1968, 16(8):1200. Appl. Microbiol.

and Ichiro Chibata

Komatsubara, Masahiko Kisumi
Jyoji Kato, So Horie, Saburo

Kurthia catenaforma
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A P P L u w M I C R O B I O L O G Y , A u g . 1 9 6 8 , P . 1 2 0 0 - 1 2 0 6
C o p y r i g h t 1 9 6 8 A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y
V o l . 1 6 , N o . 8
P r i n t e d i n U . S . A .
P r o d u c t i o n o f L - P r o l i n e b y K u r t h i a c a t e n a f o r m a
J Y O J I K A TO , S O HO R I E, S A B U R O K O M A TS U B A R A , M A S A HI K O K I S U M I , A N D I C HI R O C HI B A TA
De p a r t m e n t o f A p p l i e d B i o c h e m i s t r y , C h e m i c a l R e s e a r c h L a b o r a t o r y , Ta n a b e S e i y a k u C o . L t d . , K a s h i m a - c h o ,
Hi g a s h i y o d o g a w a - k u , O s a k a , J a p a n
R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 2 3 A p r i l 1 9 6 8
A n u m b e r o f o r g a n i s m s w e r e s c r e e n e d f o r t h e i r a b i l i t y t o p r o d u c e L - p r o l i n e .
K u r t h i a c a t e n a f o r m a , w h i c h w e r e c e n t l y i s o l a t e d , w a s s e l e c t e d . A s e r i n e - r e q u i r i n g
m u t a n t , s t r a i n 4 5 , p r o d u c e d a b o u t 1 . 5 t i m e s t h e a m o u n t o f t h i s a m i n o a c i d t h a t t h e
p a r e n t s t r a i n d i d . I n i n v e s t i g a t i o n s o f v a r i o u s m e d i a , i t w a s f o u n d t h a t a p p r o x i m a t e l y
3 0 m l o f L - p r o l i n e p e r m l w a s p r o d u c e d i n s h a k e n c u l t u r e a t 3 0 C i n a m e d i u m c o n -
t a i n i n g g l u c o s e , u r e a , c o r n s t e e p l i q u o r , c a s e i n h y d r o l y s a t e , L - a s p a r t i c a c i d , a n d
i n o r g a n i c s a l t s . To s t u d y t h e e f f e c t o f L - a s p a r t i c a c i d o n t h e p r o d u c t i o n o f L - p r o l i n e ,
v a r i o u s a m i n o o r o r g a n i c a c i d s w e r e s u b s t i t u t e d f o r L - a s p a r t i c a c i d , a n d t h e c h a n g e s
d u r i n g f e r m e n t a t i o n w e r e i n v e s t i g a t e d . L - A s p a r t i c a c i d w a s n o t r e p l a c e d b y t h e c o m -
p o u n d s t e s t e d , a n d t h i s a c i d a p p e a r e d t o i n c r e a s e g r o w t h d u r i n g t h e l a t e r s t a g e s o f
f e r m e n t a t i o n w i t h a c o n c u r r e n t i n c r e a s e i n t h e p r o d u c t i o n o f L - p r o l i n e .
Th e p r o d u c t i o n o f L - p r o l i n e h a s ,
i n t h e p a s t ,
b e e n c a r r i e d o u t b y t h e e x t r a c t i o n o f p r o t e i n
h y d r o l y s a t e s . A d i r e c t f e r m e n t a t i o n , h o w e v e r ,
w a s r e c e n t l y r e p o r t e d b y S u z u k i e t a l . ( 3 ) ,
Y a m a t o d a n i e t a l . ( 4 ) , a n d Y o s h i n a g a e t a l . ( 5 ,
6 ) .
Du r i n g t h e c o u r s e o f t h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n
o n t h e a b i l i t y o f m i c r o o r g a n i s m s t o p r o d u c e
v a r i o u s a m i n o a c i d s i n m e d i u m c o n t a i n i n g L -
a s p a r t i c o r L - g l u t a m i c a c i d , a b a c t e r i u m i s o l a t e d
b y t h e a u t h o r s a n d d e s i g n a t e d a s K u r t h i a c a t e n a -
f o r m a b y H. I i z u k a w a s s e l e c t e d f o r t h e p r o d u c -
t i o n o f L - p r o l i n e . U s i n g a m u t a n t o f t h i s o r g a -
n i s m , w e i n v e s t i g a t e d f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s a n d
f o u n d t h a t y i e l d s o f L - p r o l i n e w e r e s u b s t a n t i a l l y
i n c r e a s e d . Th e p r e s e n t p a p e r d e s c r i b e s t h e s e i n -
v e s t i g a t i o n s a n d c o m m e n t s o n t h e p r o b a b l e r o l e
o f L - a s p a r t i c a c i d i n t h i s f e r m e n t a t i o n .
M A TER I A L S A N D M ETHO DS
O r g a n i s m s . S c r e e n i n g t e s t s w e r e p e r f o r m e d w i t h
s e v e r a l h u n d r e d s t r a i n s o f b a c t e r i a , f u n g i , y e a s t s ,
a n d a c t i n o m y c e t e s , a l l f r o m t h e c o l l e c t i o n o f t h i s
l a b o r a t o r y . A s e r i n e - r e q u i r i n g m u t a n t , n o . 4 5 , w h i c h
w a s d e r i v e d f r o m t h e b a c t e r i u m K . c a t e n a f o r m a
A TC C 2 1 1 4 4 , w a s s e l e c t e d f o r t h e f e r m e n t a t i o n e x -
p e r i m e n t s .
S c r e e n i n g e x p e r i m e n t s . Th e t h r e e s c r e e n i n g m e d i a
s h o w n i n Ta b l e 1 w e r e d i s t r i b u t e d i n 2 - m l a m o u n t s t o
t e s t t u b e s a n d s t e r i l i z e d . A f t e r i n o c u l a t i o n , c u l t u r e s
w e r e s h a k e n f o r 7 2 h r a t 3 0 C .
R o u t i n e i d e n t i f i c a t i o n a n d r o u g h q u a n t i t a t i v e
e s t i m a t i o n o f t h e a m i n o a c i d s p r e s e n t i n t h e f e r m e n t a -
t i o n b r o t h w e r e m a d e b y p a p e r c h r o m a t o g r a p h y .
F e r m e n t a t i o n e x p e r i m e n t s . U n l e s s o t h e r w i s e n o t e d ,
f e r m e n t a t i o n s f o r t h e p r o d u c t i o n o f L - p r o l i n e w e r e
c a r r i e d o u t a s f o l l o w s . M e d i a w e r e d i s t r i b u t e d i n 3 0 - m l
a m o u n t s t o 5 0 0 - m l f l a s k s , s t e r i l i z e d , a n d i n o c u l a t e d
w i t h o n e l o o p f u l o f K . c a t e n a f o r m a n o . 4 5 . C u l t u r e s
w e r e i n c u b a t e d a t 3 0 C f o r 7 2 h r w i t h r e c i p r o c a l
s h a k i n g ( 1 4 0
r e v / m i n ,
8 - c m s t r o k e ) . S i n c e t h e r e w a s
n o m a r k e d d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e y i e l d s o b t a i n e d a t
4 8 h r a n d a t 7 2 h r , o n l y t h e 4 8 - h r r e s u l t s a r e r e p o r t e d
i n t h i s p a p e r . Ea c h y i e l d g i v e n i s t h e a v e r a g e o f t h r e e
f e r m e n t a t i o n f l a s k s .
M e t h o d s o f a n a l y s i s . Th e a s s a y o f L - p r o l i n e a n d L -
a s p a r t i c a c i d w a s c a r r i e d o u t b y m i c r o b i o a s s a y w i t h
L e u c o n o s t o c m e s e n t e r o i d e s p - 6 0 . L - G l u t a m i c a c i d w a s
d e t e r m i n e d b y g l u t a m i c d e c a r b o x y l a s e ( 1 ) . G l u c o s e
w a s e s t i m a t e d b y u s e o f t h e m e t h o d o f S o m o g y i -
N e l s o n ( 2 ) . F o r t h e e s t i m a t i o n o f g r o w t h , t h e f e r m e n -
t a t i o n b r o t h w a s d i l u t e d 1 : 1 0 w i t h s a l i n e , a n d o p t i c a l
d e n s i t y w a s m e a s u r e d a t 6 6 0 m j u w i t h a Hi t a c h i p h o t o -
e l e c t r i c p h o t o m e t e r ( EP O - B t y p e ) .
R ES U L TS A N D DI S C U S S I O N
S c r e e n i n g e x p e r i m e n t s o f o r g a n i s m s . S e v e r a l
h u n d r e d s t r a i n s o f b a c t e r i a , f u n g i , y e a s t s , a n d
a c t i n o m y c e t e s w e r e s c r e e n e d f o r t h e i r a b i l i t y t o
p r o d u c e a m i n o a c i d s . A b a c t e r i u m r e c e n t l y i s o -
l a t e d b y t h e a u t h o r s w a s s e l e c t e d a s t h e o r g a n i s m
p r o d u c i n g t h e l a r g e s t a m o u n t o f L - p r o l i n e i n t h e
t w o s c r e e n i n g m e d i a c o n t a i n i n g L - a s p a r t i c a c i d .
Th i s s t r a i n w a s c l a s s i f i e d a n d d e s i g n a t e d K .
c a t e n a f o r m a b y H. l i z u k a o f To k y o U n i v e r s i t y
( H. l i z u k a a n d F u r u y a H. , A b s t r . A n n . M e e t i n g
J a p a n . A g r . C h e m . S o c . , p . 1 0 6 , 1 9 6 8 ) . B e c a u s e
t h e p r o l i n e - p r o d u c i n g a b i l i t y o f t h i s o r g a n i s m
v a r i e d , a n u m b e r o f a u x o t r o p h i c m u t a n t s w e r e
o b t a i n e d b y u l t r a v i o l e t i r r a d i a t i o n a n d b y t r e a t -
m e n t w i t h N - m e t h y l - N ' - n i t r o - N - n i t r o s o g u a n i d i n e .
Th e s e m u t a n t s w e r e t e s t e d f o r s t a b i l i t y a n d p r o -
1 2 0 0

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L - P R O L I N E P R O DU C TI O N B Y K U R THI A C A TEN A F O R M A
TA B L E 1 . C o m p o s i t i o n o f s c r e e n i n g m e d i a f o r t h e
p r o d u c t i o n o f L - p r o l i n e a
C o m p o n e n t I I I I I I
% % %
G l u c o s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 . 0 6 . 0 6 . 0
U r e a . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 . 5 0 . 5 0 . 5
N H4 C l . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 . 3 0 . 3 0 . 3
C o r n s t e e p l i q u o r . . . . . . . . . 0 . 7 0 . 7 0 . 7
C a s e i n h y d r o l y s a t e
. . . . . . . 1 . 1 1 . 1 1 . 1
L - A s p a r t i c a c i d . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 . 0 2 . 0 0
L - G l u t a m i c a c i d . . . . . . . . . . 0 0 2 . 0
K 2 HP O 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 . 1 2 . 0 0 . 1
M g S O 4 * 7 H2 0 . . . . . . . . . . . . . 0 . 0 5 0 . 0 5 0 . 0 5
C a C O 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 . 0 1 . 0 1 . 0
Th e i n i t i a l p H o f a l l m e d i a w a s a d j u s t e d t o 7 . 0
w i t h N a O H.
TA B L E 2 . Ef f e c t o f c a r b o n s o u r c e u p o n t h e p r o d u c t i o n
o f L - p r o l i n e
C a r b o n s o u r c e a p H G r o w t h b L - P r o l i n e L - A s p a r t i c
( 6 % ) a c i d
m g / m l m g / m l
De x t r i n . . . . 7 . 8 . 5 0 0 1 9 0
M a l t o s e . . . 8 . 6 . 6 1 0 2 8 0
S u c r o s e . . . 8 . 4 . 5 2 0 1 2 0 . 5
L a c t o s e . . . . 8 . 4 . 3 8 0 0 . 5 1 5
G a l a c t o s e . . . 8 . 0 . 4 6 5 8 1
G l u c o s e . . . . . 8 . 8 . 6 1 0 2 8 0
F r u c t o s e . . . . 7 . 8 . 6 2 5 1 6 0
M a n n o s e . . . . 6 . 8 . 0 6 0 0 . 5 2 0
S o r b o s e . . . . . 6 . 8 . 0 6 0 0 . 5 2 0
X y l o s e . . . . . . . 8 . 6 . 2 4 0 0 1 5
A r a b i n o s e . . . 6 . 6 . 0 5 5 0 . 5 2 0
R i b o s e . . . . . . . 6 . 6 . 4 1 5 6 4
a
I n a d d i t i o n t o t h e a b o v e c a r b o n s o u r c e , a l l
m e d i a c o n t a i n e d 0 . 5 % u r e a , 0 . 3 % N H4 C l , 0 . 7 %
c o r n s t e e p l i q u o r , 1 . 1 % c a s e i n h y d r o l y s a t e , 2 %
L - a s p a r t i c a c i d , 2 % K 2 HP O 4 , a n d 0 . 1 % M g S O 4 -
7 H2 0 .
b
O p t i c a l d e n s i t y .
d u c t i o n . A s e r i n e - r e q u i r i n g m u t a n t , s t r a i n 4 5 ,
p r o d u c e d a b o u t 1 . 5 t i m e s t h e a m o u n t o f L - p r o -
l i n e t h a t t h e p a r e n t s t r a i n d i d . Th i s m u t a n t w a s ,
t h e r e f o r e , u s e d f o r f e r m e n t a t i o n e x p e r i m e n t s .
Ef f e c t o f c a r b o n s o u r c e o n f e r m e n t a t i o n f o r t h e
p r o d u c t i o n o f L - p r o l i n e . Tw e l v e s u g a r s w e r e i n -
v e s t i g a t e d a t t h e 6 % l e v e l t o d e t e r m i n e t h e m o s t
f a v o r a b l e c a r b o n s o u r c e f o r t h e p r o d u c t i o n o f L -
p r o l i n e . M a l t o s e a n d g l u c o s e g a v e t h e b e s t r e s u l t s
( 2 8 m g / m l ) , f o l l o w e d b y d e x t r i n a n d f r u c t o s e
( Ta b l e 2 ) . M a x i m a l y i e l d s w e r e o b t a i n e d a t g l u -
c o s e c o n c e n t r a t i o n s o f 6 t o 1 0 % , w i t h r e d u c e d
y i e l d s a t 4 % ( Ta b l e 3 ) .
Ef f e c t o f i n o r g a n i c n i t r o g e n s o u r c e o n p r o l i n e
p r o d u c t i o n . V a r i o u s n i t r o g e n s o u r c e s w e r e t e s t e d
f o r t h e p r o d u c t i o n o f L - p r o l i n e , a t a c o n c e n t r a t i o n
e q u a l t o 0 . 5 % u r e a o n a n i t r o g e n b a s i s . U r e a ,
a m m o n i u m c h l o r i d e , a n d a m m o n i u m n i t r a t e g a v e
t h e h i g h e s t y i e l d s , 2 2 t o 2 5 m g / m l ( Ta b l e 4 ) . Th e
a d d i t i o n o f b o t h u r e a a n d a m m o n i u m c h l o r i d e
r e s u l t e d i n s l i g h t l y b e t t e r y i e l d s t h a n t h e a d d i t i o n
o f e i t h e r c o m p o u n d a l o n e . Th e h i g h e s t y i e l d ( 2 8
m g / m l ) w a s o b t a i n e d i n m e d i u m c o n t a i n i n g 0 . 5 %
u r e a a n d 0 . 3 % a m m o n i u m c h l o r i d e ( Ta b l e 5 ) .
TA B L E 4 . Ef f e c t o f n i t r o g e n s o u r c e u p o n t h e
p r o d u c t i o n o f L - p r o l i n e
N i t r o g e n s o u r c e ' p H G r o w t h b
P r o l i n e
A s p a r t i c
r o e a c i d
m g / m l m g / m l
( N H2 ) 2 C 0 , 0 . 5 % . . . . . . 8 . 6 . 5 2 0 2 5 0 . 5
N H4 C l , 0 . 8 9 % . . . . . . . . . 6 . 4 . 6 3 5 2 3 0 . 5
( N H4 ) 2 S O , 1 . 1 % . . . . . . 5 . 6 . 5 3 5 1 6 0 . 5
( N H4 ) 2 HP O , 1 . 1 % . . . 6 . 2 . 6 0 5 1 7 0
N H4 N O 3 , 0 . 6 7 % . . . . . . . 6 . 4 . 5 8 0 2 2 0
N a N O a , 1 . 4 % . . . . . . . . . 7 . 2 . 5 9 0 1 1 0
a
I n a d d i t i o n t o t h e a b o v e n i t r o g e n s o u r c e , a l l
m e d i a c o n t a i n e d 6 % g l u c o s e , 0 . 7 % c o r n s t e e p
l i q u o r , 1 . 1 % c a s e i n h y d r o l y s a t e , 2 % L - a s p a r t i c
a c i d , 2 % K 2 HP O 4 , a n d 0 . 1 % M g S O 4 - 7 H2 0 .
b
O p t i c a l d e n s i t y .
TA B L E 3 . Ef f e c t o f c o n c e n t r a t i o n o f g l u c o s e u p o n t h e p r o d u c t i o n o f L - p r o l i n e
p H G r o w t h b L - P r o l i n e ( m g / m l )
L - A s p a r t i c a c i d
G l u c o s e ( m g / m l )
( m g / m i )
G l u c o s e a
4 8 h r 7 2 h r 4 8 h r 7 2 h r 4 8 h r 7 2 h r 4 8 h r 7 2 h r 4 8 h r 7 2 h r
0 8 . 4 9 . 0 . 3 1 0 . 2 5 0 0 0 8 6 0 0
4 8 . 6 8 . 8 . 5 3 0 . 5 3 5 1 9 2 0 1 1 0 0
6 8 . 0 8 . 8 . 6 0 0 . 6 0 0 3 0 2 9 0 0 0 0
8 6 . 6 7 . 2 . 6 3 0 . 6 2 0 3 1 3 0 0 0 0 0
1 0 6 . 2 5 . 8 . 6 4 0 . 6 3 0 3 1 3 0 0 0 2 7 0
a
I n a d d i t i o n t o g l u c o s e ,
a l l m e d i a c o n t a i n e d
0 . 5 % u r e a ,
0 . 3 %
N H4 C 1 ,
0 . 7 %
c o r n
s t e e p l i q u o r , 1 . 1 %
c a s e i n h y d r o l y s a t e , 2 % L - a s p a r t i c a c i d , 2 % K 2 HP O 4 , a n d 0 . 1 % M g S O 4 1 7 H2 O
b
O p t i c a l d e n s i t y .
V O L . 1 6 , 1 9 6 8 1 2 0 1

o
n

J
u
l
y

6
,

2
0
1
4

b
y

g
u
e
s
t
h
t
t
p
:
/
/
a
e
m
.
a
s
m
.
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g
/
D
o
w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

A P P L . M I C R O B I O L .
TA B L E 5 . Ef f e c t o f c o n c e n t r a t i o n o f n i t r o
u p o n p r o d u c t i o n o f L - p r o l i n e a
U r e a
0
0 . 1
0 . 5
2 . 0
N H4 C I
0
0 . 3
0 . 9
1 . 8
0
0 . 3
0 . 9
1 . 8
0
0 . 3
0 . 9
1 . 8
0
0 . 3
0 . 9
1 . 8
p H
6 . 4
6 . 6
6 . 4
6 . 0
6 . 8
7 . 0
7 . 4
5 . 8
8 . 6
8 . 8
8 . 8
5 . 8
5 . 8
5 . 8
5 . 6
5 . 6
G r o w t h b
. 5 3 0
. 6 0 0
. 6 3 0
. 6 7 0
. 5 8 0
. 6 1 0
. 6 5 0
. 5 6 0
. 5 4 0
. 6 0 0
. 6 2 0
. 5 8 0
. 4 3 0
. 5 4 0
. 5 2 5
. 4 3 5
L - P r o l i n e
m I g / m l
1 2
1 5
2 2
1 7
1 5
2 2
2 5
1 5
2 4
2 8
2 5
1 5
1 3
1 6
1 5
1 3
a I n
a d d i t i o n t o u r e a a n d
N H4 C 1 ,
c o n t a i n e d 6 % g l u c o s e , 0 . 7 % c o r n s t e
1 . 1 % c a s e i n h y d r o l y s a t e , 2 % L - a s p a r t i c
K 2 HP O 4 ,
a n d
0 . 1 % M g S O 4 - 7 H2 O .
b
O p t i c a l d e n s i t y .
TA B L E 6 . Ef f e c t o f o r g a n i c n u t r i e n t u j
p r o d u c t i o n o f L - p r o l i n e
?g e n s o u r c e Ef f e c t o f o r g a n i c n u t r i e n t s o n p r o l i n e p r o d u c t i o n .
Ex p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t i n m e d i u m c o n t a i n -
L - A s p a r t i c
i n g
v a r i o u s
o r g a n i c n u t r i e n t s ,
e a c h a t a c o n c e n t r a -
a c i d
t i o n o f
0 . 1 % n i t r o g e n .
Th e
p h y s i o l o g i c a l a c t i v i t y
o f t h i s s t r a i n i s c o n s i d e r a b l y i n f e r i o r t o t h a t o f
m g / m l t h e o t h e r b a c t e r i a , a n d a b u n d a n t g r o w t h a n d p r o -
0 d u c t i o n w e r e o b t a i n e d o n l y w i t h c o r n s t e e p l i q u o r
0
( Ta b l e 6 ) . Th e e f f e c t o f s u p p l e m e n t a l o r g a n i c
1
n u t r i e n t s u p o n t h e p r o d u c t i o n o f L - p r o l i n e w a s
1
i n v e s t i g a t e d i n m e d i u m c o n t a i n i n g 0 . 7 % c o r n
0
s t e e p l i q u o r . S u p p l e m e n t s
o f
p e p t o n e
a n d
c a s e i n
0
h y d r o l y s a t e g a v e
r e s u l t s
c o m p a r a b l e
t o t h o s e o b -
0
t a i n e d w i t h 2 . 1
% c o r n s t e e p l i q u o r .
V a r i o u s c o m -
0
b i n a t i o n s o f
c o r n s t e e p l i q u o r , p e p t o n e ,
a n d c a s e i n
h y d r o l y s a t e w e r e , t h e r e f o r e , t e s t e d ; t h e r e w e r e n o
0 m a r k e d d i f f e r e n c e s a m o n g t h e s e m i x t u r e s ( Ta b l e
0 7 ) .
0
Ef f e c t
o f
L - a s p a r t i c a c i d o n p r o l i n e p r o d u c t i o n .
Du r i n g s c r e e n i n g e x p e r i m e n t s , L - a s p a r t i c a c i d w a s
0 f o u n d t o p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n f e r m e n t a t i o n
0
f o r t h e
p r o d u c t i o n o f L - p r o l i n e . Th e r e f o r e ,
t h e
0
e f f e c t o f t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h i s a c i d w a s s t u d -
0
i e d . I n t h e a b s e n c e o f L - a s p a r t i c
a c i d o r i n t h e
p r e s e n c e o f l o w c o n c e n t r a t i o n s ( <1 . 0 % ) , g r o w t h
a l l m e d i a w a s p o o r a n d t h e p r o d u c t i o n o f L - p r o l i n e w a s l o w
e p l i q u o r ,
a c i d , 2 % TA B L E 7 . Ef f e c t o f c o n c e n t r a t i o n o f o r g a n i c
n u t r i e n t u p o n t h e p r o d u c t i o n o f L - p r o l i n e
p o n t h e
O r g a n i c n u t r i e ! n t a p H G r o w t h b
P r o l i n e
A s p a r t i c
m g / m l m g / m l
C o r n s t e e p l i q u o r ,
2 . 2 % . . . . . . . . . . . . . . 7 . 4 . 4 9 0 2 6 0
R i c e l i q u o r , 2 . 2 % . 8 . 6 . 1 6 0 6 1 0
Y e a s t e x t r a c t , 0 . 9 % . 7 . 0 . 0 8 5 0 . 5 2 0
M e a t e x t r a c t ,
0 . 9 % . . . . . . . . . . . . 6 . 8 . 0 3 0 0 2 0
M a l t e x t r a c t , 0 . 9 % . 6 . 8 . 0 1 5 0 2 0
P e p t o n e , 0 . 9 % . . . . . . 7 . 2 . 0 4 0 0 2 0
C a s e i n h y d r o l y s a t e ,
1 . . . . . . . . . . . . . . 6 . 0 . 2 8 0 7 5
a
I n a d d i t i o n t o t h e a b o v e o r g a n i c n u t r i e n t , a l l
m e d i a c o n t a i n e d 6 % g l u c o s e , 0 . 5 % u r e a , 0 . 3 %
N H4 C l , 2 % L - a s p a r t i c a c i d , 2 % K 2 HP O 4 , a n d
0 . 1 % M g S O 4 . 7 H2 0 .
b O p t i c a l d e n s i t y .
A l t h o u g h a h i g h c o n c e n t r a t i o n o f a m m o n i u m
s a l t s h a s b e e n r e p o r t e d t o b e o p t i m a l f o r t h e p r o -
d u c t i o n o f L - p r o l i n e ( 4 , 5 ) , o u r f e r m e n t a t i o n
y i e l d s d e c r e a s e d w h e n t h e c o n c e n t r a t i o n o f a m -
m o n i u m c h l o r i d e w a s r a i s e d t o 1 . 8 % .
L -
L
A d d i t i o n t o m e d i u m a p H G r o w t h b P r o -
A s -
l i n e
p a r t i c
a c i d
m g / m l m g / n l
C o r n s t e e p l i q u o r
0 . 7 % . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 . 2 . 2 7 0 1 2 0 . 5
1 . 4 % o . . . . . . . . . . . . . . . . 7 . 0 . 3 4 5 1 7 0 . 5
2 . 1 % . . 6 . 8 . 4 7 0 2 4 0
2 . 8 % . . 8 . 4 . 5 9 0 2 6 2
3 . 5 % . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 . 4 . 6 2 0 2 3 0 . 5
C o r n s t e e p l i q u o r ( 0 . 7 % )
p l u s p e p t o n e
0 . 3 % . . . . . . . . . . . . . . . . 7 . 2 . 2 6 0 1 4 0
0 . 6 % . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 . 4 . 4 6 5 2 4 0
0 . 9 % . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 . 4 . 4 9 0 2 3 0
C o r n s t e e p l i q u o r ( 0 . 7 % )
p l u s c a s e i n h y d r o l y s a t e
0 . 3 % . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 . 2 . 3 8 0 2 1 0
0 . 7 % . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 . 6 . 4 8 0 2 5 0
1 . 1 % . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 . 6 . 6 0 0 2 8 0
C o r n s t e e p l i q u o r ( 1 . 4 % )
p l u s c a s e i n h y d r o l y z a t e
0 . 3 % . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 . 4 . 4 4 0 2 5 0 . 5
0 . 7 % . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 . 6 . 5 4 0 2 4 0
1 . 1 % . . .. . . . . . . . . . 8 . 4 . 6 1 5 2 5 0 . 5
a
I n a d d i t i o n t o t h e a b o v e o r g a n i c n u t r i e n t , a l l
m e d i a c o n t a i n e d 6 % g l u c o s e , 0 . 5 % u r e a , 0 . 3 %
N H4 C l , 2 % L - a s p a r t i c a c i d , 2 % K 2 HP O 4 , a n d
0 . 1 % M g S O 4 - 7 H2 O .
b
O p t i c a l d e n s i t y .
1 2 0 2 K A TO ET A L .

o
n

J
u
l
y

6
,

2
0
1
4

b
y

g
u
e
s
t
h
t
t
p
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/
/
a
e
m
.
a
s
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o
a
d
e
d

f
r
o
m

L - P R O L I N E P R O DU C TI O N B Y K U R THI A C A TEN A F O R M A
TA B L E 8 . Ef f e c t o f c o n c e n t r a t i o n o f L - a s p a r t i c a c i d
u p o n t h e p r o d u c t i o n o f L - p r o l i n e
L - A s p a r t i c r o t b
L P O i e
L - A s p a r t i c
a c i d c a p H G r o w t h
L - P r o l i n e
a c i d
m g / m l m g / m l
0 5 . 8 . 2 6 0 6 0
0 . 1 6 . 0 . 3 2 0 8 0
0 . 5 6 . 0 . 4 4 0 1 4 0
1 . 0 7 . 6 . 5 0 0 2 3 0
1 . 5 8 . 6 . 5 2 0 2 8 0
2 . 0 8 . 8 . 5 5 0 2 9 0
2 . 5 8 . 8 . 6 0 0 2 8 0 . 5
3 . 0 8 . 6 . 6 1 0 2 7 1
a
I n a d d i t i o n t o L - a s p a r t i c a c i d , a l l m e d i a c o n -
t a i n e d 6 % g l u c o s e , 0 . 5 % u r e a , 0 . 3 % N H4 C I , 0 . 7 %
c o r n s t e e p l i q u o r , 1 . 1 % c a s e i n h y d r o l y s a t e , 2 %
K 2 HP O 4 , a n d 0 . 1 % M g S O 4 * 7 H2 0 .
b
O p t i c a l d e n s i t y .
TA B L E 9 . Ef f e c t o f c o n c e n t r a t i o n o f d i p o t a s s i u m
p h o s p h a t e u p o n t h e p r o d u c t i o n
o f L - p r o l i n e
K 2 HP O 4 e p H G r o w t h b L - P r o l i n e
L - A s p a r t i c
a c i d
%
m g / m l m g / m l
0 5 . 4 . . 0 9 5 0 . 5 2 0
0 . 1 5 . 6 . 1 0 0 0 . 5 2 0
0 . 5 6 . 0 . 5 4 0 9 0
1 . 0 7 . 8 . 6 4 0 2 4 0
1 . 5 8 . 8 . 5 8 5 2 8 0
2 . 0 8 . 6 . 5 8 0 2 8 0
2 . 5 8 . 4 . 5 9 5 2 5 0
3 . 0 7 . 4 . 5 7 0 2 2 0
a
I n a d d i t i o n t o K 2 HP O 4 , a l l m e d i a c o n t a i n e d
6 % g l u c o s e , 0 . 5 % u r e a , 0 . 3 % N H4 C l , 0 . 7 % c o r n
s t e e p l i q u o r , 1 . 1 % c a s e i n h y d r o l y s a t e , 2 % L -
a s p a r t i c a c i d , a n d 0 . 1 % M g S O 4 . 7 H2 0 .
b
O p t i c a l d e n s i t y .
( <1 5 m g / m l ) . Th e a d d i t i o n o f h i g h e r c o n c e n t r a -
t i o n s o f L - a s p a r t i c a c i d ( 1 . 5 t o 3 % ) s i g n i f i c a n t l y
i n c r e a s e d y i e l d s t o a p p r o x i m a t e l y
3 0 m g / m l .
Ef f e c t o f p o t a s s i u m i o n o n p r o l i n e p r o d u c t i o n .
Di p o t a s s i u m p h o s p h a t e w a s f o u n d t o e x e r t a
c o n s i d e r a b l e e f f e c t u p o n
t h e p r o d u c t i o n o f L -
p r o l i n e . Th e o p t i m a l c o n c e n t r a t i o n w a s u n u s u a l l y
h i g h ( 1 . 5 t o 2 . 0 % ) , a n d t h e l e v e l g e n e r a l l y
e m -
p l o y e d i n o t h e r f e r m e n t a t i o n s ( 0 . 1 % ) w a s u n -
f a v o r a b l e f o r g r o w t h a n d p r o d u c t i o n i n t h i s
f e r m e n t a t i o n ( Ta b l e 9 ) .
To d e t e r m i n e w h e t h e r t h i s e f f e c t i s d u e t o
p o t a s s i u m
o r p h o s p h a t e i o n , e x p e r i m e n t s
w e r e
c a r r i e d o u t w i t h m e d i u m c o n t a i n i n g v a r i o u s p o -
t a s s i u m s a l t s , e a c h a t a c o n c e n t r a t i o n o f p o t a s s i u m
i o n e q u a l t o t h e a m o u n t p r e s e n t
i n 2 . 0 % d i p o t a s -
s i u m p h o s p h a t e .
S i n c e 2 6 t o 2 8 m g o f L - p r o l i n e
p e r m l w a s p r o d u c e d
w i t h a l l o f t h e s e s a l t s , i r r e -
TA B L E 1 0 . Ef f e c t o f p o t a s s i u m s a l t u p o n t h e
p r o d u c t i o n o f L - p r o l i n e
P o t a s s i u m s a l t a p H G r o w t h b
P r o l i n e
A s p a r t i c
r o e
a c i d
m n g / m l m g / m l
N o n e . . . . . . . . . . . . . . . 6 . 0 . 5 2 0 6 0
K 2 HP O 4 , 2 . 0 0 % . . . . . . 8 . 6 . 5 6 5 2 8 0
K 2 S O 4 ,
2 . 0 0 % o . . .
. . . . . . .
8 . 4 . 6 4 0 2 6 0
K N O 3 , 2 . 3 2 % . . . . . . . . 8 . 6 . 6 6 0 2 7 0
K C I , 1 . 7 1 % . . . . . . . . . . 8 . 4 . 6 5 5 2 7 0 . 5
K B r , 2 . 7 4 % . . . . . . . . . . 8 . 6 . 6 4 0 2 6 0
K O H, 1 . 2 9 % . . . . . . . . . 8 . 6 . 6 2 5 2 6 0 . 5
a
I n a d d i t i o n t o t h e a b o v e p o t a s s i u m s a l t , a l l
m e d i a c o n t a i n e d 6 % g l u c o s e , 0 . 5 % u r e a , 0 . 3 7 %
( N H4 ) 2 HP 0 4 , 0 . 7 % c o r n s t e e p l i q u o r , 1 . 1 % c a s e i n
h y d r o l y s a t e , 2 % L - a s p a r t i c a c i d , a n d 0 . 1 % M g S O 4 .
7 H2 0 .
b
O p t i c a l d e n s i t y .
TA B L E 1 1 . Ef f e c t o f a l k a l i m e t a l i o n u p o n t h e
p r o d u c t i o n o f L - p r o l i n e
A l k a l i m e t a l i o n ' p H G r o w t h 6
l i n e
0 - A s p a r t i c
m g / m l m g / m l
L i 2 S O 4 . H2 0 , 1 . 4 7 % . . . .
5 . 6 . 5 2 0 4 0 . 5
N a 2 S O 4 , 1 . 6 3 % . . . . . . . . . 6 . 0 . 5 9 0 5 0
K 2 S O 4 , 2 . 0 0 % . . . . . . . . . . 8 . 8 . 6 4 0 2 6 0
R b 2 S O 4 , 3 . 0 7 % . . . . . . . . . 6 . 4 . 2 7 0 1 1 5
C s 2 S O 4 , 4 . 1 6 % . . . . . . . 6 . 6 . 0 4 0 0 2 0
a
I n a d d i t i o n t o t h e a b o v e a l k a l i m e t a l s a l t , a l l
m e d i a c o n t a i n e d 6 % g l u c o s e , 0 . 5 % u r e a , 0 . 3 7 %
( N H4 ) 2 HP 0 4 , 0 . 7 % c o r n s t e e p l i q u o r , 1 . 1 % c a s e i n
h y d r o l y s a t e , 2 % L - a s p a r t i c a c i d , a n d 0 . 1 % M g S O 4 .
7 H2 0 .
b
O p t i c a l d e n s i t y .
s p e c t i v e o f t h e a n i o n , t h e e f f e c t o f d i p o t a s s i u m
p h o s p h a t e w a s a t t r i b u t e d t o t h e p o t a s s i u m i o n
( Ta b l e 1 0 ) .
To c o n f i r m t h e s p e c i f i c i t y o f t h e p o t a s s i u m i o n ,
s e v e r a l a l k a l i m e t a l i o n s w e r e t e s t e d a t a c o n c e n -
t r a t i o n e q u i v a l e n t t o 2 . 0 % p o t a s s i u m s u l f a t e o n
a n a l k a l i m e t a l i o n b a s i s . O f t h e s a l t s t e s t e d , o n l y
p o t a s s i u m s u l f a t e w a s s u i t a b l e f o r t h e p r o d u c t i o n
o f L - p r o l i n e . A l t h o u g h l i t h i u m s u l f a t e a n d s o d i u m
s u l f a t e s u p p o r t e d a b u n d a n t g r o w t h , t h e s e s a l t s
g a v e i n f e r i o r y i e l d s ( Ta b l e 1 1 ) .
Ef f e c t o f a e r a t i o n o n p r o l i n e p r o d u c t i o n . Th e
e f f e c t o f a e r a t i o n w a s s t u d i e d b y v a r y i n g t h e
a m o u n t o f m e d i u m i n t h e f l a s k s . M a x i m a l p r o -
d u c t i o n o f L - p r o l i n e w a s o b t a i n e d w i t h 5 0 m l o r
l e s s i n a 5 0 0 - m l f l a s k , w h i c h i s
e q u i v a l e n t
t o a n
o x y g e n a b s o r p t i o n
r a t e g r e a t e r t h a n 1 . 5 5 m m o l e
p e r m i n ( Ta b l e 1 2 ) .
Eg f f e c t
o f t e m p e r a t u r e a n d i n i t i a l p H o n p r o l i n e
V O L . 1 6 ,
1 9 6 8
1 2 0 3

o
n

J
u
l
y

6
,

2
0
1
4

b
y

g
u
e
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h
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t
p
:
/
/
a
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m
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a
s
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D
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w
n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

A P P L . M I C R O B I O L .
TA B L E 1 2 . Ef f e c t o f a e r a t i o n u p o n t h e
p r o d u c t i o n o f L - p r o l i n e a
V o l u m e o f
L A p r i
m e d i u m p e r O A R b p H G r o w t h '
L - P r o 1 i n e
a r c i d
5 0 0 - m i f l a s k
a i
m l m m o l e s m g / m i m g / m i
1 5 4 . 0 5 8 . 8 . 6 3 5 2 9 0 . 5
2 0 3 . 1 0 8 . 8 . 6 0 0 2 8 0 . 5
3 0 2 . 0 0 8 . 6 . 6 4 0 2 7 0 . 5
4 0 1 . 7 0 8 . 4 . 6 4 0 2 7 0 . 5
5 0 1 . 5 5 8 . 2 . 6 2 0 2 7 0 . 5
8 0 1 . 2 0 6 . 4 . 5 4 0 1 3 0 . 5
a
Th e m e d i u m c o n t a i n e d 6 % g l u c o s e , 0 . 5 % u r e a ,
0 . 3 % N H4 C I , 0 . 7 % c o r n s t e e p l i q u o r , 1 . 1 % c a s e i n
h y d r o l y z a t e , 2 % L - a s p a r t i c a c i d , 2 % K 2 HP O 4 , a n d
0 . 1 % M g S O 4 . 7 H4 0 .
b O x y g e n a b s o r p t i o n r a t e ( m i l l i m o l e s o f 0 2 p e r
l i t e r p e r m i n u t e ) .
c
O p t i c a l d e n s i t y .
TA B L E 1 3 . Ef f e c t o f t e m p e r a t u r e u p o n t h e
p r o d u c t i o n o f L - p r o l i n e a
G r o w t h ( o p t i - L - P r o l i n e
L - A s p a r t i c
p H
c a l d e n s i t y )
( m g / m l )
a c i d
Te m p ( m g / m i )
4 8 h r 7 2 h r 4 8 h r 7 2 h r 4 8 h r 7 2 h r 4 8 h r 7 2 h r
C
2 5 7 . 2 9 . 0 . 6 1 0 . 6 5 5 1 8 2 2 0 0
2 8 8 . 6 9 . 0 . 6 4 0 . 6 0 0 2 7 2 7 0 . 5 0 . 5
3 0 8 . 9 9 . 0 . 5 8 0 . 5 0 0 2 7 2 7 0 . 5 0
3 2 8 . 9 9 . 0 . 5 6 0 . 4 9 5 2 8 2 7 0 . 5 0
3 4 6 . 0 6 . 0 . 3 3 5 . 3 2 0 1 2 1 3 2 0 . 5
a
Th e m e d i u m c o n t a i n e d 6 % g l u c o s e , 0 . 5 % u r e a ,
0 . 3 % N H, , C l , 0 . 7 % c o r n
s t e e p l i q u o r , 1 . 1 % c a s e i n
h y d r o l y s a t e , 2 % L - a s p a r t i c a c i d , 2 % K 2 HP O 4 ,
a n d 0 . 1 % M g S O 4 . 7 H2 0 .
p r o d u c t i o n . Th e o p t i m a l t e m p e r a t u r e f o r t h e p r o -
d u c t i o n o f L - p r o l i n e w a s 2 8 t o 3 2 C . A l t h o u g h
a b u n d a n t g r o w t h o c c u r r e d a t 2 5 C , y i e l d s w e r e
i n f e r i o r t o t h o s e o b t a i n e d a t 2 8 t o 3 2 C . A t 3 4 C ,
g r o w t h a n d p r o d u c t i o n d e c r e a s e d m a r k e d l y
( Ta b l e 1 3 ) .
Th e e f f e c t o f i n i t i a l p H w a s a l s o s t u d i e d , a n d
t h e o p t i m a l i n i t i a l p H f o r t h e p r o d u c t i o n o f L -
p r o l i n e w a s b e t w e e n 6 . 0 a n d 8 . 5 ( Ta b l e 1 4 ) .
C h a n g e s o c c u r r i n g d u r i n g f e r m e n t a t i o n . A n
e x a m p l e o f t h e c h e m i c a l c h a n g e s o c c u r r i n g d u r i n g
t h e f e r m e n t a t i o n o f L - p r o l i n e u n d e r o p t i m a l c o n -
d i t i o n s i s g i v e n i n F i g . 1 .
A f t e r a n i n i t i a l l a g p e r i o d o f a p p r o x i m a t e l y
8 h r , v i g o r o u s g r o w t h o f t h e o r g a n i s m o c c u r r e d ,
a c c o m p a n i e d b y r a p i d c o n s u m p t i o n o f g l u c o s e
a n d L - a s p a r t i c a c i d . P r o d u c t i o n o f L - p r o l i n e
p a r a l l e l e d g r o w t h a n d r e a c h e d a m a x i m u m o f
a p p r o x i m a t e l y 3 0 m g / m l a t 4 0 h r . G l u c o s e a n d
L - a s p a r t i c a c i d w e r e e x h a u s t e d a t a p p r o x i m a t e l y
3 0 h r .
Du r i n g f e r m e n t a t i o n , a s m a l l a m o u n t o f
L - g l u t a m i c a c i d w a s t e m p o r a r i l y f o r m e d i n t h e
m e d i u m . Th e p H o f t h e m e d i u m w a s m a i n t a i n e d
o n t h e a c i d i c s i d e a s l o n g a s g l u c o s e r e m a i n e d i n
TA B L E 1 4 .
Ef f e c t o f i n i t i a l p H u p o n t h e
p r o d u c t i o n o f L - p r o l i n e a
p H
G r o w t h
( o p t i c a l L - P r o i i n e L - A s i ?r t i c
I n i t i a l d e n s i t y ) ( m g / m l ) ( m g / m l )
p H . -
4 8 h r 7 2 h r 4 8 h r 7 2 h r 4 8 h r 7 2 h r 4 8 h r 7 2 h r
5 . 5 6 . 8 6 . 8 . 3 4 0 . 4 4 0 1 2 1 6 3 0
6 . 0 7 . 0 9 . 0 . 5 6 5 . 6 3 5 2 6 2 8 0 0
6 . 5 8 . 0 9 . 0 . 6 0 0 . 5 6 0 2 8 2 7 0 0
7 . 0 8 . 6 9 . 0 . 6 0 0 . 6 0 0 2 8 2 7 0 . 5 0
7 . 5 8 . 4 9 . 0 . 5 9 5 . 6 0 0 2 8 2 7 0 . 5 0 . 5
8 . 0 8 . 8 9 . 0 . 6 0 5 . 6 0 0 2 8 2 9 1 0 . 5
8 . 5 8 . 6 9 . 0 . 6 0 0 . 5 6 5 2 7 2 7 0 . 5 0 . 5
9 . 0 8 . 4 7 . 0 . 0 5 0 . 5 0 0 0 1 3 2 0 1
Th e m e d i u m c o n t a i n e d 6 % g l u c o s e , 0 . 5 % u r e a ,
0 . 3 % N H4 C l , 0 . 7 % c o r n s t e e p l i q u o r , 1 . 1 % c a s e i n
h y d r o l y s a t e , 2 % L - a s p a r t i c a c i d , 2 % K 2 HP O 4 ,
a n d 0 . 1 % M g S O 4 . 7 H2 0 .
0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0
C u l t u r e t i m e , h r
F I G . 1 . C h a n g e s d u r i n g t h e f e r m e n t a t i o n o f L - p r o l i n e .
Th e m e d i u m c o n t a i n e d 6 % g l u c o s e , 0 . 5 % u r e a , 0 . 3 %
N H4 C I , 0 . 7 % c o r n s t e e p l i q u o r , 1 . 1 % c a s e i n h y d r o l -
y s a t e , 2 % L - a s p a r t i c a c i d , 2 % K 2 HP O 4 , a n d 0 . 1 %
M g S O 4 - 7 H2 0 . S y m b o l s : 0 , L - p r o l i n e ; * , L - a s p a r t i c
a c i d ; O , L - g l u t a m i c a c i d ; A , g l u c o s e ; 0 , g r o w t h
( o p t i c a l d e n s i t y ) ; X , p H.
1 2 0 4 K A TO ET A L .

o
n

J
u
l
y

6
,

2
0
1
4

b
y

g
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p
:
/
/
a
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.
a
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a
d
e
d

f
r
o
m

L - P R O L I N E P R O DU C TI O N B Y K U R THI A C A TEN A F O R M A
TA B L E 1 5 . Ef f e c t o f a m i n o a c i d a n d o r g a n i c a c i d u p o n t h e p r o d u c t i o n o f L - p r o l i n e
A d d i t i o n t o m e d i u m e
C o m p o u n d
N o n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
L - A s p a r t i c a c i d , 2 . 0 0 % .
L - G l u t a m i c a c i d , 2 . 2 1 % . . . . . . . . . . . . . .
L - A l a n i n e , 1 . 3 4 % . . . . . . . . . . . . . . . . . .
F u m a r i c a c i d , 1 . 7 4 % . . . . . . . . . . . . . . . . .
M a l i c a c i d , 2 . 0 2 % . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
S u c c i n i c a c i d , 1 . 7 7 % . . . . . . . . . . . . . . . . .
L - A s p a r t i c a c i d
0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
p H
5 . 6
7 . 6
8 . 4
8 . 6
6 . 0
8 . 4
5 . 8
7 . 0
5 . 6
7 . 4
5 . 6
8 . 0
5 . 8
7 . 6
G r o w t h b
. 2 1 0
. 5 0 0
. 5 7 0
. 6 3 0
. 2 7 3
. 5 6 0
. 2 3 5
. 5 2 0
. 2 3 0
. 5 8 0
. 2 6 0
. 6 2 0
. 2 3 0
. 5 8 0
L - P r o l i n e
m g / m l
4
2 3
2 8
2 6
5
2 4
4
2 4
3
2 1
3
2 2
4
2 3
L - A s p a r t i c a c i d
m g / m l
0
0
0
3
0
2
0
0
0
0 . 5
0
0 . 5
0
0
a
I n a d d i t i o n t o t h e a b o v e c o m p o u n d , a l l m e d i a c o n t a i n e d 6 % g l u c o s e , 0 . 5 % u r e a , 0 . 3 % N H4 C , 0 . 7 %
c o r n s t e e p l i q u o r , 1 . 1 % c a s e i n h y d r o l y s a t e , 2 % K 2 HP O 4 , a n d 0 . 1 % M g S O 4 - 7 H2 0 .
b
O p t i c a l d e n s i t y .
J o
0 4 6 1 2
C u l t u r e t i m e , h r
1 6 2 0
4 0
2 0
0
F I G . 2 . C o m p a r i s o n o f c h a n g e s d u r i n g i n c u b a t i o n o n
m e d i u m c o n t a i n i n g L - a s p a r t i c a c i d o r L - g l u t a m i c a c i d .
i n a d d i t i o n t o 2 % L - a s p a r t i c
a c i d o r
2 . 2 % L - g l u t a m i c
a c i d , a l l m e d i a c o n t a i n e d 6 % g l u c o s e , 0 . 5 % u r e a ,
0 . 3 % N H4 C 1 , 0 . 7 % c o r n s t e e p l i q u o r , 1 . 1 %
c a s e i n
h y d r o l y s a t e , 2 % K 2 HP O 4 ,
a n d 0 . 1 % M g S O 4 - 7 H2 0 .
S y m b o l s : * , L - p r o l i n e ; * , L - a s p a r t i c a c i d ; E,
L -
g l u t a m i c a c i d ; A , g l u c o s e ; 0 , g r o w t h ( o p t i c a l
d e n -
s i t y ) .
t h e m e d i u m , a n d s h i f t e d g r a d u a l l y t o t h e a l k a l i n e
s i d e w i t h t h e e x h a u s t i o n o f g l u c o s e .
Th e c h e m i c a l c h a n g e s o c c u r r i n g d u r i n g f e r -
m e n t a t i o n w i t h t h e p a r e n t s t r a i n w e r e c o m p a r e d
w i t h t h o s e o f t h e s e r i n e - r e q u i r i n g m u t a n t , s t r a i n
4 5 , u n d e r t h e s a m e c o n d i t i o n s s h o w n i n F i g . 1 .
Th e r e w a s n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e i n t h e c o u r s e
o f f e r m e n t a t i o n , e x c e p t t h a t t h e m a x i m a l p r o d u c -
t i o n o f L - p r o l i n e b y t h e p a r e n t s t r a i n w a s o n l y
1 8 m g / m l .
Th e L - p r o l i n e i n t h e f e r m e n t a t i o n b r o t h w a s
i s o l a t e d b y o r d i n a r y s e p a r a t i o n p r o c e d u r e s , e m -
p l o y i n g i o n - e x c h a n g e r e s i n s , a n d w a s p u r i f i e d a s
t h e p i c r a t e . Th e L - p r o l i n e o b t a i n e d f r o m t h e
p i c r a t e w a s r e c r y s t a l l i z e d f r o m i s o p r o p y l a l c o h o l .
[ a , ] "
=
- 8 5 . 3 ( c
=
4 i n w a t e r ) . A n a l y s i s :
C 5 Hg 0 2 N ; c a l c u l a t e d : C , 5 2 . 1 6 ; H, 7 . 8 8 ; N ,
1 2 . 1 7 ; f o u n d : C , 5 2 . 3 1 ; H, 7 . 8 1 ; N , 1 2 . 2 4 . Th e
i n f r a r e d s p e c t r u m o f t h e p r o d u c t w a s i d e n t i c a l
w i t h t h a t o f a u t h e n t i c L - p r o l i n e ,
a n d n o o t h e r
a m i n o a c i d w a s d e t e c t e d b y p a p e r c h r o m a t o g -
r a p h y .
R o l e o f L - a s p a r t i c a c i d . A s d e s c r i b e d a b o v e , a
h i g h c o n c e n t r a t i o n o f L - a s p a r t i c a c i d i s r e q u i r e d
f o r t h e m a x i m a l p r o d u c t i o n
o f
L - p r o l i n e .
To
e s t a b l i s h t h e r o l e o f
L - a s p a r t i c
a c i d i n t h i s f e r -
m e n t a t i o n , o t h e r a m i n o a c i d s o r o r g a n i c
a c i d s
c o n c e r n e d i n t h e m e t a b o l i s m o f
L - a s p a r t i c
a c i d
w e r e s u b s t i t u t e d . Ex p e r i m e n t s
w e r e c a r r i e d o u t
w i t h m e d i a c o n t a i n i n g
t h e s e
c o m p o u n d s
a t a
c o n c e n t r a t i o n e q u i v a l e n t
t o
2 . 0 % L - a s p a r t i c a c i d ,
b o t h i n t h e p r e s e n c e
a n d i n t h e a b s e n c e o f
1 %
L - a s p a r t i c
a c i d . A l l
c o m p o u n d s
t e s t e d w e r e w i t h -
o u t e f f e c t u p o n g r o w t h
o r t h e
p r o d u c t i o n
o f
L - p r o l i n e
i n e i t h e r t h e
p r e s e n c e
o r t h e a b s e n c e o f
0 . 6 - 2
0 . 4
0 . 2
0
! o K A
A - - - ^ -
- i
O ( N o n e
- ) - , s ' - - -
0 0
z Z7 O
9 - . ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~- A
0 O
0
1 2 0 5 V O L .
1 6 ,
1 9 6 8
6 0

o
n

J
u
l
y

6
,

2
0
1
4

b
y

g
u
e
s
t
h
t
t
p
:
/
/
a
e
m
.
a
s
m
.
o
r
g
/
D
o
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n
l
o
a
d
e
d

f
r
o
m

A P P L . M I C R O B I O L .
L - a s p a r t i c a c i d , i n d i c a t i n g t h a t L - a s p a r t i c a c i d c a n -
n o t b e r e p l a c e d b y t h e s e c o m p o u n d s ( Ta b l e 1 5 ) .
Th i s s u g g e s t s t h a t L - a s p a r t i c a c i d e x e r t s a n
i n f l u e n c e u p o n t h e f e r m e n t a t i o n o f L - p r o l i n e b y
i n c r e a s i n g g r o w t h . To c o n f i r m t h i s e f f e c t , t h e
c h e m i c a l c h a n g e s d u r i n g f e r m e n t a t i o n w e r e c o m -
p a r e d i n m e d i a c o n t a i n i n g 2 . 0 % L - a s p a r t i c a c i d ,
2 . 2 % L - g l u t a m i c a c i d , o r n o a d d i t i v e . Th e c e l l s
h a v i n g h i g h L - p r o l i n e - p r o d u c i n g a c t i v i t y w e r e o b -
t a i n e d b y s h a k i n g t h e c u l t u r e f o r 1 5 h r u n d e r t h e
o p t i m a l c o n d i t i o n s d e s c r i b e d i n F i g . 1 . A f t e r
b e i n g h a r v e s t e d b y c e n t r i f u g a t i o n , c e l l s w e r e
w a s h e d t w i c e w i t h s a l i n e a n d m i x e d w i t h 3 0 m l o f
t h e r e s p e c t i v e m e d i u m . Th e m i x t u r e w a s i n c u -
b a t e d b o t h w i t h a n d w i t h o u t s h a k i n g . W i t h o u t
s h a k i n g , n o g r o w t h o c c u r r e d . F i g u r e 2 s h o w s t h e
c h a n g e s o c c u r r i n g d u r i n g i n c u b a t i o n w i t h s h a k i n g
i n t h e s e t h r e e m e d i a .
Du r i n g t h e e a r l y s t a g e s o f f e r m e n t a t i o n , t h e r e
w e r e n o m a r k e d d i f f e r e n c e s i n g r o w t h , g l u c o s e
c o n s u m p t i o n , o r p r o d u c t i o n o f L - p r o l i n e . L a t e r ,
b o t h g r o w t h a n d y i e l d r e a c h e d a p l a t e a u i n t h e
a b s e n c e o f L - a s p a r t i c a c i d , i . e . , i n m e d i u m w i t h
L - g l u t a m i c a c i d a n d i n m e d i u m w i t h n o a d d i t i o n .
I n m e d i u m w i t h L - a s p a r t i c a c i d , h o w e v e r , t h e
p r o d u c t i o n o f L - p r o l i n e l i n e a r l y i n c r e a s e d i n
p a r a l l e l w i t h t h e c o n t i n u e d g r o w t h o f t h e o r -
g a n i s m , e v e n d u r i n g t h e l a t e r s t a g e s o f f e r m e n t a -
t i o n . A l t h o u g h L - a s p a r t i c a c i d w a s r e a d i l y u t i l i z e d
b y t h e o r g a n i s m , L - g l u t a m i c a c i d w a s s c a r c e l y
c o n s u m e d . Th i s a c c o u n t s f o r t h e c h a n g e s t h a t
o c c u r r e d d u r i n g f e r m e n t a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f
L - g l u t a m i c a c i d a n d t h a t w e r e t h e s a m e a s t h e
c h a n g e s o c c u r r i n g w i t h n o a d d i t i o n .
Th e s e r e s u l t s s u g g e s t e d t h a t L - a s p a r t i c a c i d d o e s
n o t p l a y t h e r o l e o f p r e c u r s o r o f L - p r o l i n e , b u t
t h a t i t e x e r t s i t s e f f e c t b y p r o m o t i n g g r o w t h d u r i n g
t h e l a t e r p a r t o f f e r m e n t a t i o n . Th i s c o n c e p t i s
c u r r e n t l y u n d e r i n v e s t i g a t i o n w i t h t h e u s e o f
l a b e l e d L - a s p a r t i c a c i d .
A C K N O W L EDG M EN TS
W e a r e i n d e b t e d t o T. Ta k a y a n a g i , M . F u j i s a w a ,
N . S u g i m o t o , a n d K . F u j i i f o r t h e i r e n c o u r a g e m e n t
d u r i n g t h e c o u r s e o f t h i s i n v e s t i g a t i o n .
L I TER A TU R E C I TED
1 . B r n t , E. , a n d H. U . B e r g m y e r . 1 9 6 3 . L - G l u t a m a t e :
d e t e r m i n a t i o n w i t h g l u t a m i c d e h y d r o g e n a s e ,
p . 3 8 4 - 3 8 8 . I n H. U . B e r g m e y e r ( e d . ) , M e t h o d s
o f e n z y m a t i c a n a l y s i s . A c a d e m i c P r e s s , I n c . ,
N e w Y o r k .
2 . S o m o g y i , M . 1 9 5 2 . N o t e s o n s u g a r d e t e r m i n a t i o n .
J . B i o l . C h e m . 1 9 5 : 1 9 - 2 3 .
3 . S u z u k i , M . , Y . N a k a o , a n d S . Y a m a t o d a n i , 1 9 6 7 .
P r o d u c t i o n o f L - p r o l i n e b y a u x o t r o p h i c m u t a n t
o f m i c r o o r g a n i s m s . I I . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n
a c c u m u l a t i o n o f L - p r o l i n e a n d a c t i v i t i e s o f
e n z y m e s c o n c e r n e d i n L - p r o l i n e b i o s y n t h e s i s .
A m i n o A c i d a n d N u c l e i c A c i d 1 6 : 1 3 4 - 1 3 9 .
4 . Y a m a t o d a n i , S . , M . S u z u k i , a n d Y . N a k a o . 1 9 6 7 .
P r o d u c t i o n o f L - p r o l i n e b y a u x o t r o p h i c m u t a n t
o f m i c r o o r g a n i s m s . I . C o n d i t i o n s f o r L - p r o l i n e
p r o d u c t i o n b y a h i s t i d i n e r e q u i r i n g m u t a n t o f
B r e v i b a c t e r i u m S p . N o . 7 9 6 6 . A m i n o A c i d a n d
N u c l e i c A c i d 1 6 : 1 2 6 - 1 3 3 .
5 . Y o s h i n a g a , F . , S . K o n i s h i , S . O k u m u r a , a n d N .
K a t s u y a . 1 9 6 6 . S t u d i e s o n t h e f e r m e n t a t i v e
p r o d u c t i o n o f L - p r o l i n e . I . P r o d u c t i o n o f L -
p r o l i n e b y a n i s o l e u c i n e a u x o t r o p h i c m u t a n t o f
B r e v i b a c t e r i u m f l a v u m 2 2 4 7 . J . G e n . A p p l .
M i c r o b i o l . 1 2 : 2 1 9 - 2 2 8 .
6 . Y o s h i n a g a , F . , Y . Y o s h i h a r a , S . O k u m u r a , a n d
N . K a t s u y a . 1 9 6 7 . S t u d i e s o n t h e f e r m e n t a t i v e
p r o d u c t i o n o f L - p r o l i n e . I I . C o n d i t i o n s f o r
L - p r o l i n e p r o d u c t i o n b y B r e v i b a c t e r i u m f l a v u m
2 2 4 7 N o . 1 4 - 5 . J . G e n . A p p l . M i c r o b i o l . 1 3 : 2 5 -
3 7 .
1 2 0 6 K A TO ET A L .

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