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MICROBIOLOGIA DE
ALIMENTOS
ROTEIRO DE PRTICAS
2014
RECOMENDAES GERAIS
O estudante dever usar em aula prtica "OBRIGATORIAMENTE" o jaleco. Lembre-se
que de alguma forma voc estar em contato com micro-organismos, e, portanto deve
tomar todo cuidado para evitar se contaminar, ou transmitir infeco s pessoas do
seu convvio. A bancada de trabalho deve estar livre, portanto adequado que no se
coloque nela cadernos e bolsas que no sero utilizados durante a fase experimental,
evitando assim acidentes.
Em todos os trabalhos prticos, observe os seguintes critrios:
a) Bico de Bunsen com chama azulada - A utilizao deste, visa flambar a ala ou a
agulha bacteriolgica e propiciar um ambiente assptico ao redor do material que
voc manusear, evitando assim resultados indesejveis e diminuindo o risco de
infeco por aspirao de partculas.
b) Ala ou agulha bacteriolgica - Devem ser flambadas at o rubor, antes e aps cada
experimento. Saiba que antes elas so flambadas, para evitar resultados indesejveis
ao seu estudo, pois micro-organismos contaminantes do ar podem estar assentados
sobre o material; e depois, a flambagem obrigatria, pois esse material
posteriormente poder contaminar outras pessoas. Procure executar esse
procedimento colocando o instrumento sobre a chama, numa posio vertical e nunca
em posio horizontal, pois desta ltima forma voc estar esterilizando apenas a
poro final.
c) Abrir o tubo de cultura - Segure o tubo com a mo esquerda e retire a tampa com os
dedos mnimo e anelar da mo direita, deixando livres os dedos mdio, indicador e
polegar para manuseio da ala bacteriolgica ou pipeta, evitando assim deixar a tampa
sobre a bancada o que levaria sua contaminao.
e) Sempre que houver algum acidente, como quebra de tubos ou placas com microorganismos, contato com material contaminado, etc. Avise ao professor no local, para
que ele tome providncias imediatas, dependendo do caso ou acidente, e jamais seja
relaxado com os cuidados pessoais.
d) Ao final de todo trabalho prtico alm de organizar o seu local de trabalho e passar
lcool 70 na bancada. No se esquea de lavar as mos com gua e sabo e
posteriormente, lcool.
SUMRIO
PRTICA I - CONSERVAO DE ALIMENTOS..................................................................... 3
PRTICA II TCNICAS DE SEMEADURA E MEIOS DE CULTURA ...................................... 4
PRTICA III DILUIO E CONTAGEM DE UFC................................................................. 7
PRTICA IV - CONTAGEM TOTAL DE AERBIOS MESFILOS, PSICROTRFICOS,
BOLORES E LEVEDURAS .................................................................................................... 9
PRTICA V - CONTAGEM DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS EM ALIMENTOS ................... 11
PRTICA VI - ANLISE DE COLIFORMES TOTAIS E FECAIS .............................................. 13
PRTICA VII - PROVAS BIOQUMICAS PARA IDENTIFICAO DE E. COLI ....................... 16
PRTICA VII - DETECO DE SALMONELLA SPP. EM ALIMENTOS .................................. 19
PRTICA VIII - CONTAGEM TOTAL DE BACTRIAS LTICAS EM LEITES FERMENTADOS 21
3.MATERIAIS:
7 bqueres,
1 pedao de parafilme para vedao;
10 ml de vinagre;
2 colheres de sal;
1 panela pequena;
4 colheres de amido de milho;
500 ml de gua.
4. PROCEDIMENTO:
Em uma panela dissolva o amido de milho em gua, misture bem e leve ao fogo
at engrossar. Adicione at a metade de cada bquer em seguida siga o procedimento
a seguir:
- Bquer 1- Deixe aberto em temperatura ambiente.
- Bquer 2 - Cubra com o filme plstico, vede-o, e deixe-o em temperatura ambiente.
- Bquer 3 - Adicionar vinagre e deixar em temperatura ambiente.
- Bquer 4 - Adicionar sal e deixar em temperatura ambiente.
- Bquer 5 - Coloc-lo na geladeira, sem cobertura.
- Bquer 6 - Coloc-lo na geladeira, com cobertura.
- Bquer 7 - Coloc-lo no freezer, sem cobertura.
5. RESULTADOS E DISCUSSO
Qual dos mtodos testados o mais eficiente e o menos eficiente para a
conservao dos alimentos? Por qu?
MATERIAIS:
Tubo com cultivo ativado por 24 horas
Agar nutritivo em placas
Tubo com caldo nutritivo
Tubo com Agar nutritivo inclinado
Placa de Petri esterilizada
Ala bacteriolgica (ou de platina)
Ala de Drigalski
Pipetas
Ponteiras estereis
Agar fundido a 45C
Estufa de incubao
4. PROCEDIMENTO
4.1 Inoculao em superfcie por esgotamento - estrias ou espalhamento em placas
a) ESTRIAS
1) Flambar a ala na chama do bico de Bunsen, colocando-a verticalmente, at atingir a
cor rubra. Repita este procedimento, se necessrio.
Agar.
b) ESPALHAMENTO Spread plate
1) Com auxlio da pipeta, transferir 0,1ml da cultura para o centro da placa contendo o
meio slido;
2) Com auxlio da ala de Drigalsky estril espalhar todo o inculo at que seja todo
absorvido pelo meio de cultura.
3) Entre o espalhamento de uma placa e outra, a ala de Drigalsky dever ser flambada
embeber no lcool a 70% e levar a chama. (ATENO: redobrar o cuidado e ateno
durante este procedimento, para evitar acidentes);
4) Identificar a placa, incubar em posio invertida por 35-37C por 24 horas. As
placas devem ser incubadas em posio invertida para evitar que a gua de
condensao formada caia em cima do agar.
3. MATERIAL
3 Tubos com 9 ml de gua peptonada 1%
3 Placas de Petri com Agar PCA
3 Placas estreis
Frasco com Agar PCA fundido
Ala de Drigalski
Pipetas de 1ml
Pipeta de 0,1ml
Ponteiras
Cultura bacteriana em caldo
4. PROCEDIMENTO
Plaqueamento em profundidade:
Selecionar as placas que tenha entre 25 a 250 colnias. Calcular o nmero de unidade
formadora de colnia (UFC) por mL ou grama, multiplicar pelo inverso da diluio
inoculada.
5. RESULTADOS
3. MATERIAL
Frasco com 225 ml de gua peptonada 0,1%.
Esptulas estreis
Placa estril para pesagem.
3 Agar batata glicose 2% em placa para fungos
3 Agar PCA em placa para contagem total de psicrotrficos
2 Tubos com 9 ml de gua peptonada 0,1%
3 Placa de Petri esterilizada para contagem total mesfilos
Agar PCA fundido a 45C para contagem total mesfilos
Ala de Drigalski
Pipetas
Ponteiras
Estufa de incubao.
4. PROCEDIMENTO
Adicionar 25g ou ml do alimento em 225 ml de gua peptonada e preparar
diluies de 10-1 at 10-3 da amostra com gua peptonada 0,1%. Mesma diluio para
todas as contagens.
a) Contagem total de aerbios mesfilos
1. Inocular 1,0mL de cada diluio em placas de Petri estreis vazias.
2. Verter nas placas inoculadas 20 mL do Agar Padro para Contagem (PCA),
previamente fundido e resfriado a 45 C. Homogeneizar. Esperar solidificar;
3. Incubar as placas invertidas a 35C/48h. - Leitura: Selecionar as placas que
contenham entre 25 e 150 colnias.
b) Contagem total de aerbios psicrotrfilos
1. Inocular 0,1 mL de cada diluio nas placas contendo o meio solidificado PCA;
2. Com o auxlio de ala de Drigalski, espalhar o inculo cuidadosamente por toda a
superfcie do meio, at sua completa absoro.
3. Incubar as placas invertidas a 7C/10 dias. - Leitura: Selecionar as placas que
contenham entre 25 e 250 colnias.
c) Contagem de bolores e leveduras
1. Inocular 0,1 mL das diluies selecionadas sobre a superfcie seca de gar batata
glicose 2% acidificado.
2. Com o auxlio de ala de Drigalski, espalhar o inculo cuidadosamente por toda a
superfcie do meio, at sua completa absoro.
3. Incubao: Incubar as placas, sem inverter, a 25 C por 3 a 5 dias, em incubadora de
B.O.D. - Leitura: Selecionar as placas que contenham entre 15 e 150 colnias.
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MATERIAL
225 mL de gua peptonada estril.
2 tubos com 9 ml de gua peptonada estril
Pipeta graduada (10 ou 25ml)
Micropipeta 0,1 ml
3 placas com Agar BP- Baird-Parker
1 ala de Drigalski
3 lminas
Perxido de hidrognio
Plasma bovino
Kit para colorao de gram
4. PROCEDIMENTO
1. Triturar 25g ou diluir 25ml de amostra em 225 mL de gua peptonada estril.
2. Fazer 3 diluies 10-1,10-2 e e 10-3
3. Pipetar 0,1 mL de suspenso de cada diluio e colocar em placa contendo gar BPBaird-Parker e espalhar com uma ala de Drigalski at completa absoro.
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RESULTADOS
Calcular os resultados em UFC/g ou mL
Pare e pense:
a) O alimento analisado encontra-se dentro dos padres baseado na RDC n12?
b) Qual a importncia da pesquisa de S.aureus em alimentos?
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3. MATERIAL
225 mL de gua peptonada 0,1%
2 tubos com 9 ml de gua peptonada estril
9 Tubos contendo Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) (com tubos de Durham)
9 Tubos contendo Caldo Verde Brilhante (com tubos de Durham)
9 Tubos contendo caldo EC (com tubos de Durham)
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4. PROCEDIMENTO
PARTE 1:
A) Teste Presuntivo de NMP
(Amostra_alimentos)
- Presume-se que os micro-organismos que crescem e produzem gs a partir da lactose
sejam coliformes. Meio de enriquecimento: caldo LST.
1. Triturar 25g ou diluir 25ml de amostra em 225 mL de gua peptonada estril.
2. Fazer 3 diluies 10-1, 10-2 e 10-3, inocular 1 ml de cada diluio em srie de trs
tubos contendo caldo Lauril Sulfato Triptose (LST).
3. Incubar 35 - 37C por 24 a 48h.
4. Contar o nmero de tubos positivos: com produo de gs e turvao do meio.
B) Teste Confirmativo de Coliformes totais ou 35C
Meio seletivo caldo Verde Brilhante bile. Neste meio, os sais de bile tm a funo de
inibir o crescimento de bactrias no entricas e o verde brilhante de inibir as
bactrias Gram-positivas, selecionando desta forma os coliformes.
1. De cada tubo positivo de LST retirar 1 (uma) alada e inocular em tubo
correspondente contendo caldo Verde Brilhante.
2. Incubar a 35-37 C por 24 a 48h.
3. Considerar como positivos os tubos turvos com produo de gs nos tubos de
Durhan.
4. Usar a tabela de NMP para verificar qual o nmero mais provvel de
coliformes totais por grama ou mL correspondente aos tubos positivos.
PARTE 2:
C. Teste Confirmativo de Coliformes termotolerantes 45C.
Os coliformes termotolerantes tm em seu ambiente natural (trato intestinal)
temperaturas mais elevadas. Eles so capazes de crescer a 44,5 C, possibilitando,
assim, de uma forma prtica, serem avaliados separadamente.
1. De cada tubo positivo de LST retirar 1(uma) alada e inocular em tubo
correspondente contendo caldo EC.
2. Incubar a 45,5 C em banho-maria por 24h.
3. Considerar como positivos os tubos turvos com produo de gs nos tubos de
Durhan.
4. Usar a tabela de NMP para verificar qual o nmero mais provvel de
coliformes totais por grama ou mL correspondente aos tubos positivos.
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5.RESULTADOS
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2. METODOLOGIA
2.1 Prova do Indol
a) Procedimento: transferir o micro-organismo a ser testado para o meio de cultura
(caldo triptona). Adicionar 3 a 4 gotas do reativo de Kovacs.
b) Objetivo: testar a habilidade de alguns micro-organismos de degradarem a molcula
de triptofano
c) Princpio: bactrias que possuem a enzima triptofanase so capazes de hidrolisar o
triptofano, produzindo indol, piruvato (cido pirvico) e amnia. Estes dois ltimos
produtos so utilizados diretamente no metabolismo da clula, enquanto o indol
acumula-se no meio. A presena de indol pode ser detectada pela adio do reativo de
Kovacs ao meio de cultura que resultar na formao de uma colorao vermelha na
superfcie do lquido.
Resultado: aps incubao a 37C por 48 horas e adio do
reativo, tem-se:
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2.4 Citrato
a) Procedimento: transferir a bactria a ser testada para gar citrato de Simmons.
Incubar os tubos a 37C por 24 a 48 horas. Aps a incubao, examinar as culturas
contidas nos tubos com o meio inclinado e avaliar a presena ou a ausncia de
crescimento da bactria, verificando qualquer alterao na cor do meio de verde para
azul.
b) Objetivo: caracterizar micro-organismos capazes de utilizar o citrato como a nica
fonte de carbono, os quais provocam a elevao do pH do meio de cultivo devido a
metabolizao de ons citrato.
c) Princpio: para utilizar o citrato como nica fonte de carbono, necessrio que a
bactria possua a enzima citrato permease que facilita o transporte do citrato pra o
interior da clula. Do metabolismo do citrato so produzidos piruvato e CO2. Este
ltimo, ao reagir com o sdio presente no meio, forma o carbonato de sdio, de
natureza alcalina. O meio gar citrato de Simmons possui o citrato de sdio como
nica fonte de carbono, e o azul de bromotimol como indicador de pH. Com o
aumento do pH do meio, o azul de bromotimol adquire uma cor azul,
o que indica resultado positivo para o teste de utilizao do citrato.
Resultado: aps a incubao a 37C, tem-se:
Positivo: o meio se torna azul intenso, principalmente no pice;
Negativo: a cor natural do meio no muda, permanecendo verde.
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demais reaes em LIA se apresentarem tpicas: rampa e fundo cidos (amarelos), com
ou sem produo de H2S. LIA fundo e rampa alcalinos (prpura, sem alterao da cor
do meio), com ou sem produo de H2S. Reao atpica, que no devem ser
descartada se as demais reaoes em TSI se apresentarem tpicas: fundo amarelado
com rampa alcalina, com ou sem produo de H2S.
3. Teste bioqumico
a) Meio SIM
Transferir com uma agulha atravs de picada a cultura de colnia tpica do TSI
para o meio. Incubar 35 C/24h.
Produo de H2S: escurecimento do gar. Salmonela pode produzir ou no
H2S.
Motilidade: crescimento na regio da picada imvel crescimento em todo
agar ou ao redor da regio da picada: mvel. Salmonela mvel.
Aps a leitura do H2S e da motilidade, adicionar 5 gotas de reativo de Erlich ou
Kovacs no tubo. Aparecimento de cor rsea: indol positivo e aparecimento de cor
amarelado: indol negativo. Salmonela indol negativo.
b) Teste do vermelho de metila (VM) e Voges-Proskauer (VP):
Transferir uma alada com inoculo da cultura em TSI, para dois tubo com caldo
3mL VM-VP e incubar a 35 C/48h para VP e 96h VM. Aps o perodo de incubao, no
tubo VP adicionar 1,8 mL de soluo de alfa naftol 5% e agitar. Adicionar em seguida
0,6 mL de soluo KOH 40%, agitar. Observar at 1 hora. Desenvolvimento de cor
vermelha ou rosea teste positivo
Permanncia do meio na cor do reagente (amarelado ou ligeiramente
esverdeado) teste negativo. A maioria das Salmonelas so VP negativas. No tubo VM
adicionar 5 gotas de soluo vermelho metila e observar imediatamente se o meio
adquire uma colorao vermelha teste positivo ou amarela - teste negativo. A
maioria das cepas de Salmonela so VM positivas.
c) Teste do citrato:
Com uma agulha de inoculao, transferir um inoculo da cultura para um tubo
de agar citrato de Simmons inclinado, estriando a rampa e picando o fundo. Incubar a
35 C/ 96h. Observar o crescimento: Cor azul: citrato positivo: a maioria das cepas de
Salmonelas so citrato positivo. Cor do meio inalterado: citrato negativo.
d) Teste de urease:
Transferir uma alada da cultura crescida no TSI para um tubo com caldo uria
de Chistensen. Incubar 35 C/24h. Observar crescimento. Cor do meio original
(pssego): teste negativo. A maioria das cepas de Salmonelas so urases negativa. Cor
do meio rosa escuro: teste positivo.
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3. MATERIAIS
5 placas com Agar MRS (Man, Rogosa e Sharpe) fundido a 45C
5 unid.- Tubos contendo 9mL gua peptonada 0,1%
5 unid.- Placa de Petri vazias esterilizadas
Pipetas e ponteiras estreis
Estufa de incubao
4. PROCEDIMENTO
Preparar diluies com a amostra de 10-1 at 10-5 em gua peptonada 0,1%.
Partir de 1mL da amostra para 9mL do diluente.
1. Inocular 1,0mL de cada diluio em placas de Petri estreis vazias;
2. Verter nas placas inoculadas 20 mL do Agar MRS, previamente fundido e resfriado
a 45 C. Homogeneizar cuidadosamente. Esperar solidificar e colocar uma
sobrecamada. Esperar solidificar novamente.
3. Incubar as placas invertidas a 35C/48h.
4.1 Confirmao
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5. RESULTADOS:
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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