FFA

FECUNDACIN IN VITRO
EN CERDOS






ALUMNA: BLANCA ARACELI LPEZ JUREZ
MDULO: REPRODUCCIN DE MAMIFEROS E INSEMINACIN
ARTIFICIAL
DOCENTE: DR. ALEJANDRO CORDOVA IZQUIERDO
GRUPO:BJ03V
TRIMESTRE: 2014/I


CONTENIDO

I. ANTECEDENTES

II. IMPORTANCIA


III. PREREQUISITOS PARA LA FECUNDACIN IN VITRO

IV. OVOCITOS
IV.I OBTENCIN DE OVOCITOS
IV.II TRANSPORTE DE OVARIOS
IV.III EXTRACIN DE OVOCITOS
IV.IV SELECCIN DE OVOCITOS
IV.V MADURACIN DE OVOCITOS
IV.VI CONDICIONES DE CULTIVO
IV.VII EVALUACIN DE RESULTADOS DE MADURACIN

V. ESPERMATOZOIDES
V.I ORIGEN DE LOS ESPERMATOZOIDES
V.II CONCENTRACIN DE LOS ESPERMATOZOIDES
V.III CAPACITACIN DE LOS ESPERMATOZOIDES
V.IV LIMPIEZA DE LOS ESPERMATOZOIDES
V.V CONDICIONES DE INCUBACIN

VI. MEDIOS DE CULTIVO
VI.I MEDIO DE MADURACIN DE OVOCITO
VI.II MEDIO DE MADURACIN DE ESPERMATOZOIDES
VI.III. MEDIOS DE CULTIVO DE EMBRIONES

VII. FECUNDACIN IN VITRO
VII.I CONDICIONES DE CULTIVO IN VITRO DE EMBRIONES
VII.II POLISPERMIA
VII.III MADURACIN IN VITRO DE EMBRIONES

VIII. CONCLUSIN

IX. BIBLIOGRAFIA













I. ANTECEDENTES
Las investigaciones sobre fertilizacin in vitro (FIV) se iniciaron al final de la dcada de
1950, cuando se produjo el nacimiento de conejos por esta tcnica (Ducolomb et al., 2005),
en la especie porcina la primera obtencin de descendencia viva mediante fecundacin in
vitro (FIV) se llev a cabo hace 28 aos (Romar,2001), mientras en Mxico los primeros
cerdos nacidos a partir de embriones producidos in vitro se realiz en el 2004 (Ducolomb
et al., 2005), estos aos de retraso fueron consecuencia de problemas metodolgicos, ya
que las condiciones requeridas para la capacitacin espermtica, la maduracin in vitro
(MIV) de ovocitos y el desarrollo embrionario preimplantacin, difieren entre las diversas
especies de mamferos. Sin embargo, en cerdos todava existen una serie de problemas
asociados a esta especie que impiden que el rendimiento de los sistemas actuales de FIV
sea plenamente satisfactorio.

Los dos problemas clsicos que han acompaado a la FIV en la especie porcina han sido los
bajos porcentajes de formacin de proncleo masculino (PNM) tras la fecundacin y la
polispermia, que en esta especie sigue siendo elevada (Romar, 2001).

II. IMPORTANCIA

La tcnica de fecundacin in vitro (FIV) consiste bsicamente en la exposicin de ocitos
maduros a espermatozoides capacitados de forma que produzca la fecundacin fuera del
tracto reproductor femenino.
Utilizando ocitos que se hayan madurado in vivo o in vitro. Los espermatozoides
podrn ser capacitados in vivo en teros u oviductos intactos o aislados mediante
procedimientos in vitro, la tecnologa actual tiende a que la totalidad del proceso se
realice in vitro. El cultivo de los huevos resultantes durante este periodo de tiempo
variable y su transferencia a hembras receptoras, completa esta tcnica (Martnez et al.,
1989).
La fecundacin in vitro es utilizada en la valoracin de la capacidad fecundante de los
gametos masculinos y es una herramienta que permite la obtencin de embriones a partir de
gametos de alto valor gentico. La produccin de embriones mediante la FIV puede ofrecer
una gran ayuda a los programas de mejora y conservacin del patrimonio gentico, al
permitir la utilizacin de gametos que de modo natural, seran inviables (Gadea et al.,
1998).

III. PREREQUISITOS PARA LA FIV
Existen algunos prerrequisitos para la fecundacin In vitro:

1. Maduracin nuclear y citoplasmtica de los gametos en las gnadas.
2. Desarrollo de la capacidad fecundativa de los gametos en los aparatos reproductores
masculino y femenino.
3. Un nmero ptimo de espermatozoides fecundables con motilidad vigorosa.
4. Un vulo fecundable con el primer cuerpo polar (Hafez, 2002).

IV. OVOCITOS
IV.I OBTENCIN DE OVOCITOS
La obtencin de los ovocitos se realiza a travs de dos procedimientos bsicos:

1. Ocitos post ovulatorios: A partir de animales vivos utilizando la aspiracin
transvaginal ecoguiada (OPU) (Herradn et al., 2007). Se localizan en el oviducto
poco despus de la ovulacin. Normalmente, y con el fin de aumentar el nmero de
oocitos a recoger, se somete a la hembra a tratamientos de superovulacin. La
obtencin a partir del oviducto de los oocitos se efecta mediante laparotomia o tras
el sacrificio de los animales (Lorenzo, 2002).

2. Ocitos preovulatorios: A partir de hembras sacrificadas en el matadero, mediante la
obtencin de sus ovarios y la aspiracin de los folculos (Gil et al., 2010).Hay dos
tipos de ocitos pre ovulatorios, los que casi han completado su maduracin y les
falta un corto espacio de tiempo para terminar la maduracin y aquellos ocitos
foliculares que son totalmente inmaduros (Lorenzo, 2002).

Como hembras donantes se diferencian 3 grupos con diferentes estados reproductivos:
cerdas prepberes, las cuales nos han mostrado actividad cclica, cerdas cclicas y
cerdas despus del destete. Todas las donantes deben tener buena salud general y
sexual. El valor gentico debe estar claramente sobre el valor de la media poblacional
para que justifique el trabajo de la produccin in vitro. Los ovocitos inmaduros se
obtienen de folculos de 2mm a 5mm de dimetro. (Zhan et al., 2006).
IV.II TRANSPORTE DE OVARIOS
El transporte de los ovarios se lleva a cabo en un termo que contiene en su interior una
bolsa plstica estril. Entre la pared interna del termo a temperatura de 32 C (Palma,
2001).
Los medios de transporte que se utilizan para la movilizacin desde la planta de
sacrificio hasta el laboratorio han sido reportados en distintos trabajos de manera
distinta:
NaCl al 0.9% suplementado con antibitico (10 g/ml de estreptomicina y 100
UI/ml de penicilina) y mantenidos a una temperatura de 30 37C.

PBS con 100 UI/ ml penicilina y 100 g/ml de estreptomicina, a una temperatura
entre 30 y 35C.

Solucin salina estril (0,9%) suplementada con penicilina y estreptomicina (0,75
g/L) de 30 a 37 C (Hernndez et al., 2012).

IV.III EXTRACCIN DE OVOCITOS
Usualmente las formas de extraccin de complejos cmulo-ovocitos (COCs) de los
folculos que se emplean son por puncin o aspiracin con jeringa, corte de folculos y
perfusin de oviducto, cada una de estas formas de extraccin presenta ventajas y
desventajas El principal factor limitante para la obtencin de los COCs es el tamao de los
folculos, de los cules se extraen. Una vez obtenidos el dimetro del ovocito y la
morfologa de los COCs, son buenos indicadores de la competencia para producir
embriones (Fernndez et al., 2010)
IV.III.I MTODO DE ASPIRACIN (OVUM PICK-UP)

La puncin se lleva a cabo por medio de un set de aspiracin. A la bomba de aspiracin se
conecta un sistema de tubuladura cuyo extremo se conecta a un tubo de 50 cm por medio
del tapn adaptador. El tapn contiene, junto con la conexin al tubo de goma, una
conexin cnica para una cnula de 18G. La presin negativa se regula de forma que
circulen 20 ml de lquido/min. Con 6 lugares de aspiracin se pueden puncionar 800 a 1000
ovarios en un hora. El lquido folicular aspirado se lava 2 veces con una solucin PBS
(Dulbeccos USA) a 38C. Posteriormente el lquido folicular se deja sedimentar durante
10 min. Y el sobredante se elimina. El sedimento se re-diluye con 25 ml de medio de lavaje
y la suspensin se distribuye en varias placas de Petri (Palma, 2001).



IV.III.II MTODO SLICING
Consiste en la realizacin de cortes longitudinales y transversales con una hoja de bistur,
en la superficie del ovario para liberar el contenido folicular en una placa de cultivo. Se
observan los complejos cmulo- ovocito al microscopio y se seleccionaron aquellos que
presenten una o ms capas de las clulas del cmulos no expandidas y un citoplasma
ovocitario homogneo (Hernndez et al., 2012)
Con las tcnicas descritas se recuperan similar cantidad de ovocitos por ovario y similar
cantidad de ovocitos de calidad por ovario. Por tanto, es posible utilizar cualquiera de estas
tcnicas de recuperacin, pero los ovocitos deben ser tomados de folculos de 2-8 mm de
dimetro y solamente de aquellos que se encuentren en la superficie del ovario (Gmez et
al., 2012).

IV.IV SELECCIN DE OVOCITOS
La seleccin de los ovocitos se realiza generalmente en base a tres criterios: el dimetro del
ovocito, el aspecto de su citoplasma y las caractersticas del cmulo que los rodea. El
dimetro de los ovocitos condiciona su capacidad para madurar, los ovocitos grandes (ms
de 5 mm de dimetro) tienen ms capacidad de convertirse en embriones de los que
ovocitos pequeos (<3 mm de dimetro) (Marchal et al., 2002). Los ovocitos rodeados por
un cmulo compacto formado por varias capas de clulas, presentan mayores porcentajes
de maduracin, fecundacin y de desarrollo hasta blastocistos, que los que carecen de
cmulo o los que estn rodeados solamente por la corona radiada (Herradn et al., 2007).
Se ha comprobado que los ovocitos que presentan un ooplasma oscuro muestran una
acumulacin de lpidos y un buen potencial para el desarrollo, mientras que los que
presentan un citoplasma plido tienen una baja densidad de orgnulos y escaso potencial
de desarrollo. Por otra parte, cuando el ooplasma es negro, los ovocitos estn envejecidos
y tienen un potencial para soportar el desarrollo muy bajo (Martnez, 2002).
Los COCs no aptos para su uso son aquellos cuyo cmulis se encuentran expandidos,
ovocitos que estn cubiertos por menos de 2 capas completas u ovocitos desnudos. La placa
de cultivo contiene los COCs junto con abundante clulas de la pared folicular. A fin de
separar los COCs adecuados de los detritos celulares y lavarlos para el cultivo se
recomienda la manipulacin con un portapipetas o pipetas estiradas en 2 pasos: 1) Se
colocan los COCs en una nueva placa y luego se seleccionan de acuerdo a las
caractersticas morfolgicas. 2) Los COCs se lavan 3 veces en medio de maduracin
(Hernndez et al., 2012).
IV.V MADURACIN DE OVOCITOS
En las hembras de los mamferos, la divisin meitica se inicia durante el perodo fetal para
llegar a un estado de detenimiento conocido como dictoteno, durante la Profase I, la cual se
alcanza previa al nacimiento. Los ovocitos permanecen en dictoteno hasta que tiene lugar el
desarrollo folicular durante la pubertad y de ah hasta agotar sus culas germinales. Durante
este tiempo los ovocitos maduran paulatinamente, proceso que los llevar de la Profase I a
la metafase II volvindose aptos para ser fertilizados (Ambriz, 1993).
La maduracin de los ocitos de los mamferos comprende tres partes: 1) un primer periodo
de crecimiento, 2) un periodo final de preparacin nuclear y 3) un periodo final de
preparacin citoplasmtica, requisito indispensable para una fecundacin (Gil et al., 2010;
Fernndez et al., 2007).
El ocito crecido no tiene todava la capacidad de secretar las protenas necesarias para la
reactivacin de la meiosis, cuando el folculo antral alcanza un tamao determinado
dimetros de 2 mm en el cerdo, termina el crecimiento del ocito ( 120 m) y adquiere la
capacidad de reanudar la meiosis (Martnez, 2002).
La maduracin nuclear incluye la progresin desde el estado de dictoteno hasta la metafase
de la segunda divisin meitica. La descarga de LH, producida pocas horas antes de la
ovulacin e inducida por el propio oocito, va ARN-m, activa de nuevo la meiosis,
sucedindose las distintas fases meiticas, hasta que tras la extrusin del primer corpsculo
polar, se vuelve a detener la meiosis en la metafase de la 2a divisin, coincidiendo con la
ovulacin (Lorenzo, 2002).
La maduracin citoplasmtica incluye una sucesin de transformaciones de los orgnulos
del ocito, fundamentalmente de mitocondrias, grnulos corticales y retculo endoplsmico
liso y rugoso, todas ellas necesarias, para el progreso de la maduracin y el bloqueo de la
poliespermia (Ambriz, 1993).
IV.VI CONDICIONES DE CULTIVO
Particularmente la composicin de los gases, la exactitud de la regulacin de la temperatura
y la concentracin de CO2 y N2 pueden afectar considerablemente el xito del cultivo. La
ptima temperatura de incubacin es de 38 C y debe ser mantenida constante, una
atmsfera de 5% CO2 y humedad a saturacin (Zhan et al., 2006).
Para la maduracin los COCs son cultivados en placas con 500 l de medio de cultivo. Las
placas con el medio son colocadas en una estufa gaseada con CO2 con mxima humedad
relativa para su equilibracin. Los COCs seleccionados se lavan 3 veces en medio
equilibrado y colocando en grupos de 50 COCs en las gotas. (Rivas et al., 2011). Los altos
ndices de madurez ovocitos (75-85 %) se alcanzan despus de 40 a 44 h (Yuan y Krisher
2010).
IV.VII EVALUACIN DEL RESULTADO DE LA MADURACIN
El mtodo de rutina para evaluar la maduracin de COCs porcinos es la expansin del
cmulus, as como tambin la disolucin de vescula germinal.
La expansin del cmulus es la condicin de que la meiosis ha sido reiniciada
Disolucin de la vescula germinal: La maduracin nuclear comprende la
continuacin de la meiosis, que incluye tanto a los cromosomas como cambios de la
estructura nuclear. In vitro se alcanza cerca de 24 h despus de iniciado el proceso
de maduracin de la metafase I y 12 h despus de la metafase II. Ese proceso es
identificado con ruptura de la vescula germinal y consiste en la disolucin de la
membrana (Gil et al., 2010).

V. ESPERMATOZOIDES
V.I ORIGEN DE LOS ESPERMATOZOIDES
Hasta la actualidad, se han descrito varios tipos de espermatozoides para su uso en la
fecundacin in vitro dependiendo de su origen y mtodo de conservacin (Daz et al.,
2009).
Espermatozoides del epiddimo: Los espermatozoides de la cola del epiddimo se
les considera maduros y presentan los factores de decapacitacin adquiridos en el
cuerpo del epiddimo, la membrana plasmtica de los espermatozoides eyaculados
es ms estable que la de los del epiddimo. La muestra de estos espermatozoides es
sustrada de machos sacrificados, de modo que no es posible obtener diferentes
muestras del mismo verraco (Garde y Gallego, 1996).

Espermatozoides eyaculados: Los espermatozoides eyaculados se diluyen en un
diluyente comercial a modo de dosis de inseminacin artificial (3X10
7

espermatozoides/ml), adems que facilita la utilizacin de verracos con diferente
procedencia (Daz et al., 2009).

Semen congelado: Para llevar a cabo la fecundacin in vitro 3 pajillas de
descongelan en bao mara a 38C durante 20 segundos, despus de la evaluacin
de la motilidad a la descongelacin el semen se centrifuga a 800 g durante 3 min y
el decantado es resuspendido con medio de fecundacin. (Palma, 2001)




V.II CONCENTRACIN DE LOS ESPERMATOZOIDES
Cuando se preincuban los espermatozoides, existen dos posibilidades en cuanto a la
concentracin espermtica. La ms utilizada es una concentracin de 2X10
8

espermatozoides/ml (Daz et al., 2009).
V.III CAPACITACIN DE ESPERMATOZOIDES
Para la fecundacin in vitro es decisivo que los espermatozoides sean tratados previamente
para que alcancen la capacidad de fecundar a los ovocitos maduros in vitro. In vivo los
espermatozoides de verraco, no estn en condiciones de penetrar al ovocito. Previamente
requieren una fase de capacitacin, que ocurre en el tracto genital de la hembra (Palma,
2001).
La capacitacin ocurre en varias etapas e induce un cambio en la permeabilidad de la
membrana a travs de diferentes patrones de intercambio de los dominios como
consecuencia de cambios bioqumicos y fisiolgicos; durante la migracin en el tracto
reproductivo femenino transcurre un proceso de seleccin, que afecta significativamente la
cantidad y calidad de los espermatozoides hasta el lugar de la fecundacin, la ausencia de
este mecanismo bajo condiciones in vitro se le atribuye la responsabilidad de las altas tasas
de polispermia (Herrera, 2000).
Los sistemas de capacitacin in vitro de espermatozoides de verraco intentan imitar el
modelo fisiolgico que experimentan estas clulas en condiciones in vivo (Martnez, 2002).
La etapa inicial del proceso in vitro consiste en la extraccin del plasma seminal y de
ciertas protenas especficas que se unen a la superficie del espermatozoide durante su
trnsito epididimario y durante su exposicin al plasma, este tratamiento depende del
origen de la muestra espermtica (Palma, 2001).



V.IV LIMPIEZA DE ESPERMATOZOIDES
Para extraer el plasma seminal la limpieza de los espermatozoides han sido utilizados tres
mtodos:
1. El lavado en medio salino complementado con BSA de modo que con tres lavados
de 1200g, se logra extraer el plasma seminal y las partculas de cubierta que
protegen la clula (Garde y Gallego, 1996 ). Se ha observado que los lavados en
salina-BSA no son necesarios cuando se utiliza la fraccin rica del eyaculado,
diluida y conservada 24 horas a 16C, ay que esta fraccin es rica en
espermatozoides y tiene una reducida cantidad de plasma seminal (Herrera, 2000).

2. Lavados a travs de columnas de percoll, dispuestas desde 2 a 5 gradientes, de tal
forma que este procedimiento permite no solo la eliminacin de plasma seminal
sino tambin la purificacin de la muestra espermtica ya que es capaz de
seleccionar espermatozoides mtiles morfolgicamente normales (Garde y Gallego,
1996).

3. Por medio de centrifuga: el semen se centrifuga a 500G durante 5 minutos , en
medio, en medio Brackett y Oliphant, sin glucosa, complementado con 4 UI/ml de
heparina (sigma). La concentracin final del BO 2 UI/ml de heparina, 5 mM de
cafena benzoato de sodio y 10 mg/ml de albmina srica bovina fraccin (BSA,
sigma) (Rivas et al., 2011).


Por otro lado la preincubacin de los espermatozoides es una variable de suma importancia
en el procedimiento de capacitacin in vitro, mediante este sistema se intenta imitar el
tiempo que permanece el espermatozoide en el interior del tracto reproductor femenino
antes de producir el ovocito; por lo que se cree que el tiempo de capacitacin sea
dependiente del intervalo cubricin/ fecundacin, siendo en la especie porcina de 5.5 a 6 h
(Martnez, 2002).
V.V CONDICIONES DE INCUBACIN
Despus de la limpieza del plasma seminal. Los espermatozoides son recluidos en TCM-
199 suplementado con lactato, calcio, piruvato sdico y glucosa hasta una concentracin de
2X10
8
espermatozoides/ml y coincubados inmediatamente despus con los ovocitos en
medios TCM-199 (Rivas et al., 2011).
VI. MEDIOS
Las condiciones de cultivo son importantes para mejorar la maduracin y la fecundacin in
vitro de los ovocitos de cerda ( Lapierre et al., 2010). Los medios de cultivo se clasifican de
la siguiente manera:

Definidos o no definidos: refiere a aquellos donde se tiene o no conocimiento de

todos los componentes con los cuales son preparados. En la actualidad los medios
de cultivo tienden a ser de composicin definida, lo cual ayuda a determinar los
requerimientos especficos de los embriones y hacen posible la repetibilidad de los
resultados.

Secuenciales o no secuenciales: los no secuenciales son aquellos sobre los cuales

no se efecta modificaciones a lo largo del cultivo, mientras que los secuenciales
son aquellos en los cuales la composicin va siendo modificada, mediante la
adicin de sustancias o el recambio del medio en funcin de los requerimientos o
para eliminar productos del metabolismo embrionario que podra afectar su
viabilidad (INTA, 2010).

VI.I MEDIOS DE MADURACIN DE OVOCITOS
El objetivo de la maduracin in vitro (MIV) de ovocitos, es producirlos con calidad
comparable a los obtenidos in vivo (Fernndez et al., 2010).

Para incrementar la eficiencia y reproducibilidad en la MIV y FIV, as como en el
desarrollo embrionario, se han creado medios definidos (refiere a aquellos donde se tiene
conocimiento de todos los componentes con los cuales son preparados (Pelez, 2011)). El
fluido folicular porcino y el suero fetal bovino han sido eliminados de estos medios como
fuente de nutrimentos, debido a la complejidad de su composicin y a la variabilidad que
existe entre ellos (Ducolomb et al., 2005).Los medios definidos utilizados contienen
polivinil alcohol (PVA) y suplementos como cistena, glucosa, piruvato de sodio, factor de
crecimiento epidrmico (EGF), LH y FSH. El manejo del pH y de la temperatura durante
MIV, son parmetros importantes en el porcino (Fernndez et al., 2010).
Existen claras evidencias de que los ovocitos madurados In vivo tienen una competencia
para el desarrollo notablemente superior a los madurados In vitro (Herradn et al., 2007).
La maduracin en cultivo debe ser en 24 h y despus de este lapso se debe eliminar la
suplementacin con hormonas (Palma, 2001).
VI.II MEDIOS DE MADURACIN DE ESPERMATOZOIDES
Los espermatozoides de verraco pueden ser capacitados in vitro mediante el empleo de
diferentes medios (KRB, TCM.199 y TALP). Habitualmente los medios son suplementados
con una fuente energtica, normalmente como lactato, piruvato y glucosa (Garde y Gallego,
1996).
La cafena ha sido incluida en la FIV, la tiene doble funcin: estimular la motilidad y
desestabilizar las membranas (Garca- Daz et al., 2013). Sin embargo , la reaccin
acrosmica espontnea inducida por la cafena puede estar relacionado con la alta
incidencia de fertilizacin poliesprmicos en la FIV (Gil et al., 2010).

Otro componente utilizado es la albumina srica bovina, desempeando una importante
funcin en la capacitacin y reaccin acrosomal, ya que elimina el colesterol y los cidos
grasos de las membranas espermticas (Pelez, 2011).
El fluido folicular porcino tambin es utilizado en el medio de cultivo, es fundamental en la
proteccin de los ovocitos del estrs oxidativo (Gil et al., 2010).
El bicarbonato/Co2 es uno de los componentes ms universales en los sistemas de FIV, ya
que este ion estimula tanto la motilidad y es esencial para la capacitacin de los
espermatozoides de verraco, teniendo un efecto sinrgico con la cafena (Rivas, 2011).
VI.II MEDIOS DE CULTIVO DE EMBRIONES
Para replicar las condiciones naturales del microambiente del oviducto, se han desarrollado
dos sistemas para el cultivo in vitro de embriones, que son: la utilizacin de medios
definidos para cultivo de embriones (KSOM, CR1aa, CR2, TCM-199, CZB, SOF, USU,
Ham F-10, Menezo B, etc) y la utilizacin de co-cultivos (Rivas et al., 2011). Clsicamente
el medio de FIV porcina ha sido el medio comercial TCM-199 ( Romar,2001). Los
cocultivos involucra la asociacin de los cigotos con otro tipo de clulas en el medio de
cultivo. Para esto se utiliza clulas somticas tales como las clulas de la granulosa u
oviductales, que al desarrollar puede producir y liberar factores de crecimiento, hormonas,
etc, que podra favorecer el desarrollo embrionario temprano (Pelez, 2011).
Los medios de cultivo para embriones contienen aminocidos, hormonas (como la insulina
o factores de crecimiento) para incrementar el transporte de la glucosa, y sueros como:
suero fetal de bovino, suero de vaca preada (Rivas et al., 2011).
Sustratos energticos: Se utiliza la glucosa, el piruvato sdico y el lactato clcico.
Su funcin es actuar como fuente de energa en los procesos de capacitacin
espermtica y fecundacin (Romar,2001).

Componentes electrolitos: Varios cationes son vitales para la capacitacin
espermtica, la reaccin acrosmica, la motilidad y la fecundacin. El Ca2+ es uno
de los iones ms importantes y su presencia provoca cambios significativos en la
motilidad de los espermatozoides, mientras que el el K+ extracelular tambin
interviene en la reaccin acrosmica, otro ion importante es el bicarbonato ya que
su concentracin aumenta los porcentajes de penetracin del espermatozoide
(Garca- Daz et al., 2013).

Suplementos: Algunos de ellos, como la cafena que incrementa la capacidad de los
espermatozoides para fecundar (y se ha sugerido que mejora y prolonga la motilidad
de los espermatozoides del verraco). La heparina se ha usado para estimular la
capacitacin de espermatozoides. Y el cido hialurnico, que aadido al medio de
FIV aumenta la penetracin monosprmica en ovocitos denudados empleando
semen eyaculado crioconservado (Romar, 2001).

Osmolaridad: Teniendo en cuenta los valores observados en las secreciones
uterinas, podra asumirse que lo ptimo sera 280 20 mOsm/Kg. Sin embargo,
existe evidencia que indica que valores de alrededor de 245 mOsm/Kg favoreceran
el desarrollo embrionario (Mucci et al., 2006).

pH. La mayora de los embriones de mamferos cultivados in vitro desarrollan en
pH neutro o ligeramente alcalino, encontrndose los mejores resultados entre 7,2 y
7,6 (Mucci et al., 2006). .

CO
2
y O
2
: La fase gaseosa ms utilizada es aquella compuesta por 5% CO
2
en aire
para la maduracin ovocitaria y fertilizacin, y 5% O
2
, 90% N2 y 5% CO
2
para el
desarrollo embrionario. Estas son similares a las registradas en el oviducto de
algunas hembras mamferas( Mucci et al., 2006).

Agua: El componente que participa en mayor proporcin en la formulacin de
cualquier medio de cultivo y su grado de pureza est fuertemente relacionado con
el desarrollo embrionario ( Mucci et al., 2006).




VII.FECUNDACIN IN VITRO
Una vez que disponemos de ovocitos maduros, el siguiente objetivo es lograr la
fecundacin de los mismos, para ello se incuban junto con espermatozoides capacitados
en un medio (Herradn et al., 2007) de 6 a 24 horas (Pelez, 2011), suplementado con
fuentes energticas (piruvato, lactato) y albmina srica (Herradn et al., 2007). As pues
se activa la segunda divisin meitica del ovocito (Rivas et al., 2011).Para la FIV la
concentracin de espermatozoides y ovocitos tienen una relacin de 10,000:1 (Fernndez et
al., 2010)
La descondensacin de la cabeza del espermatozoide ocurre dentro de 1 a 2 horas de haber
penetrado al ovocito, y el proncleo masculino se forma de 3 a 5 horas. Para lograr un
buen porcentaje de fertilizacin hay incubar por 24 horas despus de la maduracin y
fertilizacin. Si se observan los 2 cuerpos polares dentro del gameto femenino quiere decir
que se llev a cabo la fertilizacin (Rivas et al., 2011).
VI.I CONDICIONES DE CULTIVO IN VITRO DE EMBRIONES
Tanto el ambiente fsico como el qumico se deben mantener lo ms cercano posible al
ambiente uterino, ya que los embriones no toleran grandes cambios en ambos ambientes.
Temperatura: La temperatura ptima para la maduracin in vitro de los embriones
es de 38 a 39C (Pelez, 2011).
Luz: Se recomienda no exponer los ovocitos o embriones a la luz mas de lo
necesario, ya que los eventos de maduracin ocurren normalmente en la obscuridad
en el tracto reproductivo de la hembra (Pelez, 2011).
Atmsfera de gas: Es necesario tener un riguroso control de la atmsfera para
incubar los embriones, ya sea 5% de bixido de carbono (CO2) en aire, o 5% de
CO2, 5% de oxgeno y 90% de nitrgeno, utilizando un mximo de humedad
relativa para prevenir la evaporacin del medio (Pelez, 2011).
Osmolaridad: Si la osmolaridad del medio es menor a la del ambiente uterino, el
embrin absorber agua y se hinchar hasta explotar, y al contrario, si la
osmolaridad es mayor, el tamao del embrin se encoger lo cual tambin es
detrimental para la sobrevivencia del mismo la osmolaridad del medio. Se
recomienda mantenerla a 290 mOsm (Pelez, 2011).
pH. Es importante mantener un pH de 7.4 (Pelez, 2011).

VII.II POLISPERMIA
A pesar de que se ha producido exitosamente embriones de cerdo, existe una alta
incidencia de polispermia es un problema importante en la fertilizacin in vitro ( FIV ) , la
eficacia de la FIV es reflejado en el porcentaje de monoesprmia de 30 - 50 % en la
mayora de laboratorios (Gil et al., 2004). Se cree que existen diversos factores que
influyen en la produccin de polismermia entre las hiptesis mas destacables son las
siguientes:
Los ovocitos madurados in vitro estn expuestos a un excesivo nmero de
espermatozoides. Estas condiciones pueden predisponer a la penetracin de ovocitos
por ms de un espermatozoides, el problema de la polispermia podra ser superado
porla reduccin del nmero de espermatozoides ( Abeydeera, 2002; Zhan, 2006)
La calidad del semen en la fertilizacin, as como la maduracin del ovocito puede
afectar las tasas poliespermia (Suzuki, 2003)
Condiciones subptima en el procedimiento de la FIV (Gil, 2010).
VII.III MADURACIN IN VITRO DE EMBRIONES
Luego de la maduracin in vitro, aproximadamente el 90% de los ovocitos inmaduros
puestos a cultivar, alcanzan la metafase II y expulsan el primer cuerpo polar entre las 16 y
24 h de comenzada la maduracin. De estos, aproximadamente el 80% es fecundado y
comienzan a dividirse, al menos, hasta el estadio de 2 a 4 clulas. Sin embargo, slo un 25-
40% alcanza el estadio de blastocisto (B) o blastocisto expandido (Bex) luego del cultivo
durante 6-7 das. Esto indica que el cultivo embrionario, correspondiente al paso ms
prolongado dentro del proceso de produccin in vitro, es el perodo en el que se establece el
mayor porcentajes de prdidas del sistema. A su vez, durante esta etapa, se define en gran
medida la calidad de los embriones obtenidos (Mucci et al., 2006).
Cuando el cultivo de los embriones de cerda es realizado in vitro, el desarrollo es
bloqueado en el estado donde se da la transicin de control maternal a control
embriognico de desarrollo; siendo este para la cerda de 4 a 8 clulas, que
aproximadamente es de nueve das, antes de la transferencia (Bonet et al., 2008).
Se han transferido embriones de cerdos recin fertilizados o de dos a cuatro clulas en el
oviducto, o embriones de ocho clulas o mrulas en el cuerno uterino (Ducolomb et al.,
2005) Al llegar a estos estadios, los embriones pueden ser transferidos a cerdas receptoras
(Pelez, 2011)

La transferencia de todos los embriones a un solo cuerno uterino se debe al hecho de que en
la cerda los embriones tienen la capacidad de migrar a ambos cuernos. Se ha informado que
muchos embriones no se implantan o son reabsorbidos, por lo que un alto nmero de
embriones debe ser transferido para que algunos de ellos puedan llegar al final de la
gestacin la transferencia de un alto nmero de embriones debe proporcionar proteccin
durante la gestacin, para evitar la prdida de productos (Ducolomb et al., 2005). La
transferencia de embriones frescos ofrece una tasa del 70,8% y unas camadas de 6,9
lechones (Bonet et al., 2008).

VIII. CONCLUSIN
La fecundacin in vitro es una alternativa viable en la reproduccin de cerdos,
sin embargo por su alto costo es difcil que en las unidades de produccin
animal tengan acceso a esta biotecnologa. Es importante desarrollar y
perfeccionar nuevas tcnicas de fecundacin in vitro en cerdos, ya que an no se
ha explicado totalmente la causa de polispermia siendo esta el principal
problema que afecta la fecundacin in vitro en esta especie, adems que la FIV
va de la mano con la aplicacin de otras biotecnologas como transferencia de
embriones y transgnesis.



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