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FECUNDACIN IN VITRO
EN CERDOS
ALUMNA: BLANCA ARACELI LPEZ JUREZ
MDULO: REPRODUCCIN DE MAMIFEROS E INSEMINACIN
ARTIFICIAL
DOCENTE: DR. ALEJANDRO CORDOVA IZQUIERDO
GRUPO:BJ03V
TRIMESTRE: 2014/I
CONTENIDO
I. ANTECEDENTES
II. IMPORTANCIA
III. PREREQUISITOS PARA LA FECUNDACIN IN VITRO
IV. OVOCITOS
IV.I OBTENCIN DE OVOCITOS
IV.II TRANSPORTE DE OVARIOS
IV.III EXTRACIN DE OVOCITOS
IV.IV SELECCIN DE OVOCITOS
IV.V MADURACIN DE OVOCITOS
IV.VI CONDICIONES DE CULTIVO
IV.VII EVALUACIN DE RESULTADOS DE MADURACIN
V. ESPERMATOZOIDES
V.I ORIGEN DE LOS ESPERMATOZOIDES
V.II CONCENTRACIN DE LOS ESPERMATOZOIDES
V.III CAPACITACIN DE LOS ESPERMATOZOIDES
V.IV LIMPIEZA DE LOS ESPERMATOZOIDES
V.V CONDICIONES DE INCUBACIN
VI. MEDIOS DE CULTIVO
VI.I MEDIO DE MADURACIN DE OVOCITO
VI.II MEDIO DE MADURACIN DE ESPERMATOZOIDES
VI.III. MEDIOS DE CULTIVO DE EMBRIONES
VII. FECUNDACIN IN VITRO
VII.I CONDICIONES DE CULTIVO IN VITRO DE EMBRIONES
VII.II POLISPERMIA
VII.III MADURACIN IN VITRO DE EMBRIONES
VIII. CONCLUSIN
IX. BIBLIOGRAFIA
I. ANTECEDENTES
Las investigaciones sobre fertilizacin in vitro (FIV) se iniciaron al final de la dcada de
1950, cuando se produjo el nacimiento de conejos por esta tcnica (Ducolomb et al., 2005),
en la especie porcina la primera obtencin de descendencia viva mediante fecundacin in
vitro (FIV) se llev a cabo hace 28 aos (Romar,2001), mientras en Mxico los primeros
cerdos nacidos a partir de embriones producidos in vitro se realiz en el 2004 (Ducolomb
et al., 2005), estos aos de retraso fueron consecuencia de problemas metodolgicos, ya
que las condiciones requeridas para la capacitacin espermtica, la maduracin in vitro
(MIV) de ovocitos y el desarrollo embrionario preimplantacin, difieren entre las diversas
especies de mamferos. Sin embargo, en cerdos todava existen una serie de problemas
asociados a esta especie que impiden que el rendimiento de los sistemas actuales de FIV
sea plenamente satisfactorio.
Los dos problemas clsicos que han acompaado a la FIV en la especie porcina han sido los
bajos porcentajes de formacin de proncleo masculino (PNM) tras la fecundacin y la
polispermia, que en esta especie sigue siendo elevada (Romar, 2001).
II. IMPORTANCIA
La tcnica de fecundacin in vitro (FIV) consiste bsicamente en la exposicin de ocitos
maduros a espermatozoides capacitados de forma que produzca la fecundacin fuera del
tracto reproductor femenino.
Utilizando ocitos que se hayan madurado in vivo o in vitro. Los espermatozoides
podrn ser capacitados in vivo en teros u oviductos intactos o aislados mediante
procedimientos in vitro, la tecnologa actual tiende a que la totalidad del proceso se
realice in vitro. El cultivo de los huevos resultantes durante este periodo de tiempo
variable y su transferencia a hembras receptoras, completa esta tcnica (Martnez et al.,
1989).
La fecundacin in vitro es utilizada en la valoracin de la capacidad fecundante de los
gametos masculinos y es una herramienta que permite la obtencin de embriones a partir de
gametos de alto valor gentico. La produccin de embriones mediante la FIV puede ofrecer
una gran ayuda a los programas de mejora y conservacin del patrimonio gentico, al
permitir la utilizacin de gametos que de modo natural, seran inviables (Gadea et al.,
1998).
III. PREREQUISITOS PARA LA FIV
Existen algunos prerrequisitos para la fecundacin In vitro:
1. Maduracin nuclear y citoplasmtica de los gametos en las gnadas.
2. Desarrollo de la capacidad fecundativa de los gametos en los aparatos reproductores
masculino y femenino.
3. Un nmero ptimo de espermatozoides fecundables con motilidad vigorosa.
4. Un vulo fecundable con el primer cuerpo polar (Hafez, 2002).
IV. OVOCITOS
IV.I OBTENCIN DE OVOCITOS
La obtencin de los ovocitos se realiza a travs de dos procedimientos bsicos:
1. Ocitos post ovulatorios: A partir de animales vivos utilizando la aspiracin
transvaginal ecoguiada (OPU) (Herradn et al., 2007). Se localizan en el oviducto
poco despus de la ovulacin. Normalmente, y con el fin de aumentar el nmero de
oocitos a recoger, se somete a la hembra a tratamientos de superovulacin. La
obtencin a partir del oviducto de los oocitos se efecta mediante laparotomia o tras
el sacrificio de los animales (Lorenzo, 2002).
2. Ocitos preovulatorios: A partir de hembras sacrificadas en el matadero, mediante la
obtencin de sus ovarios y la aspiracin de los folculos (Gil et al., 2010).Hay dos
tipos de ocitos pre ovulatorios, los que casi han completado su maduracin y les
falta un corto espacio de tiempo para terminar la maduracin y aquellos ocitos
foliculares que son totalmente inmaduros (Lorenzo, 2002).
Como hembras donantes se diferencian 3 grupos con diferentes estados reproductivos:
cerdas prepberes, las cuales nos han mostrado actividad cclica, cerdas cclicas y
cerdas despus del destete. Todas las donantes deben tener buena salud general y
sexual. El valor gentico debe estar claramente sobre el valor de la media poblacional
para que justifique el trabajo de la produccin in vitro. Los ovocitos inmaduros se
obtienen de folculos de 2mm a 5mm de dimetro. (Zhan et al., 2006).
IV.II TRANSPORTE DE OVARIOS
El transporte de los ovarios se lleva a cabo en un termo que contiene en su interior una
bolsa plstica estril. Entre la pared interna del termo a temperatura de 32 C (Palma,
2001).
Los medios de transporte que se utilizan para la movilizacin desde la planta de
sacrificio hasta el laboratorio han sido reportados en distintos trabajos de manera
distinta:
NaCl al 0.9% suplementado con antibitico (10 g/ml de estreptomicina y 100
UI/ml de penicilina) y mantenidos a una temperatura de 30 37C.
PBS con 100 UI/ ml penicilina y 100 g/ml de estreptomicina, a una temperatura
entre 30 y 35C.
Solucin salina estril (0,9%) suplementada con penicilina y estreptomicina (0,75
g/L) de 30 a 37 C (Hernndez et al., 2012).
IV.III EXTRACCIN DE OVOCITOS
Usualmente las formas de extraccin de complejos cmulo-ovocitos (COCs) de los
folculos que se emplean son por puncin o aspiracin con jeringa, corte de folculos y
perfusin de oviducto, cada una de estas formas de extraccin presenta ventajas y
desventajas El principal factor limitante para la obtencin de los COCs es el tamao de los
folculos, de los cules se extraen. Una vez obtenidos el dimetro del ovocito y la
morfologa de los COCs, son buenos indicadores de la competencia para producir
embriones (Fernndez et al., 2010)
IV.III.I MTODO DE ASPIRACIN (OVUM PICK-UP)
La puncin se lleva a cabo por medio de un set de aspiracin. A la bomba de aspiracin se
conecta un sistema de tubuladura cuyo extremo se conecta a un tubo de 50 cm por medio
del tapn adaptador. El tapn contiene, junto con la conexin al tubo de goma, una
conexin cnica para una cnula de 18G. La presin negativa se regula de forma que
circulen 20 ml de lquido/min. Con 6 lugares de aspiracin se pueden puncionar 800 a 1000
ovarios en un hora. El lquido folicular aspirado se lava 2 veces con una solucin PBS
(Dulbeccos USA) a 38C. Posteriormente el lquido folicular se deja sedimentar durante
10 min. Y el sobredante se elimina. El sedimento se re-diluye con 25 ml de medio de lavaje
y la suspensin se distribuye en varias placas de Petri (Palma, 2001).
IV.III.II MTODO SLICING
Consiste en la realizacin de cortes longitudinales y transversales con una hoja de bistur,
en la superficie del ovario para liberar el contenido folicular en una placa de cultivo. Se
observan los complejos cmulo- ovocito al microscopio y se seleccionaron aquellos que
presenten una o ms capas de las clulas del cmulos no expandidas y un citoplasma
ovocitario homogneo (Hernndez et al., 2012)
Con las tcnicas descritas se recuperan similar cantidad de ovocitos por ovario y similar
cantidad de ovocitos de calidad por ovario. Por tanto, es posible utilizar cualquiera de estas
tcnicas de recuperacin, pero los ovocitos deben ser tomados de folculos de 2-8 mm de
dimetro y solamente de aquellos que se encuentren en la superficie del ovario (Gmez et
al., 2012).
IV.IV SELECCIN DE OVOCITOS
La seleccin de los ovocitos se realiza generalmente en base a tres criterios: el dimetro del
ovocito, el aspecto de su citoplasma y las caractersticas del cmulo que los rodea. El
dimetro de los ovocitos condiciona su capacidad para madurar, los ovocitos grandes (ms
de 5 mm de dimetro) tienen ms capacidad de convertirse en embriones de los que
ovocitos pequeos (<3 mm de dimetro) (Marchal et al., 2002). Los ovocitos rodeados por
un cmulo compacto formado por varias capas de clulas, presentan mayores porcentajes
de maduracin, fecundacin y de desarrollo hasta blastocistos, que los que carecen de
cmulo o los que estn rodeados solamente por la corona radiada (Herradn et al., 2007).
Se ha comprobado que los ovocitos que presentan un ooplasma oscuro muestran una
acumulacin de lpidos y un buen potencial para el desarrollo, mientras que los que
presentan un citoplasma plido tienen una baja densidad de orgnulos y escaso potencial
de desarrollo. Por otra parte, cuando el ooplasma es negro, los ovocitos estn envejecidos
y tienen un potencial para soportar el desarrollo muy bajo (Martnez, 2002).
Los COCs no aptos para su uso son aquellos cuyo cmulis se encuentran expandidos,
ovocitos que estn cubiertos por menos de 2 capas completas u ovocitos desnudos. La placa
de cultivo contiene los COCs junto con abundante clulas de la pared folicular. A fin de
separar los COCs adecuados de los detritos celulares y lavarlos para el cultivo se
recomienda la manipulacin con un portapipetas o pipetas estiradas en 2 pasos: 1) Se
colocan los COCs en una nueva placa y luego se seleccionan de acuerdo a las
caractersticas morfolgicas. 2) Los COCs se lavan 3 veces en medio de maduracin
(Hernndez et al., 2012).
IV.V MADURACIN DE OVOCITOS
En las hembras de los mamferos, la divisin meitica se inicia durante el perodo fetal para
llegar a un estado de detenimiento conocido como dictoteno, durante la Profase I, la cual se
alcanza previa al nacimiento. Los ovocitos permanecen en dictoteno hasta que tiene lugar el
desarrollo folicular durante la pubertad y de ah hasta agotar sus culas germinales. Durante
este tiempo los ovocitos maduran paulatinamente, proceso que los llevar de la Profase I a
la metafase II volvindose aptos para ser fertilizados (Ambriz, 1993).
La maduracin de los ocitos de los mamferos comprende tres partes: 1) un primer periodo
de crecimiento, 2) un periodo final de preparacin nuclear y 3) un periodo final de
preparacin citoplasmtica, requisito indispensable para una fecundacin (Gil et al., 2010;
Fernndez et al., 2007).
El ocito crecido no tiene todava la capacidad de secretar las protenas necesarias para la
reactivacin de la meiosis, cuando el folculo antral alcanza un tamao determinado
dimetros de 2 mm en el cerdo, termina el crecimiento del ocito ( 120 m) y adquiere la
capacidad de reanudar la meiosis (Martnez, 2002).
La maduracin nuclear incluye la progresin desde el estado de dictoteno hasta la metafase
de la segunda divisin meitica. La descarga de LH, producida pocas horas antes de la
ovulacin e inducida por el propio oocito, va ARN-m, activa de nuevo la meiosis,
sucedindose las distintas fases meiticas, hasta que tras la extrusin del primer corpsculo
polar, se vuelve a detener la meiosis en la metafase de la 2a divisin, coincidiendo con la
ovulacin (Lorenzo, 2002).
La maduracin citoplasmtica incluye una sucesin de transformaciones de los orgnulos
del ocito, fundamentalmente de mitocondrias, grnulos corticales y retculo endoplsmico
liso y rugoso, todas ellas necesarias, para el progreso de la maduracin y el bloqueo de la
poliespermia (Ambriz, 1993).
IV.VI CONDICIONES DE CULTIVO
Particularmente la composicin de los gases, la exactitud de la regulacin de la temperatura
y la concentracin de CO2 y N2 pueden afectar considerablemente el xito del cultivo. La
ptima temperatura de incubacin es de 38 C y debe ser mantenida constante, una
atmsfera de 5% CO2 y humedad a saturacin (Zhan et al., 2006).
Para la maduracin los COCs son cultivados en placas con 500 l de medio de cultivo. Las
placas con el medio son colocadas en una estufa gaseada con CO2 con mxima humedad
relativa para su equilibracin. Los COCs seleccionados se lavan 3 veces en medio
equilibrado y colocando en grupos de 50 COCs en las gotas. (Rivas et al., 2011). Los altos
ndices de madurez ovocitos (75-85 %) se alcanzan despus de 40 a 44 h (Yuan y Krisher
2010).
IV.VII EVALUACIN DEL RESULTADO DE LA MADURACIN
El mtodo de rutina para evaluar la maduracin de COCs porcinos es la expansin del
cmulus, as como tambin la disolucin de vescula germinal.
La expansin del cmulus es la condicin de que la meiosis ha sido reiniciada
Disolucin de la vescula germinal: La maduracin nuclear comprende la
continuacin de la meiosis, que incluye tanto a los cromosomas como cambios de la
estructura nuclear. In vitro se alcanza cerca de 24 h despus de iniciado el proceso
de maduracin de la metafase I y 12 h despus de la metafase II. Ese proceso es
identificado con ruptura de la vescula germinal y consiste en la disolucin de la
membrana (Gil et al., 2010).
V. ESPERMATOZOIDES
V.I ORIGEN DE LOS ESPERMATOZOIDES
Hasta la actualidad, se han descrito varios tipos de espermatozoides para su uso en la
fecundacin in vitro dependiendo de su origen y mtodo de conservacin (Daz et al.,
2009).
Espermatozoides del epiddimo: Los espermatozoides de la cola del epiddimo se
les considera maduros y presentan los factores de decapacitacin adquiridos en el
cuerpo del epiddimo, la membrana plasmtica de los espermatozoides eyaculados
es ms estable que la de los del epiddimo. La muestra de estos espermatozoides es
sustrada de machos sacrificados, de modo que no es posible obtener diferentes
muestras del mismo verraco (Garde y Gallego, 1996).
Espermatozoides eyaculados: Los espermatozoides eyaculados se diluyen en un
diluyente comercial a modo de dosis de inseminacin artificial (3X10
7
espermatozoides/ml), adems que facilita la utilizacin de verracos con diferente
procedencia (Daz et al., 2009).
Semen congelado: Para llevar a cabo la fecundacin in vitro 3 pajillas de
descongelan en bao mara a 38C durante 20 segundos, despus de la evaluacin
de la motilidad a la descongelacin el semen se centrifuga a 800 g durante 3 min y
el decantado es resuspendido con medio de fecundacin. (Palma, 2001)
V.II CONCENTRACIN DE LOS ESPERMATOZOIDES
Cuando se preincuban los espermatozoides, existen dos posibilidades en cuanto a la
concentracin espermtica. La ms utilizada es una concentracin de 2X10
8
espermatozoides/ml (Daz et al., 2009).
V.III CAPACITACIN DE ESPERMATOZOIDES
Para la fecundacin in vitro es decisivo que los espermatozoides sean tratados previamente
para que alcancen la capacidad de fecundar a los ovocitos maduros in vitro. In vivo los
espermatozoides de verraco, no estn en condiciones de penetrar al ovocito. Previamente
requieren una fase de capacitacin, que ocurre en el tracto genital de la hembra (Palma,
2001).
La capacitacin ocurre en varias etapas e induce un cambio en la permeabilidad de la
membrana a travs de diferentes patrones de intercambio de los dominios como
consecuencia de cambios bioqumicos y fisiolgicos; durante la migracin en el tracto
reproductivo femenino transcurre un proceso de seleccin, que afecta significativamente la
cantidad y calidad de los espermatozoides hasta el lugar de la fecundacin, la ausencia de
este mecanismo bajo condiciones in vitro se le atribuye la responsabilidad de las altas tasas
de polispermia (Herrera, 2000).
Los sistemas de capacitacin in vitro de espermatozoides de verraco intentan imitar el
modelo fisiolgico que experimentan estas clulas en condiciones in vivo (Martnez, 2002).
La etapa inicial del proceso in vitro consiste en la extraccin del plasma seminal y de
ciertas protenas especficas que se unen a la superficie del espermatozoide durante su
trnsito epididimario y durante su exposicin al plasma, este tratamiento depende del
origen de la muestra espermtica (Palma, 2001).
V.IV LIMPIEZA DE ESPERMATOZOIDES
Para extraer el plasma seminal la limpieza de los espermatozoides han sido utilizados tres
mtodos:
1. El lavado en medio salino complementado con BSA de modo que con tres lavados
de 1200g, se logra extraer el plasma seminal y las partculas de cubierta que
protegen la clula (Garde y Gallego, 1996 ). Se ha observado que los lavados en
salina-BSA no son necesarios cuando se utiliza la fraccin rica del eyaculado,
diluida y conservada 24 horas a 16C, ay que esta fraccin es rica en
espermatozoides y tiene una reducida cantidad de plasma seminal (Herrera, 2000).
2. Lavados a travs de columnas de percoll, dispuestas desde 2 a 5 gradientes, de tal
forma que este procedimiento permite no solo la eliminacin de plasma seminal
sino tambin la purificacin de la muestra espermtica ya que es capaz de
seleccionar espermatozoides mtiles morfolgicamente normales (Garde y Gallego,
1996).
3. Por medio de centrifuga: el semen se centrifuga a 500G durante 5 minutos , en
medio, en medio Brackett y Oliphant, sin glucosa, complementado con 4 UI/ml de
heparina (sigma). La concentracin final del BO 2 UI/ml de heparina, 5 mM de
cafena benzoato de sodio y 10 mg/ml de albmina srica bovina fraccin (BSA,
sigma) (Rivas et al., 2011).
Por otro lado la preincubacin de los espermatozoides es una variable de suma importancia
en el procedimiento de capacitacin in vitro, mediante este sistema se intenta imitar el
tiempo que permanece el espermatozoide en el interior del tracto reproductor femenino
antes de producir el ovocito; por lo que se cree que el tiempo de capacitacin sea
dependiente del intervalo cubricin/ fecundacin, siendo en la especie porcina de 5.5 a 6 h
(Martnez, 2002).
V.V CONDICIONES DE INCUBACIN
Despus de la limpieza del plasma seminal. Los espermatozoides son recluidos en TCM-
199 suplementado con lactato, calcio, piruvato sdico y glucosa hasta una concentracin de
2X10
8
espermatozoides/ml y coincubados inmediatamente despus con los ovocitos en
medios TCM-199 (Rivas et al., 2011).
VI. MEDIOS
Las condiciones de cultivo son importantes para mejorar la maduracin y la fecundacin in
vitro de los ovocitos de cerda ( Lapierre et al., 2010). Los medios de cultivo se clasifican de
la siguiente manera: