PROGRAMA DE PS-GRADUAO STRICTOSENSU DO INSTITUTO DE
ENSINO E PESQUISA DO GRUPO SANTA CASA DE BELO HORIZONTE
MARA LVIA CARVALHO DUFFLES TEIXEIRA
EFEITO DO LASER DE BAIXA INTENSIDADE NA PREVENO DE ADERNCIAS ABDOMINAIS E CICATRIZAO DA PELE APS PERITONIECTOMIA EM MODELO EXPERIMENTAL
BELO HORIZONTE MINAS GERAIS 2012 II
MARA LVIA CARVALHO DUFFLES TEIXEIRA
EFEITO DO LASER DE BAIXA INTENSIDADE NA PREVENO DE ADERNCIAS ABDOMINAIS E CICATRIZAO DA PELE APS PERITONIECTOMIA EM MODELO EXPERIMENTAL
Dissertao apresentada ao Ncleo de Ps- graduao e Pesquisa da Santa Casa de Belo Horizonte como requisito parcial para a obteno do ttulo de Mestre em Medicina e Biomedicina.
Orientador: Prof. Dr. Luiz Ronaldo Alberti Coorientador: Prof. Dr. Leonardo de Souza Vasconcellos
BELO HORIZONTE MINAS GERAIS 2012
III
MARA LVIA CARVALHO DUFFLES TEIXEIRA
EFEITO DO LASER DE BAIXA INTENSIDADE NA PREVENO DE ADERNCIAS ABDOMINAIS E CICATRIZAO DA PELE APS PERITONIECTOMIA EM MODELO EXPERIMENTAL
Dissertao apresentada ao Ncleo de Ps-graduao e Pesquisa da Santa Casa de Belo Horizonte como requisito parcial para a obteno do ttulo de Mestre em Medicina e Biomedicina.
Data da defesa: ____/____/____ Comisso Examinadora formada pelos Professores:
Dr. Geraldo Magela Gomes da Cruz
Dr. Lvio de Barros Silveira
Prof. Dr. Luiz Ronaldo Alberti Orientador
Prof. Dr. Leonardo de Souza Vasconcellos Coorientador IV
Ao meu marido, Cludio, pelo incentivo e companheirismo durante todos os momentos desta caminhada. Aos meus filhos, Gabriel, Thiago e Isabela, que compreenderam minhas ausncias e falhas durante todo este processo. Aos meus pais, por tudo que fizeram por mim, para que eu conseguisse atingir esta etapa profissional. V
AGRADECIMENTOS
Ao meu Orientador, Dr. Luiz Ronaldo Alberti, pela amizade, apoio e presena, que foram indispensveis ao desenvolvimento desta pesquisa. Ao meu Coorientador, Dr. Leonardo de Souza Vasconcellos, pela amizade e grande contribuio em todas as etapas desta pesquisa. Ao Dr. Marcus Vinicius Lucas Ferreira, pesquisador do Centro de Tecnologia Biomdica (CTBio-UFMG), pela orientao nos estudos do laser de baixa intensidade. Ao colega Tharcsio G de Oliveira, cirurgio geral, pelo auxlio nas cirurgias experimentais. mdica veterinria, Nelma Maria da Silva, pela orientao sobre procedimentos anestsicos em animais. Ao mdico anatomopatologista, Maurcio Buzelin Nunes, do Departamento de Anatomia Patolgica da Santa Casa de Belo Horizonte, pelas anlises histolgicas. Sra. Ivone Marinho da Cruz e ao Professor Marcos Cludio Moreira, ambos do Departamento de Patologia da Faculdade de Cincias Mdicas de Minas Gerais, pela confeco das lminas histolgicas. Aos Srs. Marcelo Moreira de Jesus e Derlim Severiano de Paula, do Ncleo de Experimentao Animal da Faculdade de Medicina da UFMG, pelos cuidados com os animais. Ao Professor Marcos Rodrigues Duffles Teixeira, pela correo ortogrfica. A todos os funcionrios do Centro de Ps-Graduao do Instituto de Ensino e Pesquisa da Santa Casa de Belo Horizonte (IEP), que demonstraram disponveis e acessveis sempre que necessitei.
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SUMRIO AGRADECIMENTOS........................................................................................ - V - SUMRIO ........................................................................................................ - VI - LISTA DE TABELAS ..................................................................................... - VIII - LISTA DE ILUSTRAES .............................................................................. - IX - LISTA DE GRFICOS ..................................................................................... - XI - RESUMO ........................................................................................................ - XII - 1. INTRODUO .............................................................................................. - 1 - 1.1 ADERNCIAS ............................................................................................ - 1 - 1.2 LASER ........................................................................................................ - 6 - 2. OBJETIVOS ................................................................................................. - 9 - 3. MTODO .................................................................................................... - 10 - 3.1. TICA ...................................................................................................... - 10 - 3.2. ANIMAIS .................................................................................................. - 10 - 3.3. DISTRIBUIO DOS ANIMAIS .............................................................. - 11 - 3.4. PR-OPERATRIO ................................................................................ - 11 - 3.5. TCNICA ANESTSICA ......................................................................... - 12 - 3.6. COLETA DE SANGUE ............................................................................ - 12 - 3.7 - PROCEDIMENTO OPERATRIO.......................................................... - 13 - 3.8. EQUIPAMENTO E PARMETROS DE UTILIZAO DO LASER DE BAIXA INTENSIDADE ................................................................................................ - 16 - 3.9. CUIDADOS GERAIS DURANTE A APLICAO DO LASER DE BAIXA INTENSIDADE NO PS- OPERATRIO ....................................................... - 19 - 3.10. NECROPSIA DOS ANIMAIS ................................................................. - 20 - VII
LISTA DE TABELAS Tabela 4.1.1 Presena de aderncia abdominal nos trs grupos no 14 dia ps- operatrio....................................................................................................................................... - 27 - Tabela 4.1.2 - Comparao entre nmero de aderncias abdominais entre animais dos trs grupos no 14 dia ps-operatrio.................................................................................................................. .- 29 - Tabela 4.1.3 - Comparao entre reas de aderncias abdominais entre animais dos trs grupos no 14 dia ps-operatrio.................................................................................................................. - 29 - Tabela 4.1.4 - Tenacidade das aderncias abdominais entre animais dos trs grupos no 14 dia ps- operatrio................................................................................................................................... - 31 - Tabela 4.1.5- Vascularizao das aderncias abdominais entre animais dos trs grupos no 14 dia ps-operatrio................................................................................................................................ - 32 - Tabela 4.1.6- Comparao entre a localizao das aderncias abdominais entre animais dos trs grupos no 14 dia ps-operatrio............................................................................................. - 32 - Tabela 4.2.1 - Limite de resistncia trao da pele entre animais dos trs grupos no 14 dia ps- operatrio........................................................................................................................................ - 34 - Tabela 4.2.2- Limite de resistncia trao da parede e entre animais dos trs grupos no 14 dia ps- operatrio.............................................................................................................................. - 34 - Tabela 4.3.1 - Resultado do Leucograma (mdia e desvio padro) dosado nos animais dos trs grupos no pr-operatrio (D0) e no 4 dia ps-operatrio (D4)....................................................... - 35 - Tabela 4.3.2- Intensidade do processo inflamatrio na cicatriz cirrgica entre os animais dos trs grupos no 14 dia ps-operatrio................................................................................................... - 36 - Tabela 4.3.3- Intensidade do processo inflamatrio nas aderncias abdominais entre animais dos trs grupos no 14 dia ps-operatrio.................................................................................................... - 37 -
IX
LISTA DE ILUSTRAES Figura 1 - Identificao dos animais (A) e gaiolas (B). ..................................................................... - 11 - Figura 2 Coleta de sangue atravs da dissecao e puno da veia femoral (seta). Coleta realizada no pr-operatrio (D0) e repetida no 4 dia ps-operatrio (D4) ...................................................... - 12 - Figura 3 Tonsurotomia realizada na regio anterior do trax e abdome. ...................................... - 13 - Figura 4 Laparotomia mediana longitudinal (A), abertura e afastamento por planos das bordas da parede abdominal do coelho, (B), molde de plstico (seta), medindo 3 cm x 1 cm, utilizado para padronizao da retirada de fragmento de peritnio da parede abdominal do coelho (C) e aparncia da parede abdominal (seta) aps a retirada do fragmento de peritnio parietal (D). ....................... - 14 - Figura 5 Aplicao perioperatria do laser de baixa intensidade na lateral direita (A) e esquerda (B) da parede abdominal do coelho, logo aps a peritoniectomia. ......................................................... - 15 - Figura 6 Sutura da ferida cirrgica em planos: aponeurose e peritnio parietal e pele, com nylon 3-0. ........................................................................................................................................................... - 15 - Figura 7 Aparelho Twin Flex Evolution Laser , InGaIP, 658 nm, vermelho. ................................ - 17 - Figura 8 Proteo da caneta laser com filme de PVC incolor (seta). ............................................ - 18 - Figura 9 culos de proteo para aplicao do laser de baixa intensidade. ................................ - 18 - Figura 10 Aplicao diria do laser de baixa intensidade no ps-operatrio, em quatro pontos distintos, dois em cada lado da resseco peritoneal, com base no molde plstico padro, durante os quatro primeiros dias de ps-operatrio. .......................................................................................... - 19 - Figura 11 Esquema da inciso em U invertido na parede abdominal anterior (A). Exame da cavidade abdominal atravs da inciso em forma de U invertido (B). ........................................... - 20 - Figura 12 Contagem do nmero de aderncias abdominais. ........................................................ - 22 - Figura 13 Medio da superfcie de contato entre as estruturas (A) e da espessura das aderncias (B). ..................................................................................................................................................... - 22 - Figura 14 Mquina universal de ensaio da marca Kratos . ......................................................... - 24 - Figura 15 - Confeco do corpo de prova com molde plstico (*) medindo 8 cm x 2,5 cm. Indicao da posio da cicatriz cirrgica (seta). ................................................................................................... - 24 - Figura 16 Fragmento da pele sob trao. Observar cicatriz na parte central (seta). .................... - 25 - Figura 17 Exame da cavidade abdominal constatando ausncia de aderncia abdominal em animais n. 2 e 5 do GL2 (Grupo laser dose 3,6 J), respectivamente (A e B). Presena de aderncia abdominal entre parede abdominal e intestino grosso no coelho n. 4 do GC (Grupo Controle) (C) e no coelho n. 6 do GL1 (Grupo laser dose 0,2 J) (D). ............................................................................. - 28 - Figura 18 Medio da superfcie de contato entre estruturas aderidas (A), coelho nmero dois do GC (Grupo Controle) e da espessura das aderncias (B), coelho nmero trs do GC (Grupo Controle). ........................................................................................................................................... - 30 - X
Figura 19 - Aderncias abdominais presentes no coelho nmero cinco do CG (Grupo Controle) (seta) classificadas como firme (necessitou tripsia para ser desfeita) (A) e frouxa (sem necessidade de tripsia para ser desfeita) presente no coelho nmero trs do GL1 (Grupo laser dose 0,2 J ) (B). ... - 31 - Figura 20 - Aderncia abdominal entre parede e intestino grosso (seta) no coelho nmero dois do GC (Grupo Controle) (A) e parede e omento (seta) no coelho nmero sete do GL2 (Grupo laser dose 3,6 J) (B). ................................................................................................................................................. - 33 - Figura 21 Microscopia da cicatriz cirrgica do coelho nmero dois, Grupo GL1 (Grupo laser dose 0,2 J). Observar presena de processo inflamatrio leve/moderado (setas) com predomnio de polimorfonucleares (A) Aumento de 40x; (B) Aumento de 100x. Corado com hematoxilina e eosina. ... - 36 - Figura 22 - Microscopia da aderncia abdominal do coelho nmero dois, Grupo GL1 (Grupo laser dose 0,2 J). Observar a presena de processo inflamatrio leve/moderado (setas) com predomnio de clulas polimorfonucleares. (A) Aumento de 40x; (B) Aumento de 100x. Corado com hematoxilina e eosina. ............................................................................................................................................... - 38 - Figura 23 - Microscopia da aderncia abdominal do coelho nmero 18, Grupo GL2 (Grupo laser dose 3,6 J). Observar presena de vascularizao (setas). (A) Aumento de 40x; (B) Aumento de 100x. Hematoxilina e eosina. ...................................................................................................................... - 39 -
XI
LISTA DE GRFICOS Grfico 1 - Resumo das avaliaes quantitativas das aderncias encontradas nos trs grupos. ... - 30 - Grfico 2 - Resumo das avaliaes quanlitativas das aderncias encontradas nos trs grupos. .... - 33 -
XII
RESUMO Introduo: As aderncias abdominais so frequentes aps cirurgias e so causas de obstruo intestinal, dor abdominal crnica e infertilidade. Sua preveno permanece um desafio para os profissionais da rea da sade, principalmente no campo da cirurgia.
Objetivos: Avaliar os efeitos da aplicao do laser de baixa intensidade na preveno de aderncias abdominais e cicatrizao da pele aps peritoniectomia.
Mtodo: Foram utilizados 24 coelhos machos da raa Nova Zelndia, com cerca de 2 meses de idade, distribudos aleatoriamente em 3 grupos (n=8): GC grupo controle, no submetido ao laser, GL1 grupo com aplicao do laser na dose de 0,2 J
e GL2 grupo com aplicao do laser na dose de 3,6 J. Em todos os animais foi realizada uma laparotomia mediana longitudinal e resseco bilateral de fragmento peritoneais medindo 3 cm x 1 cm. Os animais abordados com laser receberam uma aplicao, a cada 24 horas, a contar do horrio da cirurgia, por um perodo de quatro dias. No 14 dia de ps-operatrio os animais foram sacrificados e a formao de aderncia foi avaliada quantitativa e qualitativamente, atravs de uma laparotomia em forma de "U" invertido que permitiu ampla verificao da parede da cavidade abdominal e rgos. Foi realizada tambm a avaliao quantitativa e qualitativa do tecido cicatricial e da resposta inflamatria aguda pela anlise de PCR (protena C reativa) e leucograma. As diferenas foram consideradas significativas para p<0,05.
Resultados: A formao de aderncia foi observada em 100% dos coelhos dos grupos GC e GL1 e 37,5% dos animais do grupo GL2 (p<0,01). A avaliao da tenacidade e vascularizao das aderncias entre os grupos no apresentou diferena significativa. A comparao dos stios de localizao das aderncias, entre os grupos, mostrou que 100% das aderncias formadas no grupo GL2 no envolveram estruturas viscerais. J nos grupos GC e GL1, 72% e 83% das aderncias envolveram tais estruturas, respectivamente. A resistncia trao da XIII
pele entre os grupos no foi significativa (p=0,3106). As resistncias dos segmentos cutneos entre os grupos GL2 e GC no foram diferentes, sendo melhores que o GL1, (p=0,01). A intensidade do processo inflamatrio verificada por meio de leucograma, PRC e PCR ultrassensvel no apresentou diferena entre os grupos. A exame histolgica da ferida cirrgica e das aderncias formadas no apresentou diferena significativa quanto intensidade do processo inflamatrio. Concluso: A aplicao do laser de baixa intensidade na dose de 3,6 J, fluncia de 90 J/cm 2 , potncia de 40 mW e tempo de 90 s eficaz na reduo da formao, nmero e rea de aderncias abdominais em coelhos, sem modificar as caractersticas (tenacidade, vascularizao e inflamao) e sem comprometer a resistncia cicatricial ps-operatria da parede abdominal.
Descritores: Aderncias peritoneais, laser fotobioestimulao, irradiao laser de baixa potncia, terapia laser de baixa potncia, irradiao laser de baixa potncia, terapia laser, cicatrizao, coelho, resistncia trao, PCR.
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1. INTRODUO
1.1. ADERNCIAS
Aderncias so conexes anormais de rgos ou estruturas corporais. Essas conexes ou pontes podem se constituir de uma fina lmina de tecido conjuntivo, de uma lmina tecidual mais espessa contendo vasos sanguneos e nervos, ou representar um contato direto entre a superfcie de dois rgos. Aderncias podem ser encontradas na cavidade peritoneal, pericrdica, pleural, uterina, no interior de articulaes ou das cmaras oculares. Aderncias na cavidade abdominal so conhecidas como aderncias peritoneais, uma vez que o peritnio visceral ou parietal est sempre envolvido. Sua incidncia aps ato cirrgico elevada podendo ocorrer em at 93% das laparotomias. (1) Os avanos da medicina possibilitaram o aumento do nmero de cirurgias, mas as aderncias ainda ocorrem com elevada incidncia, mesmo tendo diminudo. (1) (2) (3) Segundo Ellis et al, 34,6% dos pacientes submetidos operao abdominal ou plvica foram readmitidos no hospital, uma mdia de 2,1 vezes, nos 10 anos subsequentes, devido s complicaes diretamente relacionadas s aderncias. Do total de readmisses (n=1.209), 5,7% foram relacionadas diretamente com a presena de aderncias, sendo que 3,8% (n=1.169) necessitaram de nova operao. Mais de 22% de todas as readmisses ocorreram no primeiro ano, aps o procedimento inicial. (2) Aderncias esto associadas ao risco de vida efetivo ou potencial, pois esto relacionadas a complicaes graves, como a obstruo intestinal. (1) (3) Tambm podem causar dor abdominal crnica (4) e infertilidade feminina. (5) Aderncia ps-operatria a causa mais prevalente de obstruo aguda e recidivante de intestino delgado, estando associada a taxas de mortalidade de at 15%. (6) (2) (7) (8)
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Moreira Jr e colaboradores (2005), avaliando pacientes atendidos em servio de urgncia com diagnstico de obstruo intestinal, no perodo de 1999 a 2000, concluram que as aderncias foram a causa mais comum de obstrues intestinais, correspondendo a 37,2% dos casos. A obstruo do intestino delgado foi causada por aderncias em 82,8% dos casos, sendo que desses, 62,66% necessitaram de cirurgia e 37,73%, de tratamento clnico, com 30,30% de enterectomias e 9,09% de leso acidental ao intestino delgado. Ocorreram oito bitos (sete casos operados e um caso tratado clinicamente). Nesse estudo, a doena aderencial foi a causa mais importante de ocluso intestinal e est associada morbimortalidade elevada, pois so tratados, quase sempre, em situaes de emergncia e em evoluo avanada. (9)
Vidal (2005) avaliou as principais causas de obstruo intestinal em pacientes admitidos no servio de urgncia do Hospital Governador Joo Alves Filho- Aracaj/SE e concluiu que a principal causa foi aderncia do delgado (44%). Dessas, 30% apresentaram-se complicadas e 10% dos pacientes faleceram. (10)
Segundo Wiseman (2007), muito comum pensar que somente as mulheres so propensas a aderncias, mas os homens no esto excludos do problema. Estatsticas americanas coletadas de altas hospitalares (CID9) a partir dos dados mais recentes disponveis (2001-2005), revelam que mais de 50 mil homens receberam alta hospitalar em 2005, com diagnstico de aderncias peritoneais, representando 28% do total desse diagnstico quando comparado com as altas femininas que representaram os outros 72%. Do total de homens hospitalizados em virtude das aderncias, 71,56% apresentaram obstruo intestinal. Mais de dois mil homens e mulheres morrem todo ano com diagnstico de obstruo intestinal causada por aderncia, representando 3% do total de altas com este diagnstico. Aderncia um problema clnico significante para homens e mulheres, sendo que os homens, com diagnstico de obstruo intestinal causada por aderncias, tm risco ligeiramente maior de morrer do que as mulheres, bem como permanecem hospitalizados por mais tempo, ocasionando um custo superior estimado em US$ 48.000,00. (11)
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A presena de aderncias tambm pode ser um complicador ao tratamento do cncer. A irradiao adjuvante ou neoadjuvante e por recidiva tumoral em tecidos alterados por cirurgia anterior tende maior morbidade uma vez que aderncias prvias fixam segmentos intestinais quando submetidas a altas doses de radiao subsequente. (12)
A administrao de quimioterapia intra-abdominal tambm pode ficar prejudicada na presena de aderncias. A distribuio da droga deve ser feita de forma uniforme, por toda a cavidade peritoneal, para otimizar e evitar a exposio excessiva em focos restritos. (12)
No Brasil, estima-se que os gastos do Sistema nico de Sade (SUS) e os impactos socioeconmicos oriundos da formao de aderncias e suas respectivas complicaes tambm sejam expressivos, embora no haja dados na literatura que contabilizem esses gastos. (9)
Trauma peritoneal (cortes, cauterizao, suturas, etc.), corpos estranhos, isquemia tecidual e infeces de vsceras abdominais so os principais fatores associados com a formao de aderncias ps-operatrias. (13)
A leso peritoneal causa uma reao inflamatria serossangunea que leva a depsitos de fibrina. Bem oxigenadas, intactas, as clulas mesoteliais produzem ativador de plasminognio, que lisa os cogulos de fibrina formados aps a leso. A proliferao de clulas mesodrmicas regenera uma camada nica de mesotlio novo entre trs e cinco dias aps a injria. Nas feridas experimentais, atividade fibrinoltica foi encontrada trs dias aps a leso, antes da reconstruo da integridade mesotelial. Esse processo rpido e, geralmente, reconstitui a parede peritoneal sem formao de aderncias. Por outro lado, fibrinlise inadequada permite que a proliferao de fibroblastos produza aderncias fibrosas. Com a hipxia, a matriz fibrinosa invadida por fibroblastos, havendo estimulao de angiognese e sntese de colgeno. Aderncias fibrosas plenamente desenvolvidas formam-se aps 10 dias e tornam-se mximas entre duas e trs semanas aps a injria. (12) - 4 -
Cita-se a relao direta entre a presena de mastcitos no processo inflamatrio e o incio do processo adesivo. Acredita-se que o mastcito se une aos fibroblastos intestinais, desencadeando sua proliferao, mecanismo comprovado in vitro e em modelos experimentais. (14)
A fisiopatologia especfica das aderncias permanece incerta. Segundo Henrrick e colaboradores (2001) a formao de aderncias consequncia de uma leso peritoneal, com isquemia local e falsa regenerao. (4)
Estudo em humanos revelou a morfologia, qualidade e composio das aderncias peritoneais maduras, concluindo que as mesmas eram ricas em clulas mononucleares, fibroblastos, adipcitos e endotlios. Tais achados suportam a hiptese de que o reparo inadequado da superfcie peritoneal poderia propiciar formao de aderncias persistentes, sendo consequncia de um processo de remodelao e cicatrizao permanentes. (15)
Cerca de 90% dos pacientes desenvolvem aderncias aps laparotomia. Em se tratando de cirurgia ginecolgica esse nmero pode chegar a 100%. (3)
Certamente a preveno de aderncias reduzira a incidncia e a gravidade de suas complicaes. (16)
As medidas profilticas para reduo da formao de aderncias visam diminuir a intensidade da resposta inflamatria e a coagulabilidade, alm de impedir o contato prolongado entre superfcies justapostas, por meio de efeitos siliconizantes (6).
Segundo Cruz (1969), os primeiros mtodos utilizados para a preveno de aderncias foram a instilao de ar na cavidade peritoneal, promoo de peristaltismo intestinal precoce, uso de heparina e outros anticoagulantes na cavidade abdominal, instilao de solues hipotnicas, hialuronidase e esteroides na cavidade peritoneal, dentre outros. O uso da fibrinolisina como agente de preveno reduz a formao de aderncias peritnio-viscerais contudo enseja a - 5 -
deiscncia de suturas clicas com obtidos por peritonite, na dosagem de 195 U/g de peso corporal (17).
Existem tambm mtodos de barreiras fsicas como telas de celulose oxidada regenerada (ORC) que visam separar fisicamente os tecidos que potencialmente poderiam se aderir, como o Surgigel, Seprafilm e o Interceed . Tais mtodos podem prevenir a formao de aderncias quando em uso, sendo reabsorvidos quando no so mais necessrios (18) (19) (20), contudo sua eficcia pode ser significativamente reduzida na presena de sangue e processo inflamatrio contaminado, alm do elevado custo, sua disponibilidade e a dificuldade de manuseio do material. (21) (16)
Kumar e colaboradores (2009), em estudo de reviso que cobriu o perodo de 1966 a 2008, concluram que h evidncias de que o uso do cido hialurnico e membrana de carboximetilcelulose pode reduzir a incidncia, extenso e gravidade das aderncias o que, teoricamente, beneficiaria as reoperaes abdominais. Contudo, no h evidncia de que a incidncia de obstruo intestinal ou a necessidade de nova interveno cirrgica tenham sido reduzidas com este tipo de tratamento. (22)
Outras tentativas baseadas no processo de sntese do colgeno tambm foram estudadas. O colgeno diferente de todas as outras protenas, pois sofre vrias modificaes quando atinge o ambiente extracelular. Nesse ambiente, ocorrem cross-linking formando fibrinas e fibras de colgeno. A enzima responsvel por esta etapa, a oxidase lisil, requer a presena de cobre e pode ser inibida pelo b-aminopropionitrilo (BAPN) e d-penicillamina. A inibio do cross-linking do colgeno tem sido estudada em animais e, em um grau limitado, em humanos, na tentativa de evitar deposio excessiva de colgeno em aderncias e fibroses subsequentes. Os resultados tm sido modestos. (12)
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1.2. LASER
A palavra laser um acrnimo do ingls "Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation", o que significa "amplificao da luz pelo efeito da emisso estimulada da radiao". A gerao da onda eletromagntica depende da excitao dos eltrons presentes no meio condutivo (slido, lquido ou gasoso) que constitui o laser. A energia a laser no existe na natureza e transformada a partir de algum tipo de fonte de energia, como uma lmpada, que estimula um grande nmero de eltrons em repouso, os quais so capazes de produzir ftons de luz. Esse processo desencadeia uma ao repetida de emisso de energia gerando luz intensa. (23)
A luz gerada por um meio slido (por exemplo, rubi e alexandrita) ou gasoso (por exemplo, CO 2 ) para adquirir as trs principais caractersticas dos laseres, que so: raios colimados (todos os raios de luz caminham na mesma direo, permitindo que uma grande quantidade de energia seja transmitida a um alvo preciso), luz monocromtica (tem uma nica cor, que corresponde a um comprimento de onda do espectro eletromagntico) e raios coerentes (todos os raios da luz do laser caminham paralelos no tempo e no espao). Dessa forma, tm-se diferentes tipos de equipamentos de laser, dependendo do comprimento de onda emitido. (24)
A primeira publicao sobre Laser data de 1958, no artigo de Schawlow e Townes. (25). Em 1960 Maiman utilizando um cristal de rubi, desenvolveu a primeira fonte de laser. (26)
Em 1965, foi criado por Sinclair e Knol um aparelho de laser com efeito fotobioestimulante em tecidos vivos, o chamado laser teraputico. (27)
O laser de baixa intensidade, tambm chamado de baixa potncia ou ainda bioestimulante, tem sido usado desde o final da dcada de 1960, sendo sua grandeza de radiao to baixa (entre 2 e 30 mW) que seus efeitos biolgicos ocorrem devido a radiao e no como resultado do aquecimento, no sendo capaz de elevar a temperatura do tecido vivo alm de 1 C. A penetrao do laser chega - 7 -
apenas a poucos milmetros da pele, sendo absorvida nos seus diferentes estratos. (23)
Em 1967, Endre Mester, mdico hngaro, publicou trabalho com a utilizao de laser de baixa potncia (Soft Laser) He-Ne, para cicatrizao de feridas e lceras, demonstrando que era possvel obter bons resultados teraputicos com baixa densidade energtica (potncia mdia de 1,0 a 10,0 mW). (28)
A laserterapia de baixa potncia tem sido cada vez mais utilizada e investigada. Fatores como o no traumatismo dos tecidos, custo reduzido, bons resultados na cicatrizao e controle da dor parecem contribuir para seu uso contnuo e cada vez mais frequente. (29)
Apesar de vrias investigaes, ainda no foi possvel parametrizar o uso do laser no processo de cicatrizao. Algumas revises (30) (31) (32) e meta-anlise (33) publicadas recentemente concluram que a laserterapia benfica cicatrizao e ao controle da dor, mas no foi possvel estabelecer protocolos, uma vez que uma considervel variao nos projetos de pesquisa, metodologia e parmetros de irradiao empregados limitou a comparao dos resultados entre os estudos. (30) (33) (31) (32)
Bjordal e colaboradores (2006) avaliaram os efeitos biolgicos e clnicos de curto prazo (at sete dias aps injria) do laser na dor aguda em leso de tecido mole, demonstrando que essa terapia pode modular processo inflamatrio de uma maneira dose-dependente e capaz de reduzir significativamente a dor inflamatria aguda. (30)
Sete artigos de reviso (30) (34) (35) (32) (36) (37) (31), publicados entre 2006 e 2010 e uma meta-anlise (33), publicada em 2009, avaliaram os efeitos do laser sobre a cicatrizao de feridas e dor. Em nenhuma dessas publicaes foram encontrados estudos avaliando o efeito do laser sobre a formao de aderncias. (30) (34) (35) (33) (32) (36) (37) (31)
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Embora o laser j seja utilizado em larga escala, com o objetivo de facilitar o processo de cicatrizao h pelo menos 50 anos (25), ainda no foram publicados estudos avaliando o efeito dessa terapia sobre a formao de aderncias abdominais.
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2. OBJETIVO
Avaliar os efeitos do laser de baixa intensidade sobre a formao, morfologia e aspectos inflamatrios das aderncias abdominais e cicatrizao da pele aps peritoniectomia em coelhos.
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3. MTODO
3.1. TICA Os aspectos legais e ticos foram observados conforme a determinao da Lei 11.794, de 8 de outubro de 2008, que dispe sobre procedimento para uso cientfico de animais (38) e Princpios ticos para o Uso de Animais de Experimentao, editado pelo Comit de tica e Experimentao Animal (CETEA) da Universidade Federal de Minas Gerais. (39) O experimento foi devidamente aprovado pelo CETEA UFMG, certificado 21/2011. (Anexo I)
3.2. ANIMAIS
Este trabalho foi realizado no Ncleo de Experimentao Animal da Faculdade de Medicina da UFMG. Os animais foram adquiridos na Fundao de Estudos e Pesquisa em Medicina Veterinria e Zootecnia Fazenda Veterinria da UFMG e transportados para o Ncleo de Experimentao Animal da Faculdade de Medicina da UFMG em gaiolas apropriadas.
Foram utilizados vinte e quatro coelhos machos Oryctolagus Cunculus, da raa Nova Zelndia, pesando entre 2.110 g e 2.590 g. Os animais foram identificados com marcao em suas orelhas (Figura 1 A) com caneta dermatogrfica e alocados em gaiolas individuais, identificadas externamente com etiqueta adesiva (Figura 1 B).
Os animais permaneceram em observao por 15 dias antes do experimento para verificar seu estado de sade, a fim de excluir afeces que pudessem interferir na investigao.
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Figura 1 - Identificao dos animais (A) e gaiolas (B).
3.3. DISTRIBUIO DOS ANIMAIS
Os coelhos foram distribudos, aleatoriamente, em 3 grupos (n=8) conforme a teraputica adotada:
GC 8 coelhos, grupo controle, no irradiado com laser; GL1 8 coelhos, grupo irradiado com laser: energia de 0,2 J, fluncia de 5 J/cm 2 , potncia de 0,005 W, tempo de 40 s por ponto
; GL2 8 coelhos, grupo irradiado com laser: energia de 3,6 J, fluncia de 90 J/cm 2 , potncia de 0,04 W, tempo de 90 s por ponto.
3.4. PR-OPERATRIO
Os animais foram mantidos no Ncleo de Experimentao Animal da Faculdade de Medicina da UFMG, em gaiolas especficas para este fim, em temperatura ambiente, com livre acesso gua potvel e rao de origem industrial padronizada, respeitando ciclo normal de dia e de noite. Antes do procedimento operatrio, os animais foram pesados em balana eletrnica digital.
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3.5. TCNICA ANESTSICA
O procedimento cirrgico foi realizado sob anestesia intramuscular, na regio gltea, com cloridrato de cetamina (Cetamin, Syntec, Cotia, SP) na dose de 20mg/kg associado a cloridrato de xilazina (Xilazin, Syntec, Cotia, SP) a 2%, na dose de 6mg/kg. Realizou-se antibioticoprofilaxia com Cefalexina monoidratada (Keflex, Eli Lilly, So Paulo, SP) na dose de 50mg/kg atravs da administrao intramuscular, 30 minutos antes do procedimento. Durante todo o procedimento operatrio foram avaliados os padres respiratrios e de sedao dos animais. Quando necessrio, foi aplicada adicionalmente metade da dose inicial dos anestsicos.
3.6. COLETA DE SANGUE
Foi realizada previamente cirrgica (D0), coleta de sangue atravs da dissecao e puno da veia femoral para anlise de protena C reativa (PCR) e leucograma. O mesmo procedimento foi repetido no 4 dia ps-operatrio (D4) (Figura 2).
Figura 2 Coleta de sangue atravs da dissecao e puno da veia femoral (seta). Coleta realizada no pr-operatrio (D0) e repetida no 4 dia ps-operatrio (D4)
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A protena C reativa (PCR) foi dosada por qumica seca (VITRUS Johnson & Johnson) (valor de referncia < 10mg/L). A Protena C Reativa Ultra-sensvel (PCRus) foi dosada por nefelometria, no Laboratrio Hermes Pardini (Valor de referncia < 8mg/L para doena inflamatria na fase aguda).
3.7. PROCEDIMENTO OPERATRIO
As cirurgias foram realizadas na sala de cirurgia do Ncleo de Experimentao Animal Central da Faculdade de Medicina da UFMG. Os animais foram posicionados em decbito dorsal. Um foco cirrgico iluminou o campo operatrio. O instrumental cirrgico foi constitudo por bisturi de lmina descartvel, tesouras retas e de Metzenbaum, pinas anatmicas e dente-de-rato, pinas homeostticas curvas, retas e porta agulha. Aps a tonsurotomia de toda a regio anterior do trax e abdome com lmina de ao inoxidvel (Figura 3), foram colocados os campos operatrios estreis.
Figura 3 Tonsurotomia realizada na regio anterior do trax e abdome.
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O ato cirrgico foi realizado conforme as seguintes etapas:
1. Laparotomia longitudinal mediana medindo 7 cm de extenso, 4 cm distalmente ao apndice xifoide (Figura 4 A);
2. Abertura da parede abdominal por planos (pele, subcutneo, aponeurose e peritnio parietal) (Figura 4 B);
3. Resseco de fragmento de peritnio parietal, medindo 3 cm x 1 cm, situado 1 cm lateralmente as margens da inciso, com uso de molde para padronizar o tamanho de todos os fragmento ressecados (Figuras 4 C). Aparncia da parede abdominal aps a retirada do fragmento de peritnio parietal (Figura 4 D).
Figura 4 Laparotomia mediana longitudinal (A), abertura e afastamento por planos das bordas da parede abdominal do coelho, (B), molde de plstico (seta), medindo 3 cm x 1 cm, utilizado para padronizao da retirada de fragmento de peritnio da parede abdominal do coelho (C) e aparncia da parede abdominal (seta) aps a retirada do fragmento de peritnio parietal (D). - 15 -
4. Aplicao perioperatria do laser de baixa intensidade nos Grupos GL1 e GL2 em quatro pontos, 1 cm distantes entre si, dois na lateral direita e dois na lateral esquerda, nos locais onde foram retirados os retalhos (Figura 5 A e B).
Figura 5 Aplicao perioperatria do laser de baixa intensidade na lateral direita (A) e esquerda (B) da parede abdominal do coelho, logo aps a peritoniectomia.
5. Sutura contnua da ferida cirrgica, em planos (aponeurose e peritnio parietal e pele) com fio de nylon 3-0 (Thecnofio, Goinia, GO) (Figura 6).
Figura 6 Sutura da ferida cirrgica em planos: aponeurose e peritnio parietal e pele, com nylon 3-0. - 16 -
Todos os animais do GC foram submetidos ao mesmo procedimento, porm sem a aplicao do laser de baixa intensidade.
3.8. EQUIPAMENTO E PARMETROS DE UTILIZAO DO LASER DE BAIXA INTENSIDADE
O aparelho utilizado no experimento foi o Twin Flex Evolution Laser (Figura 8), fabricado pela MM Optics Ltda. Caractersticas do laser: meio condutivo InGaAIP, comprimento de onda de 658 nm +- 10 nm, luz visvel vermelha, rea do spot igual a 0,04 cm 2 , operao em modo contnuo, potncia mxima de sada de 40 mW +- 20%.
Os parmetros adotados para aplicao do laser de baixa intensidade foram:
GL1 - Dose: 0,2 J, fluncia de 5 J/cm 2 . Aplicado no peri e ps-operatrio, aplicao realizada perpendicularmente ao tecido cicatricial e em contato direto com o mesmo, com tempo de aplicao de 40 s por ponto, na potncia de 5 mW, aplicados em 4 pontos por animal em cada sesso diria durante 4 dias;
GL2 - Dose: 3,6 J, fluncia de 90 J/cm 2 . Aplicado no peri e ps-operatrio, aplicao realizada perpendicularmente ao tecido cicatricial e em contato direto com o mesmo, com tempo de aplicao de 90 s por ponto, na potncia de 40 mW, aplicados em 4 pontos por animal em cada sesso diria durante 4 dias;
A caneta de aplicao foi mantida perpendicular rea aplicada e em contato direto com a pele do animal. A ponteira foi protegida com filme de PVC, incolor, que foi devidamente esticado, evitando a formao de dobras que poderiam prejudicar a transmisso do feixe de luz laser (Figura 9). O filme foi trocado a cada aplicao. As aplicaes foram realizadas com a utilizao de culos de proteo fornecidos pelo fabricante do equipamento (Figura 10).
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Figura 8 Proteo da caneta laser com filme de PVC incolor (seta).
Figura 9 culos de proteo para aplicao do laser de baixa intensidade.
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3.9. CUIDADOS GERAIS DURANTE A APLICAO DO LASER DE BAIXA INTENSIDADE NO PS- OPERATRIO
Aps o ato cirrgico os coelhos permaneceram em temperatura ambiente, com livre acesso gua potvel e rao de origem industrial padronizada. Cumpriram ciclo normal de dia e de noite.
Os animais do GL1 e GL2 receberam, na pele, uma aplicao diria de laser de baixa intensidade na mesma dose utilizada no peroperatrio, a partir do horrio da cirurgia inicial, durante os quatro primeiros dias de ps-operatrio. Foi utilizado um molde (Figura10) para padronizao da aplicao do laser. Cada aplicao foi realizada em quatro pontos, dois na lateral direita e dois na lateral esquerda, afastados 1,5 cm da linha mdia e com a distncia de 1 cm entre os pontos de aplicao (Figura 10).
Figura 10 Aplicao diria do laser de baixa intensidade no ps- operatrio, em quatro pontos distintos, dois em cada lado da resseco peritoneal, com base no molde plstico padro, durante os quatro primeiros dias de ps-operatrio.
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3.10. NECROPSIA DOS ANIMAIS
Todos os animais foram sacrificados no 14 dia ps-operatrio, por pneumotrax, aps anestesia intramuscular de cloridrato de cetamina (Cetamin, Syntec, Cotia, SP), na dose de 50mg/kg.
A cavidade abdominal foi examinada aps uma ampla laparotomia mediana longitudinal em forma de "U" invertido abraando a cicatriz cirrgica (Figura 11 A e B).
Figura 11 Esquema da inciso em U invertido na parede abdominal anterior (A). Exame da cavidade abdominal atravs da inciso em forma de U invertido (B).
3.11. ANLISE DAS ADERNCIAS
A constatao da formao ou no de aderncias foi realizada atravs da avaliao da regio da cicatriz cirrgica no peritnio. Todas as aderncias encontradas foram contadas e estudadas.
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3.11.1. PARMETROS QUANTITATIVOS E QUALITATIVOS
A qualificao e a quantificao das aderncias foram baseadas no estudo de MORENO-EGEA, AGUAYO, ZAMBUDIO e PARRILLA (1993), modificado. (40). Foram avaliados os seguintes parmetros das aderncias:
1) Animais livres de aderncia: foram relacionados ao nmero de animais onde no havia a formao de aderncia (Figura 17 A e B);
2) Nmero: foi relacionado quantidade de aderncias encontradas (Figura 12);
3) rea: foi mensurada atravs de paqumetro digital, tendo sido realizadas duas medies por aderncia, a primeira referindo-se superfcie de contato entre as estruturas aderidas (Figura 13 A) e a segunda referindo-se espessura da aderncia (Figura 13 B). A partir dessas duas dimenses foi calculada a rea de aderncia;
4) Tenacidade: as aderncias foram caracterizadas como frouxa (a aderncia que se descolava facilmente, sem necessidade de disseco) e firme (quando houvia necessidade de disseco para ser descolada);
5) Vascularizao: presena ou no de vasos sanguneos na aderncia, sem o uso de lentes de aumento;
6) Localizao: foi classificada da seguinte forma: aderncia entre o peritnio parietal e o omento, entre o omento e alas intestinais, entre rgos e entre peritnio parietal e alas intestinais.
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Figura 12 Contagem do nmero de aderncias abdominais.
Figura 13 Medio da superfcie de contato entre as estruturas (A) e da espessura das aderncias (B).
3.12. EXAME HISTOLGICO
Foi realizado exame histolgico de segmentos da parede abdominal na regio da cicatriz cutnea e das aderncias formadas. Todos os fragmentos foram coletados no 14 dia ps-operatrio, fixados em soluo de formaldedo a 4% (formol a 10%). - 23 -
De cada segmento, foram colhidos fragmentos para exame histolgico, includos em parafina, de acordo com mtodos rotineiros do Laboratrio do Departamento de Patologia da Faculdade de Cincias Mdicas de Minas Gerais. Foram realizados cortes histolgicos de 4-5 m de espessura que foram corados por hematoxilina e eosina (HE). Os exames histolgicos foram realizados, no Servio de Anatomia Patolgica da Santa Casa de Belo Horizonte, por um nico patologista, sem conhecimento prvio dos animais e grupos avaliados. As lminas foram examinadas em microscpico de luz com aumentos de 40X e 100X.
Para a padronizao das avaliaes foram definidos os seguintes critrios:
1) Intensidade do processo inflamatrio (cicatriz cirrgica e aderncia):
a. Processo inflamatrio ausente (ausncia de clulas inflamatrias);
b. Processo inflamatrio leve a moderado (presena leve ou moderada de clulas inflamatrias);
c. Processo inflamatrio intenso (presena intensa de clulas inflamatrias).
2) Vascularizao das aderncias:
a. Ausncia de vasos sanguneos;
b. Presena de vasos sanguneos.
3.13. ENSAIO MECNICO DE RESISTNCIA TRAO
Para a realizao do ensaio mecnico de resistncia trao da pele e da parede abdominal sem a pele foi utilizada uma mquina universal de ensaio, marca Kratos , modelo DEK 200 kgf, do Laboratrio de Anlises Mecnicas da empresa AG- REMY Stretch Film do Brasil Ltda, Belo Horizonte/MG. Essa mquina foi equipada com uma clula de carga de 20 kgf e interface direta a um microcomputador, com - 24 -
software especfico, responsvel pelo comando do equipamento e plotagem do grfico carga versus deslocamento de cada ensaio (Figura 14).
Figura 14 Mquina universal de ensaio da marca Kratos . A parede abdominal foi retirada e um corpo de prova foi confeccionado com bisturi, atravs de um molde plstico, visando padronizao dos mesmos (Figura 15). A cicatriz cirrgica foi colocada no centro do molde (Figura 15, seta).
Figura 15 - Confeco do corpo de prova com molde plstico (*) medindo 8 cm x 2,5 cm. Indicao da posio da cicatriz cirrgica (seta).
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Foi feita a separao da pele do restante da parede abdominal utilizando-se bisturi. Os fragmentos da parede abdominal sem a pele e da pele foram acondicionados em frascos, individualmente identificados e umedecidos com gaze embebida em soluo salina. Os ensaios foram realizados no tempo mximo de 3 horas aps a preparao dos corpos de prova.
No momento do ensaio, os fragmentos da parede abdominal sem a pele e da pele foram acoplados ao equipamento conforme metodologia estabelecida pelo laboratrio da empresa AG-Remy Stretch Film do Brasil Ltda, sendo que o centro da cicatriz cirrgica foi colocado distncia mdia das duas garras. A distncia total entre garras foi fixada em 5 cm e foi aplicada uma pr-carga de 0,100 kgf, durante o tempo de acomodao de 3 segundos, com o objetivo de provocar acomodao do sistema. Aps a pr-carga, o ensaio prosseguiu com velocidade de deslocamento de 100,00 mm/min, temperatura ambiente de 25C e umidade relativa de 50%. A carga aplicada foi registrada pelo software em intervalos regulares de alongamento at que a resistncia elstica fosse vencida, ou seja, a partir desse ponto a deformao do tecido irreversvel (Figura 16). O resultado do limite da resistncia mxima foi registrado em kgf/mm 2 .
Figura 16 Fragmento da pele sob trao. Observar cicatriz na parte central (seta). - 26 -
3.14. ANLISE ESTATSTICA
As informaes coletadas foram digitadas em planilhas eletrnicas no aplicativo Excel. As anlises foram realizadas atravs de calculadora livre disponvel nos endereos eletrnicos: http://faculty.vassar.edu/lowry/anova1u.html para o teste ANOVA e Tukey HSD Test e http://faculty.vassar.edu/lowry/fisher2x3.html para o teste Freeman-Halton, extenso do teste exato de Fisher.
Os resultados foram obtidos utilizando frequncia e porcentagens para as caractersticas das variveis categricas e da medida de tendncia central (mdia e mediana) e de disperso (desvio-padro) para as variveis quantitativas. As variveis categricas foram comparadas, entre os grupos, utilizando o teste Freeman-Halton, extenso do teste exato de Fisher. As variveis quantitativas foram comparadas, entre grupos, utilizando o teste Anova. Quando se verificou diferena com significncia estatstica, foi realizado o teste de Tukey HSD para verificar quais grupos eram diferentes entre si. As anlises estatsticas foram consideradas significativas para p<0,05.
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4. RESULTADOS
Todos os animais recuperaram-se espontaneamente no ps-operatrio e sobreviveram durante os 14 dias do experimento, sem intercorrncias, quando foram sacrificados.
4.1. ACHADOS MACROSCPICOS
Feita a comparao quanto presena de aderncias abdominais observou-se que somente trs (37,5%) coelhos do grupo GL2 apresentaram aderncias enquanto todos os animais dos grupos GC e GL1 apresentaram este tipo de formao (Tabela 4.1.1)
Tabela 4.1.1 Presena de aderncia abdominal nos animais do trs grupos no 14 dia ps- operatrio. ADERNCIA
GRUPOS Valor-p GC GL1 GL2 Presente Ausente 8 (100%) 8 (100%) 3 (37,5%) - - 5 (62,5%)
0,003*
GC= Grupo Controle; GL1 = Grupo laser dose 0,2 J
; GL2 = Grupo laser dose 3,6 J. Valores expressos em nmeros absolutos e porcentagem. * Teste Freeman-Halton, extenso do teste exato de Fisher. - 28 -
5. Figura 17 Exame da cavidade abdominal constatando ausncia de aderncia abdominal em animais n. 2 e 5 do GL2 (Grupo laser dose 3,6 J), respectivamente (A e B). Presena de aderncia abdominal entre parede abdominal e intestino grosso no coelho n. 4 do GC (Grupo Controle) (C) e no coelho n. 6 do GL1 (Grupo laser dose 0,2 J) (D).
Aps contagem das aderncias abdominais entre animais dos trs grupos verificou- se que nos animais do grupo GL2 o nmero de aderncias foi significativamente menor do que nos animais dos outros grupos (GC e GL1) (Tabela 4.1.2).
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Tabela 4.1.2 - Comparao entre nmero de aderncias abdominais entre animais dos trs grupos no 14 dia ps-operatrio. NMERO DE ADERNCIAS
GC= Grupo Controle; GL1 = Grupo laser dose 0,2 J ; GL2 = Grupo laser dose 3,6 J. Os valores expressos em mdia +- desvio padro. * Anova (p=0,000414). Teste de Tukey para anlise de comparao mltipla: GL2<GC=GL1.
A Tabela 4.1.3 mostra a comparao das reas de aderncia abdominal nos animais dos trs grupos. O valor da rea corresponde multiplicao da medida da superfcie de contato entre as estruturas aderidas e a da espessura da aderncia (Figura 18). Observa-se que a rea de aderncia formada no grupo GL2 significativamente menor do que nos outros grupos (GC e GL1). Tabela 4.1.3 - Comparao entre reas de aderncias abdominais entre animais dos trs grupos no 14 dia ps-operatrio. GRUPOS AREA (cm 2 ) Valor-p GC 1.75 0.89
GL1 2.00 0.93
GL2 0.50 0.76
0.0062*
GC= Grupo Controle; GL1 = Grupo laser dose 0,2 J
; GL2 = Grupo laser dose 3,6 J Os valores expressos em mdia +- desvio padro. * Anova (p=0,0062). Teste de Tukey para anlise de comparao mltipla: GL2<GC=GL1.
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Grfico 1 Resumo das avaliaes quantitativas das aderncias encontradas nos trs grupos.
Figura 18 Medio da superfcie de contato entre estruturas aderidas (A), coelho nmero dois do GC (Grupo Controle) e da espessura das aderncias (B), coelho nmero trs do GC (Grupo Controle).
No foi verificada diferena quanto tenacidade da aderncia abdominal entre animais submetidos ou no ao laser de baixa intensidade (p=0,7107) (Tabela 4.1.4).
; GL2 = Grupo laser dose 3,6 J. Valores expressos em nmeros absolutos e porcentagem. * Teste Freeman-Halton, extenso do teste exato de Fisher: CG=GL1=GL2.
Figura 19 - Aderncias abdominais presentes no coelho nmero cinco do CG (Grupo Controle) (seta) classificadas como firme (necessitou tripsia para ser desfeita) (A) e frouxa (sem necessidade de tripsia para ser desfeita) presente no coelho nmero trs do GL1 (Grupo laser dose 0,2 J ) (B).
Quando avaliado macroscopicamente, o uso do laser no modificou a vascularizao das aderncias, sendo as aderncias predominantemente vascularizadas em todos os grupos, sem diferena entre eles (p=0,82) (Tabela 4.1.5).
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Tabela 4.1. 5- Vascularizao das aderncias abdominais entre animais dos trs grupos no 14 dia ps-operatrio. ADERNCIA
; GL2 = Grupo laser dose 3,6 J. Valores expressos em nmeros absolutos e porcentagem. * Teste Freeman-Halton, extenso do teste exato de Fisher: GC=GL1=GL2.
Quanto localizao nenhuma aderncia presente nos coelhos do grupo GL2 envolveu estruturas viscerais. Entretanto houve envolvimento de estruturas viscerais em 72% dos animais do GC e em 83% dos animais do GL2 (Tabela 4.1.6).
Tabela 4.1. 6- Comparao entre a localizao das aderncias abdominais entre animais dos trs grupos no 14 dia ps-operatrio. LOCALIZAO DAS ADERNCIAS
GRUPOS GC GL1 GL2
Parede e Omento 7 (28%) 4 (17%) 3 (100%)
Omento e Intestinos 9 (36%) - -
Entre rgos 1 (4%) 5 (22%) -
Parede e Intestinos
8 (32%) 14 (61%) - GC= Grupo Controle; GL1 = Grupo laser dose 0,2 J ; GL2 = Grupo laser dose 3,6 J. Valores expressos em nmeros absolutos e porcentagem. - 33 -
Figura 20 - Aderncia abdominal entre parede e intestino grosso (seta) no coelho nmero dois do GC (Grupo Controle) (A) e parede e omento (seta) no coelho nmero sete do GL2 (Grupo laser dose 3,6 J) (B).
Grfico 2 - Resumo das avaliaes quanlitativas das aderncias encontradas nos trs grupos.
4.2. ENSAIOS MECNICOS No foi verificada diferena quanto ao limite de resistncia trao da pele nos animais submetidos ou no ao laser de baixa intensidade (p=0,3106) (Tabela 4.2.1). 0 10 20 30 40 50 60 70 Firmes Frouxas Vascularizadas Avascularizadas Envolvimento Intestinal (%) 9 16 20 5 68 15 8 20 3 61 3 3 0 Aderncias Resumo Avaliao Qualitativa GC GL1(0.2J) GL2(3,6J) - 34 -
Tabela 4.2. 1 - Limite de resistncia trao da pele entre animais dos trs grupos no 14 dia ps-operatrio. GRUPOS LIMITE DE RESISTNCIA TRAO (KGF/MM 2 ) Valor-p GC 4,23 1,20
GL1 3,10 1,79
GL2 3,42 1,25
0,3106* GC= Grupo Controle; GL1 = Grupo laser dose 0,2 J
; GL2 = Grupo laser dose 3,6 J Os valores expressos em mdia +- desvio padro. * Anova (p=0,3106).
Quando comparamos o limite de resistncia trao da parede, exceto pele; os grupos irradiados com laser no apresentaram limite diferente daquele apresentado pelo grupo controle (GC), porm GL2 obteve resultado superior ao do GL1 (p=0,001) (Tabela 4.2.2).
Tabela 4.2. 2- Limite de resistncia trao da parede e entre animais dos trs grupos no 14 dia ps-operatrio. GRUPOS LIMITE DE RESISTNCIA TRAO (KGF/MM 2 ) Valor-p GC 3,70 0,89
GL1 2,79 0,74
GL2 4,88 1,21
0,001* GC= Grupo Controle; GL1 = Grupo laser dose 0,2 J
; GL2 = Grupo laser dose 3,6 J Os valores expressos em mdia +- desvio padro. * Anova (p=0,01). Teste de Tukey para anlise de comparao mltipla: GC=GL1, GC=GL2, GL2>GL1.
4.3. EXAMES LABORATORIAIS A comparao entre o leucograma no pr-operatrio (D0) e no 4 dia de ps- operatrio (D4), entre os animais dos trs grupos foi realizada e no foram observadas diferenas entre os grupos (p<0,05) (Tabela 4.3.1).
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Tabela 4.3. 1 - Resultado do Leucograma (mdia e desvio padro) dosado nos animais dos trs grupos no pr-operatrio (D0) e no 4 dia ps-operatrio (D4).
GC= Grupo Controle; GL1 = Grupo laser dose 0,2 J; GL2 = Grupo laser dose 3,6 J DO=Coleta Prvia ao Experimento, D4=4 dia de Ps-operatrio. Os valores expressos em mdia +- desvio padro. * Anova. WBC=Leucocitos, NEU=Neutrfilos, LYM=Linfcitos, MONO=Moncitos, EOS=Eosinfilos, BASO=Basfilos, RCB=Eritrcitos, HGB=Hemoglobina, HCT=Hematcrito e PLT=Plaquetas.
Quando avaliado o processo inflamatrio encontrado na cicatriz cirrgica verificou-se que todos os animais apresentavam infiltrado inflamatrio, predominantemente composto por polimorfonucleares (Figura 21). No foram constatadas diferenas entre os grupos (tabela 4.3.2).
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Tabela 4.3. 2- Intensidade do processo inflamatrio na cicatriz cirrgica entre os animais dos trs grupos no 14 dia ps-operatrio. PROCESSO INFLAMATRIO GRUPOS Valor-p GC GL1 GL2 Ausente 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) Leve a Moderado 4 (50%) 7 (100%) 4 (50%) Intenso 4 (50%) 0 (0%) 4 (50%)
0.0789* GC= Grupo Controle; GL1 = Grupo laser dose 0,2 J
; GL2 = Grupo laser dose 3,6 J. Valores expressos em nmeros absolutos e porcentagem. * Teste Freeman-Halton, extenso do teste exato de Fisher: GC=GL1=GL2.
Figura 21 Microscopia da cicatriz cirrgica do coelho nmero dois, Grupo GL1 (Grupo laser dose 0,2 J). Observar presena de processo inflamatrio leve/moderado (setas) com predomnio de polimorfonucleares (A) Aumento de 40x; (B) Aumento de 100x. Corado com hematoxilina e eosina. - 37 -
A avaliao do processo inflamatrio presente nas aderncias abdominais no apresentou diferena entre os grupos (Tabela 4.3.3). A Figura 22 ilustra o processo inflamatrio leve/moderado na aderncia. Tabela 4.3. 3- Intensidade do processo inflamatrio nas aderncias abdominais entre animais dos trs grupos no 14 dia ps-operatrio. PROCESSO INFLAMATRIO GRUPOS Valor-p GC GL1 GL2 Ausente 1(25%) 0(0%) 0(0%) Leve a Moderado 3(75%) 7(100%) 1(100%) Intenso 0(0%) 0(0%) 0(0%)
0.4166* GC= Grupo Controle; GL1 = Grupo laser dose 0,2 J
; GL2 = Grupo laser dose 3,6 J. Valores expressos em nmeros absolutos e porcentagem. * Teste Freeman-Halton, extenso do teste exato de Fisher: GC=GL1=GL2.
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Figura 222 - Microscopia da aderncia abdominal do coelho nmero dois, Grupo GL1 (Grupo laser dose 0,2 J). Observar a presena de processo inflamatrio leve/moderado (setas) com predomnio de clulas polimorfonucleares. (A) Aumento de 40x; (B) Aumento de 100x. Corado com hematoxilina e eosina.
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Todas as aderncias avaliadas microscopia de luz apresentaram vascularizao (P=1,00). A Figura 23 ilustra a presena de vasos sanguneos.
Figura 233 - Microscopia da aderncia abdominal do coelho nmero 18, Grupo GL2 (Grupo laser dose 3,6 J). Observar presena de vascularizao (setas). (A) Aumento de 40x; (B) Aumento de 100x. Hematoxilina e eosina.
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5. DISCUSSO Aderncias abdominais continuam a ser um desafio para os profissionais da rea da sade, sobretudo para os cirurgies. (41) Esto relacionadas com readmisso hospitalar aps cirurgia abdominal e plvica (2) (5) (9), obstruo intestinal (7) (6) (10; 41), infertilidade feminina e dor (42). Alm disso, representam um considervel custo socioeconmico para o sistema de sade de diversos pases. (1) (2) (43)
Tripsia (lise de aderncias) a nica forma de tratamento para aderncias abdominais instaladas. No entanto, esse procedimento acarreta um risco maior de complicao perioperatria e alta taxa de recorrncia, no impedindo a recorrncia de aderncias que podem levar a obstruo intestinal futura. (44) (41)
Fevang e colaboradores (2004) mostraram que cerca de 30% dos pacientes submetidos tripsia em virtude de obstruo do intestino delgado necessitaram de outra operao para liberar aderncias recorrentes. Esses dados tambm sugerem que a cirurgia para lisar as aderncias quase to adesiognica quanto a operao original. Dois teros das obstrues intestinais ocorreram nos cinco primeiros anos, quase um quarto, nos 10 anos subsequentes e mesmo aps 20 anos o risco ainda estava presente. Isso coloca claramente aderncias na categoria de complicao de longo prazo. (45)
A preveno da formao das aderncias deve ser ento o foco das atenes. O trauma peritoneal a base para a formao de aderncias abdominais aps cirurgias. (12) Segundo Arung e colaboradores (2011) somente tcnica cirurgia minuciosa pode ser recomendada para reduzir a formao de aderncias persistentes, morbidade e taxas de mortalidade oriundas das mesmas. (46)
Reviso realizada por Arung e colaboradores (2011) investigou vrios agentes de preveno contra a formao de aderncias ps-operatrias. Os agentes visavam alterar a ativao da fibrinlise, dificultar a coagulao, diminuir a resposta inflamatria, inibir a sntese de colgeno ou criar uma barreira fsica entre superfcies de feridas adjacentes. Os resultados so encorajadores mas a maioria deles contraditrios e realizados em modelos animais. (46) - 41 -
No presente trabalho, foi escolhido o coelho como modelo experimental. Na literatura, o coelho tem sido utilizado em cerca de 35% dos estudos do complexo musculoesqueltico, em cincias biomdicas. Apresenta como vantagem o tamanho, a facilidade de manuseio e o fato de atingir a maturidade esqueltica logo aps a maturidade sexual, por volta dos seis meses de idade bem como similaridade com a pele humana. (47) (48)
A peritoniectomia modelo experimental consagrado para induo da formao de aderncias. (14) (15) Na presente pesquisa, tal interveno foi eficaz, uma vez que todos os animais do grupo controle (GC) apresentaram aderncias. Esse achado consistente com a literatura que identifica a agresso ao peritnio como uma das causas da formao de aderncias. (49) (42) A etiologia das mesmas estaria ligada s falhas no mecanismo de reparo peritoneal, fazendo ento surgirem cicatrizes que se desenvolvem em locais de trauma, aps uma interveno cirrgica. (50) (51)
A utilizao do laser de baixa intensidade com o objetivo de auxiliar o reparo tecidual j pesquisada desde 1963. (28) Seis artigos de reviso (30) (34) (35) (32) (37) (31), publicados entre 2006 e 2010 e uma meta-anlise (33), publicada em 2009, avaliaram os efeitos do mesmo sobre a cicatrizao de feridas e para alvio da dor. Essas investigaes demonstraram que o laser de baixa intensidade tem um papel relevante na cicatrizao de feridas, agindo por fotobioestimulao dos tecidos lesados (35) (32), acelerando o reparo tecidual (31), modulando o processo inflamatrio e reduzindo a dor aguda em decorrncia de processo inflamatrio (30). Contudo considervel variao nos projetos de pesquisa, metodologia e parmetros de irradiao empregados limitou a comparao dos resultados entre os estudos. (30) (33) (31) (32)
Para definio dos parmetros de aplicao do laser necessrio considerar um grande nmero de variveis. O que determina se a luz fotobioestimulante ou lesiva ao tecido a intensidade (I), tambm chamada de irradincia ou densidade de potncia. Intensidade definida como sendo a potncia til do laser, expressa em Watts (W), dividida pela rea irradiada, expressa em centmetros quadrados (cm 2 ). A - 42 -
fluncia (F), tambm chamada de densidade de energia ou ainda dose de energia (DE), o termo utilizado para descrever a taxa de energia que est sendo aplicada no tecido biolgico e dada pela multiplicao da intensidade (expressa em Watts por centmetro quadrado ou W/cm 2 ), pelo tempo de exposio (em segundos) sendo expressa em Joules por centmetro quadrado (J/cm 2 ). Existe ainda a energia (E), grandeza fsica que, na aplicao do laser, representa a quantidade de luz laser que est sendo depositada no tecido e definida multiplicando-se a potncia ptica til do aparelho (expressa em Watts) pelo tempo de exposio (expresso em segundos). O resultado obtido tem como representao a unidade Joule (J). (29)
A maioria dos trabalhos descreve a dose em fluncia (J/cm 2 ), outros em Joule (J), mas no informa os outros parmetros como comprimento de onda, energia depositada no tecido, densidade de energia, rea do feixe, tempo de aplicao, potncia de pico (modo contnuo) ou potncia mdia (modo pulsado) e densidade de potncia. A falta de dados completos dificulta a reproduo e comparao de resultados. (29) (52)
Segundo o WALT (World Association for Laser Therapy), necessria aplicao de 1 a 4 J de energia final para alcanar efeitos fotobioestimulantes pelo laser de baixa intensidade, para comprimentos de onda de 780 a 904 nm, no existindo uma tabela de referncia para o comprimento de onda de 660 nm. (52) No presente trabalho, foram utilizadas duas doses de laser, uma fora da janela teraputica (5J/cm 2 por 40 s = 0,2J) e uma prxima ao final da janela (90J/cm 2 por 90 s = 3,6J), com o objetivo de saber se a janela teraputica proposta por WALT tambm se aplicaria ao laser no comprimento de onda de 660 nm.
Uma das dificuldades em se conduzir uma pesquisa sobre formao de aderncias tem sido a falta de uniformidade nas classificaes e interpretaes das aderncias encontradas na literatura. (13) (15) (20). A maioria dos mtodos utiliza ndices compostos por diversos parmetros, no informando de forma precisa a avaliao de cada um deles. Uso de termos subjetivos como nmero reduzido (53), aderncias generalizadas (54), vascularizao limitada (55), aderncias - 43 -
moderadas (53), aderncias mnimas (56) tambm dificultam a comparao dos resultados. Na avaliao da presena ou ausncia de aderncias, o laser de baixa intensidade, na dose de 3,6 J (dentro da janela teraputica) grupo GL2, foi capaz de reduzir significativamente essa formao. A aplicao na dose de 0,2 J (fora da janela teraputica) grupo GL1, teve resultado igual ao do grupo controle (GC). O ndice de animais do grupo GL2 livre de aderncias (62,5%) foi superior ao alcanado pela membrana reabsorvvel Seprafilm (51%) (57), considerado, atualmente, um dos mtodos mais eficazes para diminuir a formao de aderncias. (46) No entanto, o uso de Seprafilm aumenta significativamente a incidncia de abscessos abdominais e deiscncias e fstulas de anastomoses em cirurgia potencialmente contaminadas. (58)
D`Oliveira e colaboradores (2001) avaliaram o uso da Rifamicina para prevenir aderncias no ps-operatrio de ratos submetidos apenas laparotomia. Foi verificada mdia de 3,4 aderncias por animal, nmero superior presente investigao. Deve-se levar em conta que, no presente trabalho, realizou-se, alm da laparotomia, uma resseco bilateral de fragmento peritoneal, o que provavelmente estimularia ainda mais o surgimento de aderncias. (53) Na dose de 3,6 J
(dentro da janela teraputica), a aplicao do laser de baixa intensidade foi eficaz em reduzir a rea das aderncias formadas. Lamentavelmente, a medio da rea de formao de aderncia incomum nos trabalhos levantados na Literatura, o que dificulta a comparao dos dados desse experimento. (15) (13) (20) A dificuldade de mensurao desse parmetro tambm pode ser um fator limitante, pois as aderncias no se apresentam de forma uniforme. No presente trabalho, o mtodo empregado original e buscou apresentar os dados referentes ao contato entre as superfcies aderidas. Acredita-se que novos trabalhos devam ser conduzidos para esclarecimento dos mecanismos fisiopatolgicos dessa reduo.
A ausncia de diferena entre as tenacidades das aderncias entre os grupos sugere que a aplicao do laser de baixa intensidade no modificou a qualidade do tecido tratado. Embora no existam estudos semelhantes, algumas investigaes - 44 -
demonstraram que a aplicao do laser de baixa intensidade no altera a qualidade do tecido cicatricial formado, somente acelerando o processo de cicatrizao, o que poderia explicar, em tese, a ausncia de diferena entre os grupos. (32) (36) (31) (33) (35)
No presente trabalho, do total de 53 aderncias formadas, 45 (84,90%) eram vascularizadas quando observadas a olho nu e quando a avaliao foi realizada microscopia de luz, 100% eram vascularizadas. Esse achado est de acordo com a literatura que descreve as aderncias como tecido altamente vascularizado, contendo arterolas, vnulas e capilares bem desenvolvidos. (60) (4) (15)
O maior envolvimento do intestino grosso e delgado pelas aderncias semelhante aos demais trabalhos, (1) (6) (2) (41), contudo na dose de 3,6 J
(dentro da janela teraputica), a aplicao do laser de baixa intensidade foi capaz de minimizar esse envolvimento. Todas as aderncias formadas no grupo GL2 (3,6J) envolveram somente parede e omento. Segundo a literatura, o laser de baixa intensidade acelera o processo cicatricial. possvel que a resoluo mais rpida da cicatrizao tenha reduzido a gravidade das aderncias. Aderncias que poupam o intestino tm menor chance de se tornarem sintomticas e causarem abdome agudo. (33) (31) (37) Os estudos biomecnicos tm por objetivo determinar as propriedades mecnicas de um material e, dependendo de suas caractersticas fsicas, pode-se submet-lo aos ensaios de trao, toro, compresso e flexo. (61) No presente trabalho, foi realizado teste de limite de resistncia trao com o objetivo de identificar se a aplicao do laser de baixa intensidade alteraria esse limite no tecido cicatricial da pele e da parede abdominal exceto a pele. Buscou-se identificar o limite elstico, ou seja, ponto no qual o tecido no sofre uma deformao definitiva. Interrompendo o ensaio antes deste ponto e retirando a fora de trao, o corpo de prova volta sua forma original, tal como um elstico. A aplicao do laser, seja dentro (3,6J GL2) ou fora da janela teraputica (0,2 J Gl1), no alterou o limite de resistncia trao da pele quando comparado ao grupo controle (GC - sem tratamento). Esse achado est de acordo com a literatura, - 45 -
confirmando que a aplicao do laser de baixa intensidade no altera a qualidade do tecido cicatricial formado, o que poderia explicar a ausncia de diferena entre os grupos. (32) (36) (31) (33) (35)
Pelo fato de no haver um suporte sseo na parede da cavidade abdominal, sua resistncia derivada inteiramente da conformao das estruturas moles que a compem. A resistncia da parede abdominal de grande importncia, pois o seu enfraquecimento o principal responsvel pela formao de hrnias e eventraes. A aplicao do laser dentro (3,6J GL2) ou fora da janela teraputica (0,2 J Gl1) no alterou o limite de resistncia trao da parede abdominal quando comparado ao grupo controle (GC - sem tratamento), evidenciando que a aplicao do laser no promoveu enfraquecimento da parede abdominal, sendo seu uso seguro em cirurgias abdominais, no tocante formao de hrnias e eventraes.
A comparao do leucograma dos animais no pr-operatrio (D0) e no 4 dia de ps- operatrio (D4) no apresentou diferena significativa entre os grupos assim como a avaliao do marcador de fase aguda PCR. Na avaliao da PCR, tendo em vista que os resultados em todos os animais foram inferiores a 10 mg/L, optou-se tambm por realizar a dosagem dessa protena por mtodo ultrassensvel, com objetivo de avaliar se haveria ou no diferena entre os grupos. O PRC ultrassensvel no apresentou diferena. Inadequao do Kit utilizado para dosagem em animais ou a PCR em coelhos no ser um bom marcador para monitoramento do processo agudo talvez possa explicar a falta de diferena entre os grupos. Reviso conduzida por Nunes e colaboradores (2011) avaliando pacientes no ps-operatrio, de diversos tipos de cirurgia indicou que o pico de concentrao srica de PCR ocorre entre o segundo e terceiro dia de ps-operatrio quando cai rapidamente na ausncia de complicaes. Talvez o comportamento da PCR em coelhos seja semelhante ao dos humanos e o fato de se terem colhido as amostras no quarto dia de ps-operatrio tambm possa justificar a ausncia de diferena entre os grupos. (62). De acordo com esses dados, no se observou efeito deletrio sistmico do laser no processo inflamatrio e nas clulas sanguneas, sendo seu uso seguro.
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A comparao da intensidade do processo inflamatrio da ferida cirrgica no 14 dia de ps-operatrio no apresentou diferena entre os grupos, o mesmo acontecendo quando foi feita a avaliao da intensidade do processo inflamatrio nas aderncias formadas. Esses resultados so divergentes da literatura que preconiza que a terapia laser de baixa intensidade reduz o processo inflamatrio. (32) (36) (31) (33) (35). O pequeno nmero de amostras talvez explique a ausncia de diferena entre os grupos.
Novos estudos utilizando-se diferentes dosagens de laser e outros comprimentos de onda devem ser realizados de maneira a se compreender melhor o mecanismo de atuao do laser de baixa intensidade.
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6. CONCLUSES
A aplicao do laser de baixa intensidade na dose de 3,6 J, fluncia de 90 J/cm 2 , potncia de 40 mW e tempo de 90 s eficaz na reduo da formao, nmero e rea de aderncias abdominais em coelhos, sem modificar as caractersticas (tenacidade, vascularizao e inflamao) e sem comprometer a resistncia cicatricial ps-operatria da parede abdominal.
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