosticul de laborator folose#te metodele diagnosticului bacteriologic #i
serologic.
Din probele patologice (snge, LCR, lichid articular) se face examenul microscopic
(preparat nativ pe fond ntunecat #i preparate colorate Giemsa, Burri, Fontana-Tribondeau
care eviden!iaz" bacterii cu morfologie caracteristic").
Izolarea este dificil" #i necesit" medii speciale.
Punerea n eviden!" la B. burgdorferi se face prin PCR.
Diagnosticul serologic se bazeaz" pe tehnici ELISA, imunoblot, imunofluorescen!"
indirect".

GENUL LEPTOSPIRA

Leptospirozele sunt larg r"spndite n natur", fiind att saprofite ct #i patogene.
Leptospirele patogene produc mboln"viri la animale,dar accidental #i la om.
Leptospirele sunt grupate in speciile:
"L.interogans, care cuprinde tulpinile patogene.
"L.biflexa ,cu tulpinile saprofite.
Leptospirele patogene apar!in la mai multe serogrupe, printre care L.
icterohaemorragie cu rezervor #obolanul #i care produce boala Weil; L.gryppo-typhosa cu
rezervor #oarecele de ap" #i produce febra de n"mol; L.pomona cu rezervor porcul #i care
produce boala tinerilor porcari; L.hebdomadis cu rezervor roz"toare s"lbatice #i care
produce febra de 7 zile; L.canicola cu rezervor cinele, produce tifosul canin.
Leptospirele p"trund n organism prin leziuni dar chiar #i prin tegumente #i mucoase
intacte, produc bacteriemie #i apoi se localizeaz" n rinichi, ficat #i meninge. Pe plan clinic
apare un sindrom febril, asociat cu icter, manifest"ri renale, meningeale #i hemoragii de
intensit"!i variabile.

Diagnosticul direct

n primele zile de boal" se recolteaz! snge iar mai trziu urin" #i eventual LCR.
Examenul microscopic direct este inutil, datorit" elimin"rii foarte reduse a
bacteriilor.
Izolarea se face pe medii speciale care con!in ser de iepure cu un pH u#or alcalin
7,2-7,6 (Uhlenhut, Kortoff), incubarea se face la o temperatur" de 28-30 C.
89
Identificarea !ine cont de:caracterele morfologice eviden!iate pe frotiuri colorate
Giemsa #i Fontana-Tribondeau, dar sunt utile #i preparatele native examinate la microscopul
pe fond ntunecat.
Diagnosticul serologic:

reac!ia de fixare a complementului cu un antigen de grup comun leptospirelor,

stabile#te numai diagnosticul de leptospiroz" f"r" precizarea serotipului.

reac!ia de aglutinare-liz" permite identificarea serotipului.

Pe o lam" se amestec" o pic"tur" din dilu!iile binare ale serului de bolnav cu o
pic"tur" din serotipul de leptospira #i se acoper" cu o lamel". Dup" cteva minute preparatul
este examinat la microscop pe fond ntunecat. n cazul prezen!ei anticorpilor specifici (reac!ie
pozitiv"), leptospirele devin imobile apoi se aglomereaz" formnd ghemuri ce dau aspectul
de p"ianjen, iar n final sunt lizate.

MYCOPLASME

Familia Mycoplasmataceae reune#te genurile Mycoplasma #i Ureaplasma.
Mycoplasmataceele sunt bacterii lipsite de perete celular #i ca atare caracterizate printr-un
polimorfism accentuat. Sunt cele mai mici bacterii capabile s" se dezvolte autonom, pe medii
de cultur" acelulare.
n genul Mycoplasma sunt clasificate cca. 60 de specii, unele dintre ele fiind patogene
pentru om #i animale.
Mycoplasma pneumoniae este agentul etiologic al pneumoniei atipice primare. Dintre
condi!ionat patogeni, trebuie men!ionat" specia Mycoplasma hominis implicat" n uretrite
nespecifice la b"rba!i, respectiv colpite #i cervicite la femei.
n genul Ureaplasma sunt clasificate bacteriile dotate cu capacitatea de a scinda ureea.
Capacitatea lor patogen" este controversat", dar este cert faptul c" specia Ureaplasma
urealyticum este implicat" n infec!ii cantonate n sfera uro-genital" (idem M. hominis).
Izolarea acestor bacterii se face pe medii de cultur" speciale, iar produsele patologice
trebuie n prealabil tratate pentru distrugerea microorganismelor asociate. Se dezvolt" lent
(6-9 zile) pe medii care con!in colesterol, fosfolipide #i extract de drojdie de bere. Formeaz"
colonii de dimensiuni mici, implantate n mediu, cu centrul nfundat #i zona periferic" clar".
Examenul microscopic n colora!ia Giemsa sau cu acridin-orange, eviden!iaz"
forma!iuni polimorfe.
Diagnosticul serologic se bazeaz" pe imunofluorescen!" #i tehnici imunoenzimatice.

CHLAMYDII

Chlamydiile sunt bacterii imobile de form" cocoidal", parazi!i obligatoriu
intracelulari, care se multiplic" n celula gazd" printr-un ciclu unic de dezvoltare, care le
deosebe#te de toate celelalte bacterii. Peretele lor celular este asem"n"tor cu al bacteriilor
Gram negative; au un metabolism propriu care ns" nu produce ATP, energia fiindu-le
furnizat" de c"tre celula gazd".
La genul Chlamydia se ntlnesc dou" tipuri de celule:
90
1. celule mici, sferice, cu nucleoid compact, perete celular dens #i activitate metabolic"
redus". Acestea sunt formele puternic infec!ioase, stabile extracelular, numite corpusculii
elementari.
2. celule mari, ovoidale, f"r" nucleoid dens, cu peretele celular lax, foarte active metabolic,
dispuse intracelular #i care poart" numele de corpusculii reticula!i (sunt formele de
replicare ala chlamydiilor).
Ciclul de dezvoltare al chlamydiilor:
Corpusculii elementari se ata#eaz" la celula gazd", faptul necesitnd existen!a la
nivelul chlamydiilor a unor situsuri termosensibile, iar la nivelul celulei gazd" a unor situsuri
la neuraminidaz" (pentru C. trachomatis).
Dup" ata#are chlamydiile sunt fagocitate printr-un proces preferen!ial (sunt
internalizate mai rapid dect orice alt" bacterie, sau particul" inert").
Ciclul de dezvoltare dureaz" aproximativ 48 ore.
n fagozom, corpusculii elementari r"mn ini!ial intac!i, ns" n cca. 8 ore se
transform" n corpusculi reticula!i; ace#tia reprezint" forma metabolic activ", adaptat"
existen!ei intracelulare #i care se multiplic" prin diviziune binar".
La cca. 20 ore de la infectarea celulei, corpusculii reticula!i se reorganizeaz" printr-un
proces de condensare, transformndu-se treptat n corpusculi elementari; dup" cca. 48 ore
vacuola este plic" de corpusculii elementari nou forma!i.
Celula se rupe, iar corpusculii elementari sunt pu#i n libertate, putnd s" reia un nou
ciclu infec!ios.
Infec!ii produse de Chlamydii:
1. C. trachomatis (patogen" uman"):
o
trahom = keratoconjunctivit" cronic" cu hipertrofie folicular" #i ulcera!ii
corneene - (serotipurile A, B, Ba, C),
o
uretrit" la b"rba!i, respectiv cervicit" #i salpingit" la femei, #i prin
autoinoculare conjunctivit" (serotipurile D-K),
o
limfogranulomatoz" inghinal" benign" = leziuni ale mucoasei genitale
asociate cu adenopatie regional" #i cu simptomatologie general" constnd
n: febr", artrit", conjunctivit", meningo-encefalit" - (serotipurile L1, L2,
L3).
2. C. pneumoniae este implicat" n producerea infec!iilor respiratorii (faringite,
traheo-bron#ite, pneumonii).
3. C. psitacii infecteaz" p"s"rile producnd psitacoz"-ornitoz".

Diagnosticul folose#te att metodele diagnosticului direct ct #i al celui serologic.
Examenul microscopic direct n frotiuri colorate Giemsa sau Machiavello eviden!iaz"
incluzii intracitoplasmatice dispuse n bonete polare. Fiind un parazit obligatoriu intracelular,
izolarea se poate face numai pe culturi de celule sau n oul embrionat.
Diagnosticul serologic se bazeaz" pe imunofluorescen!" #i RFC.


RICKETTSII

91
Rickettsiile sunt bacterii de form" cocoidal" sau cocobacilar", imobile, parazi!i
obligatoriu intracelulari, care se coloreaz" prin colora!iile speciale Giemsa, Machiavello #i
Giemenez. Pot fi izolate prin inocularea n culturi de !esuturi neproliferative sau n sacul
vitelin al oului de g"in" embrionat. Marea majoritate a speciilor se transmit prin vectori
(p"duche, purece, c"pu#"), excep!ie febra Q (produs" de Coxiella burneti) care se transmite
prin pulberi contaminate #i prin alimente.
Bolile produse poart" numele rickettsioze (fiind n general zoonoze excep!ie tifosul
exantematic care este specific uman"), #i evolueaz" de regul" ca #i febre exantematice
(excep!ie face febra Q care este o pneumonie intersti!ial").
Tifosul exantematic este produs de Rickettsia prowazeki, transmis" prin p"duche;
tifosul endemic este produs de R. mooseri, transmis" prin purece; febra butunoas" datorat"
speciei R. conorri, transmis" prin c"pu#"; febra Tsutsugamushi (tifosul de l"st"ri#) transmis"
prin c"pu#"; febra Q, agent etiologic Coxiella burneti care se transmite prin pulberi
contaminate; etc. Bolile men!ionate produse de c"tre speciile amintite sunt doar cteva dintre
rickettsiozele ntlnite n practic".


NO&IUNI DE PARAZITOLOGIE

Parazi!ii sunt organisme care tr"iesc fie toat" via!a, fie doar o parte din ea n
dependen!" de un alt organism viu, care poart" denumirea de gazd".
Gazda poate fi definitiv" sau intermediar".
Gazda definitiv! este organismul care g"zduie#te forma adult" a parazitului capabil"
de multiplicare (poate fi omul sau diferite animale). Gazda intermediar! este organismul
care g"zduie#te forme asexuate ale unor parazi!i, asigurnd maturarea #i multiplicarea lor,
pn" cnd acestea dobndesc capacitatea de a parazita gazda definitiv" (gazde intermediare
pot fi omul, diferite animale sau artropode).
Ciclul parazitar poate fi: simplu- cu trecerea direct" a parazitului la o gazd"
definitiv" sau complex- care presupune trecerea parazitului prin una sau mai multe gazde
intermediare, pn" cnd devine capabil s" paraziteze gazda definitiv".
Ac"iunea parazi"ilor asupra gazdei se manifest" prin:
- Spolierea organismului de substan!e nutritive,
- Ac!iune traumatic" (mecanic"),
- Ac!iune bacterifer" (ofer" por!i de intrare pentru bacterii #i condi!ii pentru multiplicarea
acestora),
- Ac!iune toxic" (toxinele parazitare putnd s" determine fenomene alergice cutanate,
respiratorii sau chiar instalarea #ocului anafilactic),
- Ac!iune iritativ reflex" (ex: cre#terea peristaltismului intestinal),
- Ac!iune iritativ tisular" (cu formare de granuloame sau apari!ia de fibroscleroz").
La ac!iunea parazitului, gazda poate reac"iona prin:
- Reac!ii celulare- anemie, hipereozinofilie (semnificativ" n cazul helmin!ilor),
- Reac!ii tisulare:- splenomegalia (m"rire de volum a splinei), formare de perichiste.
92
- Reac!ii imunitare- cu formare de anticorpi specifici care confer" rareori o imunitate
definitiv" sau cu apari!ia de complexe imune circulante ce pot conduce la diferite complica!ii
(ex: precipitarea la nivelul glomerulilor renali cu apari!ia unei glomerulonefrite).

Clasificarea parazi"ilor
1. Fungi (ciuperci, micete)- Ex: Candida spp., Aspergillus niger etc.
2. Protozoare:
Clasa Rhizopode - Ex: Entamoeba histolytica
Clasa Flagelate - Ex: Giardia (Lamblia) intestinalis
- Trichomonas vaginalis
Clasa Sporozoare: Ex: Plasmodium - vivax
- ovale
- falciparium
- malariae
Toxoplasma gondi
Clasa Ciliate: Ex: Balantidium coli
3. Helmin"i (viermi parazi!i):
Nemathelmin!i:
Clasa nematode - Ascaris lumbricoides
- Enterobius vermicularis
- Trichiuris trichiura
- Trichinella spiralis
Plathelmin!i:
Clasa Trematode- Ex: Fasciola hepatica
Clasa Cestode- Taenia - saginata
- solium
- Diphilobotrium latum
- Echinococcus granulossus

4. Artropode

NO&IUNI DE DIAGNOSTIC N BOLILE PARAZITARE

n multe parazitoze diagnosticul se bazeaz" pe eviden!ierea direct" a parazitului din
probele patologice prelevate de la bolnav. n alte situa!ii, r"spunsul organismului gazd" la
agresiunea parazitului (modific"ri biochimice, hematologice sau imunologice), poate orienta
diagnosticul spre un anumit grup de afec!iuni parazitare. Exist" #i situa!ii n care diagnosticul
de certitudine al unei parazitoze poate fi pus pe baza specificit"!ii de reac!ie a gazdei
(detectarea de anticorpi specifici).
Diagnosticul parazitologic: - Examenul parazitologic al sngelui,
- Examenul coproparazitologic,
- Examenul parazitologic al sputei,
- Examenul parazitologic al urinii,
- Culturi de protozoare.
93
Diagnosticul indirect: - Reac!ii antigen- anticorp,
- Investiga!ia r"spunsului imun celular,
- Alte metode (ex: examin"ri biochimice #i
hematologice) - cu valoare orientativ".

Examenul parazitologic al sngelui
Este indicat n suspiciunea de : malarie, leishmanioz" visceral", tripasonomiaz",
filarioz".
Examenul direc t- permite vizualizarea parazi!ilor mobili extraglobulari
(trypanosome #i filari).
Frotiul sangvin $ n strat sub!ire- permite examinarea bun" a morfologiei
parazi!ilor, dar exist" riscul de a da rezultate fals negative pentru c" se examineaz" un volum
foarte mic de snge.
- se aseptizeaz" pulpa degetului (indexul), se punc!ioneaz", se
ndep"rteaz" prima pic"tur" de snge.
- pic"tura urm"toare se depune pe lama de microscop #i se etaleaz"
cu o alt" lam" nclinat" la 45 de grade.
$ pic"tura groas"- examineaz" un volum mai mare de snge (cresc
astfel #ansele de decelare a parazi!ilor) dar, din cauza faptului c" parazi!ii sunt mai
retracta!i, este foarte greu de stabilit diagnosticul de specie.
- 2-3 pic"turi de snge, recoltate din pulpa degetului n
condi!ii de maxim" sterilitate, sunt depuse pe o lam" de microscop. Se amestec" circular cu
col!ul unei alte lame. Se usuc" lent n circa 30 de minute.
$ colorarea frotiului
- fixare cu metanol ( cteva secunde),
- acoperire cu solu!ie Giemsa 3% ( ph 7,2)
45 de minute,
- sp"lare,
- uscare n pozi!ie vertical",
- se examineaz" la microscop cu obiectivul
de imersie.

Examenul coproparazitologic
Este indicat n parazitoze produse de c"tre protozoare (amibiaza, giardioza) sau
helmin!i (ascaridoza, strongiloidoza, trichineloza, trichocefaloza, teniaza). Rezultatul va
men!iona specia parazitar", abunden!a lui #i stadiul evolutiv.
Examenul coproparazitologic se repet" dup" trei s"pt"mni n scop de control
posterapeutic.
Probele sunt recoltate ntr-un recipient curat #i care se poate nchide etan#. Pentru
examin"rile de rutin" se recolteaz" 3 probe (dou" din scaunul de emisie spontan" #i una
dup" administrarea unui laxativ) iar n suspiciunea de amibiaz" se recolteaz" 6 probe (trei
din scaunul de emisie spontan" #i alte 3 dup" administrare de laxative). Pentru transportul
probei se folosesc conservan!i (ex: metiolat- iod- formol sau formol 10%)
Examenul macroscopic urm"re#te:
94
- consisten!a (format, semiformat, moale, lichid),
- eventuala prezen!" a proglotelor de tenie sau a viermelui adult (Ascaris lumbricoides),
- eventuala prezen!" a sngelui (dac" este snge proasp"t pe suprafa!a unui scaun format
aceasta indic" prezen!a unor hemoroizi care sngereaz"; prezen!a de snge #i mucus ntr-un
scaun semimoale poate sugera o infec!ie amibiazic").
Examinarea proglotelor de tenie se face n ser fiziologic plasate ntre dou" lame de
microscop) #i permite identificarea speciei.
Nematodele sunt examinate dup" fixare n alcool 70% timp de 3 ore (se clarific" n
glicerin" 10%- n alcool, se monteaz" n glicerin" #i se acoper" cu lamela de sticl" pentru
examinare).
Examenul microscopic se poate practica n:
- Preparat nativ ( n ser fiziologic sau solu!ie Lugol)
- Preparat n strat gros
- Preparat dup" concentrarea elementelor parazitare
(tehnici diferite)
- Preparat colorat (permanent)
Preparatul nativ detecteaz": - trofozoi!i mobili (protozoare),
- larve mobile ( strongiloide),
- chiste de protozoare,
- ou" de helmin!i,
- prezen!a sngelui #i a mucusului.
(pe lama de microscop se depune o pic"tur" de ser fiziologic- eventual #i o pic"tur" de
solu!ie Lugol, se adaug" un mic fragment de materii fecale, se omogenizeaz", se acoper" cu
lamela #i se examineaz" la microscop cu un obiectiv uscat de 10, 20 sau 40).
Preparatul n strat gros (metoda Kato- Miura) - detecteaz" ou"le de helmin!i se
folosesc benzi de celofan !inute n solu!ie de glicerol- verde malahit timp de 24 de ore. Pe
lama de microscop se a#eaz" un mic fragment de materii fecale, peste care se dispune cu
pensa celofanul !inut n solu!ia men!ionat". Dispersia (sub celofan) se face cu o alt" lam".
Adausul de glicerol permite ndep"rtarea bulelor de aer. Se las" 30 de minute la temperatura
camerei #i se examineaz" la microscop cu un obiectiv uscat).
Metodele de concentrare sunt folosite pentru eviden!ierea ou"lelor de parazi!i aflate
n num"r foarte mic n prob" sedimentare n formol- eter, flot"ri n solu!ie de zaharoz").
Preparatul colorat - detecteaz" trofozoi!ii #i chiste de protozoare
Pot fi folosite: - colora!ia tricrom
- hematoxilin" feric"
- colora!ia Ziehl- Neelsen modificat"
Colora!ia Ziehl- Neelsen modificat":
1. fucsin" fenicat"- 30 de minute (la rece), sp"lare.
2. decolorare cu acid sulfuric concentrat 20 de secunde, sp"lare.
3. colorare cu solu!ie de verde malahit 5%, 3 minute, sp"lare, uscare
(se examinez" cu obiectivul de imersie).
Reac!ii antigen- anticorp
Pot fi practicate:
- imunelectroforeza,
95
- contraimunelectroforeza,
- reac!ia de aglutinare (inclusiv hemaglutinarea),
- reac!ia de fixare a complementului,
- reac!ia de imunofluorescen!",
- reac!ii imunoenzimatice ( ELISA).
Investigarea r"spunsului imuncelular
Se poate face prin:
- intradermoreac!ie,
- testul de inhibare al migr"rii macrofagelor,
- testul de transformare blastic",
- testul de degradare al bazofilelor.

Alte metode: urm"rirea hipereozinofiliei- care este mai pronun!at" n parazitozele
datorate helmin!ilor, ns" poate fi ntlnit" n diverse alte st"ri patologice (hemopatii,
alergii).


CANDIDOZELE





Morfologie




n genul Candida sunt clasificate aproximativ 150 de specii. Dintre acestea patogene
umane sunt doar 10. Specia tip este Candida albicans, comensal" la nivelul cavit"!ii bucale,
a intestinului #i a vaginului care #i manifest" patogenitatea numai n prezen!a unor factori
favorizan!i. n momentul actual sunt admise 4 condi!ii predispozante pentru declan#area
96
infec!iei cu Candida albicans:- vrsta: se remarc" o inciden!" crescut" la sugar #i la copilul
mic;- sc"derea rezisten!ei organismului prin: sarcin", disfunc!ii endocrine (cu predilec!ie la
diabetici), imunosupresie (tratamente cu corticoizi #i citostatice, deficit imun congenital,
infec!ie cu virusul HIV);- chimioterapia antibacterian" (prin producerea dezechilibrelor n
diferitele microbiocenoze n special la administrarea timp ndelungat pe cale oral") -
distrugerea barierelor anatomice prin: interven!ii chirurgicale, protez"ri, cateterisme,
tratamente injectabile.
Alte specii de Candida, mai frecvent izolate sunt: Candida tropicalis, Candida
glabrata, Candida parapsilosis #i Candida krusei. Speciile men!ionate sunt cauz" de infec!ii
nosocomiale. Dup" cte se presupune, cre#terea inciden!ei altor specii de Candida s-ar putea
datora utiliz"rii pe scar" larg" a Fluconazolului, care a redus inciden!a infec!iilor cu specia
Candida albicans.
Candida albicans poate s" produc":
-Candidoze mucoase: digestive, bronhopulmonare, urogenitale,
-Candidoze cutanate #i unghiale: intertrigo, perles (z"b"lu!"),
onix, perionix,
-Candidoze osteo-articulare: artrit", osteomielit",
-Candidoze viscerale: pneumonii, pericardite, miocardite,
endocardite, meningite, microabcese renale, endoftalmii,
-Septicemie,
-Candidoze alergice: prin produ#i de metabolism.

Candidoza bucal"
Se manifest" mai frecvent sub form" de stomatit" (muguet).
Stomatita candidozic" debuteaz" printr-o congestie intens" a mucoasei bucale #i a
limbii. Se nso!e#te de senza!ia de arsur" #i de usc"ciune a guri. n cteva zile pe fondul
eritematos, apar depozite albicioase, ini!ial izolate #i ulterior confluente. Se instaleaz" #i o
discreta disfagie.
Lipsa tratamentului conduce la apari!ia complica!iilor: cronicizarea sau extinderea
descendent" pe tubul digestiv (esofag, intestin).
Alte manifest"ri ale candidozei bucale pot fi:
- glosita median" (limba este hipertrofiat", depapilat" cu depozite albicioase
pe un fond intens eritematos)- Leziunile sunt prezente pe fa!a dorsal", naintea V-ului
lingual.
- uranita (granula!ii albicioase pe un fond intens eritematos al bol!ii palatine).
- cheilite angulare- fisuri ale mucoasei comisurii labiale acoperite de cruste #i
cu durere intens".
Diagnosticul de laborator:
Probele patologice: sunt recoltate n func!ie de localizarea procesului infec!ios, n
condi!ii similare cu cele pentru diagnosticul direct al infec!iilor bacteriene (trebuie men!ionat
c" pentru depozitele cutaneo- mucoase sau unghiale este preferabil raclajul).
Examenul microscopic direct: se poate face pe preparatul nativ sau pe frotiuri
colorate (Gram, Giemsa, Gomori, Mac Manus). Frotiurile permit punerea n eviden!" a:
ciupercii levuriforme, filamentelor sau a pseudomiceliilor.
97
Dup" examenul microscopic n laboratoarele dotate se poate practica diagnosticul de
boal" invaziv": a) amplificarea genic" (PCR) pentru probele de snge, saliv", urin" sau pl"gi
arse sau b) se caut" antigenele proteice de Candida albicans prin utilizarea de anticorpi
monoclonali.
Cultivarea 'i identificarea:
Pe mediul Sabouraud dup" 24-48 de ore la 23C, Candida albicans formeaz" colonii
de tip S (din care n preparatele microscopice se poate pune n eviden!" ciuperca
levuriform").
Pe mediul EMB (eozin"-metilen blue) Candida albicans formeaz" colonii cu aspect
de p"ianjen.
Pe agar cu extract de porumb se pot pune n eviden!" chlamidosporii.
Pe mediul Albicans ID- specia Candida albicans formeaz" colonii de culoare albastr".
Pe fluoro-agar- specia Candida albicans formeaz" colonii de tip S, fluorescente.
Mediul CHROM-agar- se folose#te ca #i mediu de diferen!iere ntre speciile:
- Candida albicans - care formeaz" colonii de tip S de culoare verde.
- Candida tropicalis- care formeaz" colonii de culoare grialb"strui,
nconjurate de un halou maro-purpuriu.
- Candida krusei- formeaz" colonii de tip R cu centrul roz #i marginile de
culoare alb".
Testul de filamenta!ie este absolut specific pentru specia Candida albicans.
O colonie se descarc" n 0,5 ml de plasm" de iepure #i se incubeaz" la 35C, timp de
dou" ore.
Din amestec se examineaz" la microscop o pic"tur".
* Exist" tulpini de Candida stellatoidea #i tulpini de Candida tropicales care
pot s" pozitiveze testul filamenta!iei.
* Anumite tulpini de Candida albicans sunt capabile s"-#i schimbe fenotipul ,
iar aceast" capacitate poate fi asociat" cu virulen!a #i invazia tisular".
* Candida albicans exprim" cel pu!in trei tipuri de adezine care faciliteaz"
ata#area de suprafe!ele epiteliale, urmat" de penetrarea n epiteliu, prin
producerea de aspartil proteinaz" #i formarea de hife.
Pentru identificarea altor specii de Candida sunt importante propriet"!ile de
metabolism. Intereseaz" n special metabolizarea zaharurilor. n acest sens, n momentul
actual, sunt utilizate kiturile de diagnostic.
Diagnosticul immunologic:
- pentru anticorpi este inutil,
- pentru eviden!ierea antigenelor nu este nc" suficient de standardizat.

PARAZITOZE PRODUSE DE PROTOZOARE

GIARDIOZA ( LAMBLIAZA)

Lambliaza este produs" de protozoarul Giardia intestinalis (Lamblia intestinalis).
Intereseaz" toate grupele de vrst", ns" este mai frecvent" la copiii mici.
Morfologia parazitului
Giardia intestinalis este un protozoar flagelat care poate exista sub dou"
forme: trofozoit #i chist.
98

Trofozoitul (forma vegetativ") are un corp cu simetrie bilateral", fa!a dorsal" este
bombat", iar fa!a ventral" jum"tate plan" #i jum"tate concav". Privit din fa!" parazitul are
form" de par", iar din lateral form" de lingur". Prezint" doi nuclei #i patru perechi de flageli
(fiecare pornind dintr-o pereche de blefaropla#ti). Detaliile morfologice sunt vizualizate n
preparate microscopice colorate: citoplasma este fin granulat" #i nu prezint" vacuole
digestive; nucleii sunt ovalari #i sunt dispu#i n dreptul unei depresiuni; blefaropla#tii sunt
dispu#i pe linia median" ntre nuclei.
Chistul, reprezint" forma de rezisten!" a parazitului putnd supravie!ui timp
ndelungat n mediul extern. Este ovalar, are o membran" extern" dubl", bogat" n chitin",
prezint" patru nuclei #i un m"nunchi de flageli. Pe axul chistului se pot eviden!ia resturi de
flageli dispuse n forma literei S (se coloreaz" n brun n preparatele microscopice realizate
n solu!ie Lugol).
Ciclul biologic
Giardia tr"ie#te sub form" vegetativ" la suprafa!a mucoasei duodeno-jejunale.
Formele vegetative (trofozoi!ii) au dou" posibilit"!i evolutive: diviziune binar", dnd na#tere
la noi forme vegetative #i transformarea n chiste (care n momentul emisiei prin materiile
fecale sunt puternic infec!ioase), constituind forma de diseminare a infec!iei.
Contaminarea uman", se realizeaz" prin ingestia chistelor de Giardia. Contaminarea
hidric": este principala modalitate de contaminare #i conduce la apari!ia epidemiilor.
Transmiterea direct" este posibil" n condi!iile de igien" deficitar" #i se realizeaz" prin
contact direct (mini murdare) sau indirect prin obiecte contaminate de minile murdare.
Transmiterea prin alimente (zarzavaturi, legume contaminate de dejecte umane ce con!in
chiste) este rar".
Diagnostic
Examenul coproparazitologic permite punerea n eviden!" a chistelor. Preparatul
nativ n ser fiziologic: este dificil de pus n eviden!" chistele. n solu!ie Lugol chistele se
coloreaz" n brun nchis #i sunt eviden!iate detalii de structuri. Frotiul se face din materii
fecale suspendate n ser fiziologic, se coloreaz" Wheatley-Gomori (cu tricrom) sau
Heidenhein (cu hematoxilin" feric") #i eviden!iaz" att formele chistice ct #i cele
vegetative.
n eliminarea chistelor exist" #i perioade negative de 7-10 zile, a#a nct se impune
repetarea examenului coproparazitologic de 4-5 ori la 7- 10 zile interval.
99
Examenul lichidului duodenal #i al bilei, permite eviden!ierea trofozoi!ilor .Se face
preparat nativ n care trofozoi!ii prezint" mi#c"ri caracteristice (sacadate de rostogolire) sau
frotiu colorat May Grnwald Giemsa pentru ob!inerea detaliilor structurale.
Tratamentul: Metronidazol, Tinidazol (Fasygine).


TRICHOMONIAZA UROGENITAL&

Este produs" de protozoarul flagelat Trichomonas vaginalis #i se transmite pe cale
sexual". Are predilec!ie pentru mediul urban #i este mai frecvent" la femei cu parteneri
sexuali multipli (risc crescut de asociere #i al altor boli cu transmitere sexual").
Morfologia
Trichomonas vaginalis este un parazit de form" ovalar", mobil #i care exist" numai sub
form" vegetativ" de trofozoit. Are un nucleu voluminos #i situat n partea anterioar", o mas"
de blefaropla#ti de la care pornesc patru flageli liberi (situa!i anterior), un flagel recurent
care este legat de membrana ondulant" (situat dorsal). n axul corpului prezint" o structur"
rigid" cu rol de sus!inere denumit" axostil.





Ciclul biologic
Este un parazit specific uman care se ntlne#te la femei #i la b"rba!i. La femei se
localizeaz" n vagin, dar poate interesa #i glandele Bartholin, cervixul #i aparatul urinar. La
b"rba!i se localizeaz" la nivelul #an!ului balano-prepu!ial #i uneori la nivelul prostatei #i a
veziculelor seminale.
Contaminarea uman" se face pe cale sexual".
Aspecte clinice
La femei se manifest" ca #i vulvovaginit" acut" cu leucoree spumoas" galben-verzuie
cu miros de mucegai #i care p"teaz" lenjeria. Se nso!e#te de prurit vulvar intens. Evolu!ia
este de lung" durat" incluznd #i perioade de remisie. Conduce la dispareunie.
Frecvent n evolu!ie se asociaz" #i cistita. La b"rba!i evolueaz" cel mai frecvent f"r"
manifest"ri clinice. Foarte rar pot s" apar" manifest"ri de uretrit".
100
Diagnosticul parazitologic:
Produsele patologice: La femeie se recolteaz" secre!ia vaginal" pe masa
ginecologic". La b"rbat secre!ia uretral" matinal" (secre!ia vaginal" se recolteaz" n
primele zile postmenstruale la cel pu!in 48 de ore dup" contact sexual sau sp"l"tur"
vaginal").
Examenul microscopic:
Preparatul nativ- se face n ser fiziologic, examinndu-se cu obiectivul uscat de 10
pentru detectarea parazi!ilor #i apoi cu obiectivul de 40 pentru identificare (examinarea se
face imediat dup" recoltare).
Frotiul poate fi colorat May- Grnwald- Giemsa, Gram, eozin" + albastru de
metilen, Poppenhein (n colora!ie May- Grnwald- Giemsa- citoplasma parazitului apare
albastru violet, iar nucleii #i flagelii se coloreaz" ro#u- violaceu).
Izolarea (se folose#te cnd examenul microscopic d" rezultate negative). Sunt
utilizate culturi pe mediile Lffler sau Simici ( incubare 24-72 de ore).
Diagnosticul indirect:
Diagnosticul serologic (cu specificitate destul de sc"zut") se poate face prin:
imunofluorescen!" indirect", latex aglutinere sau teste ELISA. Se poate face IDR (cu antigen
din parazi!i inactiva!i) dar este foarte rar folosit!
Tratamentul - Metronidazol,
- Tinidazol ( Fasygine),
- Secnidazol ( Flagentyl).
Tratamentul se aplic" ambilor parteneri, iar la femei se impune #i asocierea
tratamentului local.
PARAZITOZE PRODUSE DE HELMIN&I

NEMATHELMIN'I

ASCARIS LUMBRICOIDES
Este agentul etiologic al parazitozei numit" ascaridoz".
Morfologia parazitului:
Viermii adul!i au o culoare roz albicioas" #i dimensiuni mari. Sunt de sexe diferite.
Femelele sunt mai lungi (cca. 20-30 cm), iar masculii mai mici (15-20 cm) #i au extremitatea
posterioar" ncurbat". n urma acupl"rii, femelele elimin" ou" neembrionate. Oul este
ovalar #i are o culoare brun". Prezint" un nveli# dublu: extern mai gros #i de aspect
mamelonat #i intern neted #i stratificat (de natur" chitinoas"). n interior se g"se#te celula
ou nconjurat" de masa vitelin". Embrionarea se realizeaz" pe sol n 10- 40 zile. Oul
embrionat prezint" n interior o larva cilindric".
101

Ciclul biologic
Ascaris lumbricoides este un parazit specific uman. Viermii adul!i se localizeaz" la
nivelul intestinului sub!ire #i au o longevitate de 10-24 de luni. Femelele depun zilnic cca.
250000 de ou" fecundate care se emit odat" cu materiile fecale contaminnd mediul ambiant
( igien" deficitar").
Contaminarea uman" se produce prin ingestia de ou" embrionate existente pe legumele
nesp"late #i pe minile murdare de p"mnt. Larva eliberat" din ou la nivelul tubului digestiv,
traverseaz" peretele intestinal #i desf"#oar" ini!ial un ciclu perienteric necesar adapt"rii la
condi!iile de anaerobioz". Ciclul perienteric presupune o etap" hepatic" (de 4-5 zile) dup"
care larvele ajung n circula!ia sangvin" #i n septele interalveolare pulmonare. Urmeaz"
etapa pulmonar" (de 5-7 zile) n care larvele progreseaz" n c"ile respiratorii pn" la
faringe. Pot fi expulzate sau nghi!ite, situa!ie n care ajung n tubul digestiv #i se transform"
n viermi adul!i relund un nou ciclu.
Diagnostic. n fazele ini!iale se poate doar suspiciona parazitoza pe baza unei
hipereozinofilii (relevat" de tabloul sangvin). Diagnosticul de certitudine se poate face n
etapa intestinal". Macroscopic- pot fi eviden!ia!i viermii adul!i elimina!i prin materiile fecale
(excep!ional de rar pe cale bucal"). Examenul coproparazitologic: preparatul nativ realizat
din materiile fecale pune n eviden!" ou" cu morfologie caracteristic".



ENTEROBIUS VERMICULARIS ( OXIURUL)

Parazitoza produs" se nume#te oxiuroz" #i este specific uman".
Morfologie
Viermele adult are o talie mic" (femelele, maximum 1 cm, iar masculii maximum 0,5
cm- cu extremitatea posterioar" ncurbat") #i culoare alb". La partea anterioar" viermii
adul!i prezint" dou" proeminen!e transparente care formeaz" butonul cefalic cu rol de fixare.
n urma fecund"rii, femelele emit ou" embrionate (contagioase). Oul este ovalar #i are un
nveli# dublu format din dou" membrane sub!iri unite ntr-un punct lateral. n interior este
prezent embrionul giriniform n"scut (n cteva ore se transform" n larv" vermiform").
102



Ciclul biologic
Viermii adul!i paraziteaz" intestinul uman la nivelul regiunii ileo-cecale. Dup"
acuplare femelele matureaz" ou" embrionate (n circa 30 de zile, timp n care r"mn
cantonate la nivelul regiunii ileo-cecale, #i ncep s" migreze descendent spre anus, for!eaz"
sfincterul anal #i depun n pliurile mucoasei (mai ales seara #i n cursul nop!ii), cte 10000
de ou" (embrionate).
Contaminarea se poate realiza prin:
a) Infesta!ie ecogen"- prin contact direct cu persoana parazitat" sau
indirect prin obiecte contaminate.
b) Autoinfesta!ie exogen" prin mecanism fecal-oral (n condi!ii de
igien" deficitar").
c) Autoinfesta!ie endogen" care se produce rar cnd femela de
oxiur depune ou" n grosimea mucoasei intestinale, care
eclozeaz" #i se elibereaz" larvele care evolueaz" spre viermi
adul!i ( n 2-4 s"pt"mni).
d) Retrofec!iunea, apare n condi!ii de igien" total deficitare. Ou"le
r"mn mult timp n regiunea perianal", iar larvele eclozate se
rentorc n intestin.

Aspecte clinice
Principalul simptom este pruritul anal nocturn nso!it de irita!ie perianal" sau chiar
eczem" #i manifest"ri nervoase. Localiz"rile ectopice ale viermilor adul!i pot s" conduc" la
declan#area de apendicite, enterite hemoragice sau chiar vulvovaginite (la feti!e).
Diagnostic parazitologic:
a) macroscopic: vizualizarea femelelor de oxiur la nivelul pliurilor mucoasei
anale.
b) microscopic: se bazeaz" pe efectuarea scoth-testului (testul Graham)
care const" n aplicarea pe mucoasa anal" a unui fragment de scoth
(pentru prelevarea ou"lor) #i transpunerea lui pe o lam" pentru
examinarea microscopic".


PARAZITOZE PRODUSE DE CESTODE

103
Plathelmin!ii sunt viermi parazi!i care au corpul turtit dorsoventral. Sunt grupa!i n
dou" clase: Trematode #i Cestode. n clasa Cestode sunt clasifica!i viermii pla!i care au
capul segmentat.
Caractere generale.
Viermii adul!i sunt forma!i din:
a) scolex (capul) prev"zut cu organe de fixare (ventuze, crlige sau botridii)
dispuse n una sau mai multe coroane.
b) col (gt) reprezentat de un !esut proliferativ care genereaz" proglotele
(segmentele corpului).
c) strobila (cap) format" dintr-o n#iruire de proglote. Cele tinere (situate n
vecin"tatea colului) au aparatul reproduc"tor imatur. Urmeaz" proglotele
mature (la care toate organele sunt bine dezvoltate) #i la cap"tul distal
(terminal) al viermelui, proglotele b"trne la care organele interne sunt
involuate cu excep!ia uterului ce ocup" proglotul n totalitate #i care practic
este un sac plin cu ou".
La unele specii uterul este nchis iar eliminarea ou"lor se face prin ruperea
proglotului, n timp ce la alte specii se deschide la exterior printr-o structur"
numit" tacostom, fapt care permite eliminarea ou"lor pe m"sura form"rii lor
(exemplu: Botriocefalul).
La cestode hr"nirea se face prin osmoz".
Sunt organisme hermafrodite caracterizate prin tipul de hermafroditism proterandric
(fecundarea se realizeaz" ntre proglote nvecinate).

TENIOZELE
Sunt parazitoze produse de : Taenia solium ( prin consum de carnea de porc) #i
Taenia saginata ( prin consum de carne de vit").

Taenia saginata

Morfologie
Viermele adult are o lungime de 6-8 m #i culoare alb opac". Scolexul prezint" 4
ventuze #i nu are crlige (tenie nearmat"). Strobila este format" din 1200- 2000 de proglote
cu papila genital" dispus" pe p"r!ile laterale, dup" o alternan!" neregulat". n proglotele
b"trne, uterul este bine dezvoltat, are 20-30 de ramifica!ii nchise n deget de m"nu#".
Ou"le sunt embrionate, au un nveli# extern fragil, iar n interior se g"se#te
embrionul format din embrionul hexacant #i un nveli# radial gros, de culoare brun".
Forma larvar" se nume#te cisticerc ( Cysticercus bovis).


Ciclul biologic
104
Omul este gazda definitiv", fiind parazitat la nivel intestinal cu viermele adult.
Proglotele b"trne se desprind din strobil" #i progreseaz" activ, str"bat sfincterul ileo-cecal,
apoi cel anal #i se elimin" din organism n intervalul dintre defeca!ii.
Pe sol proglota se sparge, ou"le se elibereaz" #i contamineaz" mediul ambiant.
Embrionii sunt ingera!i de c"tre gazda intermediar", reprezentat" prin bovine.
n intestinul animalului, prin dilacerarea nveli#ului radial se elibereaz" embrionii
hexacan!i, care str"bat peretele intestinal #i care prin circula!ia sangvin" ajung la nivelul
musculaturii active (miocard, mu#chi masticatori, etc.) unde se veziculeaz", dnd na#tere
formei larvare- cisticercul.
Contaminarea uman" se realizeaz" prin consumul de carne de vit" necontrolat"
veterinar #i care con!ine cisticerci.
n intestinul uman por!iunea vezicular" a cisticercului se dilacereaz", se elibereaz"
scolexul care se fixeaz" pe mucoasa intestinal", iar !esutul proliferativ al colului genereaz"
proglotele strobilei. n 2-3 luni se formeaz" viermele adult.
Aspecte clinice
n general parazitoza evolueaz" cu o simptomatologie digestiv" (crampe abdominale,
diaree alternnd cu constipa!ie).
Diagnosticul teniazei
Anamneza- relev" consumul de carne de vit" #i eliminarea de proglote n perioadele
dintre defeca!ii.
Examenul macroscopic (cu lupa) al proglotelor permite orientarea diagnosticului pe
baza particularit"!ilor de structur".
Examenul coproparazitologic- neconcludent. Metoda cea mai bun" este scoth
testul care permite detectarea ou"lor r"mase pe pliurile mucoasei anale, dup" spargerea
accidental" a proglotei la str"baterea sfincterului anal.
Intradermoreac"ia (IDR)- folose#te antigenul extras din cisticerc #i se folose#te
pentru depistarea focarelor epidemice.

Taenia solium
Morfologie
Viermele adult are 2-3 m lungime #i o culoare alb- l"ptoas" transparent".
Scolexul este prev"zut cu 4 ventuze #i un rostru care prezint" o coroan" dubl" de
crlige, care permit fixarea pe mucoasa intestinal" (tenie armat").
Strobila este format" din 700-1000 de proglote, care au papila genital" dispus" pe
p"r!ile laterale ale proglotelor dup" o alternan!" regulat".
Uterul este bine dezvoltat, prezint" 7-10 ramifica!ii nchise n deget de m"nu#" #i este
plin cu ou".
Ou"le sunt embrionate #i con!in embrionul hexacant. Forma larvar" se nume#te
Cysticercus cellulose.
Ciclul biologic
Gazda definitiv" este omul, parazitat la nivel intestinal, cu viermele adult.
Proglotele b"trne se deta#eaz" din strobila viermelui #i se elimin" cu materiile
fecale.
Gazda intermediar" este porcul, care inger" proglote ntregi.
105
n tubul digestiv al animalului, sunt pu#i n libertate numero#i embrioni hexacan!i,
care str"bat peretele intestinal #i prin circula!ia sangvin" ajung la nivelul musculaturii #i
!esutului subcutanat, unde prin veziculizare formeaz" cisticercii. Cisticercoza porcin" este
masiv" (datorit" ingestiei de proglote ntregi).
Contaminarea uman" se realizeaz" prin consumul de carne de porc cu cisticerci. n
intestin se elibereaz" scolexul, iar !esutul proliferativ al colului genereaz" elementele
strobilei. n 2-3 luni se formeaz" viermele adult.
Aspecte clinice.
Parazitozele evolueaz" cu o simptomatologie digestiv" nespecific", iar bolnavii sunt
deranja!i de eliminarea periodic" de fragmente de strobil".
Pot ns" s" apar" complica!ii, prin localizarea proglotelor n apendice
(apendicita) sau n c"ile biliare (angiocolita). Cea mai grav" complica!ie este ns"
cisticercoza uman".
Diagnosticul teniozei se face la fel ca #i n cazul teniozei de carne de vit".

BOLI PRODUSE DE LARVE
CISTICERCOZA UMAN&

Este o parazitoz" produs" prin dezvoltarea n organismul uman a cisticercilor de
tenie.
Mecanismul de producere
Autoinfesta!ia- se produce la persoanele parazitate cu viermi adul!i
a) endogen"- poate fi datorat" abuzului de condimente sau b"uturi alcoolice
Proglotele b"trne desprinse din strobil" pot fi regurgitate n stomac. Sunt eliberate
mii de ou", iar cisticercoza dezvoltat" va fi masiv" #i netratabil".
b) exogen"- se produce pe cale fecal oral" n condi!ii de igien" defectuoas" (prin
mini murdare se realizeaz" un aport limitat de ou" n cavitatea bucal"). Cisticercoza astfel
rezultat" va fi moderat".
Infesta!ia exogen"- se realizeaz" prin ingestia unui num"r mic de ou", prezente pe legumele
nesp"late. Cisticercoza rezultat" va fi discret".
Diagnostic
n fazele de debut hemograma relev" o hipereozinofilie cu valoare orientativ". Tot
valoare orientativ" au #i alte examin"ri radiologice (cisticercoza muscular"), oftalmoscopice
(cisticercoza ocular"); diagnosticul de certitudine se bazeaz" pe biopsia cisticercilor pentru
eviden!ierea n preparate microscopice a structurii lor caracteristice.
Diagnosticul serologic (prin reac!ia de fixare a complementului sau prin reac!ia de
precipitare inelar") se folose#te n fazele avansate ale bolii.
Diagnosticul biologic se face prin IDR cu antigen extras din cisticerc.

CHISTUL HIDATIC
Este o parazitoz" datorat" dezvolt"rii n organismul uman a formei larvare a unei
tenii de dimensiuni mici numit" Echinococcus granulosus.
Morfologie
106
Viermele adult este format din scolex (cu 4 ventuze #i o coroan" dubl" de crlige), col
#i strobil" format" din 3 proglote: tn"r", matur" #i b"trn" (care con!ine 400-800 de ou"
embrionate). Ou"le con!in embrioforul format din embrionul hexacant #i un nveli# radiar
gros. Forma larvar" se nume#te hidatid" ( la om- chist hidatic) #i este o vezicul" polichistic"
#i policefalic".
Ciclul biologic. Viermii adul!i paraziteaz" intestinul cinelui #i al altor canide s"lbatice
(lup). Spargerea proglotei b"trne conduce la eliberarea de ou" embrionate, care sunt emise
prin materiile fecale, contaminnd blana animalului #i mediul ambiant. Gazda intermediar"
este reprezentat", de obicei, de ovine. Accidental ns" forma larvar" se poate dezvolta #i n
organismul uman.
Contaminarea uman" se realizeaz" prin ingestia de ou" embrionate (n condi!ii de igien"
deficitar"). Ou"le ingerate, n tubul digestiv pierd nveli#urile, se elibereaz" embrionii
hexacan!i, care str"bat peretele intestinal, disemineaz" hematogen #i se localizeaz" n ficat
(60%), pl"mni (30%) sau alte organe (10%). La nivelul viscerelor, hidatida se dezvolt" lent,
induce formarea unei membrane reactive (membran" polichistic"), mpreun" cu care
formeaz" chistul hidatic. Ciclul biologic poate fi nchis, atunci cnd gazda intermediar" este
reprezentat" prin animale ierbivore care devin prad" pentru canide.
Diagnostic:
Examenul radiologic ofer" informa!ii orientative eviden!iind prezen!a unei forma!iuni
pseudotumorale. Examenul parazitologic se poate face numai dup" excizia chirurgical",
fiind interzis" punc!ia chistului. Macroscopic, aspectul este caracteristic, iar microscopic (n
preparat nativ) se pun n eviden!" scolec#i liberi sau grupa!i n vezicule prolegere.
Diagnosticul serologic este foarte important (asigur" diagnosticul n 90% din
cazuri). Pot fi practicate reac!ii cu antigen solubil: reac!ie de fixare a complementului,
reac!ie de latex aglutinare, reac!ie de hemaglutinare pasiv" sau imunelectroforez". Singura
reac!ie cu antigen ntreg este reac!ia de imunoflurescen!" indirect". Intradermoreac!ia
Cassoni se folose#te pentru diagnosticul biologic.

NOTE PERSONALE















107











LUCRAREA NUM#RUL 13. VIRUSOLOGIE



Diagnosticul de laborator n infec!iile virale se bazeaz" pe :
% examinarea microscopic" a produselor patologice #i a !esuturilor
infectate, pentru punerea n eviden!" a unor modific"ri caracteristice
virusurilor
% cultivarea #i identificarea agen!ilor virali
% demonstrarea unei cre#teri semnificative a titrului anticorpilor specifici,
prin compararea serului de faz" acut" #i a serului de convalescent.
Virusurile sunt caracterizate printr-un parazitism absolut. Pentru a se putea multiplica,
ele trebuie s" infecteze celulele vii. Datorit" acestui fapt sunt cultivabile numai prin inoculare
n sistemele celulare: a) animale de experien!"; b) ou" embrionate; c) culturi de celule.
Pentru diagnosticul direct virusologic, se recolteaz", n general, acelea#i probe
patologice ca #i pentru diagnosticul direct bacteriologic, ns" este indicat" utilizarea de
stabilizatori virali, iar recoltarea (care se face n primele 4-5 zile de la debutul
simptomatologiei clinice) se face n solu!ia Hanks.

CULTIVAREA VIRUSURILOR

INOCULAREA LA ANIMALE DE EXPERIEN&'

Aceast" metod" nu se mai folose#te ast"zi n scop diagnostic; inocularea la animale se
practic" numai n scopuri de cercetare.
Pentru inocul"ri se utilizau animale mici: #oareci, hamsteri, cobai, iepuri.
Exist" diferen!e semnificative de sensibilitate fa!" de acela#i virus, nu numai n
func!ie de specie, dar #i dup" rasa #i vrsta animalului.
C"ile de inoculare utilizate sunt: subcutanat", intravenoas", intranazal",
intraperitoneal", scarificare cutanat" sau corneean", inoculare intracerebral". Unele c"i
reproduc modalitatea de p"trundere a virusului n organismul uman, altele (ex:
intracerebral") pot fi considerate artificiale.
108
n organismul animalului inoculat, virusul replicat este prezent n snge #i !esuturi #i
animalul prezint" semne de boal". n lipsa acestor semne, pot fi executate pasaje
oarbe (snge, triturat de !esuturi de la animalul inoculat, vor fi inoculate la un alt animal,
sau n alte sisteme celulare), care s" asigure replicarea virusului pn" la un titru care s"
determine apari!ia unor leziuni evidente.

Criterii care demonstreaz" replicarea viral":
- prezen!a de leziuni macroscopice #i/ sau microscopice la nivelul !esuturilor.
- reproductibilitatea leziunilor prin inocularea de snge sau triturat de !esuturi la alte
animale.
Dup" ce s-a demonstrat replicarea viral", sngele #i trituratul de !esuturi vor fi
utilizate drept antigene virale n reac!iile de identificare.
Exemple de inocul"ri:
- virusurile Coxsackie pot fi izolate prin inoculare subcutanat" la #oarecele sugar (cu
acela#i produs patologic se inoculeaz" to!i #oarecii dintr-un cuib). (oarecii inocula!i cu
virusul Coxsackie A dezvolt" o paralizie flasc", iar microscopic se eviden!iaz" leziuni de
miozit" generalizat", iar cei inocula!i cu Coxsackie B dezvolt" o paralizie spastic",
microscopic fiind prezente leziuni de miozit" localizat" #i alte leziuni degenerative n SNC
#i viscere.
- virusurile gripale se izolau prin instilare intranazal" la #oarecele adult. Animalul dezvolt"
o pneumonie intersti!ial" caracteristic".
- virusurile herpetice se izolau prin scarificare cornean" la iepure. Animalul va dezvolta o
keratoconjunctivit".
- virusul rabic se izoleaz" prin inoculare intracerebral" la #oarece. Animalul dezvolt" o
encefalit" rabic", iar n preparatele microscopice (sec!iuni prin substan!a nervoas"- colorate
cu hematoxilin"- eozin" se pun n eviden!" corpusculii Babe#- Negri (incluziuni acidofile n
neuroplasm").

INOCULAREA N OUL EMBRIONAT


109
Acest tip de inoculare a fost abandonat n ce prive#te diagnosticul de rutin", dar
metoda se practic" nc", pentru replicarea virusurilor gripale n vederea prepar"rii
vaccinurilor.
Metoda era folosit" pentru:
% izolarea virusurilor gripale- inocularea n cavitatea alantoidian" sau amniotic".
% izolarea virusului urlian- inocularea n cavitatea amniotic" sau n sacul vitelin.
% izolarea herpesvirusurilor- inocularea pe membrana corioalantoidian".
Pentru inocul"ri sunt utilizate ou" fecundate #i care au cochilia alb". Acestea se spal",
degreseaz" #i dezinfecteaz" dup" care se usuc" #i se incubeaz" la 38C n atmosfer" cu
umiditate 60%.
Dup" patru zile de incubare sunt examinate la ovoscop prin transiluminare,
verificndu-se viabilitatea embrionului (pot fi inoculate numai ou" cu embrion viabil).
Pentru inoculare, oul se plaseaz" pe ovoscop cu embrionul la partea superioar", se
aseptizeaz" cochilia #i n dreptul camerei cu aer se practic", n cochilie, un orificiu care va
servi pentru introducerea acului unei seringi n care s-a aspirat produsul patologic. Orientarea
acului se va face n pozi!ie specific" pentru fiecare tip de inoculare. Volumul de produs
patologic inoculat va fi de 0,2 ml #i obligatoriu se inoculeaz" 2-3 ou" cu acela#i produs
patologic.
Pentru inocularea pe membrana corioalantoidian" este necesar" ob!inerea unei false
camere cu aer prin practicarea unui orificiu suplimentar pe una dintre p"r!ile laterale ale
oului. Se aplic" pe orificiul practicat n dreptul camerei cu aer o par" de cauciuc, se aspir",
con!inutul oului se deplaseaz" #i prin orificiul lateral p"trunde aer. Falsa camer" cu aer
conduce la ndep"rtarea membranei corioalantoidiene de membrana proprie.
Cu pipeta se depun cca 0,2 ml de produs patologic direct pe membrana corioalantoidian".
Orificiile din cochilie se nchid #i ou"le sunt incubate un timp #i la o temperatur" care s"
permit" replicarea virusului (presupus prezent n produsul patologic).
Criterii care demonstreaz" replicarea viral":
- imobilitatea embrionului, semn al mor!ii sale (se eviden!iaz" prin transluminare la
ovoscop).
- prezen!a la nivelul membranelor de hemoragii, ngro#"ri, opacifieri sau a unor noduli
pe membrana corioalantoidian" (se eviden!iaz" prin examinarea cu lupa a membranelor,
dup" ce s-au prelevat lichidele embrionare, iar oul a fost deschis #i con!inutul deversat
ntr-un recipient steril).
- dobndirea de c"tre lichidele embrionare a unor propriet"!i caracteristice virusului
replicat, cum ar fi de exemplu capacitatea hemaglutinant".
Dup" demonstrarea replic"rii virale, lichidele embrionare vor fi utilizate drept
antigene virale n reac!iile de identificare.

110












Noduli pe membrana corioalantoidian" n oul embrionat dup" inoculare cu virusul variolic (A) #i cu virusul
vaccinal (B). Mici noduli secundari sunt vizibili pentru virusul vaccinal (dup" Courtesy I.J., Downie A.W.,
1971).

INOCULAREA N CULTURI DE CELULE

Probele patologice pot fi inoculate pe:
a) culturi de celule diploide (primare sau secundare );
b) linii celulare stabilizate.
Culturi celulare primare: !esutul de origine este dezintegrat cu o enzim" proteolitic"
(ex: tripsina), iar celulele sunt reluate ntr-un mediu de cre#tere introdus ntr-un recipient
steril (au forme diferite #i pot fi confec!iona!i din sticl" neutr" sau plastic). Celulele
sedimenteaz" #i ader" de peretele recipientului care este acoperit de mediul de cre#tere. Se
multiplic" prin diviziune binar" pn" la formarea unui monostrat confluent. n acest stadiu
diviziunile celulare nceteaz" datorit" inhibi!iei de contact. Culturile primare pot fi utilizate
pentru inocularea produselor patologice sau n vederea multiplic"rii celulelor (nu toate
celulele se preteaz" ns" la pasaje).
Culturi celulare secundare: cultura primar" este desprins" de pe peretele
recipientului prin tripsinizare blnd" (dup" ce mediul de cre#tere a fost ndep"rtat). Celulele
desprinse sunt reluate ntr-un mediu proasp"t unde sedimenteaz", ader" #i se multiplic" pn"
la formarea monostratului confluent. Dup" un num"r variabil de pasaje, rata de cre#tere scade
#i celulele mor.
Linii celulare stabilizate: pentru acele celule care se preteaz" la multiple pasaje, la
al 60-70-lea pasaj se constituie arii de celule transformate, cu abera!ii morfologice #i
func!ionale care au pierdut inhibi!ia de contact #i cresc anarhic. Astfel de celule pot fi pasate
practic la nesfr#it dac" sunt asigurate condi!iile necesare. Transformarea celular", n afara
apari!iei spontane, poate fi #i indus", prin virusuri oncogene sau prin substan!e chimice
mutagen-cancerigene.
Exemple de linii stabilizate:
- de provenien!" uman":
- Hela- din carcinom de col uterin;
- KB- din carcinom laringian;
111
- Hep-2- din carcinom hepatic;
- RD din rabdomiosarcom;
- L132- din pl"mn embrionar.
- provenite de la animale:
- Vero- din rinichi de maimu!";
- BHK-21- din rinichi de hamster;
- PK- din rinichi de porc;
- Ma 188- din testicul de cal;
- RK din rinichi de iepure.
Culturile celulare sunt examinate pentru: activitatea metabolic" (eviden!iabil"
macroscopic prin acidifierea mediului cu virajul spre galben al indicatorului ro#u fenol);
monostratul celular confluent se eviden!iaz" prin examinarea la microscopul reversat.
Acela#i produs patologic (sau suspensie viral") se inoculeaz" pe minimum dou"
tuburi cu culturi de celule. Din recipient se ndep"rteaz" mediul de cre#tere. Se inoculeaz"
produsul patologic sau suspensia viral" n volum de 0,2 ml/ tub. Se las" o or" la temperatura
laboratorului (20-22C), pentru ca virusul s" se adsoarb" pe receptorii celulari, apoi se
introduce mediul de ntre!inere. Se incubeaz" la 37C. Mai frecvent incubarea se face
sta!ionar. Pentru unele virusuri este ns" necesar" incubarea cu rota!ie.
La intervale de timp culturile sunt examinate pentru punerea n eviden!" a
modific"rilor care s" ateste replicarea viral".
Criteriile care demonstreaz" replicarea viral" sunt:
% Inhibi!ia metabolismului celular:
- se pune n eviden!" prin examinarea macroscopic" a culturilor
(indicatorul colorimetric vireaz" spre violet- datorit"
acumul"rii de compu#i alcalini rezulta!i din distrugerea
celulelor).
% Efectul citopatogen (ECP):
- poate fi de tip degenerativ (citocid) ca #i n cazul virusurilor
poliomielitice; celulele se rotunjesc, se mic#oreaz", nucleul
devine picnotic distruc!ia celulelor fiind total" n 24-72 de ore.
- unele virusuri produc ECP n focar (apar focare de celule
rotunjite care se desprind treptat de pe peretele recipientului).
Ex: adenovirusuri.
- exist" #i virusuri care produc ECP de tip sinci!ial (celulele
fuzioneaz" #i apar mase celulare multinucleate care se desprind
treptat de pe peretele recipientului). Ex: VRS.
% Hemadsorb!ia:
- reprezint" capacitatea celulelor infectate cu unele virusuri de a
fixa pe suprafa!a lor hematii, urmare a unor modific"ri
specifice la nivelul membranelor celulare determinate de
prezen!a virusului replicat (se eviden!iaz" la microscop).
% Interferen!a viral":
- este o metod" indirect" care permite decelarea replic"rii unui
virus necitopatogen. Se procedeaz" la suprainfectarea celulelor
112
cu un virus citopatogen cunoscut (virus indicator). Prezen!a n
celule a virusului necitopatogen mpiedic" suprainfec!ia
celulelor cu virusul indicator.
% Incluziile celulare:
- celulele infectate viral sunt colorate #i examinate la microscop.
Se pot pune astfel n eviden!" incluzii fie intranucleare, fie
intracitoplasmatice, fie la ambele nivele.
- incluziile intranucleare sunt prezente n celulele infectate cu
adenovirusuri, Herpetoviridae, Papovaviridae.
- i ncl uzi i l e i nt r aci t opl asmat i ce sunt pr ovocat e de
Paramyxoviridae, Reoviridae, Rhabdoviridae, Poxviridae.
- incluziile intranucleare #i intracitoplasmatice se dezvolta n
timpul multiplic"rii v. rujeolei, v. citomegalic.


HEp-2 monostrat celular confluent K.B monostrat celular confluent


P.E.U-celule de pl"mn emrionar uman E.E.U-celule de embrion uman total
Dup" Anderca I. et Ianconescu M., - 1962
113


HEp-2 infectat cu Herpesvirus simplex HEp-2 infectat cu Herpesvirus simplex
ECP n focar, incluzii intranucleare ECP de tip sinci!ial


HEp-2 infectat cu VRS Celule diploide din rinichi uman infectate cu virus
ECP de tip sinci!ial rujeolic, incluzii intranucleare #i intracitoplasmatice


Dup" Courtesy I.J. en Medical Virology (Fenner F., White D.O.) - 1971

REAC&II ANTIGEN-ANTICORP UTILIZATE N VIRUSOLOGIE

n infec!iile virale acelea#i reac!ii antigen-anticorp pot fi folosite pentru:
- identificarea virusurilor cu ajutorul unor seruri antivirale standard diagnostic
virusologic.
- eviden!ierea anticorpilor din serul de cercetat cu ajutorul antigenelor virale cunoscute
- diagnostic serologic.
n reac!iile cantitative, diagnosticul serologic se stabile#te pe baza cre#terii dinamice
(de cel pu!in patru ori) a titrului anticorpilor, comparndu-se titrul serului de convalescent cu
cel al serului de faz" acut". Serul de faz" acut" se recolteaz" n primele 4-5 zile de la debutul
simptomatologiei clinice, atunci cnd se recolteaz" #i probele patologice pentru diagnosticul
direct, iar serul de convalescent dup" 10-14 zile de la prima recoltare.
114
% Reac!ia de hemaglutino-inhibare (RHI) este utilizat" pentru eviden!ierea virusurilor
hemaglutinante (gripale, paragripale, rubeolic, rujeolic, urlian, coronavirusuri, adenovirusuri
etc).
% Reac!ia de fixare a complementului (RFC) este utilizat" n infec!ii cu
adenovirusuri, enterovirusuri, herpesvirusuri, virusuri paragripale etc. n virusologie este
utilizat" tehnica Bradstreat- Taylor (n pl"ci cu godeuri).
% Reac!ia de seroneutralizare (RSN) poate fi folosit" pentru diagnostic n infec!iile cu
enterovirusuri, paramyxovirusuri, adenovirusuri, herpesvirusuri.
% Reac!ia de inhibare a hemadsorb!iei se utilizeaz" pentru virusurile care au
capacitatea de a produce fenomenul de hemadsorb!ie (virusurile gripale).
% Teste de imunodifuzie (nu se mai folosesc actualmente):
a) difuzia radial";
b) hemoliza radial"
c) contraimunelectroforeza
% Reac!ii antigen- anticorp cu reactan!i marca!i:
a) imunofluorescen!a
b) radioimunoadsorb!ia
c) teste imunoenzimatice

Imunoelectrotransfer (western-blot).
% Imunoelectronomicroscopia: ex: infec!ii cu rotavirusuri sau cu virusul hepatitei A
(HAV) etc.

Reac"ia de hemaglutino-inhibare
Se poate folosi ca #i celelalte reac!ii #i n diagnosticul direct #i n diagnosticul
serologic.
Pentru diagnosticul direct se ncepe cu titrarea antigenului printr-o reac!ie de
hemaglutinare, iar n reac!ia de hemaglutino-inhibare se va folosi antigenul la valoarea de 4
UHA (unit"!i hemaglutinante).





Reac!ia de hemaglutinare (titrarea antigenului)
Godeu nr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
S e r
f i z i ol ogi c
(ml)
0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

A n t i g e n
viral (ml)
0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
Suspensi e
h e m a t i i
(ml)
0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
115


Reac!ia de hemaglutino-inhibare se lucreaz" conform schemei:

Citirea reac!iei urm"re#te s" stabileasc" care dintre serurile antivirale are capacitatea de a
inhiba fenomenul de hemaglutinare care este caracteristic virusului izolat, indicnd astfel
diagnosticul.
















Exemplu (identificarea virusurilor gripale):

RHA , - 1/8 1/16 1 /32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024
D i l u " i i
ob"inute
) * 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024
Godeu nr.
1 2 3 4 5 6 7 8
Ser fiziologic
(ml)
0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
Ser antiviral
(ml)
Se fac dilu"ii
binare n ser
fiziologic
0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
Antigen viral
4 UHA ( ml)
0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
Se incubeaz! 60 de minute la 22 C
Suspensie de
hematii 0,5 %
( ml)
0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Se incubeaz! 60 de minute la 22 C. Se cite'te reac"ia
116



RHI

Ser standard anti AH1N1


Ser standard anti AH2N2

Ser standard anti AH3N2

= absen!a hemaglutin"rii (la titrarea prin reac!ia de hemaglutinare), respectiv inhibarea
hemaglutin"rii (n reac!ia de hemaglutino-inhibare).

= hemaglutinare.

Diagnosticul serologic
Se lucreaz" pe probe perechi de seruri #i urm"re#te cre#terea n dinamic" a titrului de
anticorpi, de cel pu!in 4 ori n proba a doua fa!" de prima prob".

Reac"ia de seroneutralizare (RSN)
Este o reac!ie sensibil" #i specific" util" n diagnosticul infec!iilor virale.
n RSN anticorpii se fixeaz" pe virionii corespunz"tori #i neutralizeaz" capacitatea lor
infectant" pentru celula gazd".
Dilu!iile de ser antiviral (standard n diagnosticul direct, de cercetat n diagnosticul
serologic) se pun n contact cu cantit"!i egale de virus (de identificat n diagnosticul direct,
standard n diagnosticul serologic), pentru 30-60 minute la temperatura laboratorului
(20-22C) dup" care amestecul se inoculeaz" ntr-un sistem celular susceptibil, urm"rind
infectivitatea viral" pentru acesta. n culturile de celule reac!ia de seroneutralizare este
pozitiv" cnd efectul citopatogen nu apare. n prezen!a efectului citopatogen caracteristici
virusului inoculat RSN se interpreteaz" ca #i negativ".

Reac"ia de inhibare a hemadsorb"iei
Este important" pentru identificarea virusurilor care nu produc un ECP evident
(exemplu: virusurile gripale).
Prin hemadsorb!ie se n!elege capacitatea unor virusuri de a induce modific"ri ale
suprafe!elor celulelor infectate care s" antreneze dup" sine posibilitatea ca aceste celule s"
fixeze pe suprafa!a lor eritrocite.
n reac!ia de inhibare a hemadsorb!iei se urm"re#te neutralizarea prin anticorpi
specifici a capacit"!ii hemadsorbante produs" de virusul replicat (omologia reactan!ilor
antigen-anticorp = diagnostic pozitiv, se traduce prin lipsa de instalare a fenomenului de
hemadsorb!ie caracteristic virusului).

117
Imunoelectronotransfer (western-blot)
Proteinele virale sunt separate prin electroforez" pe gel de poliacrilamid". Acestea
sunt ulterior transferate #i fixate pe un suport de nitroceluloz". Banda cu proteinele virale este
incubat" cu serul de cercetat. Fixarea anticorpilor se eviden!iaz" cu ajutorul imunglobulinelor
(anti Ig uman") marcate enzimatic. Se adaug" substratul pentru enzim" #i se cite#te reac!ia de
culoare.


DETECTAREA GENOMULUI VIRAL

1. Electroforeza n gel de poliacrilamid!, a ARN-ului (RNA-PAGE),
2. Hibridizarea genomic!,
3. Amplificarea enzimatic! a genomului.

Electroforeza n gel de poliacrilamid" a ARN , este o tehnic" util" pentru depistarea direct" a
rotavirusurilor #i este realizabil" numai n condi!iile unei excre!ii masive n materiile fecale
precum #i a structurii duble catenare a ARN-ului genomic.

Hibridizarea genomic"
Aceast" metod" se bazeaz" pe capacitatea ARN sau ADN viral de a se lega n mod
specific (hibridizare) de catene complementare de ADN (sonde nucleotidice), generate
artificial sau pornind de la genomul viral clonat. Legarea poate fi detectat" cu ajutorul
marcajului radioactiv sau enzimatic al sondei. Marcajul radioactiv este eviden!iat pe un film
sensibil la razele X n general prin dot blot. Aceast" modalitate de detec!ie este deosebit de
sensibil", ns" necesit" un timp de expunere lung #i condi!ii de lucru (radioactivitate).
Utilizarea enzimelor, cum ar fi peroxidaza sau fosfataza alcalin", permite detectarea prin
reac!ii de tip ELISA. Este n egal" m"sur" posibil s" se fac" hibridizarea in situ a cupelor
histologice pentru depistarea infec!iei.
DOT BLOT = tehnic" pentru detectarea, analizarea #i identificarea proteinelor similar" cu
western-blot, dar diferit" prin faptul c" proba de protein" nu este separat" electroforetic, ci
depus" punctiform pe un suport membranar sau pe hrtie.Concentra!ia proteinelor poate fi
estimat" semicantitativ, cu ajutorul anticorpilor specifici.

Amplificarea enzimatic" a genomului

Au fost propuse mai multe metode, ns" cel mai frecvent se folose#te reac!ia n lan! a
polimerazei (PCR=polymerase chain reaction). Aceast" metod" const" n separarea la cald a
celor dou" catene de ADN, ce con!in regiunea pentru amplificat. E#antionul este apoi
amestecat cu amorse (n jur de 20 de nucleotide), complementare secven!elor nucleotidice,
care flancheaz" regiunea pentru amplificat. Aceste amorse sunt alese n a#a fel nct s" fie
situate la extremit"!ile unei secven!e de 50-1000 baze. Dup" r"cirea ADN-ului, amorsele n
exces se fixeaz" cu secven!a complementar" pe ADN-ul !int", iar apoi nucleotidele sunt
incorporate secven!ial de o ADN-polimeraz" termostabil" (Taq-polimeraza); se produc astfel,
dou" copii de ADN !int".
118
Amestecul este din nou nc"lzit pentru separarea ADN-ului dublu catenar, dup" care
se r"ce#te pentru a permite fixarea amorselor #i incorporarea de nucleotide. Taq-polimeraza
(Thermus aquaticus) este utilizat" datorit" faptului c" ea nu se denatureaz" prin nc"lziri #i
r"ciri repetate. Dup" 30 pn" la 80 de cicluri efectuate n mod automat, ADN-ul amplificat
poate fi detectat prin electroforez" n gel de agaroz". Este foarte important de verificat ca
fragmentul amplificat s" corespund" perfect secven!ei !int", fie cu ajutorul unei endonucleaze
de restric!ie, fie prin hibridizare cu ajutorul unei sonde ADN. Metoda poate fi modificat"
pentru detectarea virusurilor cu ARN, prin ad"ugarea unei etape de transcrip!ie invers",
nainte de a ncepe PCR. Din punct de vedere teoretic, se poate detecta o singur" copie a
genomului viral. n practic", ns", cantit"!ile necesare sunt mult mai mari. E#antionul poate
de asemenea s" con!in" inhibitori din reac!ie, ce vor determina rezultate fals negative.
Metoda este deosebit de sensibil", iar reac!iile fals pozitive survin n urma contamin"rii
e#antionului printr-o !int" exogen". Din acest motiv, este indicat s" se foloseasc" loca!ii
distincte pentru prepararea e#antioanelor, amplificare #i detectarea produselor amplificate.
Sensibilitatea #i specificitatea PCR poate fi ameliorat" cu ajutorul unei a doua amplific"ri,
folosind amorse interne pentru primul fragment.


Titrarea antigenului prin RHA #i identificare prin RHI cu seruri antivirale standard.


119

Microscop reversat (folosit la examinarea monostratului celular)


Hemadsorb!ia eritrocitelor de pui pe celule infectate cu virus gripal.


Incluzii intracitoplasmatice acidofile = corpusculii Babe#-Negri caracteristici n infec!ia rabic".

120
Dup" Hart T. #i Shears P., Mdecine-Sciences/Flammarion, 1997.

ORTHOMYXOVIRIDAE

Familia Orthomyxoviridae, include virusurile gripale (Myxovirus influentzae) tip A,
B #i C.
Sunt virusuri cu ARN monocatenar, simetrie helicoidal", nvelite. Virionul este sferic.
Genomul viral este format din 8 segmente de ARN, fiecare dintre ele constituind o gen" care
codific" sinteza unei alte proteine. Sunt codificate 3 polimeraze (P1= ARN polimeraza ARN
dependent" care este implicat" n replicarea genomului viral; P2 #i P3 cu participare la
organizarea #i asamblarea nucleoproteinei), nucleoproteina, proteina matricei, proteina
nestructural", hemaglutinina #i neuraminidaza.
Ansamblul ARN- proteine formeaz" complexul ribonucleoproteinic. Moleculele de
ribonucleoprotein" sunt dublu spiralate, iar extremit"!ile r"mn monocatenare. Acest
complex este acoperit de c"tre proteina matricei peste care este dispus nveli#ul viral
Pe suprafa!" proemin" dou" tipuri de spiculi: hemaglutinina #i neuraminidaza.
Virusurile gripale au att antigene interne reprezentate de ribonucleoproteina, ARN-
polimeraza #i proteina matricei ct #i antigenele externe reprezentate de hemaglutinin" #i
neuraminidaz". Hemaglutinina intervine n adsorb!ia virionilor pe receptorii celulei gazd",
precum #i n procesul de nmugurire a membranei celulare n perioada de maturare a
virionului iar neuraminidaza particip" att la declan#area infec!iei, ct #i la eliberarea din
celul" a virionului matur. Hemaglutinina intervine #i n producerea reac!iei de
hemaglutinare.
La antigenele externe se descriu dou" tipuri de varia!ii:
a) minore: care constau n modific"ri mici n structura lor; se produc prin
muta!ie #i caracterizeaz" mutantele epidemice.
b) majore: constau n modific"ri bru#te #i extinse n structura acestor
antigene; se produc prin recombinare genetic" ntre virusuri care se
replic" concomitent #i caracterizeaz" mutantele pandemice.
Din punct de vedere clinic, infec!ia gripal" evolueaz" ca #i o pneumonie intersti!ial"
#i poate fi urmat" de complica!ii (fie suprainfec!ii bacteriene, fie complica!ii de alt" natur";
ex: miocardita). Profilaxia se face prin vaccinare.
Diagnosticul virusologic
Recoltarea produsului patologic:
! exudat faringian #i nazal,
! lichid de sp"l"tur" rinofaringian".
Examenul microscopic direct: folosind tehnica imunofluorescen!ei pot fi detectate
antigenele virale n celulele epiteliale.
Cultivarea: produsul patologic se inoculeaz" n cavitatea amniotic" sau alantoidian"
a oului embrionat de 9-11 zile (metod" veche) sau se folose#te inocularea n culturi de celule.
Eviden!ierea virusului se bazeaz" pe capacitatea acestuia de a aglutina hematii de
coco#, proprietate ce se eviden!iaz" prin reac!ia de hemaglutinare conform schemei de mai
jos.
121
Pentru identificarea virusurilor se folose#te reac!ia de hemaglutinoinhibare (dac" s-a
izolat n oul embrionat) dar poate fi folosit" #i reac!ia de inhibare a hemadsorb!iei (dac" s-a
izolat n culturi celulare).


PARAMYXOVIRIDAE

Cuprinde virusuri cu ARN, simetrie helicoidal", nveli# lipidic bistratificat, care
prezint" propriet"!i de mixofilie #i capacitate hemaglutinant", precum #i propriet"!i
hemolitice.
Familia include genurile:
$ Paramyxovirus cu virusurile paragripale (4 tipuri antigenice) #i virusul urlian
(Paramyxovirus parothidis).
$ Morbillivirus cu virusul rujeolic.
$ Pneumovirus cu virusul respirator sinci!ial (VRS).
Virusurile paragripale, produc la copiii mici bron#ite, bron#iolite #i pneumonii (tipul
3), precum #i laringotraheite sufocante (tipul 2). La copiii mari #i la adul!i infec!ia evolueaz"
frecvent ca #i o rinofaringit".
Virusul urlian este agentul etiologic al parotiditei epidemice caracterizat" prin
tumefierea uni sau bilateral" a glandei /glandelor parotide. Virusul manifest" un tropism
deosebit #i pentru alte !esuturi glandulare. Profilaxia se face prin vaccinare.
Virusul rujeolic este agentul etiologic al rujeolei, boal" infecto-contagioas" a
copil"riei care evolueaz" cu erup!ie tegumentar" maculo-papuloas" asociat" cu
simptomatologie respiratorie. Profilaxia se realizeaz" prin vaccinare.
Virusul respirator sinci!ial prezint" importan!" numai pentru patologia infec!ioas" a
copilului mic la care produce bron#iolite #i bronhopneumonii grave, n special n primele 6
luni de via!". La adult #i la copilul mare infec!ia evolueaz" ca o banal" rinofaringit".
Paramyxoviridaele sunt cultivabile pe culturi de celule unde produc efect citopatogen
de tip sinci!ial, ini!ial discret dar care se accentueaz" prin pasaje repetate.

RHABDOVIRIDAE

Pentru patologia uman" este important virusul rabic. Este un virus cu ARN
monocatenar liniar (nesegmentat), simetrie helicoidal", nvelit.
Virusul rabic infecteaz" att animalele s"lbatice ct #i domestice: transmiterea se
face prin mu#c"tur", virusul fiind prezent n saliva animalului bolnav.
Infec!ia se poate transmite #i la om, tot prin mu#c"tur".
Incuba!ia medie este de 30-40 de zile, dup" care se instaleaz" hiperestezie #i prurit n
zona pl"gii #i apar modific"rile de comportament #i anxietatea.
n perioada de stare, evolueaz" ca o encefalit" rabic" cu halucina!ii, agita!ie, spasme
dureroase ale musculaturii faringelui care determin" hidrofobie. Paraliziile #i starea
comatoas" preced exitusul.
Rabia, odat" instalat", nu se poate trata. Prevenirea rabiei se face prin administrarea
de ser antirabic asociat cu vaccin antirabic (obligatoriu n prezen!a unor pl"gi mu#cate).
122

Diagnosticul de laborator
La om se face numai la necropsie.
n cazul animalelor suspecte de rabie acestea sunt !inute sub observa!ie, prelevndu-
se probe de saliv" din care pot fi decelate antigenele virusului rabic prin metoda
imunofluorescen!ei.
Dac" animalul prezint" semne de boal" este sacrificat #i se practic" sec!iuni prin
substan!a nervoas" colorate cu hematoxilin" eozin". n astfel de preparate microscopice pot
fi puse n eviden!" n neuroplasm" incluzii acidofile. Acestea sunt corpusculii Babe#- Negri #i
sunt patognomonici pentru rabie.
Virusul rabic este cultivabil prin inoculare intracerebral" la #oarecele sugar, precum
#i prin inoculare pe culturi de celule diploide umane.

PICORNAVIRIDAE

Familia cuprinde virusuri cu ARN monocatenar liniar, simetrie cubic", nenvelite.
Capsida este un icosaedru cu 60 de capsomere, iar diametrul virionului este foarte mic
(22-30 nanometri)
Genul Enterovirus cuprinde: virusurile poliomielitice (tip 1, 2, 3),virusurile
Coxsackie A (23 de tipuri), Coxsackie B (6 tipuri), virusurile ECHO (32 de tipuri) precum #i
virusurile enterice umane 68- 71.
Aceste virusuri manifest" afinitate pentru tractul digestiv #i forma!iunile limfatice
ata#ate tubului digestiv (amigdale, ganglioni mezenterici, pl"ci Payer) nivele la care se
multiplic", dup" care prin viremie ating structurile !int".
Virusurile poliomielitice manifest" tropism pentru SNC, iar afectarea meningeal"
poate s" apar" n toate infec!iile cu enterovirusuri (meningite aseptice).
Infec!ia poliomielitic"
Perioada de incuba!ie are o durat" de 7- 14 zile, dup" care poate evolua: - infec!ie
subclinic"; - boal" minor" (cu febr", cefalee, mialgii, tulbur"ri digestive); - boal" paralitic"
(apare numai la 1% din cei care fac infec!ia poliomielitic") #i se caracterizeaz" prin
instalarea unei paralizii (flasc") ce intereseaz" un singur grup muscular. Paralizia este
datorat" localiz"rii virusului la neuronii motorii din coarnele medulare anterioare, sau din
cortexul motor cerebral.
Imunitatea n poliomielit" este specific" de tip.
Profilaxia se face prin vaccinare (vaccin cu virus viu atenuat tip Sabin).
Infec!ia cu virusurile Coxsackie
Coxsackie A poate produce:
$ herpangina, caracterizat" prin hiperemia faringelui fond pe care apar vezicule de
aspect cenu#iu,
$ boala mn"-picior-gur", caracterizat" prin leziuni ulcerative la nivelul faringelui
#i care asociaz" o erup!ie vezicular" palmo-plantar".
Coxsackie B poate produce:
$ pleurodinia (mialgia epidemic"), cu febr", cefalee #i dureri musculare generalizate,
dar mai intense la nivelul toracelui,
123
$ encefalomiocardita nou-n"scutului.
Infec!ia cu virusurile ECHO, evolueaz" ca #i meningit" cu lichid clar (aseptic").
Genul Heparnavirus- cuprinde virusul hepatitei A (HAV).
Genul Rhinovirus are peste 150 de tipuri antigenice. Sunt agen!i etiologici majori ai
guturaiului, boal" ce evolueaz" cu secre!ie oculo-nazal" abundent", tuse, str"nut #i cefalee.

Diagnosticul de laborator n infec!iile cu enterovirusuri

Toate Enterovirusurile pot fi izolate n culturi de celule n care induc un ECP de tip
degenerativ, iar identificarea #i diagnosticul serologic se bazeaz" pe utilizarea reac!iei de
seroneutralizare (RSN).

Diagnosticul de laborator n poliomielit".
Diagnosticul virusologic
Produsul patologic (materiile fecale) este inoculat n culturi de celule (se pot utiliza
celule diploide din rinichi uman, amnios uman sau rinichi de iepure, precum #i linia
stabilizat" Hela). Virusurile poliomielitice induc un ECP de tip degenerativ, cu rotunjirea #i
mic#orarea celulelor, nucleu picnotic, iar liza celular" este total" n 24- 72 de ore.
Identificare se bazeaz" pe practicarea reac!iei de seroneutralizare n culturi de
celule.
Pentru RSN, dilu!iile de ser sunt puse n contact cu volume egale de antigene virale,
se las" 30-60 de minute la temperatura laboratorului (22C) dup" care se inoculeaz" pe
sistemul celular (la culturile celulare se folosesc volume de 0,2 ml/ tub). Se utilizeaz" #i
culturi de celule neinoculate martor.
La intervale de timp culturile de celule inoculate sunt examinate.
Rezultatele: $RSN pozitiv"- n sistemul celular (culturile de celule) n care a
existat omologie ntre anticorpii din ser #i antigenele virale, nu mai apar modific"rile
caracteristice virusului inoculat.
$RSN negativ"- n sistemul celular (culturile de celule) n care
virusul nu a fost neutralizat prin anticorpi specifici, acesta produce modific"rile
caracteristice.

HERPETOVIRIDAE

Herpetoviridaele sunt virusuri cu AND dublu catenar, simetrie cubic", nvelite,
virionul are o form" sferic" #i diametrul de 130- 250 nanometri, iar capsida este un
icosaedru cu 162 de capsomere.
Se clasific" n subfamiliile :

1. Alfaherpesvirinae cu genurile:

Simplex virus:
o
virusurile herpes simplex tipul 1- oral
tipul 2- genital.

Varicella virus:
124
o
Virusul varicel"-zona zoster 1 tip antigenic.
2. Betaherpesvirinae cu genurile:

Citomegalovirus -virusul citomegalic- 1 tip antigenic

Roseolovirus virusul herpetic uman 6

- virusul herpetic uman 7
3. Gammaherpesvirinae cu genurile:

Lymphocryptovirus - virusul Epstein-Barr- 1 tip antigenic

Rhadinovirus virusul herpetic uman 8.

Infec"ii produse:

Virusul Herpes simplex:
Primoinfec!ia, de obicei, este inaparent" clinic #i este urmat" de cantonarea virusului
la nivelul ganglionilor rahidieni corespunz"tori ariei cutaneo-mucoase interesate. Recidivele
se traduc prin apari!ia unui buchet de vezicule pe un fond eritematos, cu localizare repetata
n acela#i teritoriu cutanat sau mucos. Factorii declan#atori ai recidivelor pot fi : a) termici (
frig sau c"ldur" excesiv"); b) hormonali; c) reac!ii de hipersensibilitate; d) radia!ii
ultraviolete; e) boli febrile.
- Gingivo- stomatita (cu tipul 1)- apare la copii ntre 6 luni #i 6 ani #i se
caracterizeaz" prin apari!ia de leziuni la nivelul mucoasei bucale ( mai rar amigdale sau
orofaringe)
- Herpesul labial (cu tipul 1)- erup!ie microvezicular" pe fond eritematos la
jonc!iunea cutaneo- mucoas".
-Keratoconjunctivita (cu tipul 1)- prinderea straturilor profunde ale corneei
prezentnd risc de opacifiere #i cecitate n cazul recidivelor.
-Eczema herpeticum erup!ia variceliform" Kapo#i)- tipul 1. Erup!ia herpetic" se
produce pe un tegument eczematos preexistent.
-Meningoencefalita (tipul 1) #i herpesul generalizat sunt forme deosebit de grave de
boal" cu mortalitate ridicat".
-Herpesul genital (cu tipul 2)- erup!ia microvezicular" intereseaz" mucoasa genital".
O situa!ie particular" o reprezint" primoinfec!ia cu herpes simplex, fie de tip 1, fie tip
2 la femeia gravid", mai ales n primele 3 luni de sarcin", cnd, urmare a trecerii
transplacentare a virusului, pot sa apar" malforma!ii congenitale.
n cazul recidivei cu herpes simplex tip 2 la gravida la termen, n timpul travaliului
din leziunile cervicale #i/sau vaginale virusul ajunge s" infecteze f"tul, iar rezultatul va fi
apari!ia la nou-n"scut a unui herpes perinatal.
Virusul varicel!-zona zoster are un singur tip antigenic dar produce dou" manifest"ri clinice
distincte.
Varicela, apare la primo infec!ie #i este o boal" infecto-contagioas" a copil"riei cu
inciden!" maxim" ntre 2 #i 6 ani. Sunt caracteristice leziunile eruptive (mai frecvent la
nivelul tegumentelor capului #i trunchiului) care se g"sesc n stadii evolutive diferite ns" n
acela#i teritoriu tegumentar (macule, papule, vezicule, pustule #i cruste).
Zona- zoster apare la adul!i, consecin!" a reactiv"rii virusului ntr-o gazd" par!ial
imun". Se caracterizeaz" prin apari!ia acelora#i leziuni, ca #i n varicel", dar care
125
intereseaz" traiectul unui nerv senzitiv (fie el intercostal sau ramura oftalmic" a nervului
trigemen).
Virusul citomegalic are un singur tip antigenic. Infec!ia produs" evolueaz" diferit la grupe
de vrst" diferite.
La copilul mare evolueaz" ca #i infec!ie subclinic", la adult determin" o pneumonie
intersti!ial", n timp ce la nou-n"scut #i sugar- se instaleaz" o boal" grav", citomegalia cu
incluzii, virusul fiind localizat n ficat, rinichi #i pl"mn.
Virusul Epstein-Barr, are un tip antigenic #i produce mononucleoza infec!ioas". Celula !int"
este limfocitul B, iar boala clinic manifest" (febr", eritem faringian, limfadenopatie
cervical", splenomegalie, hepatomegalie, icter, astenie) apare la jum"tate dintre persoanele
care fac infec!ia dup" vrsta de 8 ani.

Diagnosticul de laborator
Diagnosticul virusologic
Pentru virusul herpes simplex #i varicela-zona zoster, cultivarea se face pe celule
diploide (rinichi de iepure, rinichi de maimu!", embrion uman) sau pe linii celulare
stabilizate (Hep 2, BHK-21- numai pentru herpes simplex #i Hela), pe care produc un ECP
fie n focar, fie de tip sinci!ial, iar n preparatele microscopice se pot pune n eviden!"
incluzii intranucleare (eozinofile).
Virusul Epstein-Barr este cultivabil pe culturi de limfocite pe care le transform"
limfoblastic, iar Virusul Citomegalic se poate cultiva pe culturi de limfoblaste sau pe linia
stabilizat" Ma-188 (produce ECP de tip herpes, dar sunt caracteristice incluziile duble #i
intranucleare #i intracitoplasmatice).
Pentru identificarea virusurilor se folosesc reac!ii antigen-anticorp cum sunt RSN,
RFC sau RIF.
Diagnosticul serologic
Pentru toate herpetoviridaele se poate urm"ri cre#terea semnificativ" a titrului de
anticorpi prin RFC, RSN sau RHAP (reac!ie de hemaglutinare pasiv") sau pot fi utilizate
tehnici imuno- enzimatice.

NOTE PERSONALE












126





LUCRAREA NUMARUL 14. MICROBIOLOGIA CAVIT#$II ORALE


Cavitatea oral! con!ine numeroase microorganisme: bacterii (care sunt
predominante), levuri, protozoare #i virusuri.

BACTERIILE
Exist" aproape 200 de grupe bacteriene, unele dintre ele permanente #i altele care sunt
ocazionale.
Bacteriile sunt clasificate, dup" colora!ia Gram n dou" mari grupe: Gram pozitive #i Gram
negative.
1. Cocii Gram pozitivi
Printre ace#tia, aproape 50% sunt:
Streptococii orali (grupul viridans)
Au fost descrise 5 specii:
a. Streptoccus sanguis
! este localizat la nivelul din!ilor
! se ntlne#te n placa dentar"
! poate fi agentul etiologic al endocarditelor bacteriene.
b. Streptococus mutans
! are acela#i habitat ca #i S. sanguis
! este ini!iatorul cariei dentare
c. Streptococcus mittis
! se g"se#te pe mucoasa bucal"
! poate fi agentul etiologic al endocarditelor subacute.
d. Streptococcus salivarius
! se g"se#te n saliv" #i de asemenea n regiunea dorsal" a limbii.
e. Streptococcus milleri
! foarte pu!in implicat n patologia dentar".
Streptococii anaerobi
! apar!in genului Peptostreptococcus
! sunt prezen!i n placa subgingival"
! ei pot fi izola!i din boala paradontal" #i din infec!ii endodontice.
Genul Micrococcus cu specia M. mucilagenosus (prezent pe limb")
Genre Staphylococcus (foarte pu!in reprezentat n cavitatea bucal").
2. Cocii Gram negativi
Genul Neisseria - numai specii comensale.
GenulVeillonella
127
! sunt bacterii anaerobe
! sunt n num"r mai mare n placa dentar".
3. Bacilii Gram pozitivi
! exist" tot timpul n cavitatea oral".
! num"rul lor cre#te n placa dentar".
Actinomyces (bacterii filamentoase)
A. israeli (produce o afec!iune purulent" n regiunea cervical")
A. viscosis #i A. naeslundi care sunt prezen!i n calculusul dentar.
Bifidobacterium
! bacterii anaerobe, care se g"sesc n placa dentar"
Bacterionema prezent n placa subgingival".
Lactobacillus
! prezent n placa dentar"
! este una dintre bacteriile care sunt responsabile de evolu!ia cariei dentare.
Eubacterium (bacterii strict anaerobe)
!se ntlnesc n placa dentar"
!particip" la producerea bolii parodontale.
Rhotia
!se g"se#te n placa dentar"
Propionibacterium (bacterii anaerobe)
!se ntlne#te n placa dentar"
4. Bacilii Gram negativi
Bacteroides (bacterii strict anaerobe)
!se g"sesc n placa dentar"
!sunt izola!i de asemenea n parodontopatii
Prevotella (strict anaerobi)
!sunt izola!i n bolile parodontale.
Porphyromonas (strict anaerobi)
!predomin" n parodontit" la adult.
Fusobacterium
!responsabil de gingivite ulcero-necrotice acute.
Leptotrichia (strict anaerobi)
!se g"se#te n placa dentar"
Capnocytophaga (bacili Gram negativi nefermentativi)
!sunt implica!i n boala parodontal" juvenil".
5. Cocobacili Gram negativi
Eikenella (specia E. corrodens)
!se g"se#te n placa dentar" (n bolile parodontale)
!responsabil, de asemenea, de abcesele dento-alveolare.
Actinobacillus (specia A. actinomycetemcomitans).
!prezent n boala parodontal" juvenil".
6. Bacterii neclasificate Gram
128
Treponema (T. denticola, T. macrodentium, T.vincenti)
!izolat" de la bolnavi, care prezint" gingivite ulcero-necrotice (ANUG)
!implicat", de asemenea, n parodontite.

Levurile
! sunt reprezentate de cteva specii ale genului Candida (C. albicans, C. tropicalis)
! n anumite cazuri pot fi responsabile de infec!ii orale.

Protozoarele
Entamoeba (specia E. gingivalis)
! se g"se#te pe suprafa!a din!ilor, la nivelul gingiilor #i uneori n amigdale,
prezen!a ei putnd fi asociat" bolii parodontale #i gingivitelor.
! determin" boala parodontal" cauznd liza !esuturilor parodontale.
! parazitul inger" bacterii, leucocite #i eritrocite f"r" ns" s" manifeste caractere
invazive.
! aceast" amib" este capabil" s" ingere hemoglobina eritrocitelor, datorit"
afinit"!ii pentru O2; secret" o substan!" leucotactic" care antreneaz"
degenerescen!a #i absorb!ia leucocitelor; se transmite exclusiv prin contact
oral oral; acest parazit colonizeaz" cavitatea bucal" la majoritatea
persoanelor adulte ns", poate coloniza #i uterul (dac" se g"sesc actinomicete,
nutrientul preferat de E. gingivalis).
! E. gingivalis poate s" fie eviden!iat" n frotiuri realizate din placa dentar" #i
colorate fie trichrom sau n colora!ia cu hematoxilin" feric".
! se dezvolt" foarte bine pe mediul LES modificat sau pe mediul YES (yeast
extract-sucrose broth) la un pH de 6,4-6,7; mediile de cultur" sunt incubate
timp de 120-168 ore, temperatura optim" de multiplicare este de 34,5-35 C.

Trichomonas (T. tenax)
! strict anaerob, se g"se#te n trevisa gingival", lojele amigdaliene #i saliv", la
persoanele cu igien" dentar" deficitar"; mai poate fi izolat din secre!iile
bron#ice.
! contaminarea se face prin saliv" #i prin pic"turile lui Pflgge
! este de dimensiuni mici, forma migdalat", incolor #i refringent.
! diagnosticul se bazeaz" pe examenul microscopic ntre lam" #i lamel", a
prelevatului suspendat ntr-o pic"tur" de ser fiziologic.
! dou" prelevate de calcul dentar se cultiv" ntr-un mediu introdus n tuburi
K.T.B. (Kupferberg Trichomonas Broth). Un mediu se incubeaz" n condi!ii
de aerobioz", iar altul n anaerobioz" la 37C 72 ore. Protozoarele sunt
identificate prin examinare microscopic" direct" care relev" prezen!a
flagelatelor dezvoltate n mediul de cultur".

Virusurile
! foarte pu!in reprezentate n cavitatea bucal".
129
! printre acestea: Herpes simplex, Adenovirus.

ECOSISTEMUL ORAL

Cuprinde microorganismele #i diferite locuri din cavitatea oral", unde microorganismele se
dezvolt".
Habitatele cavit"!ii orale sunt
" din!ii (suprafa!a lor)
" mucoasa oral"
" partea dorsal" a limbii
" trevisa gingival"
" saliva.
Din!ii: reprezint" habitatul pentru bacteriile aderente: Streptococcus mutans, Streptococcus
sanguis.
Mucoasa oral"
- Este habitatul pentru bacteriile pu!in aderente: Streptococcus salivarius, Streptococcus
mittis.
trevisa gingival"
- Bacteriile care se g"sesc aici joac" un rol n ini!ierea #i dezvoltarea bolii parodontale.
Saliva
- Joac" un rol antibacterian prin sp"larea mecanic", care antreneaz" bacteriile #i previn
aderen!a lor; la fel ea con!ine diferi!i factori de ap"rare nespecifici (lizozim, lactoferine) #i de
asemenea specifici (Ig A, IgG, Ig M). Saliva reprezint" un sistem tampon de pH.

FACTORII FIZICO CHIMICI CARE INFLUEN$EAZ# DEZVOLTAREA
BACTERIILOR
temperatura ( 35 - 36
0
C)
pH-ul local - n condi!ii normale est 6,75.
- n placa dentar" pH-ul scade pn" la 5 #i permite dezvoltarea bacteriilor
acidofile (S. mutans, Lactobacillus).
poten!ialul de oxidoreducere
" n saliv", el este pozitiv (+200 ! + 500 milivol!i)
" cnd el scade pn" la - 150 mV, bacteriile anaerobe se dezvolt" foarte bine.
" n trevisa gingival" a unei gingii s"n"toase, el este de + 73 mV.
" n bolile parodontale, el scade pn" la - 300 mV (se dezvolt" numai bacterii
anaerobe).
substan!ele antibacteriene (antibioticele #i antisepticele)
" pe cale general" sau aplicate local influen!eaz" dezvoltarea bacteriilor.
alimenta!ia
" dac" este bogat" n carbohidra!i, ea favorizeaz" apari!ia cariei dentare #i
favorizeaz" cre#terea levurilor.
factori medicamento#i
" obtura!iile, extrac!iile, detartrajul - pot influen!a bacteriile orale.
130

FLORA BACTERIAN# NORMAL#
! la na#tere, cavitatea bucal" a nou n"scutului este steril".
! n primele 24 ore se vor stabili aici cteva bacterii, mai ales Streptococcus salivarius (de
la mam" sau din mediul nconjur"tor).
! apoi, ca urmare a activit"!ii metabolice a primelor specii apar celelalte bacterii: S.
mittis, S. milleri, Neisseria, Veillonella.
! la 6 luni (dup" apari!ia din!ilor): Streptococcus mutans #i Streptococcus sanguis.
! ntre 6-9 luni - n trevisa gingival" apar bacilii Gram pozitivi (Actinomyces,
Bifidobacterium) #i Gram negativi (Bacteroides, Fusobacterium, Leptotrichia).
! lactobacilii se g"sesc constant numai dup" 2 ani.
! la 6 ani se va instala Candida.
Exist" bacterii care colonizeaz" suprafe!ele dure (din!ii): S. mutans, S. sanguis,
Actinomyces.
Celelalte bacterii prefer" mediile anaerobe: Prevotella, Porphyromonas, Treponema care
colonizeaz" trevisa gingival".
La cei vrstnici (cnd i#i pierd dentitia), bacteriile care colonizeaz" cavitatea bucal" sunt
foarte similare cu cele ale unui copil nainte de erup!ia dentar".
Protezele dentare modific" din nou compozi!ia microbian" a cavit"!ii bucale.

CARIA DENTAR#
Caria dentar" este definit" ca o distruc!ie localizat" a !esuturilor dentare prin ac!iunea
bacterian". Este o infec!ie cronic" endogen" produs" de bacterii comensale. Leziunea
cariogen" este rezultatul demineraliz"rii emailului #i mai trziu a dentinei prin acizii produ#i
de c"tre bacteriile pl"cii, care metabolizeaz" carbohidra!ii alimentari. Procesul ini!ial de
demineralizare a emailului este reversibil, el fiind urmat de o remineralizare; cnd
remineralizarea nu se produce, n email vor apare cavit"!i, care pot evolua spre dentin". Se
descriu cariile dentare ale emailului (de suprafa!"), ale dentinei #i ale suprafe!ei radiculare
(profunde).
Loeche, n 1976, a elaborat teoria infec!ioas" specific" a cariei dentare, afirmnd rolul
cariogen a unui num"r limitat de bacterii. Astfel, Streptococcus mutans este responsabil de
apari!ia cariilor de suprafa!", de email, Lactobacillus #i Actinomyces de cariile suprafe!elor
radiculare.

Bacteriile cariogene
STREPTOCOCCUS MUTANS Streptococcus mutans este, in!iatorul cariei. Exist" o
corela!ie ntre num"rul (cantitatea) de S. mutans din saliv" #i din plac" #i inciden!a cariei;
acest lucru este sus!inut de experien!ele pe animale (sterile) #i prin imunizarea animalelor cu
S. mutans, fapt care reduce inciden!a cariei.
S. mutans are dou" mecanisme principale de producere a cariei dentare: capacitatea de a
metaboliza rapid sursele mai ales zaharoza la acid lactic #i prin propriet"!ile de a produce
polizaharide extracelulare plecnd de la zaharoz" #i intracelulare (glicogen) care ac!ioneaz"
ca depozite alimentare pentru momentul cnd carbohidra!ii alimentari scad.
131

DIAGNOSTIC DE LABORATOR
Identificarea S. mutans se face pe baza aspectului coloniilor, propriet"!ilor biochimice #i
prin imunofluorescen!".
Mediul GSTB (un mediu cu glucoz", zaharoz", telurit #i Bacitracin") este utilizat pentru
izolarea S. mutans. Produsele patologice se recolteaz" din leziuni cariogene utiliznd
tampoane foarte sub!iri #i sterile, care sunt ns"mn!ate pentru a ob!ine colonii izolate
(nsman!area n striu). Cutiile Petri cu medii ns"mn!ate sunt incubate timp de 48 ore la 37
0
C n atmosfer" de CO2.
Citirea se face dup" 48 ore pe baza aspectului coloniilor dezvoltate. Coloniile sunt foarte
mici (dar vizibile cu ochiul liber), cu un diametru de 0,05-0,7 mm #i sunt examinate n
condi!ii optime cu un microscop binocular. Coloniile de S. mutans au un aspect rugos cu o
suprafa!" neted" #i margini circulare, sunt bombate cu suprafa!a n general neregulat", care se
coloreaz" alb-bej pn" la maro deschis sau gri deschis. Coloniile de S. sobrinus sunt de tip S
cu marginile circulare, bombate #i cenu#ii.
Tulpinile izolate sunt ns"mn!ate, de asemenea, pe geloz" snge pentru a eviden!ia
propriet"!ile hemolitice, obsevndu-se c" majoritatea tulpinilor se dezvolt" sub form" de
colonii nehemolitice, foarte, foarte mici (0,02-0,1 mm) care sunt vizibile cu lupa; cultura se
dezvolt" n cantitate mai mic" comparativ cu cultura de pe mediul GSTB. n acest caz, de
asemenea, este necesar" incubarea n atmosfer" de CO2. Examinarea coloniilor trebuie
completat" cu punerea n eviden!" a caracterelor morfo-tinctoriale pe frotiuri colorate Gram
unde se v"d coci Gram pozitivi n lan!.
Alt criteriu de identificare este cel biochimic, plecnd de la propriet"!ile biochimice
caracteristice pentru S. mutans. Identificarea biochimic" se face pe mediul Hiss la care se
adaug" manitol, sorbitol, glicerol, glucoz", n cantitate de 1%. Indicatorul Andradi (ro#u
fenol #i NaOH n/10) este indicatorul de pH utilizat. Eprubetele ns"mn!ate sunt incubate la
37
0
C timp de 20 ore n atmosfer" de CO2. Virajul culorii indicatorului eviden!iaz" un test
pozitiv #i culoarea ro#ie apare cnd substratul a fost degradat.
Al"turi de aceste metode, S. mutans se poate eviden!ia prin metodele moderne:
imunofluorescen!a #i PCR.

LACTOBACILLUS
Lactobacillus sunt bacterii responsabile mai degrab" de progresia leziunii cariogene #i
caracterizeaz" cariile dentinei. Exist" o corela!ie ntre num"rul de Lactobacillus n saliv" #i n
plac" #i activitatea cariogen". Lactobacillus are posibilitatea de a se dezvolta la un pH sc"zut
(acid) #i de a produce, de asemenea, acidul lactic pornind de la zaharoz".

DIAGNOSTIC DE LABORATOR
Lactobacillus est o alt" bacterie cariogen". Se prezint" sub form" de bacili Gram pozitivi,
imobili, nesporula!i care se g"sesc ntr-un num"r mic n placa dentar" (ei reprezint" 1% din
flora pl"cii) #i nu au mecanisme eficiente pentru a se ata#a #i a se acumula n placa dentar".
n schimb, lactobacilii, abunden!i n cariile dentinei, sunt implica!i n etiologia cariei dentare,
nu att n ini!ierea sa ct n avansarea leziunii cariogene.
132
Sunt bacterii acidurice cu un pH optim de cre#tere de 5,5-5,8 #i cu o capacitate de
fermentare a carbohidra!ilor ceea ce explic" rolul lor n producerea #i, de asemenea, n
progresia cariei dentare atunci cnd ea a a fost ini!iat" de S. mutans #i S. sobrinus.
Dup" modul de fermentare a glucozei, lactobacilii sunt clasifica!i n specii
homofermentative care produc n principal acidul lactic (aproximativ 65%) #i specii
heterofermentative dintre care mai pu!in de 65% produc acid lactic, al"turi de al!i produ#i
finali, n principal acid acetic #i etanol, inclusiv gaz (CO2). Cele mai frecvente specii de
Lactobacillus sunt: L. casei, L. acidophylus.
Exist" teste care pot evalua num"rul de lactobacili n saliva pacien!ilor #i ei ofer" informa!ii
despre poten!ialul cariogen a acelei cavit"!i orale; exist" o corela!ie ntre num"rul de
lactobacili prezen!i n saliv" la pacien!ii susceptibili la carie (cu un num"r mare de carii
dentare) #i un num"r redus la persoanele cario-rezistente.
Lactobacilii sunt izola!i pe mediul Rogosa care permite cre#terea bacteriilor la un pH de
5,5. Cutiile Petri cu medii ns"mn!ate cu saliv" recoltat" de la subiec!ii studia!i, sunt
incubate timp de 4 zile la 25
0
C. Identificarea se face pe frotiuri din cultura dezvoltat" #i prin
teste biochimice ale ferment"rii carbohidra!ilor.


ACTINOMYCES
" sunt asocia!i mai ales cariilor suprafe!ei radiculare.
Diagnostic de laborator :
Se izoleaz" pe agar snge pe baza de infuzie cord-creier; se folosesc dou" pl"ci, una
cu incubare anaerob" la 37C timp de 21 de zile #i alta cu incubare aerob" 14 zile la 37C. Se
urm"re#te la fiecare 2 zile dezvoltarea culturilor. Formeaz" colonii de culoare alb-g"lbuie de
consisten!" ferm".
n preparatul microscopic apar ca #i bacterii filamentoase, ramificate, Gram pozitive,
cu aspecte de pseudohife. La efectuarea frotiului, prin mi#c"ri brutale ale ansei, pseudohifele
se pot fragmenta n forme bacilare difteromorfe.

NOTE PERSONALE













133




















BIBLIOGRAFIE


1. BENSON H.G., Microbiological Applications, Ed. Wm. C. Brown, Fifth-Edition, 44-172,
1990.
2. BERTON M.J., BRASSEUR F., CHOTARD S., DECLERCK C., DORARD PH.,
TRAVEAUX PRATIQUES DE BACTRIOLOGIE, Institut de formation de technicians en
analyses biomedicales, 2001.
3. BOSGIRAUD AEMIP C., Microbiologie gnrale et sant, Ed. ESKA, 155-162,
209-243, 257-265, 2003.
4. BUIUC D., NEGU& M., IONESCU G., Identificarea bacililor Gram negativi, aerobi,
glucozo-nefermentativi n tartat de Microbiologie clinic", ed. II-a, Ed. Medical", Bucure#ti,
765-795, 2008.
5. CHEN J.F., LIU G.Y., WEN W.R., CHEN C., Studies on the continuos culture and
pathogenicity of Entamoeba gingivalis, Zhongguo Ji Sheng Chong Yu Ji Sheng Chong Bing
Za Zhi, 2000, 18(2):84-86.
6. CODI&' I., BUIUC D., PNZARU C., UNGUREANU V., Identificarea cocilor Gram
pozitivi aerobi #i facultativi anaerobi n Tratat de Microbiologie Clinic", ed. II-a, Ed.
Medical", Bucure#ti, 562-607, 2008.
7. DECOSTER A., LEMAHIEU J.C., DEHECQ E., DUHAMEL M., Cours de Bactriologie,
2004, http//anne.decoster.free.fr/bindex.html
8. DURIEZ T., DUJARDIN L., AFCHAIN D., Cours de Parasitologie, Facult de Pharmacie,
Lille,France;http://pharmacie.univ-Lille2.fr/recherche/labos/Bacteriologie/ACCUEIL/
index.php
134
9. GANNON J.T., LINKE H.A., Growth studies on xenic culture of Entamoeba gingivalis
using established media, Int J Parasitol., 1989, 19(8) :835-838.
10. GANNON J.T., LINKE H.A., An antibioticfree medium for the xenic cultivation of
Entamoeba gingivalis, Int J Parasitol., 1991, 21(4) :403-407.
11. HART T., SHEARS P., Bactries et infections bactriennes dans Atlas de poche de
Microbiologie, Ed. Flamarion Mdicine - Science, 1997, 71-227.
12. HODRN'U C., BOBO( C., Microbiologie Cahier de travaux pratiques l'usage des
tudiants en Mdicine dentaire, Ed. Risoprint, Cluj-Napoca, 2008.
13. IVANOF A. (sub red.), Caiet de lucr"ri practice de Microbiologie, Ed. Did. Ped.,
Bucure#ti, 1983.
14. JUNIE M., SA(C' C., Infec!ii umane parazitare, Ed. Dacia., Cluj-Napoca, 1997.
15. MATINCA D., ST'NIL' L., Cahier de travaux pratiques lusage des tudiants en
Mdicine et Pharmacie, Ed. Med. Univ.Iuliu Ha!ieganu, Cluj-Napoca, 2002.
16. NEGU& M., BUIUC D., Identificarea bacililor Gram negativi, glucozo-fermentativi n
Tratat de Microbiologie Clinic", ed. II-a, ed. Medical", Bucure#ti, 695-764, 2008.
17. PAYMENT P., TRUDEL M., Manuel de Techniques virologiques, Ed. Aupelf, 21-72,
121-153, 1989.
18. PERLEMUTER L., CENAC A., Dictionnaire pratique de Mdicine clinique, Masson,
Paris, 1977.
19. PILLY E., Infections parasitaires et mycosiques, n Maladies infectieuses, 427-429,
437-442, 1988.
20. R'DULESCU S., MEYER E.A., Parazitologie Medical", Ed. All, Bucure#ti, 271-287,
1992.
21. SAMARANAYAKE L.P., Esential Microbiology for Dentistry, Churchill Livingstone,
1996.
22. ST'NIL' L., La microbiology de la cavite orale, n Bacteriology generale et virologie,
Ed. Med. Univ. .Iuliu Ha!ieganu, Cluj-Napoca, 2003.
23. Implication des protozoaires oraux dans la maladie parodontale, 2004,
www.dreamdirectdesign.com/dentisfuturis/ modules/news/article.php ?storyid=366.













135

























CUPRINS

LUCRAREA NUM'RUL 1. M'SURI DE PROTEC&IE N LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE.
STERILIZAREA (I DEZINFEC&IA 2
LUCRAREA NUM'RUL 2. PREPARATE MICROSCOPICE 8
LUCRAREA NUM'RUL 3. PREPARATE MICROSCOPICE 13
COLORA&IA ZIEHL-NEELSEN. COLORA&II SPECIALE 13
LUCRAREA NUM'RUL 4. MEDII DE CULTUR'. INOCULAREA PROBELOR PATOLOGICE.
CARACTERELE CULTURILOR BACTERIENE 19
MEDII DE CULTUR'. INOCULAREA PROBELOR PATOLOGICE 19
PROPRIET'&ILE BIOCHIMICE ALE BACTERIILOR 24
LUCRAREA NUM'RUL 5. ANTIBIOGRAMA 31
ANTIBIOGRAMA 31
LUCRAREA NUM'RUL 6. REAC&II ANTIGEN-ANTICORP 35
LUCRAREA NUM'RUL 7. SCHEMA DIAGNOSTICULUI ETIOLOGIC N INFEC&IILE BACTERIENE.
RECOLTAREA PROBELOR PATOLOGICE 51
LUCRAREA NUM'RUL 8. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFEC&IILOR PRODUSE DE
BACILII GRAM POZITIVI 58
LUCRAREA NUM'RUL 9. COCII 65
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFEC&IILOR PRODUSE 71
DE COCII GRAM NEGATIVI 71
LUCRAREA NUM'RUL 10. BACILII GRAM NEGATIVI 73
LUCRAREA NUM'RUL 11. BACILI GRAM NEGATIVI NEFERMENTATIVI. COCOBACILI GRAM
NEGATIVI. BACTERII ACIDO-ALCOOLO REZISTENTE. 82
LUCRAREA NUM'RUL 12. SPIROCHETE (I ALTE BACTERII NECOLORABILE GRAM
136
(RICKETTSIA, CHLAMYDIA, MYCOPLASMA). ELEMENTE DE PARAZITOLOGIE 87
LUCRAREA NUM'RUL 13. VIRUSOLOGIE 108
LUCRAREA NUMARUL 14. MICROBIOLOGIA CAVIT'&II ORALE 127
BIBLIOGRAFIE 134
137