Validación de Métodos Microbiológicos - 2014 - VERSION FINAL PDF

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es 1
Validacin, verificacin e implantacin
de un mtodo microbiolgico acorde a la
Norma ISO-17025
2/65
Organizaciones de Normalizacin y
Desarrollo de Normas
3/65
Obtener resultados equivalentes y de validez contrastada
independientemente del equipo tcnico que los realice.
Mtodo normalizado debe:
No estar limitados por conocimientos de propiedad
intelectual protegida.
Simplicidad y carcter universal.
Cubrir una necesidad tecnolgica, de seguridad, legal
Ser tcnicamente vlidos y estar sujetos a revisiones
peridicas.
las asistencias tecnolgicas (ATE) son servicios orientados a un resultado a
corto plazo, en los que ponemos nuestros conocimientos y experiencias al
servicio de la empresa
Objetivos de la Normalizacin
4/65
Organismos que desarrollan mtodos
5/65
Organismos de Normalizacin
6/65
NORMALIZACIN MICROBIOLOGIA
Organismos de Normalizacin
7/65
Estructura del Subcomit de Normalizacin
Espaol
AEN/CTN34/SC4 Mtodos horizontales de anlisis de
productos alimenticios
Grupos de trabajo coordinados por FIAB:
+GT0 (CRITERIOS GENERALES)
+GT1 (SULFITOS)
+GT2 (EDULCORANTES)
+GT3 (PLAGUICIDAS Y PCBs)
+GT4 (PLAGUICIDAS EN ALIMENTOS DE ORIGEN VEGETAL)
+GT5 (BIOTOXINAS: MICOTOXINAS Y FICOTOXINAS)
+GT6 (CONTAMINACION MICROBIANA)
+GT7 (NITRITOS/ NITRATOS)
+GT8 (ALIMENTOS IRRADIADOS)
+GT9 (VITAMINAS Y CAROTENOIDES)
+GT10 (ELEMENTOS TRAZA (METALES PESADOS))
+GT11 (ALIMENTOS GENETICAMENTE MODIFICADOS)
+GT12 (ALRGENOS ALIMENTARIOS)
+GT13 (NFC) (CONTAMINATES DE NEO FORMACIN)
SECRETARA
8/65
Justificacin de la necesidad de la misma
Desarrollo de mtodos normalizados
Requisitos legales
Demanda industrial
Comercio internacional
Ausencia de Normas en vigor con el mismo alcance
Creacin de un grupo de trabajo
Desarrollo del mtodo
Participacin activa de 5 pases miembros
Nombramiento de expertos (Organismos nacionales)
Laboratorios referencia, Universidades, Centros de
investigacin, Laboratorios control, empresas
diagnstico
Estado del arte (publicaciones, tesis)
Experiencia de expertos
Informacin experimental
Ejercicios colaborativos
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Redaccin del borrador de trabajo (CD)
Desarrollo de mtodos normalizados
Documento de trabajo del Grupo de expertos
Modificaciones y correcciones tcnicas y formato
Publicacin del borrador final (DIS)
Encuesta del ltimo borrador (FDIS)
Documento pblico
Admite cambios y comentarios
Incorporacin de comentarios de usuarios
No es un documento en vigor
No admite modificaciones tcnicas, solo editoriales
Fase de encuesta por parte de todos los miembros
Aprobacin por el 75% de los miembros
Publicacin de la Norma (ISO/CEN/UNE)
10/65
Fases en el proceso de Normalizacin
60.60
50.00
40.00
30.00
20.00
Stage
0 Registration of approved new
work item (AWI)
Preparatory
stage
Project
time
(months)
Milestones Project
stage
18 Registration of draft International
Standard (DIS)
Enquiry
stage
36 Publication of International
Standard (IS)
Publication
stage
30 Registration of final draft
International Standard (FDIS)
Approval
stage
12 Registration of Committee Draft
(CD)
Committee
stage
11/65
Fases en el proceso de Normalizacin
Main
Main
project
project
development
development
stages
stages
Committee
Committee
vs. ISO/CS
vs. ISO/CS
Stage
WD
CD
DIS
FDIS
Publication
Project
registered (AWI)
ISO/CS
Committee
20 30
40 50 60
Stage Code:
12/65
NOTA IMPORTANTE !!!
ALGUNOS DE LOS ASPECTOS
DESCRITOS A CONTINUACIN SON
DOCUMENTOS DE TRABAJO Y
SUJETOS A CAMBIOS EN EL
PROCESO DE NORMALIZACIN
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Aspectos Generales relacionados con
validacin y mtodos alternativos
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> Adecuacin al uso
La norma UNE-EN ISO/IEC 17025 en su apartado 5.4.2
establece que El laboratorio debe utilizar mtodos de
ensayo que satisfagan las necesidades del cliente y sean
apropiados para el uso previsto.
La evaluacin de las necesidades del cliente pasa por
contemplar aspectos como:
Criterios microbiolgicos establecidos
Plazo de entrega
Cuestiones logsticas
Precio
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> Adecuacin al uso
Econmicos
Infraestructuras
Inversin en equipamiento
Coste por ensayo
Tcnicos
Matrices objeto de anlisis
Cualificacin y disponibilidad del personal
Validacin o reconocimiento del mtodo
Organizativos
Desviaciones positivas y negativas
Plazo de obtencin de resultados (con y sin
confirmaciones)
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> Norma UNE EN ISO 17025:2005 (5.4.5.2):
se deben validar los mtodos no
normalizados, los mtodos
diseados/desarrollados internamente, los
mtodos normalizados utilizados fuera de su
campo de aplicacin previsto y las
ampliaciones y modificaciones de los mtodos
normalizados con el fin de comprobar que son
apropiados para el uso previsto
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> Reglamento (CE) n 2073/2005
cada criterio microbiolgico debe asociarse a un
mtodo de referencia determinado.
Conviene que los explotadores de empresas
alimentarias puedan usar mtodos analticos diferentes
de los mtodos de referencia, en particular mtodos
ms rpidos, siempre que estos mtodos alternativos
produzcan resultados equivalentes.
Como mtodos de referencia se aplicarn los mtodos
analticos y los planes y mtodos de toma de muestras
que figuran en el anexo I
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Se autorizar el uso de mtodos analticos
alternativos cuando los mtodos estn
validados con respecto al mtodo de referencia
establecido en el anexo I y si se utiliza un
mtodo registrado, certificado por terceros
conforme al protocolo de la norma EN/ISO
16140 u otros protocolos similares
internacionalmente aceptados
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si el explotador de la empresa alimentaria desea
utilizar mtodos analticos distintos a los validados y
certificados tal y como se ha descrito en el prrafo
anterior, los mtodos deben validarse conforme a
protocolos internacionalmente aceptados y su uso
deber ser autorizado por la autoridad competente
> Reglamento (UE) N 1086/2011
La Norma internacional EN-ISO 6579 se establece como
mtodo horizontal () sin perjuicio a las disposiciones
sobre el uso de mtodos alternativos.
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> NT-32 rev. 2 ENAC
Tipo I: Mtodos normalizados. Son mtodos
desarrollados por un organismo de normalizacin o por
otras organizaciones bien establecidas, cuyos mtodos son
generalmente aceptados por el sector tcnico en cuestin
(ILAC G 18)
Tipo II: Mtodos alternativos. Mtodos que han sido
validados por comparacin con el mtodo de
referencia que corresponda, de acuerdo a un estndar
aceptado
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> NT-32 rev. 2 ENAC
Tipo III: Mtodos basados en mtodos de referencia.
Mtodos descritos en procedimientos internos
del laboratorio, que estn basados claramente en mtodos
de referencia y que no suponen una
modificacin tcnica.
Tipo IV: Otros mtodos. Son aquellos mtodos
desarrollados por el propio laboratorio o por cualquier
otra parte que no disponen del reconocimiento de los
mtodos de referencia o de los mtodos alternativos.
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> Norma UNE EN ISO 17025:2005 y NT-32 ENAC
En cualquier de los casos anteriores, y suponiendo que el
mtodo alternativo est validado de forma correcta (est o no
certificado) el laboratorio siempre debe:
confirmar que puede aplicar correctamente los
mtodos antes de utilizarlos para los ensayos
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Esquema de Validacin y Comprobacin
de Mtodos Alternativos
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> rbol de decisin
MTODO ALTERNATIVO
VALIDADO?
CERTIFICADO?
Es completa
la validacin?
VALIDACIN
CUALITATIVO
Nivel deteccin Relativa
Exclusividad/Inclusividad
Eficacia, sensibilidad y especificidad
Desviacin negativa y positiva
CUANTITATIVO
Lmite deteccin y cuantificacin.
-Linealidad y precisin.
-Sensibilidad
COMPROBAR EL FUNCIONAMIENTO
CUALITATIVO
CUANTITATIVO
Recuperacin
Precisin
Matrices
Analistas
Equipos
Reactivos
VALIDAR (ISO 16140)
Registros y evaluacin del
funcionamiento
Criterios Control de
Calidad Interno
CERTIFICADO
NO
SI
NO
NO
SI
SI
TAREA DEL
LABORATORIO
DE ANLISIS
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Validacin de Mtodos Alternativos Acorde a
ISO 16140:2003
(Laboratorio Experto + Intercomparativo)
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El protocolo utilizado para validar los mtodos alternativos se
encuentra en la Norma UNE-EN ISO 16140:2003 que contempla:
Trminos y Definiciones
Principios generales
Validacin de mtodos cualitativos
Validacin de mtodos cuantitativos
Anexos (muestras, Diseo de experiencias, tratamiento
estadstico, estudios colaborativos)
Adems, existen otros protocolos desarrollados para mtodos
microbiolgicos de aguas que pueden servir de referencia como ISO/TR
13843:2000 y UNE-EN ISO 17994:2004)
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Validacin: Confirmacin mediante el examen y la aportacin de
evidencias objetivas que demuestren el cumplimiento de ciertos
requisitos para el uso especfico previsto (ISO 17025 apdo.
5.4.5.1)
Desviacin positiva: Se produce cuando el mtodo a validar da
un resultado positivo y el valor de referencia es negativo. Una
desviacin positiva se convierte en una falso positivo cuando se
puede demostrar que el resultado verdadero es negativo.
Desviacin negativa: Se produce cuando el mtodo a validar da
un resultado negativo y el valor de referencia es positivo. Una
desviacin positiva se convierte en una falso negativo cuando se
puede demostrar que el resultado verdadero es positivo.
Definiciones
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> Desviaciones positivas y negativas
MTODO A
MTODO B
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Sensibilidad relativa: Capacidad del mtodo a validar de
detectar el microorganismo cuando est presente en la muestra a
analizar o no diferir de manera significativa del valor de
referencia.
Especificidad relativa: Capacidad del mtodo a validar para no
detectar el analito cuando no es detectado por el mtodo de
referencia.
Eficacia relativa: Grado de concordancia entre la respuesta
obtenida por el mtodo a validar y el valor verdadero obtenido en
muestras idnticas.
Definiciones
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Nivel de deteccin: Menor nmero de microorganismos que
puede detectarse en una muestra.
Inclusividad: Capacidad para detectar el analito entre un amplio
grupo de cepas diana.
Exclusividad: Ausencia de interferencia en el mtodo de un
grupo de cepas no diana.
Linealidad: Aptitud del mtodo para dar resultados que estn en
proporcin con la cantidad de microorganismos presentes en la
muestra
Exactitud relativa: Grado de concordancia entre un resultado de
anlisis y el valor de referencia aceptado.
Definiciones
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Sesgo: Diferencia entre el resultado esperado del anlisis y un
valor de referencia aceptado.
Limite de cuantificacin: La menor cantidad de
microorganismos que puede ser medido con una precisin y
exactitud definidas
Repetibilidad: Realizacin de los ensayos en las mismas
condiciones (mismo analista, equipos, medios de cultivo)
Reproducibilidad: Realizacin de los ensayos en las condiciones
ms diversas (distinto analista, equipos, dias, medios de
cultivo)
Definiciones
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Ejemplos de precisin y exactitud.
Valores estadsticos de dispersin (desviacin estndar y
coeficiente de variacin)
Definiciones
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Distribucin de poblacin:
Definiciones
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Incertidumbre: Parmetro, asociado al resultado de medida,
que caracteriza la dispersin de los valores que pueden ser
atribuibles de forma razonable a los valores al recuento obtenido.
Definiciones
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Alcance de la validacin ISO 16140
Mtodos presencia/ausencia
Especificidad
Sensibilidad
Eficacia
Desviacin positiva y negativa
Limite de deteccin
Inclusividad y exclusividad
Mtodos cuantitativos
Precisin
Exactitud
Linealidad
Desviacin positiva y negativa
Limite de cuantificacin
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Puesta a punto del mtodo
Planificacin
Ejecucin
Evaluacin de resultados
Informe de validacin
V
A
L
I
D
A
C
I
N
Personal
Matrices
Cepas de referencia
Reproducibilidad
Contaminacin cruzada
Estadstica
Obtencin de parmetros.
Resultados
Registros primarios
Fechas de ejecucin
Personal implicado
Control de calidad
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Validacin por comparacin de mtodos
Se requiere disponer de un mtodo de referencia con el que comparar el mtodo a validar
X g de alimento + 9x ml. De
diluyente
Primera etapa de cultivo
Divisin
Duplicado 1 Duplicado 2
Homogenizacin
Inoculacin (si procede)
DUPLICACIN DE MUESTRAS CUANDO AMBOS MTODOS TIENEN UNA PRIMERA ETAPA COMN
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Validacin por comparacin de mtodos
X g de alimento + x ml. De
diluyente
Divisin
Mtodo de referencia Mtodo alternativo
Inoculacin (si procede)
DUPLICACIN DE MUESTRAS CUANDO AMBOS MTODOS TIENEN DIFERENTES ETAPAS
Productos slidos
X ml. Productos lquidos
Homogenizacin
2x g de homogeneizado (x ml. para
productos lquidos) + 18x ml. De
diluyente (9x ml diluyente en prod.
Lquidos)
2x g de homogeneizado (x ml. para
productos lquidos) + 18x ml. De
diluyente (9x ml diluyente en prod.
Lquidos)
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Matrices a emplear
Alimentacin animal Otros productos (especias, salsas,
huevos, pastas, cereales, bebidas)
Chocolate/productos panadera Productos lcteos
Frutas y verduras Aves de corral
Pescados y mariscos Carnes y producto crnicos
El anexo B de la ISO 16140 incluye recomendacin de matrices vs
microorganismos
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Inoculacin

Tipo de muestras a emplear para la validacin

4.-MATERIALES DE REFERENCIA
3.-MUESTRAS CONTAMINADAS ARTIFICIALMENTE
2.-CONTAMINACIN POR MEZCLA
1.-MUESTRAS NATURALMENTE CONTAMINADAS
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Preparacin inculo.
Empleo de material de referencia
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Si se inocula la muestra, se debe aplicar un stress .
A modo de ejemplo, se pueden aplicar los siguientes
tratamientos:
Tratamiento trmico (ejm. 5 minutos a 50C)
Congelacin (ejm. 72 horas a -20C)
Almacenamiento en refrigeracin (ejm. 4C durante 1
semana)
Preparacin inculo
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Se debe estimar la concentracin del inculo mediante
siembra en medios no selectivo (y selectivos, si se ha
realizado stress):
Sembrar al menos dos placas de dos diluciones contables y
aplicar la frmula (ISO 7218)
Preparacin inculo
) 1 (
1 , 1 xd Vx
C
N

=
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Validacin Mtodos cualitativos
ISO 16140
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Mtodo cualitativo
Laboratorio experto
Anlisis de 300 muestras por ambos mtodos (ref. y alt.) tomadas
de 5 categoras diferentes (aprox. 50% positivas y 50% negativas)
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Laboratorio experto
Obtencin de una tabla comparativa de mtodos:
Anlisis de 300 muestras por ambos mtodos (ref. y alt.) tomadas
de 5 categoras diferentes (aprox. 50% positivas y 50% negativas)
-/- CONCORDANCIA NEGATIVA (NA) +/- DESVIACIN NEGATIVA (ND)
MTODO A VALIDAR
NEGATIVO (A-)
-/+ DESVIACIN POSITIVA (PD)
+/+ CONCORDANCIA POSITIVA
(PA)
MTODO A VALIDAR
POSITIVO (A+)
VALOR REF. NEGATIVO (R-) VALOR REF POSITIVO (R+) RESPUESTA
MTODO A VALIDAR
NEGATIVO (A-)
(PA)
MTODO A VALIDAR
POSITIVO (A+)
Mtodo cualitativo
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EFICACIA RELATIVA (AC):
MTODO A VALIDAR
NEGATIVO (A-)
(PA)
MTODO A VALIDAR
POSITIVO (A+)
ESPECIFIDAD RELATIVA (SP):
SENSIBILIDAD RELATIVA (SE):
100
) (
) (
x
ND PD PA NA
NA PA
AC
+ + +
+
=
100
) (
x
PD NA
NA
SP
+
=
100
) (
x
ND PA
PA
SE
+
=
Como criterio arbitrario AC, SP y SE 90% y ND y PD 10%, o bien estudio de datos discrepantes (Test
McNemar en Anexo F en ISO 16140:2003)
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Nivel de deteccin relativa (ejemplo)
Resultados a concentracin de 13 ufc/25g
6 6 0 Mtodo PCR2
6 6 0 Mtodo referencia
Total Positivos Negativos
Resultados a concentracin de 3 ufc/25g
6 6 0 Mtodo PCR2
6 0 6 Mtodo PCR2
Resultados muestras negativas
El lmite de deteccin para la tcnica de PCR es inferior a 3 ufc/25g
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Laboratorio experto
10 Laboratorios, 3 niveles de contaminacin y 8 rplicas
TOTAL: 480 resultados vlidos
Estimacin del Nivel Deteccin relativa:
Anlisis de 90 muestras (5 matrices, 3 niveles, 6 rplicas)
Inclusividad y exclusividad:
50 y 30 cepas respectivamente
Intercomparativo
Mtodo cualitativo
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Validacin Mtodos cuantitativos
ISO 16140
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Laboratorio experto
Anlisis de 100-500 muestras por ambos mtodos (ref. y alt.)
tomadas de 5 categoras diferentes con 5 concentraciones
Mtodo cuantitativo
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8 Laboratorios, 3 niveles de contaminacin y 4 rplicas
TOTAL: 96 resultados vlidos
Estudio de repetibilidad (r) y Reproducibilidad (R)
Intercomparativo
Estudio de linealidad y precisin. LOD y LOQ
Sesgo (Bias) D y repetibilidad r
Laboratorio experto
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Curva de validacin
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Log ufc/g (recuento placa)
L
o
g

u
f
c
/
g

(
a
l
t
e
r
n
a
t
i
v
o
)
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Los resultados obtenidos muestran que, con respecto al mtodo de referencia, los
anlisis mediante tcnicas impedimtricas presentan una correcta exactitud relativa
y precisin, dado que los coeficientes de la curva de calibracin se ajustan a la
ecuacin ideal (Y=X) y los valores obtenidos se encuentran dentro del intervalo de
confianza del 95% calculado a partir del Error tpico (Sr) y la Tstudent ( = 0,05, 22
gl) Fig. 6.
As mismo, el mtodo se considera lineal o sin defecto de ajuste para el intervalo
estudiado (1.5-6.6 log ufc/g) dado que F calculada (0,242) < F(p) (0.911) (
=0,05, 4 gl num. y 18 gl. den.)
Los valores obtenidos mediante estimaciones basadas en la mediana recursiva de
Rousseeuw, replicados de las dosis ms bajas de diluciones consecutivas y anlisis
de cinco muestras con nivel mnimo ( 0) de las cuales al menos 3 son positivas,
muestran valores muy similares para el lmite de deteccin LD 15 ufc/g y lmite de
cuantificacin LQ 38 ufc/g, variando su incertidumbre calculada para mediante
caja negra de entre un 25% y un 54% para recuentos de 5 log ufc/g y 3 log ufc/g
respectivamente.
El control de calidad de los ensayos se ha mostrado como una herramienta eficaz
para garantizar los resultados obtenidos as como para el desarrollo de grficos de
control.
Validaci Validaci n y control de calidad aplicado a la detecci n y control de calidad aplicado a la detecci n n
de microorganismos alterantes de salsas mediante de microorganismos alterantes de salsas mediante
t t cnicas cnicas impedim impedim tricas tricas
Tom Tom s s Forn Forn s,D s,D.; de Benito .; de Benito Armas Armas, A.; , A.; Alc Alc n n Giner Giner, C. ; , C. ; Monz Monz S S nchez nchez, J.L. , J.L.
INTRODUCCIN
RESULTADOS
ainia ainia, , centro centro tecnol tecnol gico gico. .
Laboratorio Laboratorio de de Bioensayos Bioensayos
Parque Parque Tecnol Tecnol gico gico de Valencia. C/ de Valencia. C/ Benjam Benjam n n Franklin, 5 Franklin, 5- -11. 46980 11. 46980 Paterna Paterna, Spain. , Spain.
E E- -mail: mail: dtomas@ainia.es dtomas@ainia.es
La estabilidad de las salsas de mesa puede verse comprometida por la presencia de microorganismos tales como bacterias lcticas y levaduras, capaces de crecer en las
condiciones de producto: bajo pH, aw e incluso presencia de conservantes. Es por ello que surge la necesidad de disponer de un sistema de anlisis que permita detectar los
niveles de microorganismos dichos en el producto final, ya que podran proliferar durante el almacenamiento y dar lugar a alteraciones.
Las tcnicas impedimtricas permiten la deteccin y cuantificacin de microorganismos gracias a la produccin de metabolitos que son detectados elctricamente, bien de forma
directa o indirecta. Dichas tcnicas, si bien poseen limitaciones, tambin presentan numerosas ventajas con respecto a los mtodos de anlisis convencionales como son la
rapidez, automatizacin, ahorro de mano de obra y manipulacin, reactivos
En este trabajo se ha puesto a punto y validado tcnicas rpidas impedimtricas, basadas en la deteccin de CO2 mediante mtodos indirectos, para su aplicacin en el control
microbiolgico de microorganismos alterantes de salsas finas y ketchup tales como Lactobacillus brevis y Zygosaccharomyces rouxii.
Validacin (Norma UNE-EN ISO 16140:2003) Rto. bacterias acidolcticas
Mtodo de referencia: Recuento en placa (MRS, 301C, 72h)
Protocolo de medicin y diseo experimental:
1.Curva de calibracin primaria: Anlisis mediante impedancia de 24 muestras (2
matrices a 6 niveles por duplicado en condiciones de reproducibilidad) y obtencin de
la recta de regresin de valor de referencia (log ufc/g) frente tiempo deteccin (h)
para obtener recuentos en funcin de tiempo deteccin. (Fig 4)
2. Curva de calibracin final: Obtencin de recta de regresin de recuento mediante
impedancia (log ufc/g) vs. Recuento en placa (log ufc/g) (Fig 6) a partir de la cual se
calcula la exactitud relativa, linealidad o defecto de ajuste y precisin.
3.- Lmite de deteccin y cuantificacin: Anlisis de 75 muestras (2 matrices)
inoculadas a 6 niveles prximos al lmite de deteccin (<1,5 log ufc/g) mediante
mtodo referencia y alternativo en condiciones de reproducibilidad.
4.- Incertidumbre: Anlisis de 20 muestras (2 matrices) inoculadas a 2 niveles en
condiciones de reproducibilidad .
5.- Protocolo de control de calidad: Anlisis de duplicados, muestras inoculadas con
material de referencia, muestras sin contaminacin, verificacin de la temperatura del
bloque con termopares y uso de celdas con resistencias calibradas con un valor de
impedancia estable con cada serie de ensayos.
MATERIALES Y MTODOS
Material de referencia: Cultivos lquidos en fase estacionaria de cepas
salvajes aisladas de salsas alteradas identificadas bioqumica y genticamente
como Lactabacillus brevis y Zygosaccharomyces bailli.
Equipo de impedancia: BacTrac 4300 (Sy-lab instruments GmbH, Austria).
Fig.1 Bloque de impedancia
(64 posiciones, 2 temperaturas)
Fig. 3 Celdas de impedancia y viales
internos (mtodo indirecto)
Fig.2 Curvas de impedancia obtenidas por el mtodo
indirecto. (%Cambio impedancia vs tiempo de
deteccin)
Curva de validacin
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 1 2 3 4 5 6 7 8
L
o
g
u
fc
/g
(im
p
e
d
a
n
c
ia
)
Metodologa del mtodo impedimtrico:
Solucin madre :MRS y GPYB (pH 3,8)
Dilucin 1:10
Temperatura:301C
Tiempo de incubacin:48h
Umbral medida M=-10%
2 celdillas/muestra
TD
Umbral medida
CONCLUSIONES
REFERENCIAS Y AGRADECIMIENTOS
Curso de validacin y clculo de la incertidumbre en ensayos microbiolgicos. Gabinete de servicios
para la calidad. Madrid, 3-5 /12/2001.
Agradecimientos a Dr. Jose Felix lvarez (Gomensoro, S.A.) por su apoyo en el desarrollo de este
trabajo.
Curva de calibracin primaria para Lactobacillus brevis
y = -0,3305x + 9,7031
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 5 10 15 20 25 30
tiempo de deteccin (h)
Lo
g
(u
fc/g
)
Curva de calibracin primaria para Zygosacharomyces
bailli
y = -0,0665x + 6,603
0
1
2
3
4
5
6
7
0 20 40 60 80 100
L
o
g
(u
fc/g
)
Fig.4 Curva de calibracin primaria para
Lactobacillus brevis en Salsa y Ketchup
Fig.5 Curva de calibracin primaria para Z.
bailli en Salsa y Ketchup
Fig.6 Curva de calibracin final para Lactobacillus
brevis:
Ordenada en el origen (a) :0,024 (-0.397; 0.446)
Pendiente (b) : 0,989 (0,896; 1,083)
Coeficiente de correlacin:0,954
(Se indica entre parntesis los valores lmite para
con un IC 95%)
Se ha puesto a punto y validado un mtodo automatizado de anlisis de bacterias
acidolcticas en salsas y ketchup basado en tcnicas impedimtricas, al objeto de
lograr una considerable mejora en el tiempo de deteccin (<24 horas) con respecto
al mtodo de referenncia (72 horas para el recuento en placa) as como en la
disminucin de materiales, reactivos y mano de obra necesaria.
As mismo se ha demostrado la capacidad de la tcnica para el anlisis de otros
microorganismos alterantes (levaduras)
Norma UNE-EN ISO 16140:2003 Microbiologa de los alimentos para consumo humano y animal.
Protocolo para la validacin de mtodos alternativos.
Norma DIN 10115:1999 Principles of detecting and determining microorganismos in foodstuffs
using impedance methods.
Curso sobre validacin y clculo de incertidumbres en laboratorios microbiolgicos. Ases XXI.
Barcelona, 3-4/12/2002
Los resultados obtenidos muestran que, con respecto al mtodo de referencia, los
anlisis mediante tcnicas impedimtricas presentan una correcta exactitud relativa
y precisin, dado que los coeficientes de la curva de calibracin se ajustan a la
ecuacin ideal (Y=X) y los valores obtenidos se encuentran dentro del intervalo de
confianza del 95% calculado a partir del Error tpico (Sr) y la Tstudent ( = 0,05, 22
gl) Fig. 6.
As mismo, el mtodo se considera lineal o sin defecto de ajuste para el intervalo
estudiado (1.5-6.6 log ufc/g) dado que F calculada (0,242) < F(p) (0.911) (
=0,05, 4 gl num. y 18 gl. den.)
Los valores obtenidos mediante estimaciones basadas en la mediana recursiva de
Rousseeuw, replicados de las dosis ms bajas de diluciones consecutivas y anlisis
de cinco muestras con nivel mnimo ( 0) de las cuales al menos 3 son positivas,
muestran valores muy similares para el lmite de deteccin LD 15 ufc/g y lmite de
cuantificacin LQ 38 ufc/g, variando su incertidumbre calculada para mediante
caja negra de entre un 25% y un 54% para recuentos de 5 log ufc/g y 3 log ufc/g
respectivamente.
El control de calidad de los ensayos se ha mostrado como una herramienta eficaz
para garantizar los resultados obtenidos as como para el desarrollo de grficos de
control.
Validaci Validaci n y control de calidad aplicado a la detecci n y control de calidad aplicado a la detecci n n
de microorganismos alterantes de salsas mediante de microorganismos alterantes de salsas mediante
t t cnicas cnicas impedim impedim tricas tricas
Tom Tom s s Forn Forn s,D s,D.; de Benito .; de Benito Armas Armas, A.; , A.; Alc Alc n n Giner Giner, C. ; , C. ; Monz Monz S S nchez nchez, J.L. , J.L.
INTRODUCCIN
RESULTADOS
ainia ainia, , centro centro tecnol tecnol gico gico. .
Laboratorio Laboratorio de de Bioensayos Bioensayos
Parque Parque Tecnol Tecnol gico gico de Valencia. C/ de Valencia. C/ Benjam Benjam n n Franklin, 5 Franklin, 5- -11. 46980 11. 46980 Paterna Paterna, Spain. , Spain.
E E- -mail: mail: dtomas@ainia.es dtomas@ainia.es
La estabilidad de las salsas de mesa puede verse comprometida por la presencia de microorganismos tales como bacterias lcticas y levaduras, capaces de crecer en las
condiciones de producto: bajo pH, aw e incluso presencia de conservantes. Es por ello que surge la necesidad de disponer de un sistema de anlisis que permita detectar los
niveles de microorganismos dichos en el producto final, ya que podran proliferar durante el almacenamiento y dar lugar a alteraciones.
Las tcnicas impedimtricas permiten la deteccin y cuantificacin de microorganismos gracias a la produccin de metabolitos que son detectados elctricamente, bien de forma
directa o indirecta. Dichas tcnicas, si bien poseen limitaciones, tambin presentan numerosas ventajas con respecto a los mtodos de anlisis convencionales como son la
rapidez, automatizacin, ahorro de mano de obra y manipulacin, reactivos
En este trabajo se ha puesto a punto y validado tcnicas rpidas impedimtricas, basadas en la deteccin de CO2 mediante mtodos indirectos, para su aplicacin en el control
microbiolgico de microorganismos alterantes de salsas finas y ketchup tales como Lactobacillus brevis y Zygosaccharomyces rouxii.
Validacin (Norma UNE-EN ISO 16140:2003) Rto. bacterias acidolcticas
Mtodo de referencia: Recuento en placa (MRS, 301C, 72h)
Protocolo de medicin y diseo experimental:
1.Curva de calibracin primaria: Anlisis mediante impedancia de 24 muestras (2
matrices a 6 niveles por duplicado en condiciones de reproducibilidad) y obtencin de
la recta de regresin de valor de referencia (log ufc/g) frente tiempo deteccin (h)
para obtener recuentos en funcin de tiempo deteccin. (Fig 4)
2. Curva de calibracin final: Obtencin de recta de regresin de recuento mediante
impedancia (log ufc/g) vs. Recuento en placa (log ufc/g) (Fig 6) a partir de la cual se
calcula la exactitud relativa, linealidad o defecto de ajuste y precisin.
3.- Lmite de deteccin y cuantificacin: Anlisis de 75 muestras (2 matrices)
inoculadas a 6 niveles prximos al lmite de deteccin (<1,5 log ufc/g) mediante
mtodo referencia y alternativo en condiciones de reproducibilidad.
4.- Incertidumbre: Anlisis de 20 muestras (2 matrices) inoculadas a 2 niveles en
condiciones de reproducibilidad .
5.- Protocolo de control de calidad: Anlisis de duplicados, muestras inoculadas con
material de referencia, muestras sin contaminacin, verificacin de la temperatura del
bloque con termopares y uso de celdas con resistencias calibradas con un valor de
impedancia estable con cada serie de ensayos.
MATERIALES Y MTODOS
Material de referencia: Cultivos lquidos en fase estacionaria de cepas
salvajes aisladas de salsas alteradas identificadas bioqumica y genticamente
como Lactabacillus brevis y Zygosaccharomyces bailli.
Equipo de impedancia: BacTrac 4300 (Sy-lab instruments GmbH, Austria).
Fig.1 Bloque de impedancia
(64 posiciones, 2 temperaturas)
Fig. 3 Celdas de impedancia y viales
internos (mtodo indirecto)
Fig.2 Curvas de impedancia obtenidas por el mtodo
indirecto. (%Cambio impedancia vs tiempo de
deteccin)
Curva de validacin
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 1 2 3 4 5 6 7 8
L
o
g
u
fc
/g
(im
p
e
d
a
n
c
ia
)
Metodologa del mtodo impedimtrico:
Solucin madre :MRS y GPYB (pH 3,8)
Dilucin 1:10
Temperatura:301C
Tiempo de incubacin:48h
Umbral medida M=-10%
2 celdillas/muestra
TD
Umbral medida
TD
Umbral medida
CONCLUSIONES
REFERENCIAS Y AGRADECIMIENTOS
Curso de validacin y clculo de la incertidumbre en ensayos microbiolgicos. Gabinete de servicios
para la calidad. Madrid, 3-5 /12/2001.
Agradecimientos a Dr. Jose Felix lvarez (Gomensoro, S.A.) por su apoyo en el desarrollo de este
trabajo.
Curva de calibracin primaria para Lactobacillus brevis
y = -0,3305x + 9,7031
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 5 10 15 20 25 30
Lo
g
(u
fc/g
)
Curva de calibracin primaria para Zygosacharomyces
bailli
y = -0,0665x + 6,603
0
1
2
3
4
5
6
7
0 20 40 60 80 100
L
o
g
(u
fc/g
)
Fig.4 Curva de calibracin primaria para
Lactobacillus brevis en Salsa y Ketchup
Fig.5 Curva de calibracin primaria para Z.
bailli en Salsa y Ketchup
Fig.6 Curva de calibracin final para Lactobacillus
brevis:
Ordenada en el origen (a) :0,024 (-0.397; 0.446)
Pendiente (b) : 0,989 (0,896; 1,083)
Coeficiente de correlacin:0,954
(Se indica entre parntesis los valores lmite para
con un IC 95%)
Se ha puesto a punto y validado un mtodo automatizado de anlisis de bacterias
acidolcticas en salsas y ketchup basado en tcnicas impedimtricas, al objeto de
lograr una considerable mejora en el tiempo de deteccin (<24 horas) con respecto
al mtodo de referenncia (72 horas para el recuento en placa) as como en la
disminucin de materiales, reactivos y mano de obra necesaria.
As mismo se ha demostrado la capacidad de la tcnica para el anlisis de otros
microorganismos alterantes (levaduras)
Norma UNE-EN ISO 16140:2003 Microbiologa de los alimentos para consumo humano y animal.
Protocolo para la validacin de mtodos alternativos.
Norma DIN 10115:1999 Principles of detecting and determining microorganismos in foodstuffs
using impedance methods.
Curso sobre validacin y clculo de incertidumbres en laboratorios microbiolgicos. Ases XXI.
Barcelona, 3-4/12/2002
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TABLA RESUMEN VALORES ESTADSTICOS
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TABLA RESUMEN VALORES ESTADSTICOS
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VALOR
DIANA
MTODO
ALTERNATIVO B
VLIDO
VALOR
DIANA
MTODO
ALTERNATIVO A
NO VALIDO
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VALOR
DIANA
LMITE DE
ACEPTACIN
MTODO
ALTERNATIVO B
BAJA
PROBABILIDAD
ACEPTACIN
VALOR
DIANA
LMITE DE
ACEPTACIN
MTODO
ALTERNATIVO A
ALTA
PROBABILIDAD
ACEPTACIN
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VALOR
DIANA
LMITE DE
ACEPTACIN
MTODO
ALTERNATIVO B
BAJA
PROBABILIDAD
ACEPTACIN
VALOR
DIANA
LMITE DE
ACEPTACIN
MTODO
ALTERNATIVO A
ALTA
PROBABILIDAD
ACEPTACIN
REGIN DE
ACEPTACIN
REGIN DE
ACEPTACIN
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Certificacin de Mtodos Alternativos
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> Organismos de Certificacin:
En la actualidad, existen diversos organismos que CERTIFICAN la
validez de mtodos alternativos:
AFNOR VALIDATION (http://www.afnor-validation.org/)
AOAC RI(http://www.aoac.org/)
MICROVAL (http://www.microval.org/)
NordVal: (http://www.nmkl.org/NordVal/NordVal.htm)
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> Ventajas y Limitaciones:
VENTAJAS:
Garantizar validez del mtodo, ventajas y limitaciones.
Calidad en la fabricacin del kit
Revisin y actualizacin de mtodos
Evaluacin por organismo independiente (Rto. 2073)
LIMITACIONES:
Proceso Lento
Coste importante
Requiere de mtodos optimizados y robustos
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Mtodos certificados por patgenos
Certificacin de
mtodos
alternativos
0
5
10
15
20
25
30
35
S
a
l
m
o
n
e
l
l
a
L
i
s
t
e
r
i
a

s
p
p
L
i
s
t
e
r
i
a

m
o
n
o
c
y
t
o
g
e
n
e
s
E
.

c
o
l
i

O
1
5
7
C
r
o
n
o
b
a
c
t
e
r
C
a
m
p
y
l
o
b
a
c
t
e
r
AFNOR
MicroVAL
AOAC
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Mtodos certificados por tecnologas
Certificacin de
mtodos
alternativos
AOAC
Inmunoenzimtica
Gentica
Cultivo
AFNOR
Inmunoenzimtica
Gentica
Cultivo
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Verificacin interna
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> rbol de decisin
MTODO ALTERNATIVO
VALIDADO?
CERTIFICADO?
Es completa
la validacin?
VALIDACIN
CUALITATIVO
Exclusividad/Inclusividad
Eficacia, sensibilidad y especificidad
Desviacin negativa y positiva
CUANTITATIVO
Lmite deteccin y cuantificacin.
-Linealidad y precisin.
-Sensibilidad
COMPROBAR EL FUNCIONAMIENTO
CUALITATIVO
CUANTITATIVO
Recuperacin
Precisin
Matrices
Analistas
Equipos
Reactivos
VALIDAR (ISO 16140)
Registros y evaluacin del
funcionamiento
Criterios Control de
Calidad Interno
CERTIFICADO
NO
SI
NO
NO
SI
SI
TAREA DEL
LABORATORIO
DE ANLISIS
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> Consideraciones Generales
Consiste en comprobar que es capaz de cumplir con los requisitos
de funcionamiento del mtodo en las condiciones HABITUALES Y
REALES de trabajo.
Trabajar en condiciones de REPRODUCIBILIDAD
INTRALABORATORIO: Diferentes das, matrices, lotes de reactivos,
analistas, etc
En el caso se debe utilizar el mtodo alternativo TAL Y COMO HA
SIDO DISEADO por el fabricante y detectar las LIMITACIONES en
su aplicacin en mi laboratorio (matrices, microorganismos)
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Formalmente, el mtodo debe verificarse ANTES de emitir
resultados.
En algunos casos (mtodos ampliamente reconocidos y
validados) puede comprobarse a travs de CONTROL DE CALIDAD
INTERNO, siempre que su diseo sea similar al indicado
anteriormente.
Tambin pueden emplearse resultados procedentes de
EJERCICIOS INTERCOMPARATIVOS, aunque en este caso el tipo
de matrices a analizar no suele ser representativo de muestras
reales.
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No se puede verificar una matriz que NO se encuentre en el
alcance del mtodo a verificar.
Debe emplearse al menos una matriz para las que el mtodo
haya sido evaluado.
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> Matrices a verificar
Las HABITUALMENTE ANALIZADAS en el laboratorio (entre
30 y 50 muestras de diferentes productos).
+
Si se desea comprobar para TODO TIPO DE ALIMENTOS,
muestras diferentes de 3 a 5 categoras (total entre 30 y 50
muestras) tomando como referencia el Anexo B ISO 16140
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> Matrices a verificar
Las matrices deben contener la flora habitualmente presente (no
esterilizar) e idealmente contaminacin natural del
microorganismo diana.
OPCIN 1: Muestras naturalmente contaminadas.
OPCIN 2: Contaminacin por mezcla.
OPCIN 3: Muestras contaminadas artificialmente.
OPCIN 4: Materiales de referencia.
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Verificacin de Mtodo Cuantitativo
(Recuento)
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> Diseo experiencias:
MUESTRA DE ALIMENTO
CONDICIN A
SOLUCIN MADRE
ANALISIS
CONDICIN B
SOLUCIN MADRE
ANALISIS
CONTAMINACIN
ARTIFICIAL
(SI ES NECESARIO)
CONDICIONES DIFERENTES
Valor/Met. Referencia
SOLUCIN MADRE
ANALISIS
Resultado A Resultado B
Resultado R
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Si tenemos implantado el mtodo de referencia, analizamos tambin la muestra
por dicho mtodo (una nica vez) para obtener el valor de referencia.
Si no disponemos se puede emplear como valor el del material de referencia
(propio o ya preparado comercialmente)
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> Parmetros a estimar:
> RECUPERACIN.
1.- Calcular la diferencia (en valor logartmico) el Resultado A con el
Resultado R (valor de referencia) as como del Resultado B con el
Resultado R en cada caso y obtener el sesgo a partir del valor medio de
todas las diferencia (en log ufc/g)
0,11 0,16 4,45 4,40 4,56 2,80E+04 2,50E+04 3,60E+04
-0,13 -0,30 2,53 2,70 2,40 3,40E+02 5,00E+02 2,50E+02
0,04 0,07 4,91 4,88 4,95 8,20E+04 7,50E+04 8,90E+04
-0,04 -0,15 3,54 3,65 3,51 3,50E+03 4,50E+03 3,20E+03
-0,25 -0,18 5,61 5,54 5,36 4,10E+05 3,50E+05 2,30E+05
Dif R-B Dif R-A B(log ufc/g) A (log ufc/g) R (Log ufc/g) RESULTADO B RESULTADO A RESULTADO R
Promedio diferencias (D) -0,07
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> RECUPERACIN.
1.- Comparar con el sesgo (Bias) del certificado. En caso de grandes
discrepancias puede realizarse un estudio estadstico de las mismas
Promedio diferencias (D) -0,07
2.- Tambin puede estimarse a partir de este valor la recuperacin del
mtodo:
Recuperacin = 10
(D)
= 10
-0.07
= 0,86 = 86%
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> Precisin:
1.- Transformar los valores ufc/g del resultado A y B a valor
logartmico (Recuentos que contengan al menos 10 ufc/placa).
2.- Calcular la media cuadrtica de los duplicados del resultado A
y B.
3.- Estimar la desviacin estndar (SR) de la reproducibilidad:
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> Precisin: (tomado de ISO/TS19036)
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> Precisin:
4.- Este dato permite calcular la Reproducibilidad intermedia (R)
segn la frmula:
5.- Comparar la Reproducibilidad intermedia obtenida debe ser
inferior a la del certificado (es recomendable comparar con el
valor r del laboratorio experto o con el valor r del
intercomparativo):
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> Precisin:
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ISO 7932-2 R=0.42 r=0.29 B. cereus
ISO 6888-1 R=0.43 r=0.28 S. aureus
ISO 19036 S
R
=0.52 Sr = 0.04 Enterobacter.
ISO 19036 S
R
=0.75 Sr = 0.29 Mohos y
levaduras
ISO 19036 S
R
=0.47 Sr = 0.11 E. coli
ISO 4832 S
R
=0.5 Sr = 0.20 Coliformes
totales
ISO 4833 R=0,45 r=0,25 Aerobios
mesfilos
Referencia Reproducibil. Repetibilidad Ensayo
Se recomienda tomar como criterio en lugar del R (reproducibilidad
interlaboratorios) el valor de referencia identificado como r (repetibilidad
intralaboratorio) que es ms semejante a las condiciones experimentales
que se dan en este tipo de verificaciones.
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Estimacin de Incertidumbre
ISO 19036
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Incertidumbre
La evaluacin de incertidumbre es necesaria para aquellos laboratorios
acreditados bajo un sistema ISO 17025, de forma que se pueda informar al
cliente de su valor cuando este valor sea relevante, por ejemplo en casos en
los que se obtengan niveles de microorganismos prximos a un lmite legal.
La estimacin de la incertidumbre permite conocer la confianza que se
puede tener de un resultado analtico, pero no est relacionada con la
competencia del laboratorio.
Existen dos formas de estimar la incertidumbre:
Suma de componentes
Modelo Caja negra
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Incertidumbre
El modelo de suma de componentes es vlido para la estimacin de la
incertidumbre, pero se aplica principalmente para anlisis de naturaleza
qumica.
La ISO 19036 considera que este enfoque no se adapta satisfactoriamente por
lo que recomienda usar el enfoque global o de caja negra dada la dificultad
de estimar la contribucin de cada componente individual dado que:
El analito es un organismo vivo y su estado fisiolgico es altamente
variable.
El microorganismo a analizar incluye generalmente diferentes cepas,
especies o gneros.
La ISO 21748 indica que ambos enfoques no son excluyentes si bien el primer
enfoque (suma de componentes) puede subestimar su valor.
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Incertidumbre
La estimacin de la incertidumbre segn la ISO 19036 se basa en la
estimacin de la desviacin estandar de la reproducibilidad del resultado
final.
No se aplica a NMP ni a bajos recuentos (inferiores a 10 ufc/placa) Se
puede aplicar a recuentos entre 10 y 30 ufc/placa si Sr<2 log ufc/g,
considerando todas las placas contables.
La estimacin de la incertidumbre de una forma completa incluye dos tipos
de variabilidad:
La precisin que puede estimarse analiticamente (error aleatorio)
El sesgo o error sistemtico que es la desviacin con el valor verdadero.
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Incertidumbre
Principales fuentes de incertidumbre en microbiologia de alimentos:
MUESTREO
MUESTRA
ANALITICA
MATRIZ
EQUIPO,
MEDIOS DE
CULTIVO,
REACTIVOS
SUBMUESTREO
/SOLUCIN
MADRE
SESGO
ERRORES
RESIDUALES
ALEATORIOS
ANALISTA
RESULTADO ANLISIS MICROBIOLGICO
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Incertidumbre
Al respecto del sesgo, dado la naturaleza emprica de los resultados obtenidos,
(se obtiene directamente el resultado de medida en ufc) incluso empelado
materiales de referencia o valores de interlaboratorio solo se puede estimar
parte de este sesgo.
Por ello, dada la dificultad de su estimacin, se contempla la necesidad de
mantener este error bajo control mediante la participacin en interlaboratorios
o la realizacin de controles de calidad internos con el empleo de material de
referencia.
La medicin de la incertidumbre a travs de la desviacin estandar de la
reproducibilidad se puede realizar por orden de prioridad a partir de:
Resultados de pruebas intralaboratorio
Resultados de interlaboratorio
Resultados de un ejercicio colaborativo.
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Incertidumbre
Para proceder a su estimacin experimental se debe considerar todos los
factores que aporten variabilidad en el laboratorio segn el esquema que
hemos visto anteriormente.
De cada tipo de matriz que habitualmente analice el laboratorio se deben
realizar 10 anlisis por duplicado en diferentes das y condiciones.
Debe contemplarse preferiblemente el empleo de muestras naturalmente
contaminadas. En caso contrario (inoculacin artificial) debemos saber que no
estamos estimado la hetereogeneidad propia de los microorganismos en la
muestra.
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Incertidumbre
Fuentes contempladas en el estudio intralaboratorio:
MUESTREO
MUESTRA
ANALITICA
MATRIZ
EQUIPO,
MEDIOS DE
CULTIVO,
REACTIVOS
SUBMUESTREO
/SOLUCIN
MADRE
SESGO
ERRORES
RESIDUALES
ALEATORIOS
ANALISTA
RESULTADO ANLISIS MICROBIOLGICO
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Incertidumbre
MUESTRA DE ALIMENTO
CONDICION A
SOLUCIN MADRE
ANALISIS
CONDICION B
SOLUCIN MADRE
ANALISIS
CONDICIONES DIFERENTES
CONTAMINACIN
ARTIFICIAL
(SI ES NECESARIO)
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Incertidumbre
Los resultados de los duplicados se pasan a valor logaritmico y
posteriormente se estima la desviacin estandar de la
reproducibilidad
Donde Y
iA
e Y
iB
son respectivamente los recuentos de los duplicados
de cada muestra el log ufc/g y n el nmero total de muestras
analizadas
=
n
i
iB iA
R
n
y y
S
1
2
2 / ) (
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Incertidumbre
Finalmente es importante considerar como expresar los resultados en
funcin del valor obtenido
Y 2Sr (log)
X ufc/g (10
y-2Sr
, 10
y+2Sr
)
Donde se puede observar la asimetra del intervalo cuando
expresamos el valor en ufc/g
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Incertidumbre
Si el valor de recuento (nmero total de colonias) es muy bajo, (ejm si Sr =
0,3 y suma de todas las colonias inferior a 20) se debe emplear la siguiente
frmula:
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Verificacin de Mtodo Alternativo
Cualitativo (Presencia/Ausencia)
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> Nivel de deteccin relativo.
Comprobar que podemos detectar muestras con un nivel bajo de
contaminacin.
Inocular la muestra con microorganismos diana entre 1 y 25 ufc/muestra
21 7 14 12 2 7
20 7 13 10 2 6
19 6 12 9 2 5
18 5 11 6 1 4
16 4 10 5 <1 3
14 4 9 4 <1 2
13 3 8 2 <1 1
Superior Inferior Superior Inferior
Intervalo de confianza
(95%)
Nmero de
colonias
Intervalo de confianza
(95%)
Nmero de
colonias
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Para la preparacin del inculo se puede empelar material de
referencia listo para su uso o preparado a partir de cepas de
referencia.
En este ltimo caso es importante asegurarse de contar un
nmero suficiente de colonias para garantizar la validez del
recuento.
Ejm.: Sembrando un mayor nmero de placas o si no es posible
analizar una dilucin ms concentrada de la muestra.
> Estimacin del valor de referencia:
Debe analizarse 10 muestras por matriz con resultados positivos y
2 muestras blancas (sin inocular). Se recomienda un 100% de
aciertos.
(FDA: 6 replicas + y 6 rplicas con <30 ufc/25g)
> Otros parmetros de inters:
MTODO A VALIDAR
NEGATIVO (A-)
(PA)
MTODO A VALIDAR
POSITIVO (A+)
EFICACIA RELATIVA (AC):
ESPECIFIDAD RELATIVA (SP):
SENSIBILIDAD RELATIVA (SE):
100
) (
) (
x
ND PD PA NA
NA PA
AC
+ + +
+
=
100
) (
x
PD NA
NA
SP
+
=
100
) (
x
ND PA
PA
SE
+
=
Preparacin de muestras
Normas para toma y preparacin de muestras:
Integracin de muestras de un mismo lote para el ahorro de
carga analtica.
Siempre debe verificarse la capacidad de obtener resultados
equivalentes y de estudiar el tamao mximo de muestra a
integrar.
En general las normas de investigacin se desarrollan para el
anlisis de 25g y si se emplean mayores cantidades de
muestra debe verificarse.
Integracin de muestras para
deteccin de patgenos
INTEGRACION DE MUESTRAS EN FASE INICIAL
N=5
25g
Pre-enriquecimiento integrado
1250 ml APT
37C 18-24h
Siembra en
caldos enriquecimiento
Siembra en placa
Integracin de muestras para
deteccin de patgenos
INTEGRACION DE CALDOS EN ENRIQUECIMIENTO
n=5
25g
Pre-enriquec.
225 ml APT
37C 18-24h
Integracin en
caldos enriquecimiento
Siembra en placa
Conclusiones
El laboratorio debe utilizar mtodos de ensayo que satisfagan las
NECESIDADES DEL CLIENTE y sean apropiados para el USO
PREVISTO.
El empleo de mtodos alternativos esta reconocido, siempre que
se demuestre su VALIDEZ Y EQUIVALENCIA.
La CERTIFICACIN de la validez del mtodo aporta una garanta
aadida, en algunos casos necesaria.
Es necesario VERIFICAR en el propio laboratorio y en
CONDICIONES REALES que el mtodo funciona acorde a lo
esperado y se que ha implantado adecuadamente.
Comparacin con valor de
referencia.
Empleo opcional del stress
celular.
Realizacin ejercicio
colaborativo (8-10
participantes)
Inoculacin y estabilizacin
de muestras (stress
celular)
OTROS ASPECTOS
Linealidad
Exactitud
Precisin/reproducibilidad
Inclusividad/exclusividad
Limite
deteccin/cuantificacin
Desviacin + y -
Eficacia
Sensibilidad
Especificidad
Cualitativo Cuantitativo Cualitativo Cuanti.
VERIFICACIN INTERNA VALIDACIN
Control de calidad interno en laboratorios de
microbiologa.
Factores que afectan al control de calidad de los ensayos
Introduccin
CONTENIDOS
Tipologas de control de calidad interno.
Controles de 1er nivel
Controles de 2 nivel
Controles de 3er nivel
Controles de equipo.
Controles de ensayo.
Controles para mtodos automatizados (VIDAS/TEMPO)
Conclusiones
Introduccin.
La Norma UNE-EN ISO 17025:2005 (punto 5.9) indica que el
laboratorio debe tener procedimientos de control de calidad para
realizar el seguimiento de la validez de los ensayos ()
Adems, el control de calidad interno debe permitir obtener
informacin que indique si mtodos son apropiados para el tipo y
volumen de trabajo que se realiza de forma cotidiana en el
laboratorio.
El control de calidad debe realizarse de tal forma que permita detectar
tendencias y aplicar tcnicas estadsticas para la revisin de los
resultados.
Objetivos del control de calidad
Los datos debe ser analizados y si no satisfacen los criterios
predefinidos se deben tomar acciones planificadas para corregir el
problema y evitar los resultados incorrectos.
Es por ello que el control de calidad requiere del establecimiento de:
Sistemtica (COMO) Tipo de control a realizar
Criterios (QU) Forma de evaluar los resultados obtenidos
Planificacin (CUANDO) Frecuencia con la que voy a realizar
estos controles
Factores que afectan al control de calidad
Los factores
PERSONAL
Formacin acadmica
Formacin in situ
Motivacin
Formacin continua
MTODOS DE ENSAYO
Fundamento
Validacin/verificacin
Reconocimiento
Adaptaciones
EQUIPOS
Calidad
Plan de mantenimiento
Verificacin/calibracin
Supervisin
CONDICIONES AMBIENTALES
Infraestructura
Diseo de flujos
Control de condiciones ambientales
MEDIOS DE CULTIVO
/ REACTIVOS
Formulacin
Composicin
Preparacin
Productividad/Selectividad
RESULTADOS
El control de calidad planificado debe realizarse de forma que todos
estos factores no se estudien de forma independiente, sino de forma
integrada, de modo que puedan evidenciarse interferencias entre los
mismos.
En el diseo del plan de control debe contemplarse:
Procedimientos empleados
Matrices a analizar
Equipos empleados
Medios de cultivo y reactivos
Analistas
Condiciones ambientales y otros aspectos relacionados.
Niveles de control de calidad interno
Aseguramiento de la calidad
1er NIVEL
Es responsabilidad de los analistas que ejecutan los ensayos y quien los
supervisa directamente, siendo el que se ejecuta con mayor frecuencia.
Su objetivo es asegurar que los resultados obtenidos estn bajo control
2 NIVEL
Es responsabilidad de una persona diferente a la que ejecuta los ensayos
y se lleva a cabo con una menor frecuencia. Su objetivo es garantizar
que diferentes analistas o diferentes equipos permitan obtener
resultados similares. (es decir evaluar errores sistemticos o sesgos)
3er NIVEL
Es responsabilidad del Jefe de Laboratorio y pretende garantizar la
competencia tcnica del laboratorio mediante la intercomparacin de los
resultados con otros laboratorio (control externo)
Se trata de un AUTOCONTROL que pretende evaluar el trabajo diario.
As pues incluye las operaciones de control que realiza el analista
durante la ejecucin de los ensayos, as como la supervisin directa
de los resultados por la persona cualificada para ello.
Muchas de estas operaciones se realizan de forma rutinaria sin
generar registros como puede ser:
Control de correcto etiquetado y estado de las muestras
Verificacin del estado del equipo (etiquetas de uso)
Esterilidad del material y medios de cultivo
Ajustes y supervisin de equipos (tarado)
Volmenes empleados
CONTROL INTERNO DE CALIDAD
Nivel I
Controles de esterilidad o negativos
Con este control se pretende asegurar la esterilidad de los medios de
cultivo empleados y la asepsia de las operaciones de anlisis.
Se realiza mediante la siembra de un volumen de cada uno de los
medios de cultivo utilizados, as como del diluyente de la solucin
madre y de las diluciones seriadas.
Se puede realizar diariamente o con cada serie analtica,
preferentemente al finalizar la serie de siembras de muestras.
Su evaluacin se realiza comprobando que las placas de control de
esterilidad no deben presentar crecimiento.
Nivel I
Siembra de duplicados (ensayos cuantitativos)
Pretende detectar hetereogeneidad en los factores relacionados con
el ensayo.
Consiste en sembrar por duplicado las placas de recuento en
muestras positivas.
La frecuencia a realizar esta siembra duplicada puede ser semanal o
bien cada 100 anlisis.
Para su evaluacin se puede utilizar los lmites de ajuste con una
probabilidad del 99% como se muestra en la tabla siguente:
Nivel I
Nivel I
Para su evaluacin se puede utilizar los lmites de ajuste con
una probabilidad del 99% como se muestra en la frmula y
tabla siguiente (ISO 14461-2):
Nivel I
MXIMA DE DISPERSIN PLACAS DUPLICADAS
PLACA A PLACA B PLACA A PLACA B
5 16 155 203
10 24 160 209
15 32 165 214
20 39 170 220
25 46 175 226
30 53 180 232
35 59 185 237
40 66 190 243
45 72 195 249
50 78 200 254
55 85 205 260
60 91 210 265
65 97 215 271
70 103 220 277
75 109 225 282
80 115 230 288
85 121 235 294
90 127 240 299
95 133 245 305
100 139 250 310
105 145 255 316
110 151 260 321
115 157 265 327
120 163 270 333
125 168 275 338
130 174 280 344
135 180 285 349
140 186 290 355
145 192 295 360
150 197 300 366
Control del factor de dilucin (ensayos cuantitativos)
Pretende realizar un control de los volmenes de dilucin,
operaciones de manipulacin, microorganismos que presentan
agregados o problemas de dispersin y/o inhibiciones de la matriz.
Se realiza simultneamente a la lectura de las placas de ensayo y
consiste en evaluar las diferencias entre las colonias detectadas en
sucesivas diluciones decimales, asumiendo que estas debe
encontrarse dentro de ciertos lmites:
Nivel I
Control del factor de dilucin (ensayos cuantitativos)
Nivel I
Nivel I
Colonias totales dilucin
siguiente (10
-(x+1)
)
Colonias totales dilucin
siguiente (10
-(x+1)
)
Colonias
totales
dilucin 10
-x
Limite
inferior
Limite
superior

Colonias
totales
dilucin 10
-x

Limite
inferior
Limite
superior
10 0 4 155 7 27
15 0 6 160 7 28
20 0 7 165 7 28
25 0 8 170 8 29
30 0 8 175 8 30
35 1 9 180 8 30
40 1 10 185 9 31
45 1 11 190 9 32
50 1 12 195 9 32
55 1 13 200 10 33
60 1 13 205 10 34
65 2 14 210 10 34
70 2 15 215 11 35
75 2 16 220 11 35
80 2 16 225 12 36
85 3 17 230 12 37
90 3 18 235 12 37
95 3 19 240 13 38
100 3 19 245 13 39
105 4 20 250 13 39
110 4 21 255 13 40
115 4 21 260 14 41
120 5 22 265 14 41
125 5 23 270 15 42
130 5 24 275 15 42
135 5 24 280 16 43
140 6 25 285 16 44
145 6 26 290 16 44
150 6 26 295 17 45
155 7 27 300 17 46

CONTROL CALIDAD INTERNO
Nivel II
Su objetivo es garantizar la reproducibilidad entre los diversos
analistas, equipos y condiciones de ensayo, as como la influencia de
las matrices y flora natural presente en las muestras que
habitualmente analiza el laboratorio.
Consisten bsicamente en la realizacin de ensayos intralaboratorio
(o de interlaboratorio, si bien debe tenerse en cuenta el efecto matriz)
Puede estar constituido por muestras ciegas (los analistas conocen
que se trata de un ensayo de control de calidad pero desconocen el
valor diana) o por doble ciegas (adems se desconoce que se trata de
un ensayo de evaluacin de calidad)
Nivel II
La frecuencia vara en funcin del nmero de muestras que se
analicen (ejm.: 1% de las mismas) o bien por un criterio temporal
(ejm. Control mensual en aquellos ensayos que no se realicen
frecuentemente)
En el caso de ensayos que se ejecutan con baja frecuencia,
debe/puede realizarse el control de calidad de forma simultnea a la
realizacin de los mismos.
Los criterios deben ser coherentes con los resultados obtenidos en la
validacin/verificacin del mtodo.
Nivel II
Mtodos cuantitativos:
Deben asegurar que la PRECISIN y la EXACTITUD
del mtodo estn bajo control, as como es
interesante estudiar tendencias de los mismos. Para
ello pueden emplearse grficos de control.
Para realizarlo es necesario disponer de al menos
15-20 valores (obtenidos en condiciones de
reproducibilidad) de los que se disponga de un
valor de referencia (que pueden proceder de los
ensayos realizados para la validacin interna de la
tcnica)
Nivel II
RECUPERACIN RELATIVA:
Construir un grfico de control a partir de los valores obtenidos en la
comprobacin del mtodo.
Transformar todos los resultados en log ufc/g.
Estimar la diferencia de cada resultado (de forma individual) con el
valor de referencia (R), por ejemplo Log ufc/g (A) Log ufc/g (R), as
como Log ufc/g (B) Log ufc/g (R)
Nivel II
RECUPERACIN RELATIVA:
Estimar el valor medio de estas diferencias
(dmedia)
Estimar la desviacin estndar de las diferencias
(Sd)
Limite Control Superior LCS= dmedia+1,88 Sd
Limite Control Inferior LCI = dmedia-1,88 Sd
Nivel II
Evaluacin de resultados:
Realizar CCI y estimar la diferencia entre cada valor y el valor
de referencia en unidades logartmicas.
Se considera un punto fuera de control (que deber ser
evaluado y en su caso tratado como trabajo no conforme) si:
1 valor se sale de los lmites establecidos.
7 valores consecutivos en la misma parte del grfico
Existe tendencias ascendentes o descendentes.
Si ms de 2/3 de los puntos estn en el tercio central implica
que se deben recalcular los lmites LCS y LCI.
Nivel II
PRECISIN:
Se realiza a partir de los resultados obtenidos en las
dos submuestras A y B.
Transformar los resultados de las dos submuestras
(A y B) a log ufc/g.
Calcular el valor absoluto de la diferencia de ambos
valores logartmicos segn la frmula:
Nivel II
PRECISIN:
) / (log ) / (log g ufc B g ufc A R =
Construir grfico de control:
Lmite de Control Superior (LCS):
Opcin 1: valor R obtenido en los ensayos de comprobacin del
mtodo.
Opcin 2: Referencias externas (ejm valor r de intercomparativos)
Opcin 3: Valores de una secuencia de duplicados previa.
Nivel II
PRECISIN:
) / (log ) / (log g ufc B g ufc A R =
EVALUACIN DE RESULTADOS:
Los datos deben ser inferiores al valor LCS as como se debe
verificar si existen tendencias ascendentes o bien si ms de 2/3
de los puntos estn en el tercio inferior, en cuyo caso debern
recalcularse los valores de R
Nivel II
Mtodos cualitativos:
Estimar la eficacia (coincidencia con el valor diana a
un nivel determinado siendo el valor diana para
muestras positivas que contengan el
microorganismo a detectar con valores de entre el
LD y 10xLD)
CONTROLES DE 3er NIVEL (INTERCOMPARATIVOS)
Organizados por entidades que preparan muestras estables con
un contenido en microorganismos conocido cuantitativa y
cualitativamente.
Se debe contar con un elevado nmero de laboratorios
participantes.
Cada laboratorio realiza los anlisis con los mtodos que
habitualmente utiliza.
Los resultados son tratados de forma confidencial y evaluados
por el organizador.
El laboratorio recibe un certificado con los resultados globales del
ejercicio y con su evaluacin particular.
EJECUCIN:
Se debe emplear el mismo mtodo que en rutina.
Pueden participar diversos analistas o un nico analista
(especialmente si est en cualificacin)
Es recomendable, si es posible, analizar submuestras en el
ejercicio para complementar los controles de segundo nivel.
En este caso se deber decidir a priori cual de los resultados
sern los remitidos al organizador.
EVALUACIN:
La realiza el organizador, generalmente mediante Zscore.
Zscore inferior a 2 satisfactorios.
Zscore entre 2 y 3 cuestionables
Zscore superior a 3 inaceptables.
Recomendable revisar la validez de los resultados del conjunto:
(ejm.: en general el rango Zscore 2 no debe ser superior a 2 log
ufc/g)
Revisar si los resultados obtenidos por el laboratorio son coherentes
entre si (ejm. cumplen los criterios para los controles de 1er y 2
nivel)
Evaluar la calidad de un proveedor de ejercicios comparativos:
El nmero de laboratorios que participan. (nunca deben
aceptarse rondas con menos de 8 resultados vlidos).
La calidad de las muestras recibidas.
El informe de resultados.
Una comunicacin fluida y transparente.
Conclusin
Los resultados de un anlisis microbiolgico pueden tener una gran
implicacin econmica y de salud pblica.
El control de calidad de los mtodos de ensayo es una herramienta
imprescindible para garantizar la validez de los resultados.
Los resultados de los controles deben ser evaluados y pueden permitir
implantar mejoras/modificaciones que mejoran el funcionamiento del
laboratorio.
Cada laboratorio es diferente, por lo que el control de calidad debe
adaptarse a las particularidades del mismo. Debe realizarse en condiciones
lo ms reales posibles, incluyendo las matrices que habitualmente se
analicen.
El empleo de mtodos automatizados supone una importante mejora en
el control de calidad interno.
CONCLUSIN
Conclusiones
No olvidar los factores que afectan a la calidad de los
ensayos y su relacin entre ellos:
Regla de las 6 Ms:
todos
aquinaria
aterias primas
uestras
ano de obra
edio ambiente
www.ainia.es 145
Muchas gracias por su atencin
David Toms Forns 625 15 77 76
dtomas@ainia.es

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