Determinacin de Enzimas oxidativas presentes en el tejido muscular.

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Fernando Cristancho *1, Camilo Guerrero *2, Andrs Vsquez *3, Alba Luz Muriel *4, Juan
David Galn *5.

Resumen

Enzimas, cualquiera de las numerosas sustancias orgnicas especializadas compuestas por
polmeros de aminocidos, son de origen natural y catalizan reacciones biolgicas con un
alto grado de especificidad. Debido a su naturaleza proteica, a las enzimas les afectan los
mismos factores que a las protenas: temperatura, disolventes, sales, pH, entre otras, que
modifican su estructura qumica con la consecuente prdida de su actividad cataltica. Las
enzimas se clasifican en varias categoras: hidrolticas, oxidantes y reductoras, dependiendo
del tipo de reaccin que controlen. Las enzimas hidrolticas aceleran las reacciones en las
que una sustancia se rompe en componentes ms simples por reaccin con molculas de
agua. Las enzimas oxidativas, conocidas como oxidasas, aceleran las reacciones de
oxidacin, y las reductoras las reacciones de reduccin en las que se libera oxgeno. Otras
enzimas catalizan otros tipos de reacciones. Las enzimas oxidativas entran dentro de la
clasificacin de oxidoreductasas de las cuales se manejarn glucosa oxidasa,
polifenoloxidasa, catalasa, peroxidasa, lipoxidasa. Las enzimas oxidoreductasas catalizan la
oxidacin o reduccin del substrato, el cual puede ocurrir de diferentes formas. Cada enzima
es especfica de forma selectiva para la sustancia sobre la que causa la reaccin, y es ms
eficaz a una temperatura determinada. Aunque un aumento de la temperatura puede acelerar
una reaccin, las enzimas son inestables cuando se calientan. La actividad cataltica de una
enzima est determinada sobre todo por su secuencia de aminocidos y por la estructura
terciaria, es decir, la estructura de plegamiento tridimensional de la macromolcula. Muchas
enzimas precisan para su funcin la presencia de un ion o una molcula que recibe el
nombre de cofactor. Dentro de las enzimas oxidativas que tiene la funcin de oxidar los
tejidos para hacerlos perder su capacidad funcional se encuentran las OXIDASAS enzimas
que catalizan la remocin de hidrogeno de un sustrato y usan solamente al oxigeno como
aceptor de hidrogeno.







Abstract
Enzyme, any of numerous specialized organic substances composed by polymers of amino
acids, theyre from natural origin and catalyze biological reactions with a high degree of
specificity. Due to their protein nature, enzymes are affected by the same factors of proteins:
temperature, solvents, salts, pH, among others, that modify their chemical structure with
consequent loss of its catalytic activity. Enzymes are classified into several categories:
hydrolytic, oxidizing and reducing, depending on the type of reaction they control. Hydrolytic
enzymes speed up reactions where a substance is broken into simpler components by
reaction with water molecules. The oxidative enzymes, known as oxidases, accelerate
oxidation reactions, and the reducing ones in reduction reactions, in which, oxygen is
released. Other enzymes catalyze other types of reactions. The oxidative enzymes are within
the classification of oxidoreductases and specifically will be handled glucose oxidase,
polyphenol oxidase, catalase, peroxidase, lipoxidase. Oxidoreductases enzymes catalyze the
oxidation or reduction of the substrate, which can occur in different ways. Each enzyme is
selectively specific for the substance on which cause the reaction, and is more effective at a
given temperature. Although an increase in temperature can speed up a reaction, the
enzymes are unstable when get heated. The catalytic activity of an enzyme is determined
primarily by its amino acid sequence and tertiary structure, the structure of dimensional
folding of the macromolecule. Many enzymes required for its function, the presence of an ion
or molecule that receives the name of cofactor. Within the oxidative enzymes which can
oxidize the tissues to make them lose their functional capacity are the oxidases enzymes that
catalyze the removal of hydrogen from a substrate and used only to oxygen as hydrogen
acceptor.


Palabras clave
Enzimas oxidativas, sustrato, coenzimas, oxidoreductasas, catalizador .flavoproteinas, norita
(carbn activado), anaerobio. Deshidrogenasa lctica.
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Recibido: 28 de octubre del 2014
*Medicina, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Cooperativa de Colombia.
Estudiantes 1 semestre.
1 fercristancho07@hotmail.com
2 everth.guerreroa@campusucc.edu.co
3 andrevasq@hotmail.com



4 murielalbaluz@gmail.com
5 juanitogl@hotmail.com

Introduccin
Las enzimas son sustancias orgnicas especializadas compuestas por polmeros
de aminocidos, que actan como catalizadores en el metabolismo de los seres vivos. Con
su accin, regulan la velocidad de muchas reacciones qumicas implicadas en este proceso.
El nombre de enzima, que fue propuesto en 1867 por el fisilogo alemn Wilhelm Khne
(1837-1900), deriva de la frase griega en zyme, que significa 'en fermento'. Enzima es una
protena dotada de propiedades catalticas que inducen principalmente a su poder de
activacin especfica, expresada por Dixon y Webb (1958). son agentes que afectan a
la velocidad de una reaccin qumica, y no son alterados durante el proceso de la reaccin ya
que se encuentran presentes al final de la reaccin en idntica cantidad y en las mismas
condiciones fsicas y qumicas en las que se encontraban al comienzo de la misma.
Las enzimas no son alterados por la reaccin, pero por ser protenas, resultan termolbiles y
sensibles a los cambios y variaciones del medio ambiente fsico en que se hallen, estn
involucradas en todas las reacciones metablicas, tanto catalizndolas y acelerndolas, y
van desde la digestin de nutrientes como en la formacin de otras molculas. Ningn
elemento, ni mineral, ni vitamina o hormona puede realizar ninguna funcin en el organismo
sin que exista la accin de las enzimas, es por ello que son tan importantes en toda la salud y
bienestar general en el organismo, En la actualidad los tipos de enzimas identificados son
ms de 700.Las enzimas se clasifican en varias categoras: hidrolticas, oxidantes y
reductoras, dependiendo del tipo de reaccin que controlen. Las enzimas hidrolticas
aceleran las reacciones en las que una sustancia se rompe en componentes ms simples por
reaccin con molculas de agua. Las enzimas oxidativas, conocidas como oxidasas,
aceleran las reacciones de oxidacin, y las reductoras las reacciones de reduccin en las que
se libera oxgeno. Algunas enzimas, como la pepsina y la tripsina, que intervienen en la
digestin de las protenas de la carne, controlan muchas reacciones diferentes, mientras que
otras como la ureasa, son muy especficas y slo pueden acelerar una reaccin. Otras
liberan energa para la contraccin cardiaca y la expansin y contraccin de los pulmones.
Muchas facilitan la conversin de azcar y alimentos en distintas sustancias que el
organismo precisa para la construccin de tejidos, la reposicin de clulas sanguneas y la
liberacin de energa qumica para mover los msculos. La cintica de las reacciones
enzimticas difiere de las reacciones inorgnicas simples. Cada enzima es especfica de
forma selectiva para la sustancia sobre la que causa la reaccin, y es ms eficaz a una
temperatura determinada. Aunque un aumento de la temperatura puede acelerar una
reaccin, las enzimas son inestables cuando se calientan. La actividad cataltica de una
enzima est determinada sobre todo por su secuencia de aminocidos y por la estructura
terciaria, es decir, la estructura de plegamiento tridimensional de la macromolcula. Muchas
enzimas precisan para su funcin la presencia de un ion o una molcula que recibe el
nombre de cofactor. Dentro de las enzimas oxidativas que tiene la funcin de oxidar los
tejidos para hacerlos perder su capacidad funcional se encuentran las OXIDASAS enzimas
que catalizan la remocin de hidrogeno de un sustrato y usan solamente al oxigeno como



aceptor de hidrogeno. Ellas contienen invariablemente cobre y forman agua como un
producto de la reaccin (con la excepcin de la uricasa y la monoaminooxidasa que forman
H2O2, ej.: citocromo oxidasa). DESHIDROGENASAS AEROBIAS enzimas que catalizan la
remocin de hidrogeno de un sustrato pero que, a diferencia de las oxidasas, pueden usar ya
sea oxigeno u otras sustancias artificiales como aceptores, ej.: el azul de metileno. Se forma
perxido de hidrogeno en lugar de agua como producto. En forma caracterstica estas
deshidrogenasas son flavoprotenas. LAS DESHIDROGENASAS ANAEROBIAS son
Enzimas que catalizan la remocin del hidrogeno de un substrato, pero que no son capaces
de usar oxigeno como aceptor de hidrogeno. Hay un gran nmero de enzimas en esta clase.
Ellas realizan dos funciones principales, Transferencia de hidrogeno de un sustrato a otro en
una reaccin de xido reduccin acoplada que no implica una cadena respiratoria. Estas
deshidrogenasas son especficas para sus substratos pero a menudo utilizan la misma
coenzima o transportador de hidrogeno que otras deshidrogenasas. Como las reacciones
son reversibles, estas propiedades permiten que los equivalentes reductores sean libremente
transferidos dentro de la clula. Este tipo de reaccin, que permite que un sustrato sea
oxidado a expensas de otro, es particularmente til para permitir que ocurran los procesos
oxidativos en ausencia del oxgeno. Ej.: deshidrogenasa lctica. Y Como enzima inicial de
una cadena respiratoria de transporte de electrones desde el substrato al oxgeno.
HIDROPEROXIDASAS enzimas que utilizan el perxido de hidrogeno como sustrato. Dos
enzimas pertenecen a esta categora: la peroxidasa, que se encuentra en la leche, en las
plantas, en leucocitos y eritrocitos, y la catalasa que se encuentra en los animales y en las
plantas.OXIGENASAS enzimas que catalizan la transferencia directa e incorporacin del
oxgeno a una molcula de sustrato. CITOCROMO OXIDASA: La citocromo oxidasa, es una
enzima de la cadena respiratoria por lo cual se encuentra en todos los tejidos especialmente
con el miocardio. Esta enzima contiene Fe, que pasa alternativamente de una forma
reducida a una oxidada. La funcin biolgica de la citocromo oxidasa es la catlisis de
oxidacin por O2 del citocromo C. Esta enzima es inhibida por el cianuro que se acopla a la
forma oxidada del hierro, bloqueando as a la enzima. En el laboratorio, la actividad de la
citocromo oxidasa (y su inhibicin por el cianuro) puede demostrarse mediante la oxidacin
secundaria de sustancias tales como la p-fenilendiamina que se vuelve roja o prpura con la
oxidacin. En este caso, el cianuro inhibe la reaccin, acoplndose con el hierro oxidado de
la citocromo oxidasa, evitando de esta manera, el funcionamiento ulterior de la enzima.
DESHIDROGENASA LCTICA La enzima deshidrogenasa lctica est ampliamente
distribuida en todo el organismo, pero se encuentra especialmente en el msculo, hgado,
corazn y rin. Su funcin es catalizar la oxidacin reversible del lactato a piruvato,
removiendo o adicionando dos H. Para efectuar tal funcin, es necesaria la presencia de una
coenzima que es el NAD (nicotinamida adenin dinucletido), tambin ampliamente
distribuido en el organismo, la cual acta en otros sistemas enzimticos de oxidacin y
reduccin. En tales reacciones, pasa de una forma oxidada (NAD) a una reducida
(NADH+H+), esta ltima se reoxida mediante flavoprotenas termolbiles, las cuales a su
vez, pueden reducir el azul de metileno a la forma incolora (leuco) por lo cual ste puede ser
usado en el laboratorio como indicador de las reacciones de xido- reduccin.
Al ensayar la reaccin de la deshidrogenasa lctica, el producto de la reaccin, el piruvato,
debe ser removido por la adicin de KCN (para formar la cianhidrina del cido pirvico) y as
permitir que la reaccin proceda en un solo sentido y casi hasta su integridad. En la



preparacin enzimtica tambin est presente suficiente flavoprotenas para reducir el azul
de metileno. El presente artculo tiene la finalidad de exponer en forma clara y sencilla los
efectos de las enzimas oxidativas sobre los tejidos del organismo y que caractersticas se
tienen que presentar para poder llevarlo a cabo.

Mtodos
Este trabajo lo realizamos en el laboratorio de la universidad cooperativa de Colombia a
modo de prctica donde se llev a cabo una serie de pasos que nos llevaran a la
determinacin de las enzimas mediante reacciones qumicas utilizando tejido de origen
animal en este caso un pollo, as como por reactivos NaCl al 0,9%,norita(carbn activado)y
azul de metileno 0,02% este se realiz de tres maneras diferentes una primera parte la
preparacin del tejido del animal ,luego la preparacin de la coenzima y la enzima y por
ltimo la preparacin en tubos de ensayo de todas las preparaciones con la cual se
obtendrn los resultados.
Preparacin del tejido animal
Se tom un trozo de musculo de la pierna de un pollo fresco previa descongelacin paso
fundamental para lograr unos buenos resultados.(imagen 1)







Imagen 1. Preparacin del tejido muscular.
Preparacin de la coenzima
Se Tomaron aproximadamente 1 gramo de msculo de una de las piernas del conejo y se
colocaron en 8 mls de agua caliente (esto para inactivar las enzimas del msculo, que
pueden destruir la coenzima despues de la muerte del animal). Se Calento el bao de
maria hirviendo por 4 5 minutos; luego se enfrio y se paso todo el contenido del tubo a un
mortero. Se le Aadio 1 gramo de arena y se trituro hasta formar una pasta fina.paso



siguiente se Centrifugo la mezcla y guardo el sobrenadante que contiene la coenzima en
un bao de hielo hasta ser usado. (imagen 2)






Imagen 2 (preparacin de la coenzima)







1. pesaje de la muestra 2.maceracion del tejido









3. centrifugar la mezcla 4.guardar los sobrenadantes

Preparacin de la enzima
Se Tom aproximadamente 1 gramo de msculo de la otra pierna y se coloco en un
mortero. Se Aadi 20 mls de NaCl 0.9% y 1 a 2 gramos de arena. Se Trituro hasta
obtener una pasta fina. Luego la mezcla se pas a la Centrifuga por 10 minutos, se tom
el sobrenadante, que contena la enzima lctica.
Para remover cualquier resto de la coenzima de la preparacin enzimtica evitando as
que la muestra se daara se le aadi gramo de NORITA (carbn activado). El cual
se mezcl por inversin. Se Dej reposar la mezcla con agitaciones ocasionales por
media hora. Luego se centrifugo y se guard el sobrenadante que ser la solucin de
enzima pura tambin en hielo hasta ser usada.(imagen 3)








5. pesaje de la nueva muestra 6.se le adiciono NaCl al 0.9 %










6.se trituro la mezcla hasta formar una solucin 7.se centrifugo la mezcla









8. se sacaron los tubos con el sobrenadante.
Luego de tener ya preparado tanto la enzima como la coenzima, se aplic el procedimiento
de la siguiente tabla (tabla 1) para determinar que tubo tiene activa la coenzima la cual
debera reaccionar cambiando de color.

Tubo # Enzima
(ml)
Coenzima
(ml)
KCN0,5%
(ml)
Lactato 1%
(ml)
Azul de
metileno
0,2% (ml)
H2O (ml)
1 1 0 1 1 1 1
2 1 1 1 1 1 1
3 1 1 1 0 1 1
4 0 1 1 1 1 1
Tabla 1(preparacin de los tubos de ensayo)

Como ltimo paso luego de tener 4 tubos con la anterior indicacin (tabla 1) se Cubri
cada mezcla con aproximadamente 2mls de aceite mineral para establecer condiciones
relativamente anaerbicas. Y se esper tres horas para ver cuales muestras tuvieron
alguna decoloracin lo que significaba positivo para nuestro estudio.



Resultados







Teniendo en cuenta el siguiente cuadro se elabor cada tubo de ensayo:
TUBO # Enzima
mL
Coenzima
mL
KCN
0.5% mL
Lactato
1% mL
Azul de
metileno
0.2% mL
H
2
O
mL
1 1 0 1 1 1 1
2 1 1 1 1 1 1
3 1 1 1 0 1 1
4 0 1 1 1 1 1

Tubo de ensayo N 1

En esta preparacin se trabaj con enzima extrada de tejido animal, se le adiciono
KCN (cianuro de potasio), Lactato, azul de metileno y agua; adems se le adiciono 2
mL de aceite mineral para dar un estado anaerbico al preparado. Esta solucin tomo
un color azul que al pasar 3 horas no cambio. Por esta razn no hubo reaccin.
Tubo de ensayo N2




Esta solucin fue preparada utilizando enzima y coenzima de tejido animal, este
preparado contiene los dems componentes del tubo de ensayo N1, igualmente se le
adiciono 2 mL de aceite mineral, se calent por 3 horas, pero no tuvo una reaccin. La
coloracin inicial y final fue azul clara.
Tubo de ensayo N3







En este tubo de ensayo se aadieron todos los componentes exceptuando el lactato,
de igual forma se le aadieron 2 mL de aceite mineral y se calent por 3 horas; la
solucin tomo el mismo color de las dems soluciones (azul claro) pero pasadas las 3
horas no cambio, por ende no hubo reaccin.

Tubo de ensayo N4











La preparacin N4 fue la solucin que primero se realiz, esta solucin no lleva
enzima de tejido animal, contiene coenzima, KCN (cianuro de potasio), lactato, azul de
metileno y agua. Adicionalmente se le adiciono igual que a los dems 2 mL de aceite
mineral y por ltimo se calent por 3 horas. La coloracin igual que las otras
soluciones fueron azul claro desde el principio y permaneci as por las 3 horas. Por
ende no tuvo ninguna reaccin.






Discusin
Las enzimas oxidativas las encontramos en el tejido animal, especialmente en el tejido
muscular ya que son importantes en procesos de respiracin e incluso de contraccin. Por
medio de la prctica tratamos de identificar y enunciar la importancia biolgica de dichas
enzimas, igualmente esclarecer la funcin y distribucin de las enzimas en tejidos animales.
La prctica en laboratorio busca obtener cuatro preparados con distintos reactivos para
obtener dichas reacciones enzimticas.



La prctica se realiz de acuerdo a la gua, pero hubo varios tipos de errores que no
permitieron el perfecto resultado de la prctica, puesto que los preparados no reaccionaron
en el tiempo indicado ni despus.
Conclusiones
Se logr enunciar la importancia biolgica de las enzimas por medio de los preparados, a
travs del proceso de centrifugacin se separaron enzimas y coenzimas; gracias a distintos
reactivos y a otros materiales como arena y norita
Por medio del agua caliente, se aislaron las enzimas y coenzimas de los tejidos musculares
seleccionados, se logr demostrar su relacin con el tejido animal.
Tericamente se puede establecer la funcin y funcin de las enzimas y coenzimas en los
tejidos animales; prcticamente en laboratorio no se pudo establecer su funcin y
distribucin, puesto que los preparados no reaccionaron de acuerdo a los distintos reactivos
utilizados.
La inhibicin enzimtica se logra gracias a sustancias como el cianuro que inhibe la
citocromo oxidasa, en estos preparados no se pudo identificar la inhibicin de estas enzimas.
En esta prctica no tuvo una reaccin como la que se esperaba por varios factores o errores
cometidos durante y antes de la prctica. Dos casos que pueden explicar la no reaccin en la
prctica es que el tejido animal no fue utilizado de manera adecuada puesto que el animal ya
varias horas muerto y las enzimas se deterioran rpidamente. Otro factor que pudo influir fue
el uso escaso de aceite mineral, como se sabe el aceite mineral permite al preparado un
estado anaerbico, en caso de entrada de aire al preparado inmediatamente se deteriora.

Bibliografa
www.ehu.es/biomoleculas/enzimas/enz1.htm
Linda J. Vorvick, MD, Medical Director and Director of Didactic Curriculum, MEDEX Northwest Division of
Physician Assistant Studies, Department of Family Medicine, UW Medicine, School of Medicine, University of
Washington. Also reviewed by A.D.A.M. Health Solutions, Ebix, Inc., Editorial Team: David Zieve, MD, MHA,
David R. Eltz, Stephanie Slon, and Nissi Wang.medline plus.
bioquibi.webs.ull.es/bioquimica%20estructural/.../fosforoxidativa.pdf
http://www.botanica.cnba.uba.ar/Pakete/3er/LaEnergia/imag/LAS%20ENZIMAS.html
http://www.sociciens.org/files/biosportmed/biosportmed/biosportmed_articulo_5.pdf




Anexos
CUESTIONARIO

1. Usando la web explique con sus propias palabras que son las enzimas oxidoreductasas.

Las enzimas oxidoreductasas hacen parte de los 6 grandes grupos de las enzimas que se
clasifican segn su accin cataltica.
Estas enzimas son las encargadas de catalizar las reacciones de oxidorreduccin, es decir,
transferencia de hidrgeno (H) o electrones (e-) de un sustrato a otro, segn la reaccin
general:

AH2 + B A + BH2
Ared + Box Aox + Bred


Ejemplos son la succinato deshidrogenasa o la citocromo c oxidasa.
2. Usando las bases de datos de la universidad descargue dos artculos relacionados y
colocarlos como link en la wiki.
3. Explique qu tubo reacciona y porque otros no.
Ninguna solucin reacciono
4. Explique el xito o fracaso de su prctica, errores posibles
En esta prctica realizada ningn tubo reaccion, es posible que haya ocurrido debido a
que las enzimas ya estaban deterioradas en el tejido animal, lo cual ocurre inmediatamente
de su muerte.




Otro aspecto a tener en cuenta, puedo haber sido el aceite mineral utilizado para
establecer condiciones anaerbicas, el cual pudo no haber realizado el aislamiento
completamente de las enzimas preparadas.