Universidad Autnoma de Chiriqu

Facultad de Ciencias Naturales y Exactas

Escuela de Qumica
Bioqumica 38 !a"oratorio
Electroforesis del ADN en Geles de Agarosa
#resentado $or%
Alexander Cu"illa 8&8''&3('
!eydy Cu"illa )&*+)&,88
-e.undo -emestre ','
Fecha% ,' de Noviem"re del ','
#ro/0% 1.tra0 Al"ertina 1ontene.ro N23e4
Laboratorio 10
Electroforesis del ADN en Geles de Agarosa
Objetivos:
5eterminar A5N en .eles de a.arosa
Marco Terico:
El t6rmino electro/oresis se usa $ara descri"ir la mi.racin de una $artcula
car.ada "a7o la in/luencia de un cam$o el6ctrico0 1uchas mol6culas im$ortantes
"iol.icamente 8amino9cidos: $6$tidos: $rotenas: nucletidos: 9cidos
nucleicos;< $oseen .ru$os ioni4a"les y existen en solucin como es$ecies
car.adas: "ien como cationes: o "ien como aniones0 Estas es$ecies car.adas se
van a se$arar en /uncin de su car.a cuando se a$lica un volta7e a trav6s de los
electrodos0
!a electro/oresis en .el es una t6cnica muy utili4ada $ara se$arar mol6culas o
/ra.mentos de mol6culas de 9cidos nucleicos0 !os materiales m9s comunes $ara
se$arar mol6culas de 9cidos nucleicos son $olmeros como la $oliacrilamida o la
a.arosa0 Estos .eles se colocan en la cu"eta de electro/oresis: sumer.idos en un
tam$n de $= alrededor de 80 5e esta /orma: las mol6culas de 5NA o >NA
sometidas a electro/oresis se des$la4ar9n al $olo $ositivo ya que a $= su$eriores
a + $oseen car.a ne.ativa0 !os .eles se com$ortan como un tami4 molecular y
$ermiten se$arar mol6culas car.adas en /uncin de su tama3o y /orma0 As:
mol6culas de 5NA de di/erente tama3o: van a emi.rar de /orma distinta en un .el
de electro/oresis0 !a distancia recorrida $or cada /ra.mento de 5NA va a ser
inversamente $ro$orcional al lo.aritmo de su $eso molecular0 Es im$ortante la
utili4acin de marcadores de tama3o conocido $orque nos $ermitir9n calcular los
$esos moleculares de las muestras de 5NA $ro"lema0 (erner M! "00#$
En el caso de los .eles de a.arosa: se le a3ade "romuro de etidio: sustancia que
se intercala entre las "ases del 5NA y es /luorescente cuando se ilumina con lu4
ultravioleta0 ?ras la electro/oresis: se visuali4a el .el con una l9m$ara de lu4 U@: y
se ver9n las "andas corres$ondientes a las muestras de 5NA a$licado y los
marcadores de $eso molecular0
Existen al.unos ti$os de electro/oresis en .el de a.arosa $ero la electro/oresis
hori4ontal es el m9s utili4ado $ara se$arar mol6culas de A5N en a.arosa0 Atros
ti$os como la electro/oresis vertical se utili4a $ara se$arar $rotenas y utili4a .eles
de $oliacrilamida0 El a$arato de electro/oresis hori4ontal es esencialmente una
ca7a con electrodos en cada extremo: estos electrodos son de $latino ya que tiene
una conductividad el6ctrica muy "uena: de"ido a que los electrodos de $latino son
caros y /r9.iles se de"e tener cuidado cuando se mane7an equi$os de
electro/oresis0 El medio de se$aracin es un .el de a.arosa: la a.arosa es un
$olisac9rido derivado del a.ar0 Ari.inario de las al.as: la a.arosa es altamente
$uri/icada $ara eliminar todas las im$ure4as0 -e extrae de la misma al.a que se
utili4a $ara o"tener el a.ar utili4ado en micro"iolo.a y del utili4ado en
alimentacin0 Es una sustancia no txica $ero no de"e ser in.erido0 (Mathews, 2002)
Materiales % E&'i(o:
No)bre *a(acidad *antidad
E&'i(o de
Electroforesis
,
+asos ,'-)icos ,:'m! '
.'ntas Descartables +
G'antes de L/te0 '
1aln +ol')2trico ,m! ,
.robetas '+m! ,
3eactivos:
3eactivo .ro(iedades 4isico&'-)icas To0icolog-a
1ro)'ro de etidio
E-?A5A FB-CCAD A-#EC?A% Cristales
ro7os a marrn0
#unto de /usin% '38&')EC
5ensidad% :3) .Fcm
-olu"ilidad en a.ua: .F, ml a 'EC
#resin de va$or: #a a '+EC%
des$recia"le
#unto de in/lamacin% G , EC
Coe/iciente de re$arto octanolFa.ua
como lo. #oH% &,:,
Cnhalacin ?os0
A7os Enro7ecimiento0
Cn.estin 5olor de .ar.anta0
Agarosa
Alor% Cnodoro0
#unto de /usinF$unto de con.elacin
8* EC
-olu"ilidad% #oco solu"le en a.ua /ra0
-olu"le en a.ua caliente0
No son de es$erar caractersticas
$eli.rosas0 #or in.estin de .randes
cantidades% desarre.los intestinales
A"servar las $recauciones ha"ituales
en el mane7o de $roductos qumicos0
Tris base Estado /sico% -lido As$ecto% "lanco
Alor% inodoro $=% ,&,,:+ 8+ aq0solI0<
#unto de e"ullicin% ',( a '' EC a ,
mm=. Con.elacin F /usin%G ,J8:+ EC
-olu"ilidad% -olu"le0 Frmula
molecular% C)=,,NA3 #eso molecular%
,',:,) -eccin , & Esta"ilidad y
reactividad Esta"ilidad qumica%
hi.rosc$ico% a"sor"e la humedad o el
a.ua del aire0
A7os% Causa irritacin en los o7os0
#iel% #rovoca irritacin
cut9nea0 #uede ser nocivo si se
a"sor"e $or la $iel0
Cn.estin% #uede causar irritacin del
tracto di.estivo0 #uede ser nocivo si
se in.iere0
Cnhalacin% Causa irritacin del tracto
res$iratorio0 #uede ser nocivo si se
inhala0
5cido brico As$ecto% #olvo o .r9nulos "lancos0
Alor% Cnodoro0
-olu"ilidad% ,.F,8ml en a.ua /ra0
5ensidad% ,0)3
$=% +0, solucin acuosa% 80,1<
I de @ol9tiles $or el volumen ',K C
8*K F<%
#unto de E"ullicin% -e descom$one0
#unto de Fusin% ,J(K C 833JK F<
Cnhalacin% Causa la irritacin a las
mem"ranas mucosas del a$arato
res$iratorio0 #uede ser a"sor"ido $or
las mem"ranas mucosas y:
de$endiendo de la ex$osicin que se
ha tenido: $odra dar lu.ar al
desarrollo de n9useas: vmito:
diarrea: somnolencia: eru$cin en la
$iel: dolores de ca"e4a: disminucin
en la tem$eratura del cuer$o:
disminucin de la $resin arterial:
lesiones renales: cianosis: estado de
coma y hasta la muerte0
Cn.estin% -ntomas $aralelos a los de
la a"sorcin $or inhalacin0 !a dosis
/atal $ara un adulto que se re$ort es
de + a G 3 .ramos0
Contacto de la #iel% Causa la irritacin
de la $iel0 !a A"sorcin no es muy
$erci"ida a trav6s de la $iel intacta0 Es
/9cilmente a"sor"ido a trav6s de la
$iel que se encuentre da3ada o
quemada0 !os sntomas de la
a"sorcin de la $iel son $aralelos a
los de la inhalacin e in.estin0
Contacto con los o7os% Causa la
irritacin: el enro7ecimiento y el dolor0
EDTA As$ecto% !quido
Color% incoloro
Alor% Cnodoro
5ensidad relativa% 8'F)< ,:,*
-olu"ilidad% 1isci"le con a.ua
No se conocen datos concretos de
esta sustancia0 No son de es$erar
caractersticas $eli.rosas0 A"servar
las $recauciones ha"ituales en el
mane7o de $roductos qumicos0
.rocedi)iento:
.re(aracin de sol'ciones
,0 #re$aramos el ?BE +x $esando ')0' . de tris "ase m9s +0* m! 9cido ac6tico
.lacial m9s , m! de E5?A 0+ 1 8$= 8< y a/oramos en un volum6trico de , m!
con a.ua destilada0
'0 #re$aramos el ?BE ,x diluimos ) m! de ?BE +x: se necesitan ' ! $or lo que
se reali4aron dos diluciones de ' m! de ?BE +x en un volum6trico de , m!0
.rotocolo de (re(aracin de 'n gel de agarosa al 16
,0 #re$aramos la "ande7a que contendr9 el .el sellando "ien los "osrdes con cinta
adhesiva0
'0 -e $eso '0+ . de a.arosa0
30 Colocamos la a.arosa en un vaso qumico y a.re.amos '+ m! de "u//er ,x y
lo colocamos en "a3os mara $or unos minutos0
)0 #asados los + minutos se de7o en/riar y se le a.re.o "romuro de etidio y se
a.ito "ien0
+0 -e verti la solucin en la "ande7a que se $re$aro en el $aso , y se de7o
$olimeri4ar0
*orrida del gel de agarosa
,0 -e lleno el tanque de la c9mara de electro/oresis con el "u//er ,x hasta que se
cu"riera todo el .el0
'0 -e in/ectaron las muestras en A5N en los $ocitos del .el0
30 -e coloco la ta$a de la c9mara de electro/oresis y se conectaron los electrodos
a la /uente de $oder: con un volta7e de 8 @ y se de7o correr $or unos )+ minutos0
)0 ?erminada la corrida se llevo el .el al U@0
3es'ltados:
4ig'ra 17 .re(aracin de la bandeja! .oli)eri8acin e 9n%eccin del ADN %
encendido de voltaje7
4ig'ra7": *orrida % revelado 'tili8ando la c/)ara 'ltravioleta7
Disc'sin:
!a electro/oresis en .el como t6cnica $ara determinar A5N es una t6cnica muy
utili4ada $ara se$arar mol6culas o /ra.mentos de mol6culas de 9cidos nucleicos0
Es un m6todo de se$aracin /recuentemente utili4ado $ara anali4ar /ra.mentos de
A5N .enerados $or en4imas de restriccin: #C>: etc: y es un m6todo analtico
conveniente $ara determinar su tama3o en un ran.o de +&30 $ares de
"ases0 ?am"i6n $uede ser utili4ado $ara se$arar otras "iomol6culas como
colorantes: A>N y $rotenas0
Esta electro/oresis consisto en la se$aracin de mol6culas a trav6s de una matri4
tam$onada de a.arosa: la matri4 /unciono como un /iltro: se$arando las mol6culas
en un cam$o el6ctrico de acuerdo al tama3o0 En este caso los 9cidos nucleicos: el
.ru$o /os/ato es el res$onsa"le $or la /uerte car.a ne.ativa en condiciones de $=
neutro haciendo los /ra.mentos mi.ren hacia el $olo $ositivo durante la
electrolisis0
5urante el $roceso de electrolisis: en .eles de a.arosa: se le a3adi bro)'ro de
etidio: sustancia que se intercala entre las "ases del 5NA y es /luorescente
cuando se ilumina con lu4 ultravioleta0 ?ras la electro/oresis: se visuali4a el .el con
una l9m$ara de lu4 U@: y se ver9n las "andas corres$ondientes a las muestras de
5NA a$licado y los marcadores de $eso molecular0 4ig'ra "
-i la electro/oresis se reali4a con muestras de colorantes que simulen /ra.mentos
de A5N: la mi.racin de varias mol6culas $uede ser visuali4ada directamente en
el .el durante la electro/oresis y no requiere una tincin $osterior del .el0 No
o"stante: las mol6culas $eque3as de colorante $ueden ser susce$ti"les de
di/usin /uera del .el: de este modo se de"e vi.ilar cuando se $roduce la
se$aracin com$leta de los colorantes0 8Calvo: 1i.uel 'J<
!a se$aracin ocurre $orque las mol6culas m9s $eque3as $asan a trav6s de los
$oros del .el m9s /9cilmente que las de mayor tama3o0 -i el tama3o de '
/ra.mentos es similar o id6ntico: mi.rar9n 7untos en el .el0 -i el A5N .enmico es
di.erido varias veces: ha"r9 un ran.o am$lio de /ra.mentos que $roducir9 un
LsmearM en el .el0 (Mathews, 2002)
!os /ra.mentos lineares de A5N mi.rar9n m9s r9$ido a trav6s del .el0 !a
movilidad de las mol6culas durante la electro/oresis tam"i6n se $uede ver
in/luenciada $or la concentracin del .el de a.arosa: a mayor concentracin de
a.arosa la electro/oresis durar9 m9s0
*oncl'sin:
El $rinci$io "9sico de la electro/oresis consiste en la mi.racin de las
mol6culas a trav6s de un .el u otro ti$o de matri4 de naturale4a $orosa: en
el cual: $or accin de un cam$o el6ctrico: ser9n se$aradas de acuerdo a su
tama3o o $eso molecular0
En el caso de los .eles de a.arosa: se le a3ade "romuro de etidio:
sustancia que se intercala entre las "ases del 5NA y es /luorescente
cuando se ilumina con lu4 ultravioleta0
Es un m6todo de se$aracin /recuentemente utili4ado $ara anali4ar
/ra.mentos de A5N .enerados $or en4imas de restriccin: #C>: etc
!as muestras se $re$aran con un tam$n de car.a que contiene .licerol
$ara darles densidad y de esta /orma se mantienen en el $ocillo sin salirse0
Es de destacar que a escala analtica: los m6todos electro/or6ticos son de
alta sensi"ilidad: $oder de resolucin y versatilidad: y sirven como m6todo
de se$aracin de me4clas com$le7as de 9cidos nucleicos: $rotenas y otras
"iomol6culas: donde a$ortan un $otente criterio de $ure4a0
1ibliograf-a:
,0 1atheHs: C0D @an =olde: N0D Ahern: N0 8''<0 Bioqumica0 ?ercera Edicin0
1adrid: Es$a3a: #EA>-AN A55C-AN OE-!EP0
'0 BCAQUB1CCAD !ehnin.erD Cuarta edicinD Ediciones Ame.a Q Barcelona Q
'+D #9.inas% 8+ & (+0
30 Calvo: 1i.uel0 8'J<0 Bioqumica de los Alimentos0 16xico: 50F0
)0 Oerner 10 8'8<0 Bioqumica Fundamentos $ara 1edicina y Ciencias de la
@ida0 Editorial >evert60