METHODES USUELLES D'ANALYSE BACTERIOLOGIQUE

POUR LE CONTROLE SANITAIRE COURANT

DES EAUX DE MER ET DES COQUILLAGES

METHODES USUELLES D'ANALYSE BACTERIOLOGIQUE

POUR LE CONTROLE SANITAIRE COURANT
DES EAUX DE MER ET DES COQUILLAGES

SOM MAI R E

Pages
l

Introduction

II

Nettoyage de la verrerie et sterilisation

III

Milieux de culture

IV

Techniques d'ensemencement lIEaux et Coquillages"

A) Prparation de l'echantillon

B) Ensemencement en milieux liquides

10

C) Ensemencement sur milieux gloss

13

D) Methodes de concentration des germes

14

Tables N.P.P. de dnombrement des germes

17

VI

Expression des resultats

18

VII

Recherche et denombrement des coliformes

28

A) Coliformes totaux et Coliformes fecaux : methode

utilisant le bouillon lactose la bile et au vert
brillant
B)

Colifor~es

fcaux : mthode utilisant le milieu

exprimental au Mannitol

28
30

VIII

Recherche et dnombrement des Streptocoques fecaux

33

IX

Recherche des Vibrio parahaemolyticus

35

Recherche des Salmonella

45

XI

Recherche des Clostridium sulfito-rducteurs

52

XII

Technique de coloration des bacteries et methode de Gram

54

XIII

Preparation du reactif pour la recherche de l'indole

57

References bibliographiques

58
Ouistreham, le 10 avril 1981

J. Mazires

i -

l l'ri RODUC l ON

1 - BASE MICROBIOLOGIQUE DU CONTROLE SANITAIRE

- Le contrle sanitaire des eaux de mer et des coquillages a pour
but de garantir aux consommateurs des prodluts sans risque pour leur sant. Sont

redouter les germes pa-chognes qui se transmettent par voie hydrique tels que
les sallnonelles (fivres typhoides), les shigelles (dysenteries), les vibrions
(cholera) et certa:'ns virus
La presence

dorga~ismes

CO"jJle

ceux l'esponsables des hpatites infectieuses.

pathognes constituent une preuve convaincante d'une

pollution dangere'.lSe ~ mais lem" nombre est souvent limit dans le milieu et leur
mlse en e,"idence

di~~fic2Je

cause de la dure, du cot et parfois de l'insuf-

fisance des techniques _'analyses actuelles. De plus, si on fait de leur prsence

le critre de refus de mise la consommation des denres minemment prissables
comme les coquillages. on risque de voir consommer celles-ci avant qu'un
diagnostic soit fait et que des meSUTCS prophylactiques soient prises.

2 - NOTION DE GERt,mS
Le

nmrCA'I'EUHS
b~t

DE CONTAMINATION

vritable de l'hyginiste ne sera donc pas, dans le plupart

des cas, de dceler la presence effective de bactries pathognes dans l'eau ou

les coquillages, mais de dfinir les circonstances dans lesquelles cette presence
est vraisemblable. Les

ge~mes

path'Jgnes ci-dessus sont normalement rejets par

l'hoIlli"lle et les 8.:::J.i:rr:.e,ux sa'1g chaud par voie intestinale. La mise en vidence
d'une contamination fcale constitue donc un excellent signal d'alarme et permet
d/valuer les risques encourus par le consommateur ventuel. Une telle contamination peut tre dcelee par la prsence d'une bactrie ou d'un groupe de bactries particulirement no!abreuses dans la flore intestinale.

On s'est accord

retenir cor:.:Je organismes tmoins les coliformes fcaux pour les raisons suivantes

- ils sont toujours prsents dans les fecs en concentrations beaucoup plus
,
(10 9 - 10 10 co 1lformes / g de matleres
.,
~
)
grandes que les germes pathogenes
fecales
- ils ont une rsistance aux agents antiseptiques, notamment au chlore et
ses drivs, voisine de celle des bactries pathognes l'encontre desquelles
ces produits sont employs ;
- ils produisent des ractions caractristiques permettant leur mise en vidence
par des techniques simples la porte de tous les laboratoires.
Sous la dnomination de coli formes sont regroupes plusieurs espces bactriennes appartenant la famille des entrobactries et qui, au sein
de celle-ci, fermentent le lactose avec production de gaz en moins de 48 heures.
Cette reacti8n n'tant pas spcifique, les coliformes constituent un rassemblement
assez htroclite du point de vue taxonomique. Bien que tous les coliformes
puissent exister dans les matires fcales, certains sont aussi les htes habituels
du sol et des eaux tandis que d'autres ne peuvent vivre que dans le seul habitat
fecal. La presence de ces derniers dans une eau ou dans des coquillages est la
preuve d'une contamination d'origine fcale alors que celle des premiers n'est pas
probante. Escherichia coli est le type de coliforme d'habitat fcal exclusif, mais
on estime que, parmi les germes appartenant aux autres genres, ceux qui vivent
dans l'intestin de l'homme et des anlmaux sang chaud acquirent des proprits
spciales caractristiques de cet habitat dont la plus notable est une

meilleu~e

rsistance aux tempratures de culture leves.

Du point de vue pratique, cela se traduit par l'existence de t:.:ois

types d'examens colimtriques :

- la recherche et le dnombrement de l'ensemble des coliformes (coliformes totaux)
sans prjuger de leur appartenance taxonomique et de leur origine. Ce type
d'examen, capital pour la vrification de l'efficacit d'un traitement antiseptiQue, prsente peu d'intrt pour dceler une contamination fcale tant
donn son manque de specificit
- la recherche et le dnombrement des seuls Escherichia coli, examen ayant une
base taxonomique ;
- la recherche et le dnombrement des coliformes fcaux, examen sans base taxono~ique,

mais qui met en vidence des germes ayant la mme signification pour

l'hygine. La trs grande majorit des coliformes fcaux est constitue par
Escherichia coli d'o l'excellente concordance avec la numeration de E. coli
qui implique une identification systematique.
Pour toutes ces ralsons, le contrle sanitaire courant des eaux
de mer et des coquillages repose sur la recherche et le dnombrement des coliformes fcaux qUl sont consideres l'heure actuelle comme les meilleurs germes
indicateurs d'une contamination fecale.

3 - METHODES D'EXAMEN

BACTERIOLOGIQ~~

DE L'EAU ET DES COQUILLAGES

L'analyse bactriologique proprement dite se pratique selon deux

types de mthodes
- les mthodes de dnombrement direct par comptage de colonies isoles aprs
ensemencement sur ou dans un support nutritif solide,
- les mthodes de denombrement indirect, par calcul statistique aprs rpartition
de l'inoculum dans un milieu de culture liquide.
Quel que soit le type de mthodes employ, le rsultat de la
numration n'est toujours qu'une approximation du nombre rel de germes prsents
dans l'chantillon analys. De nombreuses causes d'erreur peuvent en effet influer
sur le rsultat, par exemple l'homognisation, la ralisation des suspensionsmres et des dilutions, la qualification du manipulateur. De plus, la prcision
des techniques bactriologiques est faible : elles donnent une valeur qUl se
range l'intrieur d'un intervalle de confiance plus ou moins large. Pour pallier
cette incertitude et pour tenir compte de la sensibilit variable du consommateur,
les normes bactriologiques imposes sont telles que la limite de scurite n'est
pas dpasse mme si le nombre de germes trouv est sous-estime par rapport
la valeur relle.
3.1. - Mthodes de dnombrement direct

-------------------------------

Ces mthodes ne sont pas applicables aux coquillages. Elles sont

parfois utilisees pour les eaux de mer. L'ensemencement a lieu sur un milieu
gelose selectif, soit directement, soit aprs filtration d'un certain volume

d'eau sur une membrane et dpt de celle-ci sur le milieu solide. Les bactries
donnent naissance dans des conditions favorables des colonies typiques isoles
les unes des autres, diffrentes suivant les espces, et qui peuvent tre comptees.
Connaissant le volume d'eau ensemenc ou filtr, le rsultat final du dnombrement
peut tre exprim en fonction diun volume pris comme unit : par exemple n colonies
pour 100 ml d'eau.

L'inoculum est rparti dans un certain nombre de tubes contenant

un milieu de culture liquide. La prsence de la bactrie ou du groupe de bactries
recherches se manifeste par une raction caractristique. Un tube est considre
comme tant positif lorsqu'il est le sige de cette raction caractristique. On
postule alors qu'il contenait l'origine au moins un germe recherch. Une valuation quantitative n'est possible qu'en jouant sur les volumes de la prise
d'essai et en prenant comme hypothse que les germes sont repartis de faon
homogne dans l'inoculum : si l'ensemencement porte par exemple sur 10,1 et 0,1 ml
d'inoculum dans trois tubes de milieu liquide, et si le germe recherche est
present seulement dans le premier de ces tubes, il y a aumoins un germe dans 10 ml
d'inoculum, mais il n'yen a pas dans 1 ou 0,1 ml. Si l'unite de volume d'expression du rsultat est de 100 ml, il s'ensuit que le nombre de germes est compris
entre 10 et 100 dans 100 ml d'inoculum. Afin d'affiner le dnombrement, plusieurs
tubes par serie sont ensemencs avec le mme inoculum. Pour couvrir une gamme
assez etendue de numrations, susceptibles de convenir la plupart des besoins
en hygine conchylicole on est parfois amen faire varier les volumes ensemencs
par tube, le nombre de series et l'chelonnement des dilutions dcimales. D'ordinaire on rpte l'ensemencement du mme inoculum dans

3~4

ou 5 tubes d'une

mme serie.et on utilise trois sries dans lesquels les inoculums sont respectivement de 10 ml, 1 ml et 0,1 ml.

Il -

NETTOYAGE DE LA VERRERIE ET STERILISATION

Les botes de glose ayant servi l'isolement des germes sont

recouvertes d'une solution de javel durant 30 minutes avant nettoyage.
botes~

Ces
lavs l'eau chaude

ainsi que les tubes de bouillon sont vidangs et

savonneuse~

ou contenant un agent mouillant biodgradable.

Lorsque des particules grasses demeurent l'intrieur des rcipients on peut

utiliser des dtersifs du commerce ou le mlange sulfo-chromique. Dans tous les cas,
le rinage doit tre 3bondant et comporter au moins 5 lavages successifs pour liminer toute trace de produits chimiques. Terminer par un rinage l'eau distille
ou dsionise afin

d'liminer~

ventuellement, les "louches H dus l'eau calcaire.

L'utilisation d'un lave-pipette est souhaitable.

Aprs nettoyage du matriel ayant contenu des cultures, se laver
soigneusement les mains au savon et les frictionner l'alcool. Pour les manipulations de produits corrosifs (mlange sulfo-chromique notamment), utiliser des
gants de caoutchouc.
Les crneaux des tiges de dispersion du broyeur Ultra-Turrax ainsi
que les lames des bols du broyeur Waring-Blendor doivent tre lavs et brosss afin
d'liminer les particules de chair de coquillages ou de byssus des moules.

Aire de travail

Disposer sur la paillasse une feuille de papier filtre propre, o

seront dposs les coquillages en cours d'analyse.
Aprs chaque analyse ranger et nettoyer l'aire de travail de la
paillasse l'aide d'une ponde imbibe d'eau javelise.
On doit se laver les mains aprs chaque analyse de coquillages.
Lorsqu'on procde des examens de cultures pathognes (Salmonelles,
Vibrions .. ), prendre grand soin d'viter toute dissmination intempestive de germes
et nettoyer ensuite la paillasse l'aide d'une solution javellise. Se laver
soigneusement les mains et les frictionner l'alcool 10 C.

6
Strilisation
y~!!~!~~- (pipettes, botes de ptri en verre, tubes, prouvettes).

Elle est protge par du papier gris et du coton card ou des conteneurs appropris,
et sterilisee au four Pasteur pendant 30 minutes 180 0 C. Eviter la carbonisation
du papier ou du coton qui doit avoir une teinte licaf au lait" claire la sortie du
four.
~~!i!~_i~~!!~~~!~_~~!~~~~g~~~- (pinces, scalpels, couteaux

hutres). On utilisera de prfrence des scalpels entirement mtalliques. Ces instruments sont strilises au moment de l'emploi par trempage dans lialcool 90 et
flambage. Le passage dans la flawe ne doit servir qu' enflammer le fluide

l'ins-

trument ne doit pas tre maintenu dans la flamme. On peut utiliser l'alcool brler
du commerce.

- Bols de l'appareil 1iWaring-Blendorli. Ils sont entours de papier "gris" ou de papiel

"aluminium" et striliss au four Pasteur dans les mmes conditions que la verrerie.
- Tiges de dispersion de llUltra-Turrax. La strilisation ne peut se faire au four
Pasteur. Eviter galement la strilisation la flamme. Procder de la faon suivante :
. placer la tige dans une prouvette dans le fond de laquelle on aura dispose un
pet~t tampon de coton hydrophile imbibe de 5 ml d'eau environ, ceC1 afin d'assure:

une bonne sterilisation en atmosphre humide

boucher l'prouvette au coton card et striliser l'autoclave durant 20 minutes

120 0 C.

III - MILIEUX DE CULTURE

Il Y a toujours avantage utiliser les milieux dshydrats du

commerce en raison de la rgularit dans leur composition et de leur facilit d'emploi.
Il est

p~frable

d'utiliser l'eau dsionise ou l'eau distillee

neutre pour la confection des milieux, 8. dfaut l'eau d.minralise peut convenir.
LI ajustement du pH se fait

SUT

le milieu tid.e ou froid, de prfrence

avant adjonction de colorants si l'on se sert de papier indicateur (du type OXYPHEN).
Mais il est toujours preferable d'utiliser lm pH-mtre electrique. La strilisation
entrane souvent une lgre baisse du pH (d.e 0,1 il 0,3). Il faut donc ajuster le pH
une valeur telle qu'aprs sterilisation il se situe dans les limites voulues.

Sterilisation
Sauf exception, les milieux de culture sont steriliss l'autoclave.
Les dures et temperatures de s7:rilisation sont indiques

pOUY.'

chaque milieu.

Pour les milieux contenant des hydrates de carbone, nous prefrons

ne pas depasser la temprature de 115 0 C, afin

d'vite~

tout risque d'hydrolyse des

sucres. Cette sterilisation est suffisante lorsque les milieux sont rpartis en tubes
ne contenant pas plus de 10 15 ml de milieu.
Certains milieux ne peuvent tre sterilises au-del de 100 0 C. Ils
sont indiques dans les mthodes.

IV - TECHNIQUES n'ENSEMENCEMENT

A) PREPARATION DE

EAUX ET COQUILLAGES

L'ECHfu~TILLON

Comme indiqu precedemment, se laver soigneusement les mains avant

chaque analyse de coquillages.
EAU X

L'ensemencement des eaux en tubes de bouillon n'offre pas de difficults particulires: aprs agitation vigoureuse du flacon une dizaine de fois,
prlever les volumes ncessaires.

L'analyse des coquillages porte sur un nombre d'individus tel que

le volume des corps soit au moins de 40 ml (soit environ, et selon leur taille,

6 8 hutres, une vingtaine de moules, de coques, etc.).

Le broyage au Waring-Blendor permet un broyage fin de la chair et
une bonne libration des germes, mais il ne doit pas excder trente secondes afin
d'viter l'chauffement qui pourrait dtruire un certain nombre de germes.
Li analyse porte
soit sur la chair seule (CH)
soit de prefrence, sur la chair + liquide intervalvaire (CLI)
- CHAIR SEULE a - laver, brosser, goutter, ouvrir les coquillages aprs flambage rapide de la
charnire (le byssus des moules doit tre coup au ciseau avant ouverture et
non arrache),
b - rejeter l'eau intervalvaire,
c - trancher le muscle adducteur et placer les corps dans une prouvette contenant
10 ml d'eau salee 1

%et

sterile,

9
d - noter le volume des corps par deplacement de lleau,
e - verser dans un bol du Waring-Blendor (ou dans un becher dans le cas de l'UltraTurrax). et ajouter un volume d'eau salee 1

%strile

de sorte que le volume

total broyer (chair de coquillages + eau salee sterile) soit egal trois
fois le volume de corps

mesur~

f - broyer durant 30 secondes,

g - prlever aussitt les volumes ncessaires aux ensemencements.

a - laver, brosser, goutter, ouvrir les coquillages aprs flambage rapide de la

charnire (le byssus des moules doit tre coup au ciseau avant ouverture, et
non arrache),
b - recueillir les eaux intervalvaires dans une premire eprouvette,

c - trancher le muscle adducteur et placer les corps dans une deuxime prouvette
contenant 10 ml d'eau salee 1

%strile,

d - noter le volume des corps par dplacement de l'eau,

e - verser dans un bol du Waring-Blendor (ou dans un bcher dans le cas de l'UltraTurrax), le contenu des deux prouvettes ci-dessus et y ajouter un volume d'eau
sale 1

% strile

de sorte que le volume total broyer soit gal trois fois

le volume des corps,

f - broyer durant 30 secondes,
g - prlever aussitt les volumes ncessaires aux ensemencements.
Une raction positive dans un tube suppose qu'un germe au mOlns ait
t inocule. Un calcul statistique a permis d'tablir une correspondance entre le
nombre de tubes positifs dans chaque srie et la population probable existant dans
le milieu d'o l'inoculum est issu. Dans la pratique, le passage du nombre de tubes
positifs la population probable se fait en utilisant les tables de Mac GRADY,
(p. 18 26).

10
B) ENSEMENCEMENT EN MILIEU LIQUIDE
L'analyse des coquillages pose souvent un problme en raison de
leur teneur leve en glycogne ou en produits gnitaux lorsque le volume
du broyat ensemenc est

important~

par exemple 10 ml ans une combinaison

10 - 1 - 0,1 ml : il risque de se former un bouchon qui place la culture dans

des conditions d'anarobiose et de toute faon une opacification qui empche
de voir un dgagement gazeux ventuel. Il convient alors d'ensemencer des
volumes plus faibles ou d'utiliser des tubes de plus fort diamtre.
L'chelonnement numrique correspondant des sries de 3, 4 ou 5
tubes ensemencs par l'inoculation de trois dilutions dcimales est donn

C1-

dessous en fonction des volumes inoculs.

3 tubes
dans
chaque srie
: Combinaison

10 - 1 - 0,1

Eau
Coq.

2 !~OO

7 200

4 tubes
dans
chaque srie
2,3
6,9

2 160
6 480

5 tubes
dans
chaque srie
2

2 400
7 200

"

Eau
Coq.

6 4 800
18 14 400

4,6 4 320
: 13,8 12 960

4 4 800
12 14 400

"

3 :2,5 - 0,25 -0,025: Eau

Coq.

12 9 600
36 28 800

: 9,2 8 640
:27,6 25 920

8 9 600
24 28 800

5 - 0,5 - 0,05

Des dilutions dcimales successives permettent d'atteindre des

numrations plus leves en cas de fortes contaminations prsumes : il suffit
alors d'appliquer aux rsultats donns par les tables N.P.P. le coefficient
multiplicateur voulu.
Dans tous les cas, qu'il s'agisse d'eau ou de coquillages, et quelle
que soit la combinaison choisie, l'ensemencement primaire se fait toujours en
milieu double et chaque tube de 20 x 200 reoit un volume uniforme de 10 ml,
constitu soit par le produit analyser lui-mme, soit par le mlange "Produit
analyser + eau sale 1

%strile

de dilution".

11

Nous prendrons cornme eX2mple la numration des coli formes fcaux

en

~ilieu

d'EIJKMAN. La prsence de coliformes est dicte par la production de

gaz rsultant de la fermentation du lactose. Pour reconnatre la formation de

gaz on introduit dans le milieu une petite cloche en verre.
En cours diensemencement, on portera attention aux points suivants
- avant chaque inoculation, le milieu ensemencer doit tre agit (aspir puis
souffl trois fois avec la pipette dans le fond de l;Gprouvette doucement pour
viter tout dbordement),
- aprs inoculation dans les tubes 20 x 200, assurer le mlange intime des composants, en remuant les tubes doucement et en prenant soin diviter toute introduction d'air dans la cloche.

Volumes ensemencer
dans chacun des 3, 4 ou
5 tubes de ln
SERIE A

Combinaison
choisie

Rpartir directement
10 ml par tube de
liquide analyser

1 et
0,1 ml

10 -

_______~
5 - 0,5 et
0,05 ml

2,5 - 0,25
et
0,025 ml

Volumes ensemencer
dans chacun des 3, 4 ou
5 tubes de la
SERIE B
(dilution au 1/10me)

VolQ~es

ensemencer
dans chacun des 3, 4 ou
5 tubes de la
SERIE C
(dilution au 1/100me)

Faire di~ut i on de Il A Il
Faire dilution de "B"
10 n
10 ml
+ 90 ml eau salee 1%
+ 90 ml eau sale 1%
strile:
strile:
Mlanger
Mlanger
__=_....;R:..;.~pl;.a:;;.r=_t..:..J.:;;.r=__...:..10.::......;ml==........Partube : _~~"partir 10 rnl-'2.ar tube

50 ml liquide analyser: Faire dilution de "A"

:+50 ml eau salee 1% str.:
10 ml
+
90
ml eau salee 1% ste:
Mlanger
Mlanger
Rpartir 10 ml par tube
Rpartir 10 ml par tube

Faire dilution de "BI!

10 ml
+ 90 ml eau sale 1% str.:
I>llanger
Rpartir 10 ml par tube

25 ml liquide analyser: Faire dilution de

10 ml
10 ml
:+75 ml eau salee 1% str.:
salee
1%
st:
+
90
ml eau salee 1% str.:
+
90
ml
eau
Mlanger
ml
par
tube
Repartir
10 ml par tube
Rpartir
10
Rpartir 10 ml par tube

Tableau rcapitulatif des principales combinaisons diensemencement

SCHEMA DES OPERA'fIONS D~gNSEMENCm~EN;l' "EAUX .?ot COQU1LI..i-\GBS" .t::~

.

de:}

OU

5 tubes

_ _ _- - - - - .. - . - - . -......._ ......_.._ _........._......

_._
.. "!"!'t!l~_"'''''jj
iZI

Sb;kIES

plU' l!lI1.e~

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env..: lmlJit.t..2.tLm!

1,,0) ~2mbptai80n des s.I:;1;es 1

SEm

10

ml.

Rpartir di..,.,ctement

~ 10 ml dana chacun des :3, 4 ou 5 tubes de la a.rifl

(

:h

Z!J Q2m.binaison g,es

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sries 2i"JI." - 0,5 IJI.1

SERIE. 5

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10 ml dans chacun des ,~ 4 ou 5 tubes de la:

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-+ 90 ml eau sale )
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10 ml

..

al

50 ml .
) + 50 ml e a u '

8au.
; Broyat

'>

roll dans cbactm des :3 f 4 ou 5 tubes de la srie

Hlanger

et
Rpartir

Combinaison des saGes 2,5ml -O

.. 25ml et O,025ml
J

SERIE 2.5

Eau ou

Broyat

to ml
ml
+ 90
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5. ,tubes

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..

..

lB: ~'r1~.

13

C) ENSEMENCEMENT SUR MILIEUX GELOSES

Ce mode de nuneration n'tant pas applicable aux coquillages, et
dlicat dans le cas d'eaux

turbides~

l'ISTPM a opt pour la mthode de dnombrement

en milieux liquides, on n'aura pratiquement pas utiliser les milieux solides

(comptage des colonies caractristiques sur milieux gloss slectifs).

Toutefois~

et selon les circonstances (par exemple en cas de dnombrement paucimicrobien

dans les eaux des stations d'puration de coquillages), il peut tre ncessaire
d'utiliser la technique des membranes filtrantes sur milieu de CHAPMAN modifi
(glose lactosee au chlorure de triphnylttrazolium et au Tergitol), que nous
'"
..... :
resumons
c1-apres

Peptone .........................

10 g

Extrait de viande .............

Extrait de levure ..............

5 g
6 g

Lactose .........................

20 g

Bleu de bromothymol ..........

Eau.

0,05 G
000

Dissoudre en chauffant modrment et jusqu' complte dissolution. Refroidir

jusqu' 50 environ et ajuster le pH 7,2.
Repartir 100 ml de milieu par flacon de 150 ml.
Striliser l'autoclave 15 minutes 115

c.

Au moment de l'emploi, faire fondre au bain-marie bouillant. Aprs

refroidissement environ 50 C, ajouter chaque flacon:
- 5 ml d'une solution strile de chlorure de 2-3-5 triphnylttrazolium (TTC)
0,05

%dans

l'eau distille

- 5 ml d'une solution de Tergitol 0,02

%dans

l'eau distille.

Mlanger intimement sans faire de bulles et couler immdiatement en botes de

ptri avant refroidissement, raison de 25 ml par bote.
(L'Institut Pasteur fournit le produit dshydrat - base - qu'il suffit de
dissoudre dans la quantit d'eau ncessaire, mais il faut ensuite

~jouter

dans

les conditions ci-dessus, au moment de l'emploi, les deux solutions de TTC et

Tergitol. A noter que des ampoules de ces produits sont galement fournies par
l'Institut Pasteur).

14
Ensemencement

On utilise des membranes filtrantes de porosit 0,45

~m,

diamtre 5 cm,

livres striles.
Liappareil filtration peut tre strilis au four Pasteur, aprs
entourage de papier "igris ou papier d'alu."Jlinium

comme la verrerie.

Selon la richesse prsume en germes, on ensemencera de 100 500 ml

d'eau sur une, deux ou plusieurs membranes. Aprs filtration, la membrane est
enleve l'aide d'une pince flambe et applique soigneusement au centre de la
bote de ptri, en vitant d'enfermer des bulles d'air.
Si l'on dsire obtenir les Coliformes totaux et les Coliformes fcaux
indpendamment, on doit faire deux ensemencements
l'un sera incub 37 durant 24 heures (C.T.),
. l'autre sera incub 44 en atmosphre sature d'humidit durant 24 heures (C.F.)
A 37, toutes les colonies jaunes sont prsumes tre des coliformes (coliformes totaux

: ne rduisent pas le triphnyltetrazolium).

A 44, les colonies jaunes sont prsumes tre des Escherichia coli ( 95 %)
(coliformes fcaux).
Dans les deux cas, des

rep~quages

sont ncessaires sur glose au fer de

KLIGLER\et galerie de diagnostic ou galerie API, si l'on dsire une dtermination

plus prcise des germes.

Dnombrement

On fait la somme des colonies caractristiques et on rapporte 100 ml

d'eau selon le volume filtr.

D) METHODES DE CONCENTRATION DES BACTERIES

Lorsque le nombre des bactries dans un milieu devient trop faible pour
tre dnombr dans un volume de liordre de 100 ml (cas des bactries pathognes:
Salmonelles, Vibrio parahaemolyticus, etc.), il devient ncessaire de prlever un
volume beaucoup plus important et de procder une concentration des microorganismes qui y sont ventuellement prsents.

15
Cette opration n'est pas ncessaire dans le cas de coquillages qui,
par suite de leur pouvoir filtrant lev, assurent une concentration

I1

naturelle"

des microorganismes. Mais elle peut tre indispensable pour les eaux. On utilisera
l'une ou l'autre des methodes suivantes:

Trs intressante pour les eaux de consommation , cette mthode est

beaucoup moins aisment applicable pour les eaux de mer qui sont plus ou moins
charges en matires en suspension vivantes ou inertes et qui ont l'inconvnient
de colmater trs vite la membrane.
Nanmoins, lorsque les eaux sont suffisamment claires, cette mthode
peut tre utilise pour des volumes de 500 ou 1 000 ml, en assurant des filtrations
successives partir de 3, 4 ou 5 membranes diffrentes.
Dans le cas o lion dsire un dnombrement, celui-ci se fait
gnralement en utilisant les milieux Geloses choisis, correspondant aux germes

rechercher, en appliquant les 3. 4 ou 5 membranes ayant assur la totalit du

volume filtr sur autant de botes de glose.

a) Prparation du lait d'alumine

Dans un ballon Pyrex de 2 litres, mettre 1 litre d'eau + 100 g de
sulfate d'alumine.
Mlanger et precipiter, par additions successives, 190 ml d'ammoniaque 28

%NH3.
Faire bouillir pendant 5 minutes pour liminer l'ammoniaque en

...

exces.
Laisser dcanter 24 heures.
Siphonner ou vider avec prcaution le liquide clair surnageant
et le remplacer par le mme volume d'eau pure. Agiter vigoureusement et laisser
dcanter encore 24 heures.
Refaire cette opration autant de fois que ncessaire jusqu'
limination de toute trace d'ammoniaque (s'en assurer l'aide du ractif de
NESSLER)
Lorsque l'~oniaque a disparu en totalit, ajouter une dernire
quantit d'eau pure de faon obtenir un lait assez pais mais suffisamment fluide

16
pour pouvoir tre aisment pipete. Rpartir 10 ml par tube de 16 x 160 bouch
vis.
Striliser 15 minutes 120 0 C. Trs bonne conservation.

b) Concentration des germes

Ajouter 10 ml de ce lait d'alumine (1 tube) 500 ml d'eau analyser
(ou 2 tubes pour 1 litre).
Agiter vigoureusement pendant 5 minutes.
Laisser dcanter au rfrigrateur durant la nuit
Siphonner l'eau surnageante. Le culot d'alumine peut tre encore rduit
par centrifugation, mais cette opration n'est pas indispensable.
Un volume de 500 ml d'eau

analyser~

traite, fournit un culot d'en-

viron 10 15 ml qui peut tre alors ensemence sur les milieux liquides choisis
correspondant aux germes recherchs.

17

v - TABLES N.PoP. DES GERMES EN MILIEU LIQUIDE

PAGES
Eaux
Ensemencements en 3 tubes dans les series

10 - 1 - 0,1 ml

18

18

19

19

2,5 - 0,25 - 0,025 ml

20

20

10 - 1 - 0,1 ml

21

22

23

24

25

26

5 - 0,5 - 0,05 ml

Ensemencements en

4 tubes dans les series

Coquillages

5 - 0,5 - 0,05 ml
2,5 - 0,25 - 0,025 ml

J8

..
Nombre le plus probe:bie d f crgardsmes prsents d.ar.s 100 ml dt ea.u, a.J.Ira ensemencement da

WtubeS d..a.r'..s ch1:t.c'Jne des, dilU:tiO:n.."l :

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enaencenent dtuoos dans cb.aqu.ne des di11XtiOns : 10 ml - 1 ml- 0,1 ml

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ensemencement d{D!:ubes darlB chacune des dilutions : 5 r.. - 0,5 ml - 0,05 ml

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d{TItubes dans chacune des sries : 2,5 ml - 0,25 ml - 0,025 ml

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Nombre le plus prohable dt org-anismes prsenta dans 100 ml do clID.ir de coquillages, aprs

ensemencement de , tubes dnns c.~acune des d.iluUons : 2,5 ml - 0,25 ml - 0,025 ml

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Nombre le plus probable d'organismes prsents dans 100 ml d'eau aprs ensemencement
de@Ubes ,dans chacune des dilutions: 10 ml .: 1 ml - 0,1 ml

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1440

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2

1560

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268

1+

1+

,.

960
2800

.5600
8640

le plus p~bable d'organismes prsents dans 100 III de chair de cOQuillages,

Nombre

aprs ensemencement d~tube8 dans chacune des dilutions : 2,5 - 0,25 -0,025 1111.

1
2,5 0,25 0,025 ii NPP

NPP

2,5 0,25 0,025

NPP

2,5 0,25 0,025

m"p

2,5 0,25 0,025

o.
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0

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0
0
0

0
1

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1

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81,6

109,2
132

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1
1
1

55,2
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1
1

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144

1
1

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1
1

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1

NPP

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348
396

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4

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3
3
:5
3
3

4
4
4

600

708

516
804

4
4
4

25920

27

VI - EXPRESSION DES RESULTATS

Le rsultat donner doit dans tous les cas tre exprim par un
nombre entier.
Les nombres dcimaux seront arrondis l'unit la plus proche.
Exemples

18,3

sera report

18

27,9

28

10,8

11

54,6

55

28

VII - RECHERCHE ET DENOMBREMENT DES COLIFORMES

A) RECHERCHE ET DENOMBREMENT DES

COLIFOR~S

TOTAUX ET DES COLIFORMES FECAUX

sur bouillon lactos bili au vert brillant

Milieux utiliss
Bouillon 1actos la bile et au vert brillant
Bouillon pepton ordinaire

Formules du bouillon lactos bili

Milieu simple

Milieu double

Peptone

lOg

20 g

Lactose

10 g

20 g

Bile de boeuf dshydrate

20 g

40 g

Vert brillant

0,0133 g

Eau

0,0266 g
1000

1 000

Dissoudre par chauffage modr

Ajuster le pH 7,2
Rpartir :
le milieu simple

10 ml par tube de 16 x 160 muni d'une cloche de Durham 6 x 35 mm

le milieu double - 10 ml par tube de 20 x 200

striliser l'autoclave 15 minutes 115 0

Il

" "

9 x 35 mm

c.

(Il est prfrable d'utiliser un milieu dshydrat, commercialis par diverses marques
le milieu fourni par l'Institut Pasteur - Lille, donne de bons rsultats. On l'utilise
raison de :

40 g par litre pour le bouillon simple

80 g "

"

double

dissolution, pH, rpartition

et
strilisation comme ci-dessus

29

Peptone (ou tryptone)

Chlorure de sodium
Eau

10 g

5 g
1 000

Dissoudre par chauffage modr.

Ajuster le pH 7, aprs refroidissement.
Repartir

e~viron

10 ml par tube de 16 x 160.

Steriliser l'autoclave: 15 minutes 115 0 C.

. Le prem1er ensemencement (Test prsomptif : Coliformes totaux) se fait sur milieu
lactose bili DOUBLE
. La suhculture (Test confirmatif : Coliformes fcaux) se fait sur milieux
lactos bili SIMPLE
et
peptone ordinaire

Ensemencemen t

(voir ch. IV B)

En pratique courante, on ensemencera les coquillages, de prfrence selon

la combinaison faisant intervenir les trois dilutions
5 ml - 0,5 ml et 0,05 ml
en trois tubes pour chaque dilution.
(Toutefois, en cas de coquillages trs gras on pourra pratiquer des ensemencements
plus faibles de : 2,5 ml - 0,25 ml et 0,025 ml en trois, quatre ou cinq tubes pour
chaque dilution, et selon l'chelonnement souhait des numrations).
L'ensemencement des EAUX ne pose aucun problme et les volumes ensemencs
pourront s'chelonner selon l'une ou l'autre des trois dilutions, le plus souvent en
trois tubes.
Incubation

Placer les tubes de culture pr1ma1re (20 x 200) l'tuve 37 0 C

durant 48 heures.

30

1/ Recherche des coliformes totaux

Noter les tubes gazognes (au moins 1/4 de la cloche) : ils correspondent aux coliformes totaux. Le dnombrement est donne par les tables N.P.P.

2/ Recherche des coliformes fcaux

A partir des tubes gazognes ci-dessus, pratiquer le test de
MACKENZIE.
Chaque tube est repiqu
. sur milieu lactose bilie concentration SIMPLE (tubes 16 x 160),
. sur bouillon peptone ordinaire.
Placer au bain-marie regl trs exactement 44 C durant 24 heures.
Noter les tubes gazognes et rechercher l'indole dans les tubes
homologues (ajouter environ 0,5

IT~

de ractif de l'indole). En prsence d'indole,

une coloration rouge cerise se dveloppe immdiatenent(ne pas tenir compte des
reactions tardives ou de teintes rose, brune, orange-rougetre, etc.).
Tout tube de culture primaire gazogne 37 C et ayant donn
GAZ + INDOLE 44 C, contient un Coliforme fcal (Escherichia coli dans la quasi
totalit des cas).
i

Dnombrement

Selon Tables N.P.P., correspondant aux dilutions et nombre de tubes

ensemencs dans chaque serie.

B) RECHERCHE ET DENOMBREMENT DES COLIFORMES FECAUX sur bouillon au Mannitol

(milieu exprimental de dnombrement rapide des C.F.)
Milieu utilis

Bouillon bili au mannitol.

31
!~~~~~

(concentration double)

Tryptone
Tryptophane

24 g
2 g

Mannitol

18 g

Bile de boeuf dshydrate

50 g

Chlorure de sodium

10 g

Phosphate monopotassique

3 g

Phosphate Di-potassique

7 g
0,4 g

Lauryl-sulfate de sodium

000

Eau

Dissoudre par chauffage modr.

Ajuster le pH 7, aprs refroidissement.
Rpartir le milieu double raison de 10 ml par tube de 20 x 200 mm,
muni d'une cloche de Durham de : 9 x 35 mm et bouch vis.
Steriliser l'autoclave 15 minutes 115 0 C.
!~~~~S~~~~ (voir Ch. IV B)

Rappel

======

Pour les analyses habituelles, et quelle que soit la combinaison choisie

(voir ci-aprs), on ensemence chaque tube de milieu double avec un
volume uniforme de 10 ml constitue soit par le produit analyser luimme, soit par un mlange "produit analyser + eau sale 1

%strile

de dilution".

En pratique courante, on ensemencera les coquillages de prfrence selon

la combinaison faisant intervenir les trois dilutions :
5 ml - 0,5 ml et 0,05 ml

en trois tubes

(toutefois en cas de coquillages trs gras, on pourra pratiquer des

ensemencements plus faibles de 2,5 ml - 0,25 ml et 0,025 ml, en trois, quatre ou
cinq tubes pour chaque dilution, selon l'chelonnement souhaite des numrations).
L'ensemencement des eaux ne pose aucun problme et les volumes ensemenc~6
pourront s'echelonner selon l'une ou l'autre des trois dilutions, le plus souvent
en trois tubes.

32
Incubation

Immediatement aprs ensemencement, placer dans un bain-marie rgl

trs exactement 44 0 C (tolerance thermique maximale :

0,2 0 cl.

Utiliser un bain-marie parfaitement calorifug ou une cuve munie

d'un thermo-plongeur circulation et disposant d'un thermomtre contact.
Duree d'incubation: 24 heures.

Recherche des coli formes fcaux

Reprer les tubes gazognes (dont la cloche contient au moins 1/4 de

gaz) et y ajouter environ 1 ml de reactif d'indole.
Agiter doucement.
En prsence d'indole, une coloration rouge cerise se dveloppe
immdiatement (ne pas tenir compte des ractions tardives ou de teintes rose, brune,
orang-rougetre, etc.).
Tout tube prsentant Gaz + indole est rput contenir un coliforme
fecal (Escherichia coli dans la quasi totalit des cas).

Dnombrement

Selon Tables N.P.P. correspondant aux dilutions et au nombre de tubes

ensemencs dans chaque srie.

33

VIII - RECHERCHE ET

D~NOMBREMENT

DES STREPTOCOQUES FECAUX

Milieux utiliss

Test presomptif .. , .. Hilieu de ROTHE

Test confirmatif ..... Milieu de LITSKY
- Formule du milieu de ROTHE
Milieu simple
Peptone

Milieu double

20 g

40 g

5 g

10 g

Chlorure de sodium.............

5 g

10 g

Phosphate bipotassique .........

2,7 g

5~4 g

Phosphate monopotassique .......

2,7 g

5,4 g

Azothydrate de sodium........

0,2 g

0,4 g

Glucose

Eau distille ................

000

1 000

Dissoudre en chauffant modrment - filtrer.

Ajuster le pH : 6,8 7.
Rpartir le milieu double ra1son de 10 ml par tube de 20 x 200.
Striliser l'autoclave: 15 minutes 115 0 C.
Il est prfrable d'utiliser

fui

milieu dshydrat, commercialis par diverses marques

le milieu fourni par l'Institut Pasteur de Lille donne de bons rsultats. On l'utilise

raison de 71,2 g par litre de milieu double.

- Formule du milieu de LITSKY
Peptone

20 g

Chlorure de sodium.............

5 g
5 g

Phosphate bipotassique ........

2,7 g

Phosphate monopotassique ......

2,7 g

Azothydrate de sodium.........

0,3 g

Etyl-violet .................

0,0005

Glucose

34

Dissoudre en chauffant moderment - filtrer.

Ajuster le pH : 6,8 7.
Rpartir raison de 10 ml par tube de 16 x 160.
Steriliser l'autoclave: 15 minutes 115 C.
Il est preferable d'utiliser un milieu deshydrate, commercialise par diverses
marques: le milieu fourni par l'Institut Pasteur de Lille donne de bons resultats.
On l'utilise

raison de 35,7 g par litre.

- le premier ensemencement (Test prsomptif) se fait sur milieu de ROTHE

(double) ;
- la subculture (Test confirmatif) se fait sur milieu de LITSKY (simple)

Pour les analyses habituelles, et quelle que soit la combinaison

choisie, on ensemence chaque tube de milieu de ROTHE avec un volume uniforme de 10 ml
constitue, soit par le liquide analyser
analyser + eau salee 1

lui-mme~

soit par un melange "liquide

%strile".

Incubation

Test presomptif (milieu de ROTHE)

Placer l'etuve 37 C durant 48 heures.
Tout tube prsentant, aprs ce dlai, un trouble, est presume contenir
un streptocoque fecal, il doit tre obligatoirement repique sur milieu confirmatif
de LITSKY.
Test confirmatif (milieu de LITSKY)
Placer l'tuve 37 C durant 48 heures.
Tout tube presentant aprs ce delai un trouble net ou un louche, accompagne d'un petit amas violac dans le fond du tube (agglomerat de corps microbiens
ayant fix le colorant), est considere positif.
Le dnombrement est donn par la table N.P.P.

35

IX - RECHERCHE DE VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS

(Groupe des Vibrios N.A.G.)

A - GENERALITES SUR LES VIBRIONS PATHOGENES

Famille des spirillaceae
Gram Formes courtes, souvent incurves (en virgule) - polymorphisme frquent
dans les cultures ges.
Giliature polaire, trs mobile.
Aerobie.
Prfre un pH alcalin (de 7,6 9).
Vgte de 14 42 C (Opt. 37 C).
Supporte des teneurs leves en sel

ce critre a permis de distinguer

1 - ~2~_h!2Eh!!~~_~2~~~~~ vgtant dans des milieux dpourvus de sel ou ayant

des teneurs en sel n'excdant pas 3 g

%.

Ils comprennent les Vibrions agglutinables dits "Vibrions cholriques"

Vibrio cholerae(ou Vibrio

cc~a)

et

. Vibrio cho10rae El Tor (biotype du prcdent).

tous deux trs pathognes et responsables du "cholera asiatique".

2 - Les haloEhiles stricts ne se dveloppant pas dans

et supportant de hautes teneurs (jusqu' 10

un

milieu dpourvu de sel

%).

Ils comprennent les Vibrions N.A.G. (non agglutinables) beaucoup moins

pathognes que les precedents, ma1S responsables de toxi-infections alimentaires, selon les types:
Le Type l .... : Vibrio parahaemolyticus est toujours pathogne, exige du sel
pour sa croissance et supporte jusqu' 6
Le Type IL ...

Vib~io

alginolyticus est rarement pathogne, exige du sel et

tolre jusqu' 10
Le Type III ...

%.

%'

Vibrio anguillarum n'est jamais pathogne, exige du sel et

supporte jusqu' 8

%'

36

SUCRES : glucose, amidon, dextrine, mannose, maltose sont acidifis sans gaz.
saccharose est acidifi sans gaz (ce caractre permet de diffrencier
les Vibrio cholerae et Vibrio cholerae El Tor (saccharose +) de Vibrio
parahaemolyticus (saccharose -).
Lactose, inuline, dulcite : Red. des nitrates ..... : +
Glatine ...... ,......

toujours liqufie

Indole. . . . . . . . . . . . . . . .

touj ours +

H2S. . . . . . . . . . . . . . . .

- (parfois des traces)

Oxydase/cytochrome-oxydase .... : toujours +

e~E~~!~E~_~~~~8~~~~~~

Les Vibrio cholriques (Vibrio cholerae et Vibrio cholerae El Tor)

disposent des anticorps :
H

(flagellaire non spcifique)

(somatique, specifique)

Seul ce dernier est utilisable : les deux germes agglutinent dans le serum 0
(groupe 1)
(ce test important permet, si ncessaire, la distinction entre les vibrions
choleriques, les vibrions non-agglutinables - N.A.G. - tels que: V. parahaemolyticus, V. alginolyticus et V. anguillarum).
Vibrio parahaemolyticus possde trois varites d'antignes

(somatique, thermostable),

(flagellaire, thermolabile),

(capsulaire, de surface qui inhibe la reaction d'agglutination

par "0" rendant ainsi "0" in.?,gglutinable).

Aucun de ces anticorps n'est specifique. En outre, d'autres vibrions specifiquement "marins" sont agglutines par les anticorps 0 et K de V. parahaemolyticus : le
test d'agglutination n'est absolument pas concluant en ce qui concerne
V. parahaemolyticus.
En pratique courante, l'identification serologique n'est pas faite pour ce
groupe de germes.

37

Les vibrions cholriques (V. cholerae et V. cholerae El Tor) lysent

les hmaties de l'homme et du lapin, mais seul V. cholerae El Tor lyse en outre
les globules rouges du mouton, ce qui permet, si ncessaire, de les distinguer.
Pour Vibiio parahaemolyticus, l'hemo-digestion est ngative.

Elle intresse :
Vibrio cholerae et Vibrio cholerae El Tor, responsables du cholra "Asiatique".
Le groupe des Vibrio N.A.G. (non agglutinables) et spcialement Vibrio parahaemolyticus responsable des toxi-infections alimentaires.

La prsente notice traite uniquement de la recherche des Vibrio N.A.G.

(Vibrio parahaemolyticus) dans les eaux de mer et les coquillages.
(en raison cependant des caractres voisins de ces deux groupes de
germes, les lments diffrentiels importants entre les vibrions cholriques et les
vibrions N.A.G. ont t indiques).

B - RECHERCHE DE VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS

Le petit nombre de ces

org~nismes

dans les eaux de mer et les coquillages

rend ncessaire un enrichissement prealable.

EAU X
Proceder une concentration pralable dans au moins 1 litre d'eau
analyser :
dans le cas d'eaux claires, on concentre par passage sur une ou plusieurs membranes,
dans le cas d'eaux limoneuses, on concentre par l'alumine.

Broyer et diluer selon la technique habituelle et prlever les volumes

choisis :
si l'on fait une recherche qualitative, il suffit d'ensemencer 3 tubes avec 10 ml,
1
S1

ml et 0, 1 ml,
l'on recherche un dnombrement, on ensemence 3 fois 3 tubes avec 10 ml, 1 ml

et 0,1 ml (ou encore 5 ml, 0,5 ml et 0,05 ml) - dnombrement selon tables N.P.P.

38

ENRICHISSEMENT
10 ml eau ou broyat

+ 10 ml milieu d'enrichissement double (2)

i'

Il

+ 9 ml diluant (1)

0,1ml"

"

+ 9.9

1 ml

11

(*)

+ 10
+ 10

"

"

1.

Bien agiter les tubes avant incubation

INCUBER 24 h 37 C

(*) NOTA - L'inoculum de 0,1 ml d'eau ou de broyat sera pris dans 1 ml de la

dilution prcdente rajout dans 9 ml de diluant.
ISOLEMENT
Prlever une anse de chacun des tubes ci-dessus, EN SURFACE, et isoler
en stries parallles sur Glose T.C.B.S. (3) coule en botes de ptri, et tien sche.
INCUBER 15 18 h

(~axi)

37 C

Sur ce milieu, les Vibrio poussent plus vite que la flore adventice,
qui est presque totalement inhibe durant les premires heures d'incubation. Les
plaques doivent donc tre examines entre 15 et 18 heures aprs isolement : aprs
ce dlai les caractristiques morphologiques et tinctoriales des colonies de vibrio
se modifient et des colonies appartenant d'autres espces se dveloppent;
\,

Petites colonies centre vert ou bleu-vert ( bord incolore) (Saccharose -)

o2

3 mm. lisses, en dme : Vibrio parahaemolyticus et ventuellement Vibrio

anguillarum
Petites colonies jaunes (saccharose +)

02

Grosses colonies jaunes-brun (saccharose +)

3 mm
C/J

Vibrio cholriques possibles,

3 6 mm : Vibrio e.lginolyticus.

(Sur ce milieu, les coliformes, les Proteus et Streptocoques donnent

des colonies petites et incolores).
Choisir des colonies "suspectes ll (c'est--dire

vertes ou bleu-vert,

rondes, lisses) et les repiquer sur milieu de ICLIGLER sal 3

%(4),

en strie sur

la tranche et en piqre centrale profonde dans la butte.

INCUBER 24 h 37 C

39

Dans les deux cas de : Vibrio cholriques (V. cholerae et V. cholerae

El Tor) et des Vibrio N.A.G. , le tube de KLIGLER se prsente ainsi
(lactose -)

- Tranche

roU{~e

- Butte

jaune (glucose +) Gaz

- H2S

)
) Si KLIGLER diffrent, inutile de pour) su~vre

Si KLIGLER comme ci-dessus : ensemencer une galerie de 6 tubes d'eau

peptone alcaline (5)
de 0

%;

%;

(chacun des 6 tubes ayant respectivement une teneur en NaCl

% ; 6 %; 8 % ;

10

%).
INCUBER 24 h 37 C

Les Vibrio N.A.G. (comme tous les Vibrio) sont Oxydase +, et presentent
en outre les caractres halophiles suivants sur eau peptone alcaline, non sale,
salee et hypersalee.
Type l

Vibrio parahaemolyticus : Vegte et donne de l'indole pour des teneurs

en sel de 1, 3 et 6 % (mais non pour
0, 8 et 10 %)
Oxydase: +

T'.e II

Vibrio alginolyticus

Vgte et donne de l'indole pour des teneurs

en sel de 1, 3, 6, 8 et 10
Type III

Vibrio anguillarum

% (mais

non pour 0

%)

Oxydase : +

Vgte et donne de l'indole pour des teneurs

en sel de : 1, 3, 6 et 8

% (mais

non pour 0 et 10 %)

Oxydase : +

EXAMENS COMPLEMENTAIRES
L'identification biochimique est fastidieuse et pratiquement inutile en
analyse de routine.
On pourra cependant pratiquer les examens complementaires suivants
destines assurer le diagnostic :
Examen microscopique : Mobilit (grande) entre lame et lamelle,
Morphologie,
Coloration de Gram (-)

40
Distinction entre les 3 types ci-dessus

NaCI

8 % la %

Actoine

,
Culture a

Saccharose

42

V. parahaemolyticus

V. alginolyticus

V. anguillarum

Dans le cas des Vibrio N.A.G. (V. parahaemolyticus), il n'y a pas

d'preuve d'agglutination possible.
Mais Sl l'on a pris soin de replquer des colonies jaunes provenant des
plaques T.C.B.S. et ayant donn des lments positifs sur KLIGLER et EAU PEPTONEE
faisant penser des Vibrions cholriques, on doit faire une preuve

d'agglutination~

61le-ci se fait d'abord en eau physiologique pour s'assurer qu'il n'y a pas autoagglutination puis, si le rsultat est ngatif, avec l'antisrum 01.
Si agglutination avec 01 : il s'agit probablement de V. cholerae ou de
V. cholerae El Tor: la distinction peut tre faite par la recherche de l'acetone.

41

CARACTERES
Vibrions responsables
du cholra
Vibria
Cholerae

Vibrio
cholerae
El Tor

+++

Color. colonies sur TCES

j.aune

ET DIFFERENTIELS

Vibrions responsables de
taxi-infections alimentaires
Vibrio
parahaemolyticus
(Type 1)

Entropathognicit

CO~WillNS

+++

Vibrio
alginolyticus
( T"'.JP e

II)

Vibrio
anguillarum
(Type III)

- (+)

++

jaune

Bleu-vert

jaune

bleu-vert

Liqufaction de la
glatine

Rduction des nitrates

Acidification du
saccharose

Indole (sur E.P. pH 8)

Production H2S
;

"----~./

Actoine

//

+
+

%
6 %
8 %
10 %

....

Cytochrome-oxydase
Arginine dihydrolase
Lysine-dcarboxylase
Halophilie sur E.P. pH 8
Teneurs en CINa

0
3

Hmodigestion (hmaties mouton)

partielle
totale
(zone verdtre) (zone incolore)
Agglutination sur Antisrum 01 +

Croissance 42 C

42

PRINCIPAUX MILIEUX UTILISES

....... -----~

(1) ~i!~~~~_~~~~~~_~~!~
(' Q........

......

Tryptop

foI."""""'" U-r: OV'

..,.,...-~,.

/",.-

pH : 8

1 g

NaC)./

Ea distil16e

30 g

Striliser 20' 120 0 C

000 n

(2) Milieu d1enrichissement double

Peptone
NaCl
Eau distille

40 g )
pH : 8,6
60 g ) Steriliser 20' 120 0 C
000 ml )

(3) Glose TCBS

Peptone
Extrait de levure
Citrate de sodium
Thiosulfate de sodium
Chlorure de sodium
Bile de boeuf
Citrate ferrique
Saccharose
Bleu de bromothymol
Bleu de thymol
Agar

10 g

5
10
10
10

pH:

8,6

20
0,04
0,04
14

Dissoudre en chauffant modrment et porter bullition jusqu' dissolution complte

dans 1 litre d'eau distille.
Ne pas autoclaver.
Distribuer en flacons (25 ou 50 ml par flacon)
au rfrigrateur.
VInstitut Pasteur fournit le milieu

I1

':lU

directement en bote de ptri, conserver

prt l'emploi en flacon de 25 ml (nO 55 931)

ou sous forme dshydrate en bote de 100 g (nO 69 456) - dans ce cas, il suffit de
verser 88 g du produit dans 1 000 ml d'eau, dissou1re en chauffant lentement jusqu'
bullition - ne pas autoclaver.

(4) Milieu de KLIGLER SALE

Extrait de viande de boeuf
Extrait de levure
Peptone
Chlorure de sodium
Citrate ferrique
Thiosulfate de sodium
Lactose
Glucose
Rouge de phnol
Agar

3 g
3
20

30
0,3
0,3
10
1

0,05
12

pH

7,5

Dissoudre en chauffant et porter bullition dans 1 litre d'eau distille.

Distribuer en tubes de 16 x 160 - Striliser

l'autocl~ve

15 minutes

120~

C.

Refroidir en position incline de faon obtenir une butte de 3cn de haut. environ.
(le milieu est ensemenc en stries sur la tranche et en piqre profonde
dans la butte).
Y~IGLER

L'Institut Pasteur fournit le milieu de

ordinaire, (c'est-

-dire non sale et contenant seulement 5 g de chlorure de sodium, sous forme

dshydrate en bote de 100 g (nO 64 846)

au moment de la dissolution des 55 g

ncessaires pour faire un litre de milieu de KLIGLER ordinaire, il suffit d'ajouter

25

Y~IGLER

de chlorure de sodium p01rr obtenir le milieu de

sal necessaire la

recherche des Vibrio.

Peptone. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
lOg
NaCl
0, 10, 30,60,80.100 g
Eau distille................
1000 ml

(6) Milieu de CLARK et

pH 8

) Striliser 20 i 120 0 C

Lu~S

Peptone
.
Phosphate bipotassique
.
Glucose
.
Eau distille ...............

10

2 g

10 g
1000 ml

pH 7,5

Rpartir 5 ml par tube. Steriliser 20 mn 120 0 C. Recherche de l'Actyl - Methyl Carbinol (Actoine). Ensemencer largement le milieu. Incuber 24 h 37. Prelever
1 ml de la culture, l'additionner de 0,5 ml dlune solution d'alpha-naphtal 6
alcool 60 0 C et de 1 r:.. d'une solution de soude 16

%.

%dans

Agiter. Laisser reposer 1/4

heure. Teinte rouge ou rose : raction +.

Antisrum 01 (Vibrion cholrique) fourni par Institut Pasteur.

44

On utilise les disques de papier imprgns d'oxalate de dimethyl831)~

paraphnylne diamine (Institut Pasteur, nO 53

pratiquer ainsi

_. l'aide d'une effilure de pipette Pasteur (et non dlun fil Nichrome), prelever

un fraement de culture sur ,--:,;elose et le placer sur un disque 1I0X" imbib d'eau
distille~

la prsence d'une oxydase dans le systme enzymatique du r,erme se

traduit par une coloration violette immdiate.

- des fausses ra.ctions se produisent lorsqu ion l)art de culture sur milieu..x geloss
sucres (KLIGLER

nota~ent),

il est prfrable dans ce cas d'utiliser des cultures

sur bouillon peptone. Placer environ 0,5

~l

de la culture dans un tube hmolyse

et y ajouter un disque "OX", une coloration violette apparat aprs 1/4

Lysine monochlorhydrate
5
Extrait de levure
3
Glucose ........................... 1
Bromocresol pourpre (solution ~
1,6 g % d'alcool il 95 C)
1
Eau distille
1000

d'~eure.

G
g

pH 7,2

ml
ml

Rpartir environ 5 ml par tube de 16 x 160 et striliser 15 minutes 120 C.

Au noment de l'emploi, distribuer aseptiquement lV un des tubes de 16 x 160 en une
dizaine de tubes

a hmolyse

raison de 0,5 ml par tube.

Ensemencer le tube hmolyse avec ml fragment de culture sur glose (ou KLIGLER).
Placer au bain-marie 37 durant 2

&3

heures - la dcarboxylation se traduit par

une coloration bleu-violet du milieu.

Mme milieu de base que ci-dessus. Mme preparation.

Remplacer la lysine par l'arginine
Saccharose
10 p;
Peptone ..........................
Saccharose .......................
5 g
NaCl ............................
30 g
Eau distille ................... 1000 ml

)
)

pH L6

...

) Steriliser 20' a 110 C.

45

x-

RECHERCHE DES SALMONELLA

Nous mentionnerons seulement ici la recherche biochimique des Salmonella

permettant d'aboutir au diagnostic de groupe.
Une

identific~tion

plus prcise du type peut cependant tre faite, de

faon assez facile, partir des colonies isoles sur glose et ayant donn un
rsultat positif sur galeries de diagnostic biochimique, en mettant en oeuvre le
diagnostic srologique.
Nous signalons, pour les laboratoires qui souhaitent faire cette recherche complmentaire, que l'Institut Pasteur distribue les srums polyvalents
T.A.B.C. permettant le diagnostic antignique de : Salmonella Typhi et des Salmonella
paraptyphi A, B et C (le mode opratoire - assez simple - est indiqu de faon trs
claire dans chaque coffret de srunls agglutinants).
PREPARATION DE L'ECHANTILLON
EAU X
On doit procder une concentration prealable des germes presents dans
au m01ns

litre d'eau analyser:

dans le cas d'eaux .e mer limpides, on peut concentrer, par passage de 1 litre (ou
plus) sur une ou plusieurs membranes filtrantes (nO Coli 5),
dans le cas d'eau limoneuses, on concentre par l'alumine.

Broyer selon technique habituelle et prlever les volumes choisis.

A - IDENTIFICATION BIOCHIMIQUE

Dans le cas de filtrat provenant de la concentration par l'alumine ou

dans le cas du broyat de chair d'hutres, les volumes de produit analyser sont
places dans des flacons contenant le milieu de pr-enrichissement double (soit

46
volume de bouillon double + 1 volume de produit analyser).
Dans le cas de concentration des germes de l'eau sur membrane, on place
directement celle-'ci (ou celles--ci) dans un tube ou un flacon contenant le milieu
de pr-enrichissement simple.
Dans les deux cas, incuber 16 20 h

37 C.

2 - Enrichissement sur milieux d'enrichissement selectifs

-----------------------------------------------------

Transferer 10 ml de la culture pr6cdente dans deux flacons contenant

l'un 100 ml de milieu liquide au Slfnite
l'autre 100 ml de

"

A partir de

Il

ch~cun

"

)incubation 24 h

"

Tetrathionate

"

....

Il

37 c)

a.... 43 C)

des 2 milieux ci-dessus, pratiquer des isolements

(1 ose boucle) sur de. botes de Ptri contenant les gloses bien seches

Glose lactos au vert brillant et au rouge de phnol

(*)

incubation 24 h 37 C.

Glose au dsoxycholate-citrate-lactose
4 - Identification
a) Examen des colonies isoles
Sur Glose au vert brillant de Kristensen
\

colonies roses etmlo rouge ............ Salmonelles possibles,

colonies vertes et halo jaune-vert

Coliformes ou autres germes

lactose + et saccharose +

colonies incolores ou blanchtres centre nOJ.r

Salmonelles possibles (H2S +)

Arizona

colonies rouges................................ : E. coli et autres coli formes

lactose +

(*) Pour obtenir des gloses bien sches, on place le couvercle de la bote sur une
tagre de l'tuve 37 C, ouverture dirigGe vers le bas, le fond qui contient
le milieu 17,610s6 solidifi tant pose obliquement sur le couvercle, ouverture
galement dirige vers le bas (voir figure).

b) Galerie de diagnostic biochimique

Les colonies typiques repres sur les plaques prcdentes sont
repiques sur l'une des galeries de diagnostic biochimique ci-aprs:
- Milieu uree-indole
Placer

iL~Jdiatement

au bain-marie 37 C durant 4 heures.

Si, aprs ce dlai, le milieu devient rouge :

ur~se

+, il ne s'agit pas d'une

Salmonelle et il est inutile de poursuivre. Sinon remettre au B.M. jusqu' 24 h.

Milieu Mannitol-Mobilit
et
Glose au fer de Kli 01er
(Aprs 24 h

incuber 24 heures 37 C
rechercher l'indole. Si indole +, il ne s'agit pas d'une
Salmonelle et il est inutile de poursuivre.
Si indole -, voir rsultats suivants)

Examiner rsultats des tubes de Mannitol-Mobilite et Glose de

Si

Mobilit

Mannitol

et Kligler

Lactose Glucose +
H28 +

(tranche rouge)
(butte jaune )
(plus ou moins abondant)

Y~igler

)
)
)
)
) Salmonelle possible
)
)

- Ensemencer une Galerie API (se reporter la technique d'ensemencement et la

fiche de diagnostic diffrentiel des entrobact6ries, dites par cette Maison).

48
SCHEMA DE LA RECHERCHE BIOCHIMIQUE
25 g floculat Eau
ou
broyat de coquillages
,.
ensemence sur :

Milieu de Pre-enrichissement non slectif

(16 20 h 37 C)

. . .,;
V'
dans

Enrichisseuent de 10 ml
)0 ml de Milieu slectif au Slnite

(18 24 h 37 C)

/
././

,""''''1\,.

',,-

.............

......

...... ...;~
#'

Enrichissement de 10 ml dans
100 ml de Milieu selectif au tetrathionai

(18 h 43 C)
i

,v
Isolements sur
~elose

/
au V.B.

~,::)
Gelose D.C.L.

Isolements sur :

Glose au V.B.

Gelose D.C.]

(24 h

Repiquages
colonies typiques
sur :
Galerie

ou

Kligler
Uree-Indole
Mannitol-Mobilit
API

iF

Repiquages
colonies tyPiques
sur :
Galerie

ou

Kligler
Uree-Indole
Mannitol-Mobilit,
API

Bouillon de pr-enrichissement, non selectif

Concentration simple
Peptone

Extrait de viande ..........

Extrait de levure
.
Chlorure de sodium .........

Concentration double
10 g

5 B

pH 7~4

pH 7,4

10

Dissoudre en chauffant modrment~ repartir le milieu double raison

de 25 ou 50 ml par flacon. Repartir le milieu simple raison de 15 ml par tube.
(L'Institut Pasteur fournit le Bouillon nutritif sous forme dshydrate,
il suffit de dissoudre dans l'eau les quantits correspondant aux deux formules cidessus) .
Striliser 15 minutes 120 0 C.
Milieux d'enrichissement slectif
- Bouillon au selenite
Peptone
.
Phosphate de sodium
.
Lactose ....................
Bi-selenite de sodium
.
Eau

5 g
la

pH 7

1-1-

000

Dissoudre en chauffant modrment jusqu' complte dissolution. Ajuster

le pH. Repartir 100 ml par flacon. Ne pas autoclaver. Striliser la minutes au bainmarJ.e bouillant.
(L'Institut Pasteur fournit ce milieu sous forme dshydrate).
- Bouillon au tetrathionate de sodium

de Muller-Kauffman

-----------------------------------~-------------------

Peptone de sOJa
.
Hydrolysat de cf-l.s6ine
.
Chlorure de sodium
.
Carbonate de calcium.......
Hyposulfite de sodium.....
Bile de boeuf ..............
Eau

2,3 g
7
2,3
25

pH 7

40.7
4)15
000

Dissoudre en chauffant jusqu' bullition. Ajuster le pH aprs refroidis

sement.
Ajouter: 19 ml d'une solution iodo-iodure,
9,5 ml d'une solution de vert brillant 0,1 %
Bien mlanger. Repartir 100 ml par flacon.
Ne pas stfriliser.
Utiliser irr~diatement ou conserver au rfrigrateur + 40 C.
(L'Institut Pasteur fournit le milieu sous forme dshydrate - base
seulement -. Il convient d'y ajouter les deux solutions ci-dessus au moment de
l'emploi) .

50

Glose lactose au vert brillant et au rouge de phnol (dite de Kristensen)

Protose-peptone ................
10 g
Extrait de levure .................
3
Chlorure de sodiwn...............
5
10
Lactose ...........................
10
Saccharose
.
Vert brillant
.
0,0125
0,08
.
Rouge de phnol
12
Agar
.
Eau
1 000

pH 7

Dissoudre en chauff~t jusqu' bullition. Ajuster le pH aprs refroidis

sement. Rpartir raison de 100 ml par flacon ou 20 ml par tube de 20 x 200.
Striliser 15 minutes 115 0 C.
(les botes de ptri recevront par la suite environ 20 ml par bote).
(L'Institut Pasteur fournit ce milieu prt l'emploi ou sous

f~rme

dshydrate) .
Glose au dsoxycholate-citrate-lactose (Hynes)
Peptone ..........................
Ext rait de vi ande ................
Citrate de sodium................
Hyposulfite de sodium
.
Citrate ferrique
.
Dsoxycholate de sodium
.
.
Rouge neutre
Agar
.
Eau

f!,

5
8,5

5,4
1

pH 7,3

5
0,02
12
,000

Dissoudre en chauffant lentement jusqu' bullition, qui ne doit pas

tre poursuivie. Aprs lger refroidissement, ajuster exactement 1 litre. Ajuster
le pH. Repartir raison de 100 ml par flacon ou 20 ml par tube de 20 x 200.
Ne pas striliser.
(L'Institut Pasteur fournit ce milieu sous forme dshydrate).
Glose au fer de Kligler-Hajna
Peptone .......................
Extrait de viande de boeuf
.
Extrait de levure ................
Chlorure de sodium
.
Citrate ferrique .................
Hyposulfite de sodium
.

20 g
3
3

Lactose
Glucose

10

Il

c-

III

Rouge de phenol .................

Agar.............................
Eau

..

5
0.3
0,3

pH 7,4

0,05
12
000

Dissoudre en chauffant lentement jusqu' bullition. Refroidir et

51
ajuster le pH. Rpartir 8 ml par tube. Steriliser 115 0 C. pendant 15 minutes.
Refroidir en position incline de faon avoir une butte de 3 cm
envJ.ron de haut.
(L'Institut Pasteur fournit le milieu prt l'emploi et sous forme
dshydrate) .
Milieu ure-indole
L-Tryptophane
Phosphate diacide de potassium
Phosphate monoacide de potassium
Chlorure de sodium
Ure

GO

..

Il

Go

"

<1

.
.
.
.
"

Alcool 95 0 C
, ..
Solution de rouge de phnol 1 %..
Eau

o o

3 g
1
1

5
20

10 ml

2,5 ml
1 000

Dissoudre en chauffant lgrement. Ne pas striliser par chauffage maJ.s

par filtration sur bougie L3 ou membrane.
Repartir 1 ml par tube hmolyse.

(On a tout '3.vantage utiliser le milieu fourni tout prt par l'Institut
Pasteur) .
Milieu Mannitol-Mobilit
Peptone
Nitrate de potassium
Mannitol
Rouge de phnol 1 %
Agar
""
Eau. . . . . . . . . . . . . . . . .

.
.
.

GO

41

"

"

..

..

"

..

..

20 g

2
2
4ml

pH 8

1 000

Dissoudre en chauffant lentement et en agitant constamment jusqu'

bullition. Aprs refroidissement, ajuster le pH.
Rpartir environ 8 ml par tube de 16 x 160.
Striliser 15 minutes 115 0 C
(L'Institut Pasteur fournit ce milieu prt l'emploi).

52

XI - RECHERCHE DES SPORES DE CLOSTRIDIUM SULFITO-REDUCTEURS

Milieu utilis - "Viande-Foie il

Digestion pepsique de viande et de foie de boeuf ...............

Glucose

Il

Il

li

Il

Il

Il

Amidon soluble
A!j'ar.. . . . . .. . .

li

..

..

..

..

..

..

..

..

CI

..

..

..

..

..

..

..

..

..

..

..

..

..

..

..

..

..

Ct

..

..

..

..

..

..

li

..

..

..

..

..

..

..

..

..

..

..

..

..

..

..

..

000 ml

..

2 g

2 g

15

..

pH

7,7

Dissoudre en chauffant modrment - Repartir 20 ml par tube de 20 x 200.

Steriliser 15 minutes 115

c.

Prparer les solutions suivantes :

. Sol. A) solution de sulfite de soude pur cristallise 5
(peut tre sterilise par sejour de

la

%dans

eau distille

mn au bain-marie bouillant)

. Sol. B) solution de citrate de fer ammoniacal 5

%dans

eau distille strile.

(ne pas striliser)

L'Institut Pasteur fournit le milieu prt l'emploi ou le milieu-base
dshydrat - Merk fournit le milieu complet sous forme dshydrate).

Afin de dtruire les formes vgtatives des bactries et conserver

seulement les spores thermo-resistantes, placer

la

ml de l'eau analyser dans un

gros tube essai PYrex et chauffer au bain-marie rgl 75 C durant 10 minutes.

Refroidir rapidement sous courant d'eau.
Ensemencement

Faire fondre au bain-marie bouillant le tube de glose V.F. jusqu'

liqufaction complte. Refroidir ensuite

jusqu'~

55 C environ et ajouter chaque

tube:
0,5 ml de la solution A) ci-dessus)

4 gouttes de la solution B) ci-dessus.

Remettre au bain-marie rgl 55 C environ.

53
Trois tubes de glose V.F.

. le
. le

a~ns~

prpars sont ensemencs

premier avec 5 ml de l'eau analyser

2me

le 3me

avec 5 ml d'une dilution au 1/10 de l'eau analyser

avec 5 ml d'une dilution au 1/100 de l'eau analyser.
Mlanger doucement pour viter toute introduction d'air, refroidir

i~~diatement

sous courant d'eau.

INCUBER 18

24 h 37 c

Lecture

Les Clostridium sulfito-rducteurs (total des bactries sporognes

rductrices) donnent aprs 18 24 heures des colonies noires par rduction du
sulfite et production de sulfure de fer.

(Si l'on recherche spcialement Cl. Perfringens, on cultive 44 C de faon

rendre le milieu plus selectif).

54

XII - TECHNIQUE DE COLORATION DES BACTERIES

ET METHODE DE GRAM

Sur une lame propre, etaler une petite quantit de culture en bouillon
avec une anse de platine. Pour les cultures sur milieu glose, prlever une colonie
avec un fil et la diluer sur la lame dans une petite quantit d'eau sterile.
Laisser secher liair.
Aprs dessication (aspect terne), fixer la prparation par la chaleur
en passant la lame trois fois dans la flamme d'un bunsen, frottis en dessus (le
fixage par l'alcool s'utilise surtout pour les produits pathologiques).
Laver l'eau courante.
Coloration simple
Sur la lame encore mouille, verser 5 gouttes du colorant choisi

qu~

sera tal en remuant la lame. Laisser agir une minute et rejeter le colorant.
Laver l'eau.
Scher d'abord sur papier

Joseph~ pu~s

l'air jusqu' dessication

complte.
Observer l'objectif immersion.
Double coloration (mthode de GRM~)

Alors que la coloration simple permet de teinter toutes les bactries,

la coloration par la mthode de GRAM permet de les classer en deux groupes, selon
qu'ils conservent ou ne conservent pas la coloration initiale.
Au cours d'une premire coloration, on fait agir un colorant (violet
de gentiane ou cristal violet) qui colore tous les germes. Pour fixer ce colorant et
supporter les operations ulterieures on applique un mordant, la solution de LUGOL.

55
Aprs dcoloration par l'alcool, seules restent colores les bactries qui gardent
la coloration violette initiale : elles sont dites GRAM +. Les autres qui sont
dcolores sont dites GillLM -.
Pour distinguer aisment ces bactries GRAM -, on procde une
deuxime coloration avec un colorant diffrent du premier, dit "colorant de contraste" (fushine basique de ZIEHL) qui leur donne une teinte rouge.
De la sorte, la fin du traitement
GRN~

. les bactries colores en violet-noir sont dites

les bactries colores en rouge sont dites

GR~1

a) sur la prparation sche et fixe, verser 2 ou 3 gouttes de

solution de violet de gentiane; laisser en contact 60 secondes.
b) rejeter le colorant et sans laver, recouvrir de solution de LUGOL
durant quelques secondes ; jeter la solution et recommencer 2 fois
jusqu' ce que la pellicule mordore ait disparu (2 minutes environ
au total), vider.
c) laver lleau courante.
d) la partie suprieure de la lame tenue incline, verser quelques
gouttes d'alcool 90 qui, au dbut s'coule violet. Arrter la
dcoloration ds que l'alcool n'entrane plus de colorant et laver
rapidement l' eau.
- on peut aussi diffrencier l'aide d'un mlange alcool-actone
alnSl compos : alcool absolu 5 parties - actone 1 partie
e) la lame tant bien goutte, recolorer avec quelques gouttes de
solution de fuschine de ZIEHL diluer au 1/10me. Maintenir enVlron
30 secondes en contact.
f) couler le ZIEHL, laver l'eau, scher au papler Joeeph, PU1S
l'air.
g) observer l'objectif immersion.
Solutions :

Coloration simple

Colorant (violet de gentiane, ou cristal violet ou bleu de mthylne)

Acide phenique cristallis .................................

2 g

10 ml

Ajouter ensuite eau distille ...................................

100 ml

Broyer au mortier en ajoutant peu peu: alcool

Laisser reposer 24 heures et filtrer.

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Coloration de GRAM
Procder comme coloration simple avec le violet de gentiane
Solution iodo-iodure (mordant) de LUGOL
Iodure de potassium...................... . . .. .

2 g

Iode. . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Eau distille.......................... ... ...

200 ml

Dissoudre d'Rbord l'iodure de potassium dans un peu d'eau; ajouter l'io!

triturer au mortier jusqu' complte dissolution de l'iode et completer avec l'eau
distille.
Solution de Fuschine de ZIEHL
Fuschine basique de Ziehl.......................
Alcool 90
Acide phnique cristallis.....................

g
10 g
5 g

Eau distille.................................. 500 ml

Dissoudre le colorant dans l'alcool, ajouter l'acide phenique par petitef
quantits, triturer au mortier, ajouter l'eau peu peu - laisser reposer 24 heures filtrer.

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XIII - PREPARATION DU REACTIF POUR LA RECHERCHE DE L'INDOLE

Les ractifs les plus sensibles utilisent les ractions de EHRLICH,

KWACS, fa.isant appel au Para-Dimethylaminobenzaldhyde, en milieu acide.
En pratique courante, on utilisera le ractif de KWACS, facile
preparer et employer.
Reactif de KOWACS

5 g

Para-Dimethylaminobenzaldehyde

Alcool amylique primaire (Pentanol-1) .......... 75 ml

Acide chlorhydrique pur ..................... 25 ml
Mettre l'alcool dans

~~

ballon Pyrex de 150 ml.

Chauffer au bain-marie jusqu' 60 c, y dissoudre l'aldhyde en remuant

constamment.
Laisser bien refroidir le mlange et ajouter l'acide lentement (goutte
goutte), en remuant constamment.
Conserver en flacon Jaune bouch meri.
Ajouter quelques gouttes (environ 0,5 ml) du ractif la culture en
bouillon et agiter lgrement, en prsence d'indole le ractif se colore immdiatement
en rouge cerise.

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