1

1
ELEKTROFOREZA
SEPARACIONE METODE
dr Nataa Peji, vanr.prof.
2
PLAN PREDAVANJA
Uvod (def., podela)
Princip
Teorija
Elektroforeza na papiru
Instrumentacija
Primena
2
3
LITERATURA
1. M. Medenica, D. Maleev, Eksperimentalna fizika
hemija
www.pharmacy.bg.ac.rs/predmeti/instrumentalne
metode (5MRF20INM)/Udbenik: M. Medenica, D. Maleev
2. M. Medenica, Skripta: Instrumentalne metode, deo C
4
Separaciona metoda razdvajanje komponenata
smee (naelektrisanih estica istog, ili predznaka) u
polju jednosmernog elektrinog napona
ELEKTROMIGRACIONA METODA
Kretanje koloidnih i drugih naelektrisanih estica kroz
neku sredinu (rastvor, gel i sl.) uslovljeno prisustvom
i delovanjem homogenog elektrinog polja
Jonoforeza
pravi rastvori pravi rastvori
(molekuli malih M, gel (molekuli malih M, gel) )
Elektroforeza
Elektrokinetika pojava
Metoda
u analitike i
preparativne svrhe
3
5
Agens?
Teorija?
Meri se?
Elektrino polje
Kretanje naelektrisanih i koloidnih estica u
elektrinom polju
Pokretljivost, migraciono vreme
Analiziraju
se?
Joni (nitrati, nitriti, fluoridi, amonijum joni...),
koloidni rastvori, vitamini, lekovi, proteini,
organske kiseline, geni, nukleotidi...
Koristi se?
u analitike svrhe (u)
u preparativne svrhe (za separaciju)
6
Zbog Zbog Zbog Zbog nedostataka nedostataka nedostataka nedostataka slobodne slobodne slobodne slobodne elektroforeze elektroforeze elektroforeze elektroforeze
Stabilizacija
kretanja molekula
korienjem poluvrstih
matrica umesto
tenosti
papir (amino kiseline, nukleotidi,
naelektrisani makromolekuli)
celuloza acetat ( )
gelovi:
poliakrilamid (proteini, fragmenti DNA)
agaroza (nukleinske kiseline)
Matrica ima potpornu ulogu: spreava konvencijsko kretanje
molekula pufera uzorkovanih promenama T i koncentracije uzorka
4
7
ELEKTROFOREZA
Prema nainu izvoenja:
Slobodna
(u rastvoru)
Zonska
(na vrstoj podlozi)
( pokretljivost)
pH=const.
papir, gel
u kapilari
Podela
Nakon prestanka dejstva E, razdvojene
komponente e se pomeati (usled difuzije)
Najvanija je
KAPILANA ELEKTROFOREZA
(CE)
ZONSKA ELEKTROFOREZA
Prema vrsti podloge (nosaa)
Papiru
(nije const. homogenost)
veliki U
hlaenje
dugo razdvajanje
adsorpcija kompon.
izraena
elektroosmoza
nije skupa
Celuloza acetatu
(homogen)
dobro razdvajanje
(otre frakcije)
jednostavna i brza
Gelu
(skrob, agaroza,
poliakrilamidni)
(3D umreene strukture)
u kapilari
u obliku ploa
Podela
Elektroforeza na:
Najnoviji pravci kreu se ka
CE!!!
5
9
Podela
Prema nainu postavljanja
komore (posude)
Horizontalna
*
Vertikalna (gornji i donji
rezevoar za pufer)
*
kod horizontalne gel elektroforeze nema
rezervoara, ve se na rub gela prislone trake
natopljene puferom
10
Papirna elektroforeza
Prema jaini elektrinog polja:
Niskonaponska
(E < 10 V cm
1
)
Visokonaponska
(10 100) V cm
1
za razdvajanje estica izuzetno
male pokretljivosti
kratko vreme razdvajanja
otrija separacija zona (jer se
smanjuje efekat difuzije)
znatno zagrevanje papirne trake i
isparavanje rastvaraa
potrebno hlaenje
Podela
6
11
RAZDVAJANJE KOMPONENATA SMEE
NA OSNOVU:
RAZLIITOG PREDZNAKA
NAELEKTRISANJA
(KATJONI KA KATODI
ANJONI KA ANODI)
RAZLIITE POKRETLJIVOSTI
ESTICE ISTOG PREDZNAKA
ZAVISI OD:
KOLIINE naelektrisanja
veliine i oblika estice
jaine elektrinog polja
T, karakteristika potporne sredine
na osnovu razliitih M proteina
(SDS PAGE)
Princip
12
Ispitivani rastvor (joni) u elektrinom
polju kree se zbog:
Teorija
Elektroforetske pokretljivosti
Odgovor na primenjeno
elektrino polje
Katjoni ka K, anjoni ka A
Elektroosmotskog protoka
(EOF)
Kretanje rastvora (rastvaraa sa
jonima) u odnosu na nepokretnu
podlogu zbog primenjenog elek.
polja
obino ka K : rastvor nosi sve
estice (ukljuujui anjone i
neutralne) u ovom smeru
moe se kontrolisati
(npr. podeavanjem pH)
7
13
IZVOENJE IZRAZA I OD EGA ZAVISI!
E Q F =
1
Jonska pokretljivost estica
Naelektrisana estica u
elektrinom polju
Elektrina sila:
Q koliina naelektrisanja
E jaina elektrinog polja (U/d)
Sila trenja:
koeficijent viskoznosti
r poluprenik estice
v brzina kretanja estice
E Q F
1
=
v r F 6
2
=
2 1
F F =
v r QE 6 =
14
Brzina kretanja naelektrisane
estice:
Jonska pokretljivost estica (u):
r
E Q
v
6
=
r
Q
E
v
u
6
= =
] V s m [
1 1 2
8
15
Elektroosmotki protok (EOF)
Problem kod elektroforeze!
ELEKTROOSMOZA
Tenost (rastvara) se kree (pod uticaj elektrinog polja),
a vrsta faza (podloga) je nepokretna
1. Zato se
tenost kree?
2. Paradoks:
pod odreenim uslovima, i anjoni
i nenaelekrisane estice se kreu
ka katodi
ZATO?
nepo nepo nepo nepo eljna pojava eljna pojava eljna pojava eljna pojava
kod papirne elektroforeze!! kod papirne elektroforeze!! kod papirne elektroforeze!! kod papirne elektroforeze!!
16
Neke podloge adsorbuju jone iz rastvora:
npr. OH

, kada se kao podloga koristi papir
neke podloge ve imaju jonizovane grupe (npr.kapilara)
9
17
Kapilara je negativno naelektrisana: veliki broj silanol grupa
(SiOH)
1. Npr. kod elektroforeze u kapilari
1. Zato se
tenost kree? CE
povrina kapilare (vrsta faza):
tenost u kontaktu sa kapilarom (rastvara) + i kree se ka K
18
Zbog kretanja tenosti ka katodi :
+ joni (ka K) se ubrzavaju, joni uspravaju i neutralni kreu ka K
2. Pod odreenim uslovima, i anjoni i
nenaelekrisane estice se kreu ka katodi
ZATO?
Katjoni eluiraju prvi
Neutralni eluiraju istom brzinom kao EOF
Anjoni koje usporava EOF eluiraju poslednji
Zbog
elektroosmoze
Prednost postojanja EOF kod CE krae vreme analize i mogunost detekcije
neutralnih, + i jona na K , ali...
CE
10
19
Efekat elektroosmoze:
znatan kod podloga: filter-hartija,
agar- gel i
celuloza-acetat
neznatan: POLIAKRILAMIDA
EOF = f (pH, , E, I, T, )
20
Migraciono vreme (t
m
)
t
m
se smanjuje:
primenom veeg potencijala
u kraoj kapilari
za kvalitativnu analizu
11
21
ELEKTROFOREZA NA PAPIRU
Najstarija tehnika zonske elektroforeze
Papir natopljen puferom
Uzorak se nanosi kapilarom na jednu taku (start)
Jaina polja: 20 V cm
1
Struja (mA)
Posle nekog vremena, papir se vadi i sui
Papir se tretira obojenim reagensima za dobijanje
zona
VEBA!
22
S izvor naizmenine
struje
T ispravlja
R otpornik
A ampermetar
V voltmetar
E kada za
elektroforezu
k katodni prostor
a anodni prostor
S
Shema ureaja
Zato se koristi
naizmenina struja?
12
23
Fotografija aparata
Fotografija aparata
24
Komora (staklena, ili plastina) sa ugraenim a i k prostorom (pufer)
Traka oznaiti start olovkom; natopiti puferom i krajevi trake u a i k prostor
Kako se izvodi i ta je potrebno?
13
25
Nanoenje uzorka kapilarom na start
26
Unapred izabrati I, U i t: optimizacija
Na elektroforezu utiu:
E, tj. U (v , ako E (tj. U)
I (utie na udaljenost koju e joni prei)
t (utie na udaljenost koju e joni prei)
Eksperimentalno se utvruju ovi uslovi
14
27
Osuiti traku i identifikovati zone: kvaenjem reagensima, posmatranjem
pod UV lampom
Kvantitativna analiza
Isei trake sa zonama (zone se ekstrahuju pogodnim rastvaraima) i
odreuje c (fotometrijski)
ELEKTROFOREZOGRAM (ELEKTROFEROGRAM): slika (zapis) koji se
dobija nakon razdvajanja komponenti elektroforezom
unutra unutra unutra unutra nji elektoforezogram nji elektoforezogram nji elektoforezogram nji elektoforezogram
28
Faktori koji utiu na elektroforetsko
pomeranje:
Koliina naelektrisanja i veliina estice
Koji jon se kree bre: Fe
2+
ili Fe
3+
i zato?
15
29
Faktori koji utiu na razdvajanje
pH elektrolita
Jonska sredina pufera
Vrsta podloge
Dulov efekat
Jonska jaina
elektroosmoza
30
Uloga pufera
omoguava protok struje
odrava pH = const. (const. jonizacija isp. jedinj.)
utie na EOF
podesiti da joni postignu max. pokretljivost
u zavisi od stepena jonizacije makromolekula (f=(pH))
disocijacija slabih kiselina (baza) u baznoj (kiseloj) sredini
molekulski anjoni (katjoni)
16
31
Amfoterni makromolekuli (aminokiseline i belanevine):
GLICIN
Vrednost pH pri kojoj dolazi do izjednaenja broja + i nelektrisanja
(ukupno naelektrisanje 0)
Makromolekuli se ne kreu u elektrinom polju (u = 0)
Pufer treba da obezbedi pH pI
(to je vea razlika, protein e se bre kretati)
32
=
n
i i j
c z I
1
2
2
1
RS
d
d
IR
d
U
E
= =
= =

1
S
I
E

=
Jonska jaina pufera
utie na E i u
I
j
mnogo veliko ( E produava elektroforezu)
I
j
mnogo mala (koagulacija koloida i taloenje makromolekula i anglomerati)
OPTIMUM: 0,05 0,1 mol L
1
I
j
= 0 (nema razdvajanja)
17
33
Jonska sredina pufera
utie na E i u
Polarnost rastvaraa
Priroda elektrolita
34
Vrsta podloge
utie na u
adsorpcija naelektrisanih estica ( u)
elektroosmoza (usporava kretanje estica prema A)
18
35
Isparavanje elektrolita sa podloge
utie na u
zagrevanje (Dulov efekat): Q = R I
2
t
t I R Q
2
=
isparavanje rastvaraa sa podloge
smanjuje se:
smanjenjem I, vremena kretanja, T, otpora podloge i
hermetikim zatvaranjem kade male zapremine ija je atmosfera
zasiena parama
nepo nepo nepo nepo eljna pojava!! eljna pojava!! eljna pojava!! eljna pojava!!
Posledica:
fitiljni protok
smejanje gela
topljenje gela
36
Na papiru razdvojiti Fe
2+
i Fe
3+
jone iz smee i prikazati
dobijeni elektroforezogram
ta ta ta ta ete raditi na ve ete raditi na ve ete raditi na ve ete raditi na ve bi? bi? bi? bi?
19
37
Fotografije ureaja
CE (Milipore)
CGE (Hewlet Packard)
38
Kapilarna zonska elektroforeza (CZE)
Kapilarna elektrohromatografija
Kapilarna gel elektroforeza (CGE)
Kapilarno izoelektrino fokusiranje, i dr.
Tehnike kapilarne elektroforeze
Specifine elektroforetske tehnike
20
39
kapilara sa puferom
uzorak na jedan kraj kapilare
kapilara sa puferom i uzorkom se stavlja u pufer (anodni odeljak) i
drugim krajem u pufer (katodni odeljak)
1. eluiraju katjonimanji joni i sa veom koliinom naelektrisanja eluiraju
pre veih (i sa manjom koliinom naelektrisanja)
2. eluiraju neutralni joni (pojedinana zona)
3. eluiraju anjoni (obrnutim redom u odnosu na katjone
red eluiranja moe se promeniti dodavanjem alkilamonijumove soli
(povrina kapilare postaje pozitivno naelektrisana)
CZE
40
koliine
naelektrisanja
(zavisi od duine
lanca)
Nukleinske kiseline Agaroza
molarnih masa
(duina lanca)
Proteini SDS-PAGE
(natrijum dodecil
sulfat poli akril
amid)
Gel
razliiti predznak
naelektrisanja ili
pokretljivost
joni, koloidni rastvori,
proteini krvnog seruma,
(globulini), belanevine
plazme, nukleotidi,
steroidi, naelektrisani
makromolekuli..
Papirna
Kapilarna
Razdvajanje na
osnovu:
Razdvajaju se: Tip elektroforeze
21
41
Primena
Kvalitativna analiza Kvantitativna analiza
Migraciono vreme
Povrina ispod pika
UV/VIS
Fluorescencija
Amperometrijski
itd.
aminokiselina lekova
nukleinskih kiselina alkaloida (morfin, kokain)
naelektrisanih makromolekula bilirubina, vitamina, itd.
Primena
42
Elektroforezogram
vreme (min)
A
2
8
0
n
m
Kvalitativna analiza
OD = f(t)
fluorohinoloni
22
43
Povrina = f(c) Kvantitativna analiza







40 80 120
0
40
80
Y = A + B X
P = -15,5 + 0,8 c
r = 0,9982
P
o
v
r

i
n
a

p
i
k
a
c (mg L
-1
)
ciprofloksacin ciprofloksacin ciprofloksacin ciprofloksacin
44
Elektroforezogram DNA
Kako fluorescira?
Sonda: etidijum-bromid!!
Vreme/s
I
f
23
45
Primena u farmaciji
1. Feniramin
2. Hlorfeniramin
3. Bromfeniramin
4. Anileridin
5. Amfetamin
6. Metaamfetamin
7. Trifluoperazin
8. Pseudoefedrin
9. Efedrin
10. Metoksamin
11. Difenhidramin
12. Dekstrometofan
13. Kodein
14. Hidroksizin
15. Salbutamol
16. Metoprolol
17. Trazodon
18. Haloperidol
19. Verapamil
20. Loperamid
Vreme/min
A

2
0
0

n
m
46
naelektrisanje jona moe se menjati sa promenom pH
iako naelektrisane estice imaju isto naelektrisanje mogu
se razdvajati ( u veliini i konformaciji)
ne-denaturaciona tehnika (nikakva, ili min.interakcija sa povrinom)
velika osetljivost malo uzorka (nL)
Metoda izbora za:
analizu smea
kao kriterijum istoe
Ogranienje:
Analiza jonskih vrsta rastvornih u H
2
O
Efikasna (veliki broj N)
Brza (min i s)
Jeftinija od HPLC
Zato koristiti elektroforezu za separaciju?
24
47
ta ta ta ta je je je je elektroforeza elektroforeza elektroforeza elektroforeza , kako se deli i na osnovu , kako se deli i na osnovu , kako se deli i na osnovu , kako se deli i na osnovu ega su izvr ega su izvr ega su izvr ega su izvr ene podele? ene podele? ene podele? ene podele?
Jonska pokretljivost Jonska pokretljivost Jonska pokretljivost Jonska pokretljivost estica (izv estica (izv estica (izv estica (izvoenje izraza i od oenje izraza i od oenje izraza i od oenje izraza i od ega zavisi) ega zavisi) ega zavisi) ega zavisi)
ta je elektroosmoza, gde je izra ta je elektroosmoza, gde je izra ta je elektroosmoza, gde je izra ta je elektroosmoza, gde je izra ena, nabrojati od ena, nabrojati od ena, nabrojati od ena, nabrojati od ega zavisi ega zavisi ega zavisi ega zavisi
elektoosmotski protok elektoosmotski protok elektoosmotski protok elektoosmotski protok
Migraciono vreme (za Migraciono vreme (za Migraciono vreme (za Migraciono vreme (za ta se koristi i od ta se koristi i od ta se koristi i od ta se koristi i od ega zavisi) ega zavisi) ega zavisi) ega zavisi)
Papirna elektroforeza Papirna elektroforeza Papirna elektroforeza Papirna elektroforeza (princip, (princip, (princip, (princip, shema ureaja i osnovni delovi shema ureaja i osnovni delovi shema ureaja i osnovni delovi shema ureaja i osnovni delovi), kako se ), kako se ), kako se ), kako se
izvodi, optimizacija eksperimentalnih uslova izvodi, optimizacija eksperimentalnih uslova izvodi, optimizacija eksperimentalnih uslova izvodi, optimizacija eksperimentalnih uslova
Elektroforezogram sme Elektroforezogram sme Elektroforezogram sme Elektroforezogram sme e jona (kvantitati vna analiza) e jona (kvantitati vna analiza) e jona (kvantitati vna analiza) e jona (kvantitati vna analiza)
Faktori koji uti Faktori koji uti Faktori koji uti Faktori koji uti u na elektroforetsku pokretljivost (uloga pufera, jonska u na elektroforetsku pokretljivost (uloga pufera, jonska u na elektroforetsku pokretljivost (uloga pufera, jonska u na elektroforetsku pokretljivost (uloga pufera, jonska
ja ja ja ja ina pufera, jonska sredina pufera, vrsta podloge, elektroosmoza, ina pufera, jonska sredina pufera, vrsta podloge, elektroosmoza, ina pufera, jonska sredina pufera, vrsta podloge, elektroosmoza, ina pufera, jonska sredina pufera, vrsta podloge, elektroosmoza,
isparavanje elektrolita sa podloge) isparavanje elektrolita sa podloge) isparavanje elektrolita sa podloge) isparavanje elektrolita sa podloge)
Elektroforezogram (kvalitativna analiza i kvantitativna anal Elektroforezogram (kvalitativna analiza i kvantitativna anal Elektroforezogram (kvalitativna analiza i kvantitativna anal Elektroforezogram (kvalitativna analiza i kvantitativna analiza iza iza iza
(metoda kalibracione krive)) (metoda kalibracione krive)) (metoda kalibracione krive)) (metoda kalibracione krive))
Prednosti primene elektroforeze i ograni Prednosti primene elektroforeze i ograni Prednosti primene elektroforeze i ograni Prednosti primene elektroforeze i ograni enje enje enje enje
I
Z
V
O
D