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1985, 162(1):67. J. Bacteriol.

M R Smith, J L Lequerica and M R Hart

metabolism in Methanosarcina sp. by cyanide.


Inhibition of methanogenesis and carbon
http://jb.asm.org/content/162/1/67
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V o l . 1 6 2 , N o . 1
I n h i b i t i o n o f M e t h a n o g e n e s i s a n d C a r b o n M e t a b o l i s m i n
M e t h a n o s a r c i n a s p . b y C y a n i d e
M I C HAEL R . S M I T H, ' * JUAN L. LEQUER I C A, 2 AN D M AR C US R . HAR T '
W e s t e r n R e g i o n a l R e s e a r c h C e n t e r , U. S . De p a r t m e n t o f Ag r i c u l t u r e , B e r k e l e y , C a l i f o r n i a 9 4 7 1 0 , 1 a n d I n s t i t u t o d e
Ag r o q u i m i c a y T e c n o l o g i a d e Al i m e n t o s , C o n s e j o S u p e r i o r d e I n v e s t i g a c i o n e s C i e n t i f i c a s , V a l e n c i a 4 6 0 1 0 , S p a i n 2
R e c e i v e d 2 4 O c t o b e r 1 9 8 4 / Ac c e p t e d 1 0 Ja n u a r y 1 9 8 5
N a C N wa s t e s t e d f o r i t s i n h i b i t o r y e f f e c t s o n g r o wt h o f a n d m e t a b o l i s m b y M e t h a n o s a r c i n a b a r k e n i 2 2 7 .
N a C N ( 1 0 , u M ) i n h i b i t e d c a t a b o l i s m o f a c e t a t e m e t h y l g r o u p s t o C H4 a n d C O 2 b u t d i d n o t i n h i b i t
m e t h a n o g e n e s i s f r o m m e t h a n o l , C 0 2 , m e t h y l a m i n e , o r t r i m e t h y l a m i n e . N a C N a l s o i n h i b i t e d t h e a s s i m i l a t i o n
o f m e t h a n o l o r C O 2 ( a s t h e s o l e c a r b o n s o u r c e ) i n t o c e l l c a r b o n a n d s t i m u l a t e d t h e a s s i m i l a t i o n o f a c e t a t e . T h e s e
r e s u l t s s u g g e s t t h a t i n h i b i t i o n b y N a C N wa s a r e s u l t o f i t s a c t i o n a s a n i n h i b i t o r o f i n v i v o C O d e h y d r o g e n a s e .
T h e r e s u l t s a l s o i m p l i c a t e C O d e h y d r o g e n a s e i n t h e o x i d a t i o n o f a c e t a t e b u t n o t m e t h a n o l m e t h y l g r o u p s t o
C O 2 .
M e t h a n e i s g e n e r a t e d f r o m a c e t a t e i n M e t h a n o s a r c i n a
s p p . b y a d e c a r b o x y l a t i o n r e a c t i o n i n wh i c h t h e m e t h y l
g r o u p i s r e d u c e d t o C H4 a n d t h e c a r b o x y l g r o u p i s o x i d i z e d
t o C O 2 ( 1 , 2 1 ) . T h i s r e a c t i o n , wh i c h m a y i n v o l v e c o e n z y m e
M ( 2 - m e r c a p t o e t h a n e s u l f o n a t e ) a s a n i n t e r m e d i a t e , g e n e r -
a t e s e n e r g y f o r AT P s y n t h e s i s a n d g r o wt h b y a n u n k n o wn
m e c h a n i s m ( 2 , 2 0 - 2 2 ) . T h e f r e e e n e r g y y i e l d f r o m t h e
a c e t i c l a s t i c r e a c t i o n ( - 3 6 k J m o l - 1 ) i s i n s u f f i c i e n t f o r t h e
f o r m a t i o n o f 1 m o l o f AT P p e r m o l o f a c e t a t e c l e a v e d ( 2 1 ) .
El e c t r o n t r a n s p o r t p h o s p h o r y l a t i o n i s i n d i c a t e d f o r AT P
s y n t h e s i s ( 2 6 ) .
C y a n i d e wa s f i r s t r e p o r t e d t o i n h i b i t m e t h a n o g e n i c b a c t e -
r i a g r o wi n g o n a c e t a t e ( 1 1 , 2 1 ) . G r o wt h i n h i b i t i o n i s p r o b a b l y
d i r e c t e d s p e c i f i c a l l y t o wa r d c a t a b o l i s m b e c a u s e g r o wt h a n d
m e t h a n o g e n e s i s o n H2 - C O 2 o r m e t h a n o l a r e n o t i n h i b i t e d b y
c y a n i d e ( 7 , 2 5 ; M . R . S m i t h , M . Ha r t , a n d M . W e i s s , Ab s t r .
An n u . M e e t . Am . S o c . M i c r o b i o l . 1 9 8 3 , I 7 , p . 1 4 0 ) . C y a n i d e
i s a we l l - k n o wn i n h i b i t o r o f c y t o c h r o m e s , a n d m e t h a n o g e n s
t h a t c a t a b o l i z e m e t h y l g r o u p s we r e r e p o r t e d t o p o s s e s s
c y t o c h r o m e s ( 6 , 1 4 , 1 6 ) . Ho we v e r , c y a n i d e i s n o t s p e c i f i c i n
i t s a c t i o n , a n d i t s g e n e r a l e f f e c t s i n v i v o o n t h e m e t a b o l i s m o f
m e t h a n o g e n s h a v e n o t b e e n r e p o r t e d .
I n t h i s p a p e r , we r e p o r t t h a t N a C N a t l o w c o n c e n t r a t i o n s
i s a s p e c i f i c i n h i b i t o r o f m e t h a n o g e n e s i s f r o m a c e t a t e , o x i -
d a t i o n o f a c e t a t e m e t h y l g r o u p s t o C 0 2 , a n d a s s i m i l a t i o n o f
o n e - c a r b o n u n i t s . C y a n i d e s h o we d n o s e l e c t i v e a c t i v i t y o n
m e t h y l - g r o u p o x i d a t i o n f r o m m e t h a n o l . ( Pa r t o f t h i s wo r k
wa s r e p o r t e d p r e v i o u s l y [ S m i t h e t a l . , Ab s t r . An n u . M e e t .
Am . S o c . M i c r o b i o l . 1 9 8 3 . ] )
M AT ER I ALS AN D M ET HO DS
B a c t e r i a l s t r a i n a n d c u l t u r e m e d i a . M e t h a n o s a r c i n a b a r k -
e r i 2 2 7 ( DS M 1 5 3 8 ) wa s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 2 1 ) . C u l t u r e s
we r e m a i n t a i n e d b y t r a n s f e r r i n g t h e m i n 5 0 m l o f M O PS
( m o r p h o l i n e p r o p a n e s u l f o n i c a c i d ) c o m p l e x b a s a l m e d i u m
( c o m p l e x m e d i u m ) ( 2 0 ) i n 1 6 0 - m l s e r u m b o t t l e s c o n t a i n i n g
H2 - C O 2 ( 8 0 : 2 0 ; 2 0 2 k Pa ) , m e t h a n o l ( 4 0 m M ) , m e t h y l a m i n e
( 2 5 m M ) , t r i m e t h y l a m i n e ( 2 5 m M ) , o r s o d i u m a c e t a t e ( 5 0
m M ) a s t h e o n l y e n e r g y s o u r c e . C o m p l e x m e d i u m a l s o c o n -
t a i n e d 0 . 2 % y e a s t e x t r a c t a n d 0 . 2 % T r y p t i c a s e ( B B L M i -
*
C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .
6 7
c r o b i o l o g y S y s t e m s , C o c k e y s v i l l e , M d . ) . Ac e t a t e wa s
p r e s e n t i n t h e m e d i u m a t a 2 m M c o n c e n t r a t i o n b e c a u s e i t
wa s s u p p l i e d b y t h e T r y p t i c a s e ( 2 2 ) . M e t h a n o l c u l t u r e s we r e
a l s o m a i n t a i n e d o n M O PS d e f i n e d b a s a l m e d i u m ( d e f i n e d
m e d i u m ) o r PB B M m e d i u m ( m i n e r a l m e d i u m ) ( 1 2 ) f o r a t l e a s t
f i v e t r a n s f e r s b e f o r e t h e y we r e u s e d a s i n o c u l a f o r e x p e r i -
m e n t s . T h e d e f i n e d m e d i u m wa s i d e n t i c a l t o t h e c o m p l e x
m e d i u m e x c e p t t h a t 1 0 m l o f W o l i n v i t a m i n s o l u t i o n ( 1 ) p e r
l i t e r a n d 1 . 0 m l o f t r a c e m i n e r a l ( 1 ) s o l u t i o n p e r l i t e r we r e
s u b s t i t u t e d f o r t h e y e a s t e x t r a c t a n d T r y p t i c a s e . De f i n e d
m e d i u m c o n t a i n e d ( g r a m s l i t e r - ' ) : N H4 C l , 1 . 0 ; K 2 HPO 4 , 0 . 4 ;
M g C l 2 6 H2 0 , 0 . 1 ; M O PS , 2 . 6 2 ; N a O H, 0 . 3 ; r e s a z u r i n ,
0 . 0 0 0 1 , a n d c y s t e i n e h y d r o c h l o r i d e , 0 . 5 . W o l i n t r a c e m i n e r a l
a n d v i t a m i n s o l u t i o n s ( 1 a n d 1 0 m l l i t e r - ' , r e s p e c t i v e l y ) we r e
a d d e d b e f o r e t h e m e d i u m wa s b o i l e d u n d e r N 2 . S t e r i l e a n -
a e r o b i c N a 2 S * 9 H2 0 a n d N a HC O 3 we r e a d d e d t o f i n a l c o n -
c e n t r a t i o n s o f 0 . 0 1 a n d 0 . 1 % , r e s p e c t i v e l y , b e f o r e i n o c u l a -
t i o n . T h e d e f i n e d m e d i u m d i f f e r e d f r o m t h e m i n e r a l m e d i u m
i n h a v i n g M O PS i n s t e a d o f p h o s p h a t e a s a b u f f e r i n g a g e n t
a n d i n h a v i n g c y s t e i n e h y d r o c h l o r i d e a d d e d . T h e m i n e r a l
m e d i u m c o n t a i n e d n o a d d e d o r g a n i c c o m p o u n d s o t h e r t h a n
t h e v i t a m i n s o l u t i o n .
De f i n e d m e d i u m o r c o m p l e x m e d i u m wa s u s e d f o r a l l
g r o wt h e x p e r i m e n t s wi t h m e t h a n o l a s t h e e n e r g y s o u r c e .
M i n e r a l m e d i u m wa s u s e d o n l y f o r g r o wt h e x p e r i m e n t s wi t h
H2 - C O 2 a s t h e e n e r g y s o u r c e . Al l m e d i a we r e p r e p a r e d
a n a e r o b i c a l l y u n d e r N 2 wi t h d i s t i l l e d wa t e r a n d r e a g e n t
g r a d e c h e m i c a l s .
C h e m i c a l s . C o e n z y m e M wa s p u r c h a s e d f r o m S i g m a C h e m -
i c a l C o . , S t . Lo u i s , M o . M e t h y l c o e n z y m e M wa s s y n t h e -
s i z e d a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 2 0 ) . B r a d f o r d r e a g e n t ( 4 ) f o r
p r o t e i n a s s a y s wa s p u r c h a s e d f r o m B i o - R a d La b o r a t o r i e s ,
R i c h m o n d , C a l i f .
I s o t o p e s . [ 1 4 C ] m e t h a n o l ( s p e c i f i c a c t i v i t y , 5 8 m C i m m o l - 1 ) ,
s o d i u m [ 2 - 1 4 C ] a c e t a t e ( s p e c i f i c a c t i v i t y , 5 7 . 5 m C i m m o l - 1 ) ,
a n d s o d i u m [ 1 - 1 4 C ] a c e t a t e ( s p e c i f i c a c t i v i t y , 5 4 m C i m m o l - 1 )
we r e p u r c h a s e d f r o m Am e r s h a m C o r p . , Ar l i n g t o n He i g h t s ,
I l l .
C e l l s u s p e n s i o n s a n d e x t r a c t s . W a s h e d c e l l s u s p e n s i o n s
we r e p r e p a r e d a n a e r o b i c a l l y i n PD b u f f e r ( p H, 7 . 0 ) ( 2 0 ) f r o m
5 0 m l o f c u l t u r e i n c o m p l e x m e d i u m . T h e s u s p e n s i o n wa s
d i s t r i b u t e d i n 5 - m l p o r t i o n s i n t o 2 7 - m l B a l c h t u b e s ( 1 ) i n s i d e
a n a n a e r o b i c g l o v e b o x . S u b s t r a t e s , r a d i o a c t i v e s u b s t r a t e s ,
JO UR N AL O F B AC T ER I O LO G Y , Ap r . 1 9 8 5 , p . 6 7 - 7 1
0 0 2 1 - 9 1 9 3 / 8 5 / 0 4 0 0 6 7 - 0 5 $ 0 2 . 0 0 / 0

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6 8 S M I T H ET AL.
T AB LE 1 . Ef f e c t o f c y a n i d e o n m e t h a n e p r o d u c t i o n b y M . b a r k e r i 2 2 7 a
M e t h a n e
p r o d u c e d
( j u . m o l )
wi t h t h e
f o l l o wi n g
a m o u n t o f N a C N
( i LM ) : Da y s
S u b s t r a t e M e d i u m
i n u a t e d
0 1 1 0 1 0 0 1 , 0 0 0 i n c u b a t e d
H2 - C 0 2 C o m p l e x 1 , 1 0 9 7 2 0 1 , 3 0 4 8 4 6 3
M e t h y l a m i n e C o m p l e x 8 3 5 7 6 1 7 5 1 1 1 4 4 7
T r i m e t h y l a m i n e C o m p l e x 1 , 0 8 9 1 , 0 7 2 9 2 5 3 5 5 3 7
Ac e t a t e C o m p l e x 1 5 9 1 0 3 0 0 N Db 1 0
H2 - C 0 2 M i n e r a l 6 2 2 5 8 6 1 3 N D 3 5
H2 - C 0 2 M i n e r a l + a c e t a t e c 8 8 2 1 , 4 3 3 1 , 0 4 2 N D 9 4
a Al l c u l t u r e s e x c e p t t h o s e o n 5 0 m M a c e t a t e we r e i n 5 0 m l o f m e d i u m i n 1 6 0 - m I s e r u m b o t t l e s . Ac e t a t e c u l t u r e s we r e g r o wn i n 1 0 . 5 m l o f m e d i u m i n 2 7 - m l B a l c h
t u b e s ( 1 ) . M i n e r a l m e d i u m wa s a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 1 2 ) . Fi n a l s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n s we r e 2 5 m M ( m e t h y l a m i n e o r t r i m e t h y l a m i n e ) o r 5 0 m M ( s o d i u m
a c e t a t e ) . H2 - C O 2 ( 8 0 : 2 0 ) wa s a d d e d a t 2 0 2 k Pa t o m e d i a u n d e r a n N 2 a t m o s p h e r e . H2 - C O 2 c u l t u r e s we r e s h a k e n a t 2 0 0 r p m .
b
N D, N o t d e t e r m i n e d .
c 1 0 m M .
a n d i n h i b i t o r s o l u t i o n s we r e t h e n a d d e d t o m a k e t h e d e s i r e d
f i n a l c o n c e n t r a t i o n s f r o m c o n c e n t r a t e d , a n a e r o b i c , f i l t e r - s t e r -
i l i z e d s t o c k s o l u t i o n s . T h e s u s p e n s i o n s we r e i n c u b a t e d i n a
3 7 C wa t e r b a t h f o r 2 3 h .
C e l l e x t r a c t s we r e p r e p a r e d f r o m 1 0 l i t e r s o f c u l t u r e a s
d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 2 0 ) . C e l l s ( 8 t o 1 0 g [ we t we i g h t ] ) we r e
s u s p e n d e d i n 5 t o 8 m l o f PD b u f f e r a n d b r o k e n a n a e r o b i c a l l y
u n d e r H2 wi t h a Fr e n c h p r e s s . T h e c r u d e e x t r a c t s we r e
c e n t r i f u g e d a t 3 0 , 0 0 0 x g f o r 2 0 m i n a t 4 ' C . T h e s u p e r n a t a n t
wa s c o l l e c t e d a n a e r o b i c a l l y , a n d t h e c e l l p e l l e t wa s d i s -
c a r d e d .
Ex p e r i m e n t s t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t s o f N a C N o n t h e r a t e
o f m e t h a n o g e n e s i s b y r e s t i n g c e l l s u s p e n s i o n s we r e c o n -
d u c t e d wi t h 5 6 FLg o f c e l l p r o t e i n i n c u b a t e d a t 3 7 C i n 5 - m l
v i a l s c o n t a i n i n g PD b u f f e r a n d 1 0 m M s o d i u m a c e t a t e o r 1 0
m M m e t h a n o l a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 2 0 ) .
G r o wt h . G r o wt h wa s d e t e r m i n e d b y o b s e r v i n g c h a n g e s i n
a b s o r b a n c e a t 4 5 0 n m , u s i n g a Pe r k i n - El m e r m o d e l LC - 5 5
s p e c t r o p h o t o m e t e r . Ab s o r b a n c e d e t e r m i n a t i o n s we r e p o s s i -
b l e wi t h M . b a r k e r i 2 2 7 b e c a u s e o f i t s t e n d e n c y t o g r o w a s
f i n e l y d i s p e r s e d p a r t i c l e s . C e l l y i e l d s a t t h e e n d o f i n c u b a t i o n
we r e d e t e r m i n e d b y we i g h t d i f f e r e n c e a f t e r f i l t e r i n g 2 0 t o 4 0
m l o f c u l t u r e t h r o u g h p r e we i g h e d 0 . 4 5 - , . m - p o r e - s i z e p o l y -
c a r b o n a t e f i l t e r s ( N u c l e p o r e C o r p . , Pl e a s a n t o n , C a l i f . ) , wa s h -
i n g t h e f i l t e r s t wi c e wi t h 1 0 m l o f d i s t i l l e d wa t e r , a n d t h e n
d r y i n g t h e m t o c o n s t a n t we i g h t i n a d e s i c c a t o r .
G r o wt h r a t e s we r e d e t e r m i n e d b y o b s e r v i n g a b s o r b a n c e a t
4 5 0 n m a n d b y c a l c u l a t i n g f r o m t h e e x p o n e n t i a l i n c r e a s e i n
C H4 . T h e s p e c i f i c g r o wt h r a t e c o n s t a n t ( , u ) i s t h e n a t u r a l
l o g a r i t h m o f 2 d i v i d e d b y t h e d o u b l i n g t i m e . Ab s o r b a n c e
m e a s u r e m e n t s a n d C H4 m e a s u r e m e n t s g a v e g o o d a g r e e m e n t
i n t h e v a l u e o f p u .
M e t h a n e . M e t h a n e a n d c a r b o n d i o x i d e we r e m e a s u r e d b y
g a s c h r o m a t o g r a p h y a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 2 0 - 2 2 ) . 1 4 C H4
a n d 1 4 C O 2 we r e d e t e r m i n e d b y c o n s t a n t v o l u m e s a m p l i n g o f
t h e h e a d s p a c e s o f c u l t u r e s o r c e l l s u s p e n s i o n s f o l l o we d b y
i n j e c t i o n o f t h e s a m p l e i n t o a n F&M g a s c h r o m a t o g r a p h
( wi t h a t h e r m o c o n d u c t i v i t y d e t e c t o r ) c o n n e c t e d i n t a n d e m t o
a Pa c k a r d m o d e l 8 9 4 g a s p r o p o r t i o n a l c o u n t e r ( 2 1 ) . Fo r
a n a l y s i s o f 1 4 C H4 a n d 1 4 C O 2 i n c e l l s u s p e n s i o n s , t h e s u s p e n -
s i o n s we r e a c i d i f i e d b e f o r e t h e h e a d s p a c e wa s s a m p l e d b y
a d d i n g 1 m l o f 2 0 N H2 S O 4 . T h e s u s p e n s i o n s we r e s h a k e n
v i g o r o u s l y a t i n t e r v a l s f o r a t l e a s t 2 h b e f o r e s a m p l i n g t o
a l l o w d i s s o l v e d C O 2 t o e q u i l i b r a t e wi t h t h e h e a d s p a c e .
Di s s o l v e d 1 4 C O 2 wa s e s t i m a t e d b y He n r y ' s l a w. M e t h a n o -
g e n e s i s b y c e l l e x t r a c t s wa s m o n i t o r e d a t 1 5 - m i n i n t e r v a l s
wi t h a Pe r k i n - El m e r g a s c h r o m a t o g r a p h a n d f l a m e i o n i z a t i o n
d e t e c t o r ( 2 0 ) .
As s a y s . T h e m e t h o d o f B r a d f o r d ( 4 ) wa s u s e d t o a s s a y
p r o t e i n i n c e l l e x t r a c t s . B o v i n e s e r u m a l b u m i n ( f r a c t i o n V ;
S i g m a ) wa s u s e d a s a s t a n d a r d . C e l l p r o t e i n i n c e l l s u s p e n -
s i o n s wa s a s s a y e d b y t h e m e t h o d o f Hi p p e e t a l . ( 1 0 ) .
M e t h y l c o e n z y m e M m e t h y l r e d u c t a s e a c t i v i t y a n d m e t h a n o -
g e n i c a c t i v i t y f r o m m e t h a n o l i n c e l l e x t r a c t s we r e a s s a y e d i n
5 - m l v i a l s b y t h e m e t h o d o f R o m e s s e r a n d B a l c h ( 1 9 ) , u s i n g
t h e r e a c t i o n m i x t u r e s a n d i n c u b a t i o n c o n d i t i o n s d e s c r i b e d
p r e v i o u s l y ( 2 0 ) .
La b e l i n g e x p e r i m e n t s . T h e e f f e c t s o f N a C N o n a s s i m i l a t i o n
o f c a r b o n f r o m ' I C - l a b e l e d s u b s t r a t e s we r e d e t e r m i n e d f o r
c u l t u r e s g r o wi n g i n c o m p l e x m e d i u m c o n t a i n i n g 4 0 m M
m e t h a n o l a n d 1 , u C i o f s o d i u m [ 2 - 1 4 C ] a c e t a t e , s o d i u m [ 1 -
1 4 C ] a c e t a t e , o r [ ' 4 C ] m e t h a n o l . C u l t u r e s we r e i n o c u l a t e d ( 1 %
v o l u m e ) i n t o t h e m e d i u m a n d i n c u b a t e d a t 3 5 C f o r 9 6 h . At
t h e e n d o f i n c u b a t i o n , t h e c e l l s we r e h a r v e s t e d b y f i l t r a t i o n
o n t o 0 . 4 5 - p . m - p o r e - s i z e N u c l e p o r e m e m b r a n e f i l t e r s . Ea c h
f i l t e r wa s wa s h e d t h r e e t i m e s wi t h 1 0 m l o f c o l d 5 % t r i c h l o -
r o a c e t i c a c i d a n d o n c e wi t h 1 0 m l o f d i s t i l l e d wa t e r . T h e
f i l t e r s we r e t h e n d r i e d t o c o n s t a n t we i g h t i n a d e s i c c a t o r a n d
c o u n t e d i n Aq u a s o l ( N e w En g l a n d N u c l e a r C o r p . , B o s t o n ,
M a s s . ) i n a l i q u i d s c i n t i l l a t i o n c o u n t e r t o d e t e r m i n e t h e
q u a n t i t y o f r a d i o a c t i v e s u b s t r a t e a s s i m i l a t e d .
Ex p e r i m e n t s t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t s o f N a C N o n t h e
m e t a b o l i s m o f r a d i o a c t i v e m e t h a n o l o r a c e t a t e t o g a s e s i n
m e t h a n o l - a c e t a t e m i x t u r e s e m p l o y e d a c e t a t e - g r o wn c e l l s u s -
p e n s i o n s p r e p a r e d a n d d i s t r i b u t e d a s d e s c r i b e d a b o v e . M e t h -
a n o l p l u s a c e t a t e wa s a d d e d t o g i v e a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f
1 0 m M m e t h a n o l a n d 1 m M s o d i u m a c e t a t e . T h e t u b e s a l s o
r e c e i v e d 2 , u C i o f [ 1 4 C ] m e t h a n o l o r s o d i u m [ 2 - 1 4 C ] a c e t a t e
a n d 8 9 p . g o f c e l l p r o t e i n . I n c u b a t i o n s we r e c o n d u c t e d a t
3 7 C f o r 2 3 h . 1 4 C H4 a n d 1 4 C O 2 we r e d e t e r m i n e d b y g a s
c h r o m a t o g r a p h y a n d b y c o u n t i n g wi t h a Pa c k a r d m o d e l 8 9 4
g a s p r o p o r t i o n a l c o u n t e r c o n n e c t e d i n t a n d e m t o a g a s
c h r o m a t o g r a p h a f t e r a c i d i f i c a t i o n wi t h 1 m l o f 2 0 N H2 S O 4
( 2 1 ) . S a m p l i n g o f h e a d s p a c e s f o r 1 4 C H4 a n d 1 4 C O 2 wa s
p e r f o r m e d a t 2 a n d 2 4 h a f t e r a c i d i f i c a t i o n t o a l l o w d i s s o l v e d
C O 2 t o e q u i l i b r a t e wi t h t h e h e a d s p a c e . T h e i n c u b a t i o n
m i x t u r e s we r e s h a k e n v i g o r o u s l y a t i n t e r v a l s d u r i n g t h e
e q u i l i b r a t i o n p e r i o d . N o d i f f e r e n c e s i n 1 4 C H4 a n d 1 4 C O 2
r e a d i n g s we r e o b s e r v e d a t 2 a n d 2 4 h a f t e r a c i d i f i c a t i o n .
Di s s o l v e d C O 2 wa s e s t i m a t e d b y He n r y ' s l a w.
R ES ULT S
I n f l u e n c e o f m e d i u m c o m p o s i t i o n a n d g r o wt h s u b s t r a t e o n
s e n s i t i v i t y t o N a C N . G r o wt h i n h i b i t i o n b y N a C N v a r i e d wi t h
t h e e n e r g y s o u r c e a n d c o m p o s i t i o n o f t h e m e d i u m ( c o m p l e x
o r m i n e r a l ) ( T a b l e 1 ) . G r o wt h wa s e s t i m a t e d v i s u a l l y a n d
f r o m t h e q u a n t i t y o f m e t h a n e p r o d u c e d a t i n t e r v a l s d u r i n g
i n c u b a t i o n a t 3 5 C f o r t h e i n d i c a t e d t i m e s . N a C N i n h i b i t e d
m e t h a n o g e n e s i s o f c u l t u r e s i n c o m p l e x m e d i u m c o n t a i n i n g
H2 - C O 2 , m e t h y l a m i n e , o r t r i m e t h y l a m i n e o n l y wh e n t h e
J. B AC T ER I O L.

o
n

A
p
r
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1
3
,

2
0
1
4

b
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d

f
r
o
m

C Y AN I DE I N HI B I T I O N I N M ET HAN O S AR C I N A S P. 6 9
N a C N c o n c e n t r a t i o n wa s 1 0 0 p u M o r g r e a t e r ( T a b l e 1 ) .
M e t h a n o g e n e s i s f r o m a c e t a t e wa s m o r e s e n s i t i v e t o c y a n i d e
t h a n m e t h a n o g e n e s i s f r o m t h e o t h e r s u b s t r a t e s , wi t h i n h i b i -
t i o n o c c u r r i n g a t 1 0 p . M N a C N .
C u l t u r e s i n m i n e r a l m e d i u m ( 1 2 ) c o n t a i n i n g H2 - C O 2 a s t h e
g r o wt h s u b s t r a t e we r e i n h i b i t e d b y l o we r ( 1 0 p . M ) c o n c e n -
t r a t i o n s o f N a C N t h a n we r e H2 - C O 2 c u l t u r e s i n c o m p l e x
m e d i u m . I n h i b i t i o n o f g r o wt h o n H2 - C O 2 i n m i n e r a l m e d i u m
d i d n o t o c c u r i f t h e m e d i u m wa s s u p p l e m e n t e d wi t h 1 0 m M
s o d i u m a c e t a t e . T h i s i n d i c a t e s t h a t a c e t a t e o v e r c a m e t h e
m e t a b o l i c b l o c k t h a t wa s r e s p o n s i b l e f o r g r o wt h i n h i b i t i o n .
C y a n i d e e x h i b i t e d t h e s a m e p a t t e r n o f i n h i b i t i o n o n m e t h -
a n o l c u l t u r e s i n d e f i n e d m e d i u m a s i t d i d o n H2 - C O 2 c u l t u r e s
i n m i n e r a l m e d i u m ( T a b l e 2 ) . C o n t r o l c u l t u r e s i n d e f i n e d
m e d i u m c o n t a i n i n g 4 0 m M m e t h a n o l b u t wi t h o u t N a C N
g r e w wi t h a d o u b l i n g t i m e o f 1 4 . 1 h ( p . = 0 . 0 4 9 h - 1 ) . N a C N
( 1 0 , u M ) i n c r e a s e d t h e d o u b l i n g t i m e t o 2 1 . 7 h ( p . = 0 . 0 3 2
h - 1 ) , a n d 1 0 0 p . M N a C N c a u s e d n e a r l y c o m p l e t e i n h i b i t i o n
o f g r o wt h . I n d e f i n e d m e d i u m s u p p l e m e n t e d wi t h 1 0 m M
s o d i u m a c e t a t e , t h e d o u b l i n g t i m e wa s 1 1 . 7 h ( p . = 0 . 0 5 9 h - 1 )
a n d wa s u n a f f e c t e d b y t h e a d d i t i o n o f 1 0 p . M N a C N . Fi n a l
a b s o r b a n c e s a t a wa v e l e n g t h o f 4 5 0 n m a g r e e d wi t h s p e c i f i c
g r o wt h r a t e c o n s t a n t d e t e r m i n a t i o n s .
I n h i b i t i o n b y N a C N o f m e t h a n o l a n d a c e t a t e a s s i m i l a t i o n
i n t o c e l l c a r b o n . N a C N i n h i b i t e d g r o wt h o n H2 - C O 2 i n
m i n e r a l m e d i u m o r o n m e t h a n o l i n d e f i n e d m e d i u m p r o b a b l y
b e c a u s e i t i n h i b i t e d c a r b o n a s s i m i l a t i o n . T o d e t e r m i n e i f
N a C N i n h i b i t i o n wa s c a u s e d b y i n h i b i t i o n o f m e t h a n o l o r
C O 2 a s s i m i l a t i o n , c u l t u r e s we r e i n o c u l a t e d i n t o c o m p l e x
m e d i u m c o n t a i n i n g m e t h a n o l a n d 1 p . C i o f r a d i o a c t i v e m e t h -
a n o l o r a c e t a t e ( T a b l e 3 ) . C o m p l e x m e d i u m a n d 1 0 , u M
N a C N we r e c h o s e n b e c a u s e g r o wt h wa s n o t i n h i b i t e d a s i n
t h e p r e v i o u s e x p e r i m e n t s . As s i m i l a t i o n o f [ 1 4 C ] m e t h a n o l ,
s o d i u m [ 1 - _ 4 C ] a c e t a t e , o r s o d i u m [ 2 - 1 4 C ] a c e t a t e wa s c o m -
p a r e d i n c u l t u r e s i n c u b a t e d wi t h a n d wi t h o u t 1 0 p . M N a C N .
T h e c u l t u r e s g r e w e x p o n e n t i a l l y d u r i n g t h e 9 6 h o f i n c u b a -
t i o n .
C u l t u r e s i n c o m p l e x m e d i u m wi t h o u t a d d e d a c e t a t e p r o -
d u c e d 1 , 1 7 0 t o 1 , 3 7 8 p . m o l o f C H4 a n d g r e w wi t h d o u b l i n g
t i m e s o f 1 0 . 3 t o 1 0 . 8 h ( p .
=
0 . 0 6 7 t o 0 . 0 6 4 h - 1 ) . T h e m e t h y l
a n d c a r b o x y l c a r b o n a t o m s o f a c e t a t e we r e a s s i m i l a t e d i n
a p p r o x i m a t e l y e q u i m o l a r r a t i o s ( 3 . 5 a n d 3 . 3 m m o l g o f
c e l l s - ' ) . Ab o u t f o u r t i m e s a s m u c h c a r b o n wa s a s s i m i l a t e d
f r o m m e t h a n o l ( 1 4 m m o l g o f c e l l s - 1 ) a s f r o m t h e m e t h y l o r
c a r b o x y l g r o u p o f a c e t a t e . W h e n 1 0 p . M N a C N wa s p r e s e n t
i n t h e m e d i u m , g r e a t e r q u a n t i t i e s o f a c e t a t e we r e a s s i m i l a t e d
( 4 . 9 m m o l g o f c e l l s - 1 ) a n d l e s s m e t h a n o l wa s a s s i m i l a t e d
( 9 . 2 m m o l g o f c e l l s - ' ) . T h e m e t h y l a n d c a r b o x y l c a r b o n
a t o m s o f a c e t a t e c o n t i n u e d t o b e a s s i m i l a t e d i n e q u a l p r o -
p o r t i o n . S p e c i f i c g r o wt h r a t e c o n s t a n t s , t o t a l m e t h a n e , a n d
f i n a l c e l l y i e l d s ( b a s e d o n a b s o r b a n c e a t 4 5 0 n m ) we r e n o t
a f f e c t e d b y t h e p r e s e n c e o f 1 0 p . M N a C N .
T AB LE 2 . C y a n i d e i n h i b i t i o n o f g r o wt h o f M . b a r k e r i 2 2 7 o n
m e t h a n o l i n d e f i n e d m e d i u m a
Ad d i t i o n ( C H4 ) Fi n a l A4
T o t a l C H4
N o n e 0 . 0 4 9 0 . 1 5 6 3 4 1
1 0 , u M N a C N 0 . 0 3 2 0 . 0 3 3 7 0
1 0 0 p . M N a C N 0 . 0 0 2 0 . 0 0 6 9
1 0 m M s o d i u m a c e t a t e 0 . 0 5 9 0 . 2 7 4 7 0 2
1 0 m M s o d i u m a c e t a t e + 1 0 0 . 0 5 9 0 . 3 5 2 8 4 6
, u M N a C N
a
De f i n e d m e d i u m i s d e s c r i b e d i n t h e t e x t . M e t h a n o l ( 4 0 m M ) wa s a d d e d a s
a n e n e r g y s o u r c e . T h e r e s u l t s a r e a v e r a g e s o f d u p l i c a t e d e t e r m i n a t i o n s .
T AB LE 3 . C y a n i d e i n h i b i t i o n o f a c e t a t e a s s i m i l a t i o n b y M .
b a r k e r i 2 2 7 i n c o m p l e x m e d i u m '
La b e l e d N a C N T o t a l La b e l e d s u b s t r a t e
s u b s t r a t e ( > . M ) m e t h a n e I . ( h - 1 ) a s s i m i l a t e d
( p . m o l )
( m m o l g o f c e l l s - ' )
[ 2 - 1 4 C ] a c e t a t e 0 1 , 3 7 8 0 . 0 6 4 3 . 5
[ 1 - 1 4 C ] a c e t a t e 0 1 , 1 7 0 0 . 0 6 7 3 . 3
1 4 C H3 0 H 0 1 , 2 0 4 0 . 0 6 6 1 4 . 0
[ 2 - 1 4 C ] a c e t a t e 1 0 1 , 2 6 7 0 . 0 6 3 4 . 9
[ 1 - _ 4 C ] a c e t a t e 1 0 1 , 2 6 5 0 . 0 6 4 4 . 9
" 4 C H3 O H 1 0 1 , 2 3 3 0 . 0 6 4 9 . 2
a
C o m p l e x m e d i u m i s d e s c r i b e d i n t h e t e x t . C u l t u r e s ( 5 0 m l ) we r e g r o wn o n
4 0 m M m e t h a n o l i n t h e p r e s e n c e o f 1 p . C i o f [ 1 4 C ] m e t h a n o l o r [ " 4 C ] a c e t a t e f o r
% h a t 3 7 ' C . C e l l s we r e t h e n h a r v e s t e d b y f i l t r a t i o n , wa s h e d , d r i e d , a n d
c o u n t e d . T h e s p e c i f i c g r o wt h r a t e c o n s t a n t ( , u ) wa s c a l c u l a t e d f r o m t h e
e x p o n e n t i a l i n c r e a s e i n m e t h a n e . R e s u l t s a r e a v e r a g e s o f d u p l i c a t e o r t r i p l i -
c a t e d e t e r m i n a t i o n s .
Ef f e c t s o f N a C N o n t h e c a t a b o l i s m o f m e t h a n o l a n d a c e t a t e .
I n h i b i t i o n o f g r o wt h o n a c e t a t e i n c o m p l e x m e d i u m wa s
p r o b a b l y a c a t a b o l i c e f f e c t r a t h e r t h a n a n a n a b o l i c e f f e c t a s
o c c u r r e d wi t h H2 - C O 2 o r m e t h a n o l i n m i n e r a l o r d e f i n e d
m e d i u m . T h i s wa s c o n f i r m e d b y t e s t i n g t h e e f f e c t o f 1 0 p . M
N a C N o n t h e r a t e o f m e t h a n e p r o d u c t i o n f r o m a c e t a t e b y
wa s h e d c e l l s u s p e n s i o n s o f a c e t a t e - g r o wn c e l l s . T h e r a t e o f
m e t h a n o g e n e s i s f r o m a c e t a t e wa s i n h i b i t e d 8 5 % b y 1 0 , u M
N a C N ( 1 3 7 n m o l m i n - 1 m g o f p r o t e i n - ' t o 2 0 n m o l m i n - 1 m g
o f p r o t e i n - 1 ) , wh i l e m e t h a n o g e n e s i s f r o m m e t h a n o l ( 5 5 n m o l
m i n - ' m g o f p r o t e i n - ' ) wa s n o t a f f e c t e d b y N a C N . T h e r a t e
o f m e t h a n o g e n e s i s f r o m m e t h a n o l o r m e t h y l c o e n z y m e M i n
m e t h a n o l - g r o wn c e l l e x t r a c t s wa s n o t a f f e c t e d b y 1 0 m M
N a C N ( d a t a n o t s h o wn ) .
T h e e f f e c t o f N a C N o n t h e c a t a b o l i s m o f m i x t u r e s o f
m e t h a n o l a n d a c e t a t e wa s a l s o i n v e s t i g a t e d . I n m e t h a n o l - a c -
e t a t e o r H2 - C O 2 - a c e t a t e m i x t u r e s , p a r t o f t h e m e t h y l g r o u p
o f a c e t a t e i s o x i d i z e d t o C 0 2 , a n d e l e c t r o n s g e n e r a t e d f r o m
t h e o x i d a t i o n a r e u s e d t o r e d u c e m e t h a n o l o r C O 2 t o C H4 ( 8 ,
1 7 , 2 8 ) . N a C N ( 1 0 p . M ) h a d a s t r o n g i n h i b i t i n g e f f e c t o n C H4
a n d C O 2 p r o d u c t i o n f r o m t h e m e t h y l g r o u p o f a c e t a t e b u t d i d
n o t i n h i b i t C H4 o r C O 2 p r o d u c t i o n f r o m m e t h a n o l ( T a b l e 4 ) .
N a C N c a u s e d a 5 0 % i n c r e a s e i n 1 4 C O 2 p r o d u c t i o n b y
a c e t a t e - g r o wn c e l l s u s p e n s i o n s i n c u b a t e d wi t h [ 1 4 C ] m e t h a n o l
a n d m e t h a n o l p l u s a c e t a t e b u t h a d l i t t l e e f f e c t o n t h e a m o u n t
o f 1 4 C H4 p r o d u c e d . W h e n s o d i u m [ 2 - 1 4 C ] a c e t a t e wa s s u b s t i -
t u t e d f o r [ 1 4 C ] m e t h a n o l , 1 4 C H4 p r o d u c t i o n a n d 1 4 C O 2 p r o -
d u c t i o n we r e i n h i b i t e d e q u a l l y ( 5 9 % ) . T h i s e f f e c t wa s a l s o
e v i d e n t i n t h e r a t i o o f 1 4 C H4 t o 1 4 C O 2 p r o d u c e d f r o m t h e
T AB LE 4 . I n f l u e n c e o f c y a n i d e o n c o n v e r s i o n o f a c e t a t e a n d
m e t h a n o l t o C H4 a n d C O 2 b y r e s t i n g c e l l s u s p e n s i o n s o f M .
b a r k e r i a
La b e l e d N a C N d p m / l m o l
s u b s t r a t e ( > . M ) 1 4 C H4 1 4 C O ,
1 4 C H4 ' 4 C O 2
1 4 C H3 0 H 0 4 4 , 4 0 0 1 2 , 3 0 0 3 . 6
1 4 C H3 O H 1 0 4 0 , 6 0 0 1 8 , 0 0 0 2 . 3
[ 2 - 1 4 C ] a c e t a t e 0 4 5 , 3 0 0 6 1 , 9 0 0 0 . 7
[ 2 - 1 4 C ] a c e t a t e 1 0 1 8 , 5 0 0 2 7 , 1 0 0 0 . 7
a
C u l t u r e s f o r p r e p a r a t i o n o f c e l l s u s p e n s i o n s we r e g r o wn o n c o m p l e x
m e d i u m wi t h 5 0 m M s o d i u m a c e t a t e . M e t h o d s f o r p r e p a r a t i o n o f s u s p e n s i o n s
a n d i n c u b a t i o n c o n d i t i o n s a r e d e s c r i b e d i n t h e t e x t . I n c u b a t i o n s we r e p e r -
f o r m e d i n d u p l i c a t e o r t r i p l i c a t e i n PD b u f f e r c o n t a i n i n g 8 9 p . g o f c e l l p r o t e i n .
R e a c t i o n m i x t u r e s r e c e i v e d 1 0 m M m e t h a n o l , 1 m M a c e t a t e , a n d 2 p C i o f
l a b e l e d s u b s t r a t e i n a n N , a t m o s p h e r e .
V O L. 1 6 2 , 1 9 8 5

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A
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1
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7 0 S M I T H ET AL.
C I
FI G . 1 . Po i n t s a t wh i c h c y a n i d e i n h i b i t s m e t a b o l i s m o f M .
b a r k e r i .
m e t h a n o g e n i c s u b s t r a t e s . T h i s i n d i c a t e s t h a t t h e o x i d a t i o n o f
a c e t a t e b u t n o t m e t h a n o l m e t h y l g r o u p s t o C O 2 wa s v i a a
c y a n i d e - s e n s i t i v e p a t h wa y .
DI S C US S I O N
O u r e x p e r i m e n t s a g r e e wi t h p r e v i o u s wo r k s h o wi n g t h a t
a c e t a t e c a t a b o l i s m t o C H4 a n d C O 2 i n M . b a r k e r i i s i n h i b i t e d
b y l o we r ( 1 0 , u M ) N a C N c o n c e n t r a t i o n s t h a n t h o s e r e q u i r e d
t o i n h i b i t m e t h a n o g e n e s i s f r o m H2 - C O 2 o r m e t h a n o l ( 7 ;
S m i t h e t a l . , Ab s t r . An n u . M e e t . Am . S o c . M i c r o b i o l . 1 9 8 3 ) .
W e a l s o f o u n d t h a t m e t h a n o g e n e s i s f r o m m e t h y l a m i n e o r
t r i m e t h y l a m i n e wa s r e l a t i v e l y i n s e n s i t i v e t o N a C N i n h i b i -
t i o n .
Fr o m t h e g r o wt h e x p e r i m e n t s , i t i s c l e a r t h a t N a C N
e x h i b i t e d t wo i n h i b i t o r y e f f e c t s : ( i ) i n h i b i t i o n o f a c e t a t e
c a t a b o l i s m a n d ( i i ) i n h i b i t i o n o f C O 2 ( a s t h e s o l e c a r b o n
s o u r c e ) a n d o f m e t h a n o l a s s i m i l a t i o n . T h e f i r s t e f f e c t wa s
m a n i f e s t i n c o m p l e x m e d i u m ; t h e s e c o n d o c c u r r e d i n m i n -
e r a l o r d e f i n e d m e d i u m c o n t a i n i n g m e t h a n o l o r H2 - C O 2 .
S i n c e t h e s a m e e f f e c t s o c c u r r e d i n m i n e r a l m e d i u m a s i n
d e f i n e d m e d i u m , we c o n c l u d e d t h a t c y s t e i n e c a n n o t r e p l a c e
a c e t a t e a s a s o l e s o u r c e o f c a r b o n o r a b o l i s h i n h i b i t i o n b y
N a C N . T h e s p e c i f i c i n h i b i t i o n o f a c e t a t e c a t a b o l i s m wa s
c o n f i r m e d b y t h e e x p e r i m e n t s wi t h c e l l s u s p e n s i o n s a n d c e l l
e x t r a c t s . T h e i n h i b i t i o n o f a n a b o l i s m f r o m C O 2 o r m e t h a n o l
wa s c o n f i r m e d b y l a b e l i n g e x p e r i m e n t s wi t h r a d i o a c t i v e
s u b s t r a t e s i n wh i c h a s s i m i l a t i o n o f m e t h a n o l b u t n o t g r o wt h
wa s i n h i b i t e d . T h e p o i n t s a t wh i c h N a C N i n h i b i t e d m e t a b o -
l i s m i n M . b a r k e r i a r e s u m m a r i z e d i n Fi g . 1 .
I n h i b i t i o n b y N a C N o f a c e t a t e c a t a b o l i s m wa s n o t l i m i t e d
t o m e t h a n o g e n e s i s . Ac e t a t e - g r o wn c e l l s m e t a b o l i z i n g a m i x -
t u r e o f m e t h a n o l a n d a c e t a t e o r H2 - C O 2 a n d a c e t a t e p r o d u c e
C H4 s i m u l t a n e o u s l y f r o m m e t h a n o l a n d a c e t a t e ( 8 , 1 7 , 2 1 ) .
I n a d d i t i o n , p a r t o f t h e a c e t a t e m e t h y l g r o u p m e t a b o l i z e d i s
o x i d i z e d t o C 0 2 , wh i c h p r o v i d e s e l e c t r o n s f o r i n c r e a s e d C H4
p r o d u c t i o n f r o m m e t h a n o l ( 2 8 ) . O u r e x p e r i m e n t s s h o we d
t h a t 1 0 FM N a C N i n h i b i t e d e q u a l l y m e t h a n o g e n e s i s f r o m
a c e t a t e a n d o x i d a t i o n o f t h e m e t h y l c a r b o n a t o m o f a c e t a t e
t o C O 2 . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e s o u r c e o f m e t h y l g r o u p s f r o m
a c e t a t e f o r o x i d a t i o n t o C O 2 wa s t h e m e t h a n o g e n i c a c e t i c l a s -
t i c r e a c t i o n . M e t h y l - g r o u p o x i d a t i o n i n m e t h a n o g e n i c b a c t e -
r i a h a s n o t b e e n s t u d i e d i n a n y d e t a i l e v e n t h o u g h i t h a s a n
e s s e n t i a l r o l e i n c a t a b o l i s m .
I n h i b i t i o n o f c a r b o n a s s i m i l a t i o n f r o m m e t h a n o l o r C O 2 b y
1 0 , M N a C N h a s n o t b e e n r e p o r t e d f o r M e t h a n o s a r c i n a
s p p . b u t wa s r e p o r t e d f o r C O 2 m e t a b o l i s m b y M e t h a n o b a c -
t e r i u m t h e r m o a u t o t r o p h i c u m ( 7 ) . At t h e l o w a c e t a t e c o n c e n -
t r a t i o n s ( 2 m M ) u s e d i n o u r e x p e r i m e n t s wi t h c o m p l e x
m e d i u m , a p p r o x i m a t e l y 2 m o l o f c a r b o n we r e a s s i m i l a t e d
f r o m m e t h a n o l f o r e a c h m o l o f c a r b o n a s s i m i l a t e d f r o m
a c e t a t e . W h e n 1 0 , u M N a C N wa s a d d e d t o t h e c u l t u r e s ,
c a r b o n f r o m m e t h a n o l a n d a c e t a t e wa s a s s i m i l a t e d i n e q u a l
p r o p o r t i o n s , a n d g r o wt h r a t e s we r e n o t d e c r e a s e d . I t i s
b e l i e v e d t h a t m e t h a n o l a n d C O 2 a r e a s s i m i l a t e d i n t o c e l l
c a r b o n b y f i r s t b e i n g c o n v e r t e d t o a c e t a t e ( o r a c e t y l c o e n -
z y m e A) ( 1 2 ) , b u t t h i s h a s b e e n s h o wn o n l y f o r C O 2 ( 1 3 ) . O u r
e x p e r i m e n t s s h o w t h a t wh e n a s s i m i l a t i o n o f C O 2 o r m e t h a -
n o l i s b l o c k e d b y N a C N , t h e c e l l s a r e a b l e t o i n c r e a s e t h e
r a t e o f u p t a k e a n d a s s i m i l a t i o n o f e x o g e n o u s a c e t a t e t o
m a i n t a i n t h e i r g r o wt h r a t e . I n a d e f i n e d m e d i u m n o t c o n t a i n -
i n g e x o g e n o u s a c e t a t e , t h e g r o wt h r a t e s m u s t s l o w d o wn i n
t h e p r e s e n c e o f N a C N b e c a u s e o f c a r b o n l i m i t a t i o n .
I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e s y n t h e s i s o f a c e t a t e f r o m
o n e - c a r b o n u n i t s f o r a n a b o l i s m i s a c c o m p l i s h e d b y t h e s a m e
e n z y m e s y s t e m o p e r a t i n g i n r e v e r s e d i r e c t i o n a s t h e c l e a v -
a g e o f a c e t a t e t o C H4 a n d C O 2 ( 1 5 , 2 7 ) . Ho we v e r , t h e r e i s n o
e v i d e n c e f o r t h i s . C O d e h y d r o g e n a s e wa s p r o p o s e d a s a
c a n d i d a t e f o r t h a t e n z y m e b e c a u s e i t i s i m p l i c a t e d i n a c e t o -
g e n e s i s f r o m C O 2 b y a c e t o g e n i c b a c t e r i a a n d i s p r e s e n t i n
m e t h a n o g e n s s u c h M . t h e r m a u t o t r o p h i c u m t h a t s y n t h e s i z e
a c e t a t e f r o m C O 2 f o r a n a b o l i c p u r p o s e s ( 5 , 9 , 1 8 ) . C O
d e h y d r o g e n a s e o c c u r s wi t h h i g h s p e c i f i c a c t i v i t y i n e x t r a c t s
f r o m a c e t a t e - g r o wn c u l t u r e s o f M . b a r k e r i i n wh i c h a c e t a t e
s y n t h e s i s i s n o t r e q u i r e d ( 1 2 ) . T h e p u r i f i e d e n z y m e i s i n h i b -
i t e d b y 1 0 , u M N a C N ( 1 5 ) . O u r r e s u l t s a r e c o n s i s t e n t wi t h t h e
s u g g e s t i o n t h a t C O d e h y d r o g e n a s e h a s a d u a l m e t a b o l i c
f u n c t i o n . I f t h e s u g g e s t i o n i s c o r r e c t , t h e n C O d e h y d r o g e -
n a s e a l s o f u n c t i o n s i n t h e o x i d a t i o n o f a c e t a t e m e t h y l g r o u p s
b u t n o t m e t h a n o l m e t h y l g r o u p s t o C O 2 . T h i s c o u l d g i v e
r i s e
t o t h e p r e f e r e n t i a l o x i d a t i o n o f a c e t a t e t o C O 2 o v e r o t h e r
s u b s t r a t e s o b s e r v e d wi t h s u b s t r a t e m i x t u r e s a n d m i g h t
e x -
p l a i n t h e o b s e r v a t i o n o f B l a u t a n d G o t t s c h a l k ( 3 ) t h a t u p t o
h a l f o f t h e a c e t a t e m e t h y l g r o u p i s o x i d i z e d t o t h e l e v e l o f a
m e t h y l e n e g r o u p b e f o r e b e i n g r e d u c e d t o C H4 .
N a C N i n h i b i t i o n e x p e r i m e n t s wi t h M . t h e r m o a u t o t r o p h -
i c u m i n d i c a t e d t h a t C O d e h y d r o g e n a s e f u n c t i o n e d i n t h e
s y n t h e s i s o f a c e t y l c o e n z y m e A f o r c a r b o n a s s i m i l a t i o n b y
r e d u c i n g o n e m o l e c u l e o f C O 2 t o t h e l e v e l o f a c a r b o x y l
g r o u p a n d t h e n a t t a c h i n g t h e c a r b o x y l g r o u p t o a m e t h y l
g r o u p t h a t wa s d e r i v e d f r o m a s e c o n d m o l e c u l e o f C O 2
( 2 3 - 2 5 ) . S y n t h e s i s o f t h e m e t h y l g r o u p o f a c e t y l c o e n z y m e A
f r o m C O 2 i n v o l v e d a s e p a r a t e p a t h wa y t h a t wa s i n s e n s i t i v e
t o c y a n i d e . O u r e x p e r i m e n t s a r e c o n s i s t e n t wi t h C O d e h y -
d r o g e n a s e i n v o l v e m e n t i n a s s i m i l a t i o n o f m e t h a n o l i n M .
b a r k e r i .
N a C N i n h i b i t i o n i n s o m e r e s p e c t s r e s e m b l e d i n h i b i t i o n
r e p o r t e d f o r t h e c o r r i n o i d a n t a g o n i s t i o d o p r o p a n e ( 1 2 ) , b u t
wi t h s o m e c l e a r d i f f e r e n c e s . B o t h N a C N a n d i o d o p r o p a n e
i n h i b i t i o n we r e p r e v e n t e d b y a d d i n g a c e t a t e t o t h e g r o wt h
m e d i u m , a n i n d i c a t i o n t h a t b o t h i n h i b i t o r s b l o c k e d t h e
s y n t h e s i s o f a c e t a t e f r o m o n e - c a r b o n u n i t s . Ho we v e r ,
i o d o p r o p a n e d i d n o t s e l e c t i v e l y i n h i b i t a s s i m i l a t i o n o f m e t h -
a n o l i n s h o r t - o r l o n g - t e r m i n v i v o l a b e l i n g e x p e r i m e n t s ( 1 2 ,
1 3 ) . N a C N , h o we v e r , d i d s e l e c t i v e l y i n h i b i t m e t h a n o l a s s i m -
i l a t i o n i n t o c e l l c a r b o n . T h i s d i f f e r e n c e s u g g e s t s t h a t N a C N
d i d n o t i n h i b i t m e t h a n o l a s s i m i l a t i o n a s a c o r r i n o i d a n t a g o -
J. B AC T ER I O L.

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C Y AN I DE I N HI B I T I O N I N M ET HAN O S AR C I N A S P. 7 1
n i s t . O u r e x p e r i m e n t s s u g g e s t t h a t N a C N i n h i b i t e d m e t h a n o l
a s s i m i l a t i o n b y i n h i b i t i n g C O d e h y d r o g e n a s e , b e c a u s e N a C N
b u t n o t i o d o p r o p a n e i n h i b i t s p u r i f i e d C O d e h y d r o g e n a s e
( 1 5 ) .
N a C N i n h i b i t i o n i n M . b a r k e r i d i f f e r e d f r o m N a C N i n h i -
b i t i o n i n M . t h e r m o a u t o t r o p h i c u m i n n o t b e i n g p r e v e n t e d b y
a c e t a t e ( 2 3 - 2 5 ) . T h i s s u g g e s t s t h a t e s s e n t i a l c y a n i d e - s e n s i -
t i v e p a t h wa y s o f c a r b o n m e t a b o l i s m t h a t e x i s t i n M . t h e r -
m o a u t o t r o p h i c u m a r e n o t o p e r a t i v e i n M . b a r k e r i .
AC K N O W LEDG M EN T S
W e t h a n k L. B a r e s i a n d R . A. M a h f o r v a l u a b l e d i s c u s s i o n a n d
M a r y C . S u l l i v a n a n d M . W e i s s f o r t e c h n i c a l a s s i s t a n c e .
T h i s wo r k wa s c o n d u c t e d a t W R R C a n d s u p p o r t e d i n p a r t b y a
g r a n t f r o m t h e Fu l b r i g h t - M i n i s t r y o f Ed u c a t i o n a n d S c i e n c e o f S p a i n
C o m m i s s i o n .
LI T ER AT UR E C I T ED
1 . B a l c h , W . E. , G . E. Fo x , L. J. M a g r u m , C . R . W o e s e , a n d R . S .
W o l f e . 1 9 7 9 . M e t h a n o g e n s : r e e v a l u a t i o n o f a u n i q u e b i o l o g i c a l
g r o u p . M i c r o b i o l . R e v . 4 3 : 2 6 0 - 2 9 6 .
2 . B a r e s i , L. , a n d R . S . W o l f e . 1 9 8 1 . Le v e l s o f c o e n z y m e F4 2 0 ,
c o e n z y m e M , h y d r o g e n a s e , a n d m e t h y l c o e n z y m e M m e t h y l -
r e d u c t a s e i n a c e t a t e - g r o wn M e t h a n o s a r c i n a . Ap p l . En v i r o n .
M i c r o b i o l . 4 1 : 3 8 8 - 3 9 1 .
3 . B l a u t , M . , a n d G . G o t t s c h a l k . 1 9 8 2 . Ef f e c t o f t r i m e t h y l a m i n e o n
a c e t a t e u t i l i z a t i o n b y M e t h a n o s a r c i n a b a r k e r i . Ar c h . M i c r o b i o l .
1 3 3 : 2 3 0 - 2 3 5 .
4 . B r a d f o r d , M . 1 9 7 6 . A r a p i d a n d s e n s i t i v e m e t h o d f o r t h e
q u a n t i t a t i o n o f m i c r o g r a m q u a n t i t i e s o f p r o t e i n u t i l i z i n g t h e
p r i n c i p l e o f p r o t e i n d y e b i n d i n g . An a l . B i o c h e m . 7 2 : 2 4 8 - 2 5 4 .
5 . C o n r a d , R . , a n d R . K . T h a u e r . 1 9 8 3 . C a r b o n m o n o x i d e p r o d u c -
t i o n b y M e t h a n o b a c t e r i u m t h e r m o a u t o t r o p h i c u m . FEM S M i -
c r o b i o l . Le t t . 2 0 : 2 2 9 - 2 3 2 .
6 . Di x o n , M . , a n d E. C . W e b b . 1 9 5 8 . En z y m e s . Ac a d e m i c Pr e s s ,
I n c . , N e w Y o r k .
7 . Ei k m a n n s , B . , a n d R . K . T h a u e r . 1 9 8 4 . C a t a l y s i s o f a n i s o t o p i c
e x c h a n g e b e t we e n C O 2 a n d c a r b o x y l g r o u p o f a c e t a t e b y
M e t h a n o s a r c i n a b a r k e r i g r o wn o n a c e t a t e . Ar c h . M i c r o b i o l .
1 3 8 : 3 6 5 - 3 7 0 .
8 . Fe r g u s o n , T . J. , a n d R . A. M a h . 1 9 8 3 . Ef f e c t o f H2 - C O 2 o n
m e t h a n o g e n e s i s f r o m a c e t a t e o r m e t h a n o l i n M e t h a n o s a r c i n a
s p p . Ap p l . En v i r o n . M i c r o b i o l . 4 6 : 3 4 8 - 3 5 5 .
9 . Ha m m e l , K . E. , K . L. C o r n we l l , G . B . Di e k e r t , a n d R . K .
T h a u e r . 1 9 8 4 . Ev i d e n c e f o r a n i c k e l - c , o n t a i n i n g c a r b o n m o n o x -
i d e d e h y d r o g e n a s e i n M e t h a n o b r e v i b a c t e r a r b o r i p h i l i c u s . J.
B a c t e r i o l . 1 5 7 : 9 7 5 - 9 7 8 .
1 0 . Hi p p e , H. , D. C a s p a r i , K . f i e b i g , a n d G . G o t t s c h a l k . 1 9 7 9 .
Ut i l i z a t i o n o f t r i m e t h y l a m i n e a n d o t h e r N - m e t h y l c o m p o u n d s
f o r g r o wt h a n d m e t h a n e f o r m a t i o n b y M e t h a n o s a r c i n a b a r k e r i .
Pr o c . N a t l . Ac a d . S c i . U. S . A. 7 6 : 4 9 4 4 9 8 .
1 1 . Hu s e r , B . A. , K . W u h r m a n , a n d A. J. B . Z e h n d e r . 1 9 8 2 . M e t h -
a n o t h r i x s o e h n g e n i i g e n . n o v . , s p . , n o v . , a n e w a c e t o t r o p h i c
n o n - h y d r o g e n - o x i d i z i n g m e t h a n e b a c t e r i u m . Ar c h . M i c r o b i o l .
1 3 2 : 1 - 9 .
1 2 .
K e n e a l y , W . , a n d J. G . Z e i k u s . 1 9 8 1 . I n f l u e n c e o f c o r r i n o i d
a n t a g o n i s t s o n
m e t h a n o $ e n
m e t a b o l i s m . J. B a c t e r i o l .
1 4 6 : 1 3 3 - 1 4 0 .
1 3 .
K e n e a l y ,
W .
R . , a n d J. G . Z e i k u s . 1 9 8 2 . O n e - c a r b o n m e t a b o l i s m
i n
m e t h a n o g e n s : e v i d e n c e f o r s y n t h e s i s o f a t wo - c a r b o n c e l l u l a r
i n t e r m e d i a t e a n d u n i f i c a t i o n o f c a t a b o l i s m a n d a n a b o l i s m i n
M e t h a n o s a r c i n a b a r k e r i . J. B a c t e r i o l . 1 5 1 : 9 3 2 - 9 4 1 .
1 4 .
K n o wl e s ,
C . J. 1 9 7 6 .
M i c r o o r g a n i s m s a n d c y a n i d e . B a c t e r i o l .
R e v . 4 0 : 6 5 2 - 6 8 0 .
1 5 .
K r z y c k i , J. A. , a n d J. G . Z e i k u s . 1 9 8 4 . C h a r a c t e r i z a t i o n a n d
p u r i f i c a t i o n o f c a r b o n m o n o x i d e d e h y d r o g e n a s e f r o m M e t h -
a n o s a r c i n a b a r k e r i . J. B a c t e r i o l . 1 5 8 : 2 3 1 - 2 3 7 ,
1 6 . K u h n , W . , K . Fi e b i g , H. Hi p p e , R . A. M a h , B . A. Hu s e r , a n d G .
G o t t s c h a l k . 1 9 8 3 . Di s t r i b u t i o n o f c y t o c h r o m e s i n
m e t h a n o g e n i c
b a c t e r i a . FEM S M i c r o b i o l . Le t t . 2 0 : 4 0 7 - 4 1 0 .
1 7 . M a h , R . A. , M . R . S m i t h , T . Fe r g u s o n , a n d S . Z i n d e r . 1 9 8 1 .
M e t h a n o g e n e s i s f r o m H2 - C O 2 , m e t h a n o l a n d a c e t a t e b y M e t h -
a n o s a r c i n a , p . 1 3 1 - 1 4 2 . I n Ho wa r d Da l t o n ( e d . ) , Pr o c e e d i n g s o f
t h e 3 r d I n t e r n a t i o n a l S y m p o s i u m o n M i c r o b i a l G r o wt h o n C - 1
C o m p o u n d s . He y e d e n a n d S o n , Lt d . , S h e f f i e l d , En g l a n d .
1 8 .
Pe z a c k a , E. , a n d H. G , W o o d . 1 9 8 4 . T h e s y n t h e s i s o f a c e t y l -
C o A
b y C l o s t r i d i u m t h e r m o a c e t i c u m f r o m c a r b o n m o n o x i d e ,
h y d r o g e n , c o e n z y m e A a n d m e t h y l t e t r a h y d r o f o l a t e . Ar c h . M i -
c r o b i o l . 1 3 7 : 6 3 - 6 9 .
1 9 . R o m e s s e r , J. A. , a n d W . E. B a l c h . 1 9 8 0 . C o e n z y m e M :
p r e p a -
r a t i o n a n d a s s a y . M e t h o d s En z y m o l . 6 7 : 5 4 5 - 5 5 2 .
2 0 . S m i t h , M . R . 1 9 8 3 . R e v e r s a l o f 2 - b r o m o e t h a n e s u l f o n a t e i n h i b i -
t i o n o f m e t h a n o g e n e s i s o f M e t h a n o s a r c i n a s p . J. B a c t e r i o l .
1 5 6 : 5 1 6 - 5 2 3 .
2 1 . S m i t h , M . R . , a n d R . A. M a h . 1 9 7 8 . G r o wt h a n d m e t h a n o g e n -
e s i s b y M e t h a n o s a r c i n a s t r a i n 2 2 7 o n a c e t a t e a n d m e t h a n o l .
Ap p l . En v i r o n . M i c r o b i o l . 3 6 : 8 7 0 - 8 7 9 .
2 2 . S m i t h , M . R . , a n d R . A. M a h . 1 9 8 0 . Ac e t a t e a s s o l e c a r b o n a n d
e n e r g y s o u r c e f o r g r o wt h o f M e t h a n o s a r c i n a s t r a i n 2 2 7 . Ap p l .
En v i r o n . M i c r o b i o l . 3 9 : 9 9 3 - 9 9 9 .
2 3 . S t u p p e r i c c h , E. , a n d G . Fu c h s . 1 9 8 3 . Au t o t r o p h i c a c e t y l c o e n -
z y m e A s y n t h e s i s i n v i t r o f r o m t wo C O 2 i n M e t h a n o b a c t e r i u m .
FEB S Le t t . 1 5 6 : 3 4 5 - 3 4 8 .
2 4 . S t u p p e r i c h , E. , a n d G . Fu c h s . 1 9 8 4 . Au t o t r o p h i c s y n t h e s i s o f
a c t i v a t e d a c e t i c a c i d f r o m t wo C O 2 i n M e t h a n o b a c t e r i u m t h e r -
m o a u t o t r o p h i c u m . I . Pr o p e r t i e s o f i n v i t r o s y s t e m . Ar c h . M i -
c r o b i o l . 1 3 9 : 8 - 1 3 .
2 5 . S t u p p e r i c h , E. , a n d G . Fu c h s . 1 9 8 4 . Au t o t r o p h i c s y n t h e s i s o f
a c t i v a t e d a c e t i c a c i d f r o m t wo C O 2 i n M e t h a n o b a c t e r i u m t h e r -
m o a u t o t r o p h i c u m . I I . Ev i d e n c e f o r d i f f e r e n t o r i g i n s o f a c e t a t e
c a r b o n a t o m s . Ar c h . M i c r o b i o l . 1 3 9 : 1 4 - 2 0 .
2 6 . W o l f e , R . S . 1 9 8 0 . R e s p i r a t i o n i n m e t h a n o g e n i c b a c t e r i a , p .
1 6 1 - 1 8 6 . I n C . J. K n o wl e s ( e d . ) , Di v e r s i t y o f b a c t e r i a l r e s p i r a -
t o r y s y s t e m s , v o l . I . C R C Pr e s s , I n c . , B o c a R a t o n , Fl a .
2 7 . Z e i k u s , J. G . 1 9 8 2 . M i c r o b i a l i n t e r m e d i a r y m e t a b o l i s m i n a n -
a e r o b i c d i g e s t i o n , p . 2 3 - 3 5 . I n D. Hu g h e s e t a l . , ( e d . ) , An -
a e r o b i c d i g e s t i o n , 1 9 8 1 . El s e v i e r B i o m e d i c a l Pr e s s , Am s t e r d a m .
2 8 . Z i n d e r , S . H. , a n d R . A. M a h . 1 9 7 9 . I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a -
t i o n o f a t h e r m o p h i l i c s t r a i n o f M e t h a n o s a r c i n a u n a b l e t o u s e
H2 - C O 2 f o r m e t h a n o g e n e s i s . Ap p l . En v i r o n . M i c r o b i o l . 3 8 :
9 9 6 - 1 0 0 8 .
V O L. 1 6 2 , 1 9 8 5

o
n

A
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