Cultivos celulares

El cultivo celular o cultivo de tejidos, tiene su origen en el siglo XIX, como

un mtodo para el estudio del comportamiento de las clulas animales libres
de las variaciones sistmicas ocurridas dentro del organismo durante su
normal homeostasis y bajo el estrs de un experimento. Estas tcnicas
iniciaron con el cultivo de fragmentos no disgregados de tejidos, los cuales
restringan la mitosis de las clulas cultivadas y por tanto su crecimiento.
Despus se realizaron cultivos con fragmentos disgregados de tejidos, los
cuales aumentaban el crecimiento celular en cultivo ya que se utilizaban
clulas dispersas.
EVOLUCION DE LOS CULTIVOS CELULARES
El cultivo de clulas tuvo su origen en el siglo XIX. Rechlinhausen en
1866, mantuvo vivas clulas sanguneas de anfibio, pero fue la utilizacin de
bloques de agar con plasma coagulado que es el soporte y alimento el inicio
del cultivo de clulas in vitro (Freshney, 1987).
El desarrollo del cultivo de clulas de
vertebrados se inici con las observaciones
de Roux (1885) en cultivos de clulas de
embrin de pollo; posteriormente Harrison
(1907) cultiv tejido nervioso de rana el cual
ms adelante fue reemplazada por plasma
de pollo (Burrows, 1910); posteriormente, se
aplic esta tcnica para el estudio en
animales de sangre caliente (Carrel, 1912).
El empleo de tcnicas de fusin celular
(Barski, 1960; Littlefield, 1964) estableci las
bases de la gentica de clulas somticas para el anlisis de especies
animales (incluyendo al hombre); igualmente la tcnica de anticuerpos
monoclonales (Kohler y Milstein, 1975) ha permitido estudios en inmunologa
y su aplicacin a nivel teraputico.

1.1.4.1. Biologa del cultivo celular
La validez de un cultivo celular como modelo de funcin fisiolgica in vivo
ha sido criticado, ya que se presentan problemas de caracterizacin por la
alteracin del desarrollo celular; la proliferacin in vitro no se presenta de
igual manera a la de in vivo, debido a la reduccin de la relacin clula-clula
y la interaccin matriz-clula por la no presencia de la heterogeneidad y la
estructura tridimensional de las clulas hallada in vivo, adems porque el
medio hormonal y nutricional se ve alterado. Esto crea un ambiente que
favorece la difusin, migracin y proliferacin de clulas no especializadas,
pero no a la expresin de funciones diferenciadas. La provisin de un
ambiente apropiado, nutriente, hormonas y sustratos son fundamentales
para la expresin de funciones especializadas (Brand, et al., 1997).
En un cultivo celular la mayora de las clulas crecidas a partir de un tejido
slido disgregado o de un subcultivo tienen la capacidad de adherirse en
monocapa, transformarse o anclarse independientemente. Esta adherencia
celular es mediada por receptores celulares especficos de superficie en la
matriz extracelular y la dispersin celular podra ser precedida por la
secrecin de protenas de matriz extracelular y proteoglicanos por parte de
la clula. Las clulas se pueden anclar y difundir en el vidrio donde se
cultivan por medio de ligeras cargas negativas y al plstico, como el
poliestireno, si tienen una propiedad o tratamiento con descargas elctricas
o con radiacin ionizante de alta energa. El cultivo en vidrio o plstico
provee condiciones favorables para el crecimiento y anclaje celular
(Freshney, 1995).
El crecimiento de las clulas en un cultivo celular primario depende de la
supervivencia de stas a las diferentes tcnicas de disgregacin y a la
capacidad de adherirse al sustrato o de sobrevivir en suspensin. Se
cultivan clulas de plantas, animales y humanos en un caldo de cultivo en el
laboratorio. Se pueden cultivar una amplia variedad de cultivos de clulas,
as como clulas de cncer y sangre humanas para investigar cmo los virus
provocan infecciones.
Cuando el cultivo proviene de clulas que han sido disgregadas de un tejido
original tomado de un rgano de un animal recin sacrificado, reciben el
nombre de Cultivo Primario.
Cuando ste cultivo primario es sometido a procesos de transformacin
que le confiere capacidad ilimitada de multiplicacin, reciben el nombre de
Lneas Celulares.
Cuando de un cultivo primario genera otro tipo de clulas que se pueden
separar recibe el nombre de Cultivos Secundarios.
Cuando en el cultivo coexisten dos tipos de clulas de linajes diferentes
que se pueden separar recibe el nombre de Cocultivo.
Tipos de cultivo celular
CULTIVOS EN MONOCAPA
Son los que cuben la correspondiente superficie de crecimiento (confluencia), lo
que hace que su multiplicacin sea inhibida cuando establecen contacto entre s
(quiescencia).
Las clulas provenientes de cultivos primarios son las que mejor crecen en sta
condicin, dada su estabilidad gentica y su naturaleza diploide normal.

CULTIVOS EN SUSPENSION

Son sistemas en suspensin tambin requieren de matrices que son
macromolculas, que sirven de protectores a la superficie celular; stas
macromolculas se encuentran en el suero, el cual contribuye igualmente con el
medio de cultivo, proporcionando un sistema balanceado de nutrientes. Dentro de
stas matrices est el Methocel, esencial para el crecimiento de cultivos en
suspensin.

CULTIVOS PRIMARIOS

Tienen caractersticas especiales que los diferencian de
las lneas celulares: conservan la morfologa de las
clulas del rgano del que fueron aisladas.
El estar ms cercanas a las clulas que las originaron,
se ve reflejado en una mejor actividad y funcionalidad
similar a su ambiente natural.
LINEAS CELULARES
Las Lneas Celulares continuas estn formadas por
clulas que se diferencian gentica y morfolgicamente
de las clulas de las cuales se originaron. Pueden
provenir de clulas que se derivan de tumores o de un proceso de
transformacin de un cultivo primario mediante transfeccin con oncogenes
o con tratamiento con carcinogenticos, lo que les confiere un nuevo
fenotipo.
Este tipo de cultivo tiene la caracterstica de no tener inhibicin por
contacto y de crecer de manera indefinida. El paso de un cultivo primario a
lnea se denomina transformacin que puede inducirse fisiolgicamente
(interaccin celular, polaridad) a travs de hormonas como la hidrocortizona
o utilizando inductores no fisiolgicos.
CULTIVOS TRIDIMENSIONALES
Son aquellos que buscan mantener la caracterstica o arquitectura del tejido
in vivo. Los sistemas tridimensionales permiten estudiar la proliferacin y
morfologa epitelial y su interaccin con otras clulas como son las del
tejido conectivo; igualmente con ellos se puede evaluar el efecto de
sustancias que pueden influenciar en tales interacciones intercelulares.
Actualmente se producen Kits drmicos comerciales con base en cultivos,
que permiten evaluar la citotoxicidad de componentes qumicos presentes
en lociones, preservativos, detergentes, perfumes, shampoos y solventes
entre otros.



El cultivo de cortes de tejido utiliza fragmentos de tejidos colocados en
vasos de vidrio o plstico con un medio con interfase lquida que va a
promover la migracin de las clulas cultivadas hacia un plano slido
provisto de un sustrato especfico para cada clula.
El cultivo de clulas dispersas en suspensin se refiere al cultivo de
clulas tomadas del tejido original, de cultivos primarios de clulas o de una
lnea o cadena celular por disgregacin enzimtica, mecnica o qumica, este
cultivo necesita de una monocapa adherente o un sustrato slido que le
provea a las clulas un medio adecuado para desarrollarse.
Derivado del cultivo anterior encontramos el cultivo secundario en el cual
se cultivan diferentes provenientes de una misma, es el caso de los cultivos
de astrocitos donde se puede obtener, en un mismo cultivo, crecimiento de
los tipos I y II de stas clulas.

En la actualidad se estn realizando cultivos que permiten la recombinacin
de clulas de diferentes linajes como los queratinocitos de la epidermis en
combinacin con los fibroblastos de la dermis; a estos cultivos se les
denomina cocultivos.
El cultivo de clulas transformadas generalmente se obtiene por la
inyeccin de un carcingeno, despus de una serie de cultivos alternados y
pasaje por animales
1.1.4.3. Ventajas del cultivo celular
Las dos principales ventajas cuando se utilizan los cultivos celulares son:
el control del medio fisicoqumico, a saber, pH, temperatura, presin
osmtica, tensin de oxgeno (O2) y gas carbnico (CO2) de las clulas
cultivadas y, las condiciones fisiolgicas que deben ser constantes.
1.1.4.4. Desventajas del cultivo celular
Una mayor limitacin en el cultivo de clulas es el gasto de esfuerzo y
materiales para la produccin de una pequea cantidad de clulas o de
tejido. Los costos de producir clulas en cultivo son diez veces ms que el
uso de tejido animal, ya que se invierte bastante en ensayos o
procedimientos preparativos que pueden ayudar en la estandarizacin del
proceso reduciendo tiempo de manipulacin, volmenes de muestra,
tiempos de centrifugacin, etc. (Brand, et al., 1997).
En los cultivos celulares se dificulta relacionar las clulas cultivadas con
las clulas funcionales ubicadas en el tejido del cual son derivadas,
Usos de los cultivos celulares
Para el estudio de clulas especficas, cmo crecen, qu necesitan para
su crecimiento, cmo y
cuando dejan de crecer
Para investigaciones
sobre el ciclo celular, el
control del crecimiento de
clulas tumorales y la
modulacin de la expresin
gentica.
Tcnicas de cultivo
celular para la insercin de
genes extraos en las
clulas receptoras (animales
transgnicos).
La tecnologa de la fusin celular y los ensayos de citotoxicidad son
tcnicas de cultivo celular.
Niveles y normas de seguridad
Nivel 1. No presentan peligros reconocidos cuando se utilizan en
condiciones normales.
Nivel 2. Se emplean para materiales de origen primario humano que no se
conoce el riesgo de infeccin o que tienen la posibilidad de que en las
muestras contengan VIH, TBC, hepatitis B u otros patgenos.
Nivel 3. Su manejo pueden presentar un riesgo potencial.
Nivel 4. Extremadamente peligrosos.
EN QUE CONSISTE UN LABORATORIO DE CULTIVOS CELULARES
Es un espacio independiente para el proceso de lavado y preparacin de
material y un rea propiamente destinada al trabajo con cultivos celulares.
Dentro de la infraestructura fsica bsica se debe contar con sistemas de
refrigeracin y congelacin, incubadoras, centrfugas, balanzas,
microscopios y cabinas de flujo laminar.
Adicionalmente, se debe disponer de un buen suplemento de material
plstico y de vidrio y con sistemas de esterilizacin apropiados para los
diferentes tipos de reactivos y material utilizados.
Desde el punto de vista de los sistemas de esterilizacin se pueden citar los
siguientes:
Calor Hmedo: Mediante el empleo de autoclaves los cuales proporcionan
una temperatura de 121oC y una presin de 15 lb.
Calor Seco: Lo constituye el uso de hornos a temperatura de 200C por
espacio de 3 horas. Es empleado para la esterilizacin de material de vidrio
particularmente.
Filtracin: A travs del uso de equipos con membrana de nitrocelulosa o
acetato de celulosa con poro de 0.22 0.1 mm de dimetro, mediante la
aplicacin de presin positiva o negativa. Por ste sistema se esterilizan la
mayor parte de los medios de cultivo, suero, solucin de antibitico-
antimictico y suplementos.

Para un experimento de cultivos con antelacin se debe tener en cuenta dos
aspectos importantes:
PROGRAMACION - TIEMPOS
Debido a la extensin de un cultivo, en cultivos primarios se debe
programar el tiempo de un experimento desde el momento en que se cruzan
los animales para obtener el tejido necesario para los experimentos.
PROGRAMACION - TAMAO DE MUESTRA
Los cultivos celulares son realizados con diferentes replicaciones para
permitir la conversin de experimentos heterogneos, cuando se realiza un
solo cultivo, en experimentos homogneos o uniformes, cuando se realizan
varios cultivos (replicaciones) cada uno con muestra y caractersticas de
cultivos idnticos. Cuando las replicaciones experimentales sean
virtualmente idnticas, la necesidad del anlisis de varianza como
estadstica se reduce.
Cultivo celular


Clulas epiteliales en cultivo, con tincin roja para la queratina y verde para el
DNA.
El cultivo celular es el proceso mediante el que clulas, ya sean clulas
procariotas o eucariotas, pueden cultivarse en condiciones controladas. Este
termino se usa normalmente en referencia al cultivo de clulas aisladas de
eucariotas pluricelulares, especialmente clulas animales.
ndice
1 Historia

2 Conceptos en el cultivo de clulas de mamfero
o 2.1 Aislamiento de clulas
o 2.2 Mantenimiento de clulas en cultivo
o 2.3 Manipulacin de las clulas en cultivo
2.3.1 Cambios de medio
2.3.2 Pase de las clulas
2.3.3 Transfeccin y transduccin
o 2.4 Lneas celulares humanas establecidas
o 2.5 Generacin de hibridomas
3 Aplicaciones del cultivo celular
o 3.1 Ventajas y desventajas de los cultivos celulares
o 3.2 Estudios que emplean cultivos celulares
o 3.3 Cultivo de tejidos e ingeniera
o 3.4 Vacunas
4 Cultivo de clulas provenientes de organismos no mamferos
o 4.1 Mtodos de cultivo de clulas de plantas
o 4.2 Mtodos de cultivo de bacterias y levaduras
o 4.3 Mtodos de cultivo de virus
5 Lneas celulares comunes
6 Referencias
Manipulacin de las clulas en cultivo
Al estar generalmente las clulas en continua divisin durante el cultivo, es normal
que crezcan hasta ocupar toda el rea o volumen disponible. Esto puede generar
varios problemas:
Agotamiento de los nutrientes del medio
Acumulacin de clulas apoptticas o necrticas
Inhibicin de la divisin celular por contacto: los contactos entre clulas
pueden desencadenar un arresto del ciclo celular
Diferenciacin celular promiscua provocada por los contactos intercelulares
Estos problemas pueden afrontarse mediante mtodos de cultivo celular en
esterilidad. El objetivo de estos mtodos es evitar la contaminacin con bacterias o
levaduras que competiran por los nutrientes y/o podran infectar y as eliminar las
clulas. Toda manipulacin se lleva a cabo, tpicamente, en una campana de flujo
laminar para evitar la entrada de microorganismos contaminantes. Tambin
pueden aadirse antibiticos al medio de cultivo.
Entre las manipulaciones ms comunes llevadas a cabo en cultivos celulares, se
encuentran los cambios de medio, el pase de las clulas y la transfeccin.


Cambios de medio
El objetivo de este es renovar los nutrientes y evitar la acumulacin de productos
metablicos potencialmente txicos y de clulas muertas. En el caso de las
suspensiones celulares, las clulas se separan del medio mediante centrifugacin
y se suspenden en medio fresco. En los cultivos adherentes, el medio puede
eliminarse directamente mediante aspiracin y reemplazarse por el fresco.
Pase de las clulas
Consiste en transferir un pequeo nmero de clulas a un nuevo continente. Las
clulas pueden cultivarse ms tiempo si se pasan regularmente, ya que as se
evita la senescencia asociada a situaciones prolongadas de alta densidad celular.
Con cultivos en suspensin el pase se hace fcilmente, tomando una pequea
cantidad de cultivo que contenga unas pocas clulas y diluyndola en un volumen
mayor de medio fresco. En cultivos adherentes, las clulas han de ser inicialmente
despegadas; esto se efecta comnmente con una mezcla de tripsina y EDTA,
aunque actualmente existen otras mezclas de enzimas para esto. Un pequeo
nmero de las clulas despegadas pueden sembrarse en un nuevo continente.
Transfeccin y transduccin
Artculos principales: Transfeccin y Transduccin (gentica).
Otro mtodo comn en la manipulacin de las clulas es la introduccin de un
DNA externo por transfeccin. Esto se lleva a cabo a menudo para conseguir que
las clulas expresen una protena de inters. Ms recientemente, la transfeccin
de RNA interferentes se han llevado a cabo como mecanismos adecuados para
suprimir la expresin de un particular gen.
El DNA tambin puede ser introducido en las clulas usando virus, en mtodos
llamados transduccin, infeccin o transformacin. Los virus, como agentes
parsitos, son adecuados para introducir DNA en clulas, ya que esto forma parte
de su ciclo normal de reproduccin.
Lneas celulares humanas establecidas


Una de las primeras lneas celulares humanas, obtenida de Henrietta Lacks, quien
falleci de cncer de tero a partir del cual se obtuvieron estas clulas. El cultivo
de clulas HeLa que se muestra en la imagen fue teido con Hoescht que se une
al ADN coloreando de azul el ncleo.

Aplicaciones del cultivo celular
El cultivo masivo de lneas celulares animales es fundamental para la manufactura
de vacunas virales y diversos productos biotecnolgicos. Los productos biolgicos
producidos mediante la tecnologa del ADN recombinante en cultivo celular
incluyen enzimas, hormonas sintticas, inmunobiolgicos (anticuerpos
monoclonales, interleucinas, linfoquinas y agentes anticancergenos). A pesar de
que muchas protenas pueden producirse mediante ADN recombinante en cultivos
bacterianos, las protenas ms complejas que son glicosiladas (modificadas
mediante el agregado de carbohidratos) deben producirse en clulas animales. Un
ejemplo relevante de tales protenas complejas es la hormona eritropoyetina.
Actualmente, se estn realizando investigaciones para producir tales protenas
complejas en clulas de insectos o de plantas superiores, debido al alto costo que
implica producir tales protenas complejas en clulas de mamferos.
Ventajas y desventajas de los cultivos celulares
Ventajas:
- Permiten un control preciso y fino del medio ambiente. En un cultivo se pueden
controlar todos los factores del medio: Fsico-qumicos (pH, temperatura, presin
osmtica, niveles de O2, CO2, tensin superficial...), y fisiolgicos (hormonas,
factores de crecimiento, densidad celular,...)
- Caracterizacin y homogeneidad de la muestra. Las clulas en cultivo de una
lnea celular, o de una lnea continua son homogneas, con morfologa y
composicin uniformes.

- Economa. Suponen una economa en el uso de reactivos o drogas a estudiar
pues al realizarse en volmenes reducidos, y con un acceso directo de las clulas
a la droga las concentraciones requeridas son mucho ms bajas que en el animal
completo.
Desventajas.-
- Tcnica sensible. El crecimiento de las clulas animales es mucho ms lento que
el de los contaminantes ms habituales (hongos, levaduras, bacterias) y adems
dado que proceden de organismos pluricelulares son incapaces de crecer en
ausencia de una compleja mezcla de nutrientes que simula el plasma o el fluido
intersticial. Esto supone la necesidad de mantener las condiciones de asepsia en
todo momento, lo cual es limitante a nivel tanto del instrumental requerido como
del personal calificado para su manipulacin.
- Cantidad y costo. El costo de produccin de 1 g de tejido en cultivo es ms de 10
veces superior al obtenido en el animal. Asimismo existe una limitacin de
produccin, que es del orden de 10 g de clulas en un laboratorio normal, y que
para ser superior a 100 g requiere instalaciones de tipo industrial.
- Inestabilidad. Muchas de las lneas celulares continuas son inestables, como
consecuencia de la dotacin cromosmica aneuploide. La poblacin celular puede
variar su composicin si alguna de las subpoblaciones celulares es capaz de
crecer con una tasa ligeramente superior, es decir podemos encontrar diferencias
significativas en la lnea celular de una generacin a la siguiente. La nica manera
de evitarlo es emplear lneas estables que se resiembran a partir de un stock
congelado cada determinado tiempo, o despus de un determinado nmero de
generaciones.
Estudios que emplean cultivos celulares
Los estudios que emplean cultivos celulares abarcan gran nmero de disciplinas y
aproximaciones al estudio del fenmeno celular. Son:
Actividad celular. Estudia los mecanismos implicados en los diferentes procesos
intracelulares, como por ej: transcripcin de DNA, sntesis de protenas,
metabolismo energtico.
Flujo intracelular. Estudia los movimientos intracelulares de sustancias y seales
asociadas a los diferentes procesos fisiolgicos, como por ejemplo: ensamblaje y
desensamblaje de los diferentes componentes intracelulares, movimientos del
RNA: ncleo-citoplasma, movimiento de protenas.
Ecologa celular. Estudio de las condiciones ambientales responsables del
mantenimiento de la funcionalidad celular, de su diferenciacin..., como por ej.
estudio de las necesidades nutricionales, infecciones, estudio de la transformacin
celular (inducidad por virus o agentes qumicos), cintica de la poblacin celular,...
Interacciones celulares. Estudia los procesos de induccin embrionaria,
cooperacin metablica, inhibicin por contacto o por adhesin, interacciones
clula-clula.
Como ejemplo de reas de investigacin fuertemente dependientes de las
tcnicas de cultivo celular son:
- Virologa: establecimiento de condiciones de cultivo de virus animales y de
plantas, produccin de vacunas antivirales,...
- Investigacin del cncer
- Inmunologa
- Ingeniera de protenas. Por la produccin de protenas en lneas celulares:
interfern, insulina, hormona de crecimiento.
- Estudios de interaccin y sealizacin celular, en la diferenciacin y en el
desarrollo.
Salud ocupacional: Mediante ensayos citogenticos que permiten detectar dao
gentico a nivel celular, donde los cultivos de linfocitos de sangre perifrica son
una herramienta para aplicar ensayos como: Ensayo de Micronucleos (MN),
aberraciones cromosmicas (AC), Intercambio de Cromatides Hermanas (ICH, a
trabajadores expuestos a algn agente citotxico.
Cultivo de tejidos e ingeniera
El cultivo celular es un componente fundamental del cultivo de tejidos y la
ingeniera de tejidos, ya que establece los conocimientos bsicos del crecimiento y
mantenimiento de clulas ex vivo.
Vacunas
En la actualidad las vacunas para enfermedades como el polio, sarampin,
paperas, rubola y varicela se producen en cultivos de clulas de mamferos. El
peligro que representa una posible pandemia de influenza por la cepa H5N1 se
estn realizando activas investigaciones con el fin de producir dicho virus en
cultivos celulares, financiadas por el gobierno de Estados Unidos. En marzo del
2009 se us esta tcnica para producir la primer partida de vacunas (destinadas al
testeo) para la influenza H1N1 en El D.F.
Cultivo de clulas provenientes de organismos no mamferos
Mtodos de cultivo de clulas de plantas
Artculo principal: Cultivo de tejidos vegetales
Las clulas de plantas crecen normalmente en suspensiones clulares en medio
lquido o como cultivo de callos en medio slido. El cultivo de clulas de plantas no
diferenciadas y callos requiere de un adecuado balance de las hormonas de
crecimiento vegetales auxina y citoquinina.
Mtodos de cultivo de bacterias y levaduras
Artculo principal: Cultivo (microbiologa)
Usualmente, las cantidades pequeas de bacterias y levaduras que crecen en
medio slido que contiene los nutrientes necesarios embebidos en un gel, tal
como el Agar. Mientras que grandes cantidades son crecidas en medio lquido con
las clulas en suspensin.
Mtodos de cultivo de virus
El cultivo de los virus requiere un sustrato de clulas de mamferos, plantas,
hongos o bacteria como hospedadores para el crecimiento y replicacin de los
virus. En las condiciones adecuadas se pueden generar virus enteros, virus
recombinantes o productos virales en clulas diferentes a los hospedadores
naturales.
maryguionbajocoralguionbajo92@hotmail.com