18/8/2014 Biochimie regulation metabolique Texte et corrige travaux diriges Enseignement et recherche Biochimie Emmanuel Jaspard Universite Angers

bioch
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Travaux dirigs de biochimie et de rgulation mtabolique
1 Jaime

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A.
Transduction
du signal
1. Dcrire
en quelques
phrases
avec une
vingtaine de
mots-cls la
figure ci-
contre.
2. Faire un tableau dcrivant les diffrents types de rcepteurs et leurs principales caractristiques.
3. Expliquer la multiplicit des cibles compte-tenu des possibilits de complexes [rcepteur coupl une protine G - protines
G].
B. Mtabolisme du glucose - contrle allostrique de la glycolyse
1. Dtailler le rle de linsuline, de GLUT4 et du glucagon dans la rgulation de la glycolyse.
2. Slectionner dans la liste suivante de molcules et de voies mtaboliques (mentionnes dans nimporte quel ordre), celles
qui sont susceptibles dintervenir dans l[homostasie du glucose / mtabolisme nergtique arobie] :
glycogne synthtase, F1,6BP, ATP, photosynthse, mitochondrie, Ser/Thr protines phosphatases, sphingomyline, glycogne,
histone, protine G, adnylate cyclase, phospholipase A2, citrate, PFK1, thrombine, F2,6BP, enzyme de la noglucognse,
rcepteur activit tyrosine kinase, cytochrome C, oxaloactate, glucagon, cytokine, AMP, transducine, CDPK, actylCoA, ure,
ATP synthase, Ca2+, AMPc, inositol 3-phosphate, pyruvate kinase, adrnaline, PFK2, glycolyse, entre/sortie du glucose libre,
NADH, calmoduline, diacylglycrol, pinphrine, FADH2, phosphatidyl 4,5-bisphosphate, protasome 19S, glycogne
phosphorylase, cycle de Krebs, domaine DBD doigt de zinc , pyruvate, cystine, actyl-CoA, glucose 6 phosphate,
cadhrine, transporteur GLUT4, ARN polymrase, insuline, nitrate rductase, MAP kinase p38, rcepteur coupl une protine
G, ubiquitine, protine kinase A, hmoglobine, hexokinase, transaminase, glucose, fer, muscle.
3. Faire un schma de l[homostasie du glucose / mtabolisme nergtique arobie] sur la base des mots retenus dans cette
liste.
2. Les courbes ci-dessous reprsentent la vitesse de la raction catalyse par la PFK1 en fonction de la concentration dATP,
du citrate et du NADH.
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a. Sur la base du schma prcdent, interprtez lallure des courbes obtenues pour lATP et le citrate.
b. Etablir un lien entre lactivit de la PFK1 et la concentration du NADH (glycolyse et cycle de Krebs).
C. Dshydrognase NAD(P)
+
.
1. Aller au NCBI. Rechercher les squences de la lactate dshydrognase. Attention : anglais, abrviation, Boolens.
Dans "Advanced", affinez la recherche avec EC 1.1.1.27 dans les rsultats prcdents.
2. A quoi correspond EC 1.1.1.27 ? Chercher un fichier correspondant dans la base de donnes Uniprot.
3. Quest-ce que FASTA (squence) et FASTA (programme) ?
4. Faire une recherche de squences homologues et/ou similaires de la lactate dshydrognase de lhomme avec BLAST. Les
chaines sont-elles identiques ?
5. Effectuer une prdiction de structures secondaires avec un outil appropri. Essayer de reprer les acides amins du Pli
Rossmann en sappuyant sur les donnes du fichier Uniprot.
Exemples doutils :
BLAST : recherche dhomologies locales entre squences
Multalin, ClustalW : alignement global de squences
Jpred - NPSA - CFSSP - GOR - Hhpred : prdiction de structures secondaires
D. CaM kinases II et protines kinases calcium dpendantes
Comparez les structures et les modes de fonctionnement de la CAM kinase II et de la CDPK en indiquant clairement les
points communs et leurs spcificits.

E. Calmoduline
1. Voici un exemple de syntaxe PROSITE : <A-x-[ST](2)-x(0,1)-{V}
Elle se lit : Ala en position N-terminale puis n'importe quel acide amin puis 2 fois (Ser ou Thr) suivie ou non par n'importe
quel acide amin puis n'importe quel acide amin sauf Val.
a. Ecrire la squence suivante dans cette syntaxe : 4 Ser puis (Asp ou Ser) puis (Asp ou Glu) puis n'importe quel acide amin
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puis (Asp ou Glu) puis (Glu ou Gly ou Val) puis 1 7 fois n'importe quel acide amin puis (Glu ou Gly) puis 1 2 fois n'importe
quel acide amin puis 4 fois (Arg ou Lys).
b. Ecrire la squence consensus du motif de fixation du calcium (motif "EF-hand") dans la syntaxe PROSITE.
2. Effectuer une recherche de squence de la calmoduline de lhomme au NCBI.
3. Effectuer une recherche de squences homologues ou similaires avec PHI-Blast partir de cette squence de calmoduline et
du motif de fixation du calcium.
4. Emettre une hypothse pour expliquer que la calmoduline reconnait autant de cibles distinctes bien quil y ait une trs forte
homologie de squence en acides amins entre les calmodulines.
F. Interfrence ARN
Cet exercice ncessite de lire le cours
Interfrence ARN.
Source : Napoli et al. (1990) Plant Cell 2, 279 - 289

Source figures: Napoli et al. (1990) Plant Cell 2, 279 - 289
1. Analyser ces rsultats. Quel phnomne traduisent-ils ?
2. Trouver la squence dun siRNA dans la squence de lARN messager codant la vimentine de lhomme : Homo sapiens vimentin
mRNA, NM_003380.
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> gi|240849334|ref|NM_003380.3| Homo sapiens vimentin mRNA
GGGCGCGCCAGAGACGCAGCCGCGCTCCCACCACCCACACCCACCGCGCCCTCGTTCGCC
TCTTCTCCGGGAGCCAGTCCGCGCCACCGCCGCCGCCCAGGCCATCGCCACCCTCCGCAG
CCATGTCCACCAGGTCCGTGTCCTCGTCCTCCTACCGCAGGATGTTCGGCGGCCCGGGCA
CCGCGAGCCGGCCGAGCTCCAGCCGGAGCTACGTGACTACGTCCACCCGCACCTACAGCC
TGGGCAGCGCGCTGCGCCCCAGCACCAGCCGCAGCCTCTACGCCTCGTCCCCGGGCGGCG
TGTATGCCACGCGCTCCTCTGCCGTGCGCCTGCGGAGCAGCGTGCCCGGGGTGCGGCTCC
TGCAGGACTCGGTGGACTTCTCGCTGGCCGACGCCATCAACACCGAGTTCAAGAACACCC
GCACCAACGAGAAGGTGGAGCTGCAGGAGCTGAATGACCGCTTCGCCAACTACATCGACA
AGGTGCGCTTCCTGGAGCAGCAGAATAAGATCCTGCTGGCCGAGCTCGAGCAGCTCAAGG
GCCAAGGCAAGTCGCGCCTGGGGGACCTCTACGAGGAGGAGATGCGGGAGCTGCGCCGGC
AGGTGGACCAGCTAACCAACGACAAAGCCCGCGTCGAGGTGGAGCGCGACAACCTGGCCG
Les rgles de conception dun siRNA partir dune squence dARM messager sont :
Targets should be located 50-100 nt downstream of the start codon (ATG).
Search for sequence motif AA(N19)TT or NA(N21), or NAR(N17)YNN, where N is any nucleotide, R is purine (A, G) and
Y is pyrimidine (C, U).
Target sequences should have a G+C content between 35-60%.
Avoid stretches of 4 or more nucleotide repeats.
Avoid 5'URT and 3'UTR, although siRNAs targeting UTRs have been shown to successfully induce gene silencing.
Avoid sequences that share a certain degree of homology with other related or unrelated genes.
3. Faire un schma de "filiation" des diffrents intermdiaires dans l'interfrence ARN (pri-miRNA, pre-miRNA ...).
Readseq : "biosequence conversion tool"
G. Noglucognse et glycognolyse.
1. Quels sont les deux principaux points de contrle de la rgulation de la noglucogense et quelles sont les quatre enzymes
spcifiques de cette voie ?
2. De quelle faon la cafine agit-elle pour stimuler la glycognolyse ?

H. Reconstruction mtabolique - approche bioinformatique de la rgulation du mtabolisme.
Cet exercice ncessite de lire le cours Mtabolomique et de tlcharger les articles mentionns ci-dessous (accessibles en ligne
via les liens).
1. Modle gnral et stratgies
Sur la base des articles suivants, faire un schma de la dmarche gnrale de la reconstruction mtabolique l'chelle d 'un
gnome.
a. Article : Lee et al. (2008) "Dynamic Analysis of Integrated Signaling, Metabolic, and Regulatory Networks" PLoS Comput. Biol.
5
Voir aussi : "Supporting information - Text S1" - "Prototypic Integrated System"
b. Article : Durot et al. (2009) "Genome-scale models of bacterial metabolism: reconstruction and applications" FEMS Microbiol.
Rev. 33, 164 190
Voir en particulier :
"Fig. 1 - Genome-scale modeling of metabolism"
"Table 4 : Existing genome-scale metabolic models for bacterial organisms"
c. Article : Oberhardt et al. (2008) "Genome-Scale Metabolic Network Analysis of the Opportunistic Pathogen Pseudomonas
aeruginosa PAO1" J Bacteriol. 190, 2790 - 2803
Voir en particulier :
"Fig. 2 - Schematic of the network reconstruction process for iMO1056
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"Fig. 3 - S matrix"
2. Base de donnes de modles : "Biomodels" - EBI
Aller : BioModels Database - A Database of Annotated Published Models
Cliquer sur le lien : "Browse models using GO"
Ouvrir l'arborescence : "GO:0008150 biological_process (422)"
Ouvrir l'arborescence : "GO:0023052 signalling (169)"
Ouvrir l'arborescence : "GO:0023051 regulation of signalling (63)"
Ouvrir l'arborescence : "GO:0009966 regulation of signal transduction (53)"
Ouvrir l'arborescence : "GO:0008277 regulation of G-protein coupled receptor protein signaling
pathway (3)"
Ouvrir l'arborescence : "GO:0045745 positive regulation of G-protein coupled receptor
protein signaling pathway (1)"
Partie droite de la fentre : cliquer sur le modle BIOMD0000000145 -
Wang2007_ATP_induced_Ca_Oscillator
a. Quel type de signal ce modle essaye-t-il
de modliser ?
b. Faire le lien entre les informations
contenues dans l'onglet "Math" et le modle
dcrit ci-contre.
Source : Wang et al. (2007)
c. Dans le menu droulant "Actions" :
Choisir : "View Bitmap Recation Graph". Faire le lien entre le modle obtenu et les informations contenues dans l'onglet
"Math".
Choisir : "View Dynamic Reaction Graph" (Applet java) pour visualiser le rseau d'interactions. Les diffrentes
interactions sont obtenues en cliquant sur les composs du modle.
Choisir : "BioModels Online Simulation" pour visualiser la simulation de la cintique d'volution du modle.
d. Quelle information obtient-on dans l'onglet Physical entities ?
3. Exercice d'application
Faire le schma de l'ensemble des ractions associes la matrice de stoechiomtrie S suivante :
R1 R2 R3 R4 R5 R6
M1 -1 0 0 0 0 0
M2 +1 -1 -1 0 0 0
M3 0 +1 0 -1 +1 0
M4 0 0 +1 +1 -1 -1
M4 0 0 0 0 0 +1
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I. Justifier le choix de la ou des rponse(s).
1. a) l'ATP et le GTP sont "activs" par phosphorylation - b) l'ATP est "activ" et le GTP est "inactiv" par phosphorylation
- c) l'ATP est inactiv et le GTP est inactiv par hydrolyse - d) l'ATP est activ et le GTP inactiv par hydrolyse.
2. L'augmentation de la concentration intracellulaire du calcium : a) rsulte de l'activation des pompes calcium - b) peut se
faire par libration du calcium partir du R.E. - c) est implique dans la phosphorylation des tyrosines.
3. La protine G htrotrimrique : a) contient 3 types de sous-unit - b) une fois active, diffuse librement le long de la
membrane plasmique - c) amplifie la cascade intracellulaire de signalisation - d) peut-tre associe au rcepteur b-
adrnergique.
4. Cascade de la signalisation dans le photorcepteur de la rtine : a) l'absorption des photons ferme des canaux sodiques ce
qui induit une dpolarisation membranaire du rcepteur - b) la protine G du photorcepteur s'appelle la calmoduline - c) la
protine G agit, via une phosphodiestrase sur le GMPc qui est le second messager du photorcepteur.
5. La phospholipase C : a) est un rcepteur 7 domaines transmembranaires - b) est active par la sous-unit a de la protine
associe au GDP - c) transforme l'IP3 en inositol phospholipidique et en DAG - d) permet la libration d'un second messager et
l'activation d'une protine kinase - e) est implique dans la voie de transduction des rcepteurs 7 domaines
transmembranaires.
6. L'AMP cyclique : a) est un second messager qui peut activer les protines kinases - b) l'AMPc phosphodiestrase augmente
la synthse de l'AMPc - c) l'adnylate cyclasse diminue le taux d'AMPc - d) permet la synthse d'ATP et donc augmente
l'activit des protines kinases.
7. L'activation du rcepteur de la rhodopsine: a) aboutit la formation de GMPc et la fermeture de canaux sodiques - b)
aboutit la formation de GMPc partir de GTP par une guanylate cyclase - c) aboutit l'activation de la protine G de type
Gt - d) aboutit l'activation de la GMPc phosphodiestrase et la formation de GMP - d) aboutit la diminution du taux de
GMPc et augmentation de la concentration du sodium dans le cytoplasme.
8. Les rcepteurs nuclaires : a) sont activs par des protines G - b) sont imports vers le cytoplasme en prsence de
l'hormone - c) sont des facteurs de transcription en prsence de l'hormone - d) fixent l'ADN via leur domaine en doigt de zinc
en prsence de l'hormone - e) sont transmembranaires et transports dans le noyau en prsence de leurs ligands.
9. Le doigt de zinc est une partie de la structure : a) d'un site de liaison intracellulaire d'un RCPG - b) de la sous-unit a d'une
protine G - c) du domaine de fixation l'ADN d'un rcepteur nuclaire - d) du domaine d'activation d'un rcepteur coupl
une activit enzymatique.
10. La transduction d'un signal extracellulaire mettant en jeu l'adnylyl cyclase se droule en plusieurs tapes : a) hydrolyse du
GTP en GDP par les protines G - b) fixation du mdiateur chimique (ligand) sur son rcepteur spcifique et changement de
conformation du rcepteur - c) hydrolyse de l'ATP et cyclisation de l'AMP par l'adnylyl cyclase - d) remplacement du GDP
par du GTP sur la protine G (change) - e) formation du complexe protine G-adnylyl cyclase - f) activation d'une cascade de
phosphorylation.
Dans quel ordre chronologique se droulent les tapes ?
a) 1, 2, 5, 3, 6, 4
b) 2, 1, 5, 3, 6, 4
c) 2, 1, 5, 3, 4, 6
d) 2, 4, 6, 3, 1, 5
e) 2, 4, 5, 3, 6, 1
11. Aprs stimulation de cellules en culture par l'adrnaline, on observe une augmentation de la concentration du calcium libre
dans le cytosol. On peut penser que : a) ces cellules n'ont pas de calmoduline - b) toutes les S/T protines kinases cytosoliques
peuvent tre actives - c) une activation des pompes calcium peut s'ensuivre - d) il y aura une dsensibilisation de tous les
RCPG trimriques.
12 : Quelle est la rponse de lorganisme lorsque la glycmie augmente ? a) Le glucagon induit la libration du glucose par les
cellules hpatiques - b) Le glucagon induit le stockage du glucose sous forme de glycogne dans les cellules hpatiques et
musculaires et sous forme de triglycrides dans les cellules adipeuses - c) Linsuline induit la libration du glucose par les
cellules hpatiques - d) Linsuline induit le stockage du glucose sous forme de glycogne dans les cellules hpatiques et
musculaires et sous forme de triglycrides dans les cellules adipeuses.
13. Question la plus difficile : Posez une question pertinente sur la rgulation du mtabolisme.
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[Questions inspires des TD de Biologie cellulaire / Signalisation - Facult de mdecine Bichat & Lariboisire]
J. Rcepteurs et insuline
1. Aller la base de donnes ddies aux RCPG : "GPCRDB : Information system for G protein-coupled receptors".
Onglet "Search" => Fentre "Protein search" => champs "Description" => taper "serotonin".
Exercice d'alignement de squences de la famille des rcepteurs de la srotonine de type 1A.
Cliquer sur le lien "Serotonin type 1a"
Cliquer sur le lien "Alignments & Analyses", puis "Download alignments (fasta)". Copier quelques squences au format
FASTA.
Aller un logiciel d'alignement de squences (exemple : Multalin).
Coller les squences et lancer le programme.
Remarques :
l'onglet "MView alignment" permet de visualiser directement des alignements.
l'onglet "JalView multiple sequence alignment" ncessite l'activation de Java dans le navigateur.
Tirer des conclusions quant la nature des acides amins conservs.
2. Recherches de squences de rcepteurs.
a. Aller Uniprot.
Taper : "ENSRNOP00000013618" dans la fentre "Query".
Cliquer sur le lien G3V7B9 dans la colonne "Entry".
Dcripter les informations.
b. Rcuprer le fichier : "FastaRecepMamm".
Effectuer un alignement multiple. Tirer des conclusions.
3. Insuline.
a. Aller au NCBI. Effectuer une recherche de rcepteur de l'insuline de l'homme. Quels mots-cls faut-il employer ?
Analyser le contenu rsultat du fichier dont le N d'accession est : AAA59452.
b. Effectuer une recherche avec BLAST.
Comparer la figure "Putative conserved domains detected" celle du cours sur le rcepteur de l'insuline.
c. Rechercher les fichiers dont les N d'accession sont les suivants :
AAA59179
NP_000198
NP_001008996
Q8HXV2
P30407
AEG19452
ABB89743
ABB89749
ABI63346
Effectuer un alignement multiple. Tirer des conclusions.