Dubravka evoriS(ec i lvana eepelak

u red n ice

STRAI-JSOVA

ME,DICINSKA
BIOKE,MIJA

NIEDICINSKA NAKLADA
ZAGREB,2OO9.

teinski, d,uiikoai
s?oJeul
BoZidar Straus, Karmela Bari5i(

Ureja

203

l/etode clred r,:n1a korcertrar te urele

Kreatin i kreatinin
iVetcie odreul!anla korcentrac,je krealrni::

Mokra(na kiselina
Bios nteza

,45

pr,rnsr h baz:

:"tt

lrlokncra kilel ra u kr,il

I\tletoie od,ediranla mokraire r

s:

"e

Amonijak
liletoJe rdred var,a

:i208

puflni

Bazgradnta

ti4
205

Niskornolckularni duiikovi spojevi koji nakon deproteinizacije z:rostaju u

kn'noj tekucini nose zajednidki naziv neproteinski duiikovi spojevi, a sam duiik iz rih spojevtr naziva se neproteinskim du5ikom (NPN). Najveci dio NPN-a
tini cluSik iz r-rreje, slobodnih arninokiselina, mokraine kiseline, krcarinine,
kreatina i an'ronijaka (tabl. 10-1.).

antn

laka

au

:!.
rl:

Tablica 10-'l . Udio duiika iz pojedinih neproteinskih duiikovih spojeva u serumu

212

Duiik iz ureje

7,1

Duiik iz aminokiselina

3,6 mmol/L

Duiik iz mokracne kiseline

0,71 mmol/L

0,03 -0,0s

od NPN

Duiik iz kreatinina

0,36 mmol/L

oko 0,02

od NPN

oko 0,35

od NPN

Neproteinski duiik

Ll

Duiik iz ostalih spojeva

14,3 mmol/L

mmolil

NPN

0,4s-0,60

od NPN

0,15-0,17

od NPN

ro.r. Ureja
Ureja je glar-ni n.retaboliiki produkt duiikovih tvari u iovjetjem organizn.rr.r.
Sintetizira se Krcbs-Henseleirovim ciklusom u f etri (r,'. pogl. 19.). Lagano difundira kroz staniine memhr;nc px se zaro nalazi u tjelesnim rekuiinama i tkivima
u pribliZr-ro isrirn koncer-rtracijan-ra. Vi.(e od 90o/o ureje izlLrduje se iz rijela purem
bubrega, ptr oclrcdivanje koncenrracije r,rreje u krvi i scrurru sluii kao pokazatelj

bubreine funkcije. Ostatak r-rreje izluduje se purem gastrointestinalnoga trakta

i ko2e. U molekuli ureje nalazc se 2 aroma cluiika (H.N-CO-NH.) pa od 60,
kolika ;e reltrtivna molekr-rlarna n.rasa ureje, na duiik orpada 2tl, a odnos urejc
prema duiiku iz ureje ie 2,11(60/28).
U serumu zdrar-ih odraslih osoba ima 2,8 do 8,3 rnrnol/L urcjc, dok je u
punoj kn'i koncentracija neito rnan.ja zbog rnanjeg sadliaja ureje u erirrocitirna.
Brojni izvanjski iimbenici r-rtjedu na koncentraciju ure.je u kn'i ograniiavajuii

203

204

Poglaulje

l0
tako njezino klinidko znadenje u procjeni bubre2ne funkcije. Koncentracija urejc ovisi o prehra,
ni, pa osobe na prehrani koja sadrZava mnogo proteina imaju neico veiu koncenrraciju od osob;
kojima je hrana siromaSnija proteinima. Osim toga, u stanjima pove6anog krtabolizma prote in;
pri reapsorpciji krvnih proteina nakon krvarenja u gastrointesrinalnom traktu, pri Ljetenju kortizolom ili njegovim sintetidkim an:rlozima, dehidraciji ili smanjenoj perfuzrji bubrega (kod zastoja u radu srca) takoder dolazi do poveianjl koncer-rtracije ureje u krvi. Por.ecana koncentracij.
ureje u serllmll nalazi se u bolesnika sa sm:rnjenom funkcionalnom sposobnoiiu bubrcga. Rerencija duiikovih tvari jedan je od ranih znakor.a bubreine insufici.jencije. Intenzitet porasra urejc r-r
serumu pri akutnom i kronitnom glornerulonefritisu ili pijelonefritisu, te nefiosklerozi, ovisi o
stupnju smanjcnja bubreine funkcije. Yelike koncenrracije ureje u semmu (uremija) nalaze se u
kronidnoj, a pogorovo u akutnoj bubreinoj insu6cijcnciji.
Sn-ranjena koncentracija ureje u serulnll prati dugotrajna gladovanja, a u reikim o5teienjim:.
jetre to je znak smanjene sinteze ureje.

i0r 1. Metode odredivanja koncentracije ureje

Ureja se moie odrediri razliiitirn rnetodarnrr koje se osnivaju na sljedeiim principima: l. reakcija ureje s a,-diketonima i njihovim oksimin-r:r (npr. diacerilmonoksim), 2. odredivanje amonrj.rka nakon hidrolize ureje s Llreazom (npr. Berrhelotova reakcija), 3. odredivar-rje ion-selektivnim
elektrodarna i 4. enzin-rsko odredivanjc oslobodenog an.rorrijaka nakon hidrolize s ureazom.

LI metodarna na principu reakcije s a-dikeronirna reagira cijela molekula ure.je. Te metode

nisu dovoljno specifitne, jer reakciju daju i neke arninokiseline (citrulin, arginin), kreatinin i
proteini. Kao reagensi upotrijebljeni su diircetil, diacetiln.ronoksim, a-izonirrozopropiofenon.r i
dr. Serum se mora deproteinizirati, a reakcija se razvija zagrijavanjem na 100 'C. Osirn nedovoljne specifitnosti, reagens je dosta nestabilan, boja koja sc razvij:r nije dovoljno inrenzivna i ne slijedi u Sirern podrudiu Lanrbert-Beerov zakon. Da bi se intcnzivirala nastala boja, dodaju se poli-

valentni ioni kao pererovalentni arsen, zarirn feri-ion ili riokarbazid.

Metode u kojima se ureja hidrolizira ureazom, enzimom iz legun.rinoza ili bakrerija, a zarim
odreduje nastali an.ronijak, specifidne su. Nastali amonijak moie se odrediti na r.iie natina. Prije
su se dosta primjenjivale mecode odredivanja nasralog amonijaka s Nesslerovim reagensom, pri
demu se stvara koloidni iutonaraniasti kompleks. Reakcija je osjedjiva, ali katkad ntlsrupa zamucen.ie, pa su bile razvijene mnoge rnodifikacije s razlidirim stabilizarorima i modifikaci;'ama originalnoga Nesslerova reagensa.
N{nogo osjetljivija i specifidnii:r jesr Berthelotova reakcija u kojoj arr-ronijak reagira s hipokloricom i fenolom, a natrijev nitroprusid kao katalizator ubrzava nastajanje plavog indofcnola.
Reakcija tete tako da najprije amonijak s hipokloricom srvara kloramin, a iz natrijeva nitroprusida r-rasraje akvapentacijanof'erat koji karalizira vezanje kloramina i fenola u indofenol. Reakciya

tete brzo kod pH 10,5. Postoje mnoge modifikacae ove merode. Fenol koji sluii kao reagens u
rnnogim metodama poshje je zamijenjen derir.atirna fenola na C-2 atomu, koji pojadavaju inten-

zitet

bo.je,

ili salicilatom.

Ion-selektivne elcktrode za odredivanje ureje su selekrivne elektrode za amonijak koje na

n-rembrani imaju Eksiranu ureazu.
Enzimska metoda na temclju optiikog test;r visoko je specifitna i danas sluii kao referenrna
tnetoda za odredivanje ureje. Princip r.netode jest da amonijak osloboder-r iz ureje, n;rkon djelovanja ureaze, reagira s a-ketoglutaratom i NADH, u prisurnosti enzima glnramat-dehidrogenaze
(GLD). Pri tome a-ketoglutarat prelazi u glutaminsku kiselinu uz prjelazak NADH u NAD, (to
se mjeri optidkim lesrorn.

t_
l{ePro teins ki dui ikoz, i

OdreClivanje koncentracije ureje u serumu i mokraci

Preporudena metoda za odredivanje ureje u serumu

i mokraii jest UV-spektrofotometrijska

metoda s GLD-om.

Princip
Ureja se hidrolizira ureazom, a nastali amonijak reagira uz katalitidko djelovanje GLD-a s
2-a-keroglutarnom kiselinom i NADH-om. Pri tome nastaju glutaminska kiselina i NAD. Pad
apsorpcije zbog oksidacije reduciranog nikotin-amid-adenin-dinukleotida (NADH) ruzmieran
je prisutnom NH, oslobodenom iz ureje:

2weja* 2HrO -11s333* (NH4)rCO3

2-a-ketoglutarnakiselina + 2NH4* + 2NADH +

Ht

GLD

2 glutaminskakiselina + 2NAD* + 2 HrO.

Napomene
Ureja je u serumu stabilna nekoliko dana ako se serum tuva na +4 "C.
ADP se dodaje da bi akdvirao i stabilizirao GLD. pH 8,6 je optimalan za aktivnost GLD-a,
dok je ureaza najaktivnija pri pH 7,0.

Referentni intervalza odrasle osobe (serum)

2,8-8,3 mmol/L

10.2.

Kreatin i kreatinin

Kreatin je po kemijskoj strukturi metilgvanidooctena kiselina. Gubitkom molekule vode iz

njega nastaje kreatinin koji je, prema tome, anhidrid kreatina:

CH,

?",

Hrc

H.C_N

C:NH

-N
O:C_OH H.N

o:c-NH
krearinin

N,Ietabolizam krearina i kreatinina dog,rda se u bubrezir-na,

miiiiima, jetri i guSteraii. Najprije

u bubrezima iz arginina i glicina nastaju ornitin i gvanidooctena kiselina. Gr.anidooctena kiselina prelazi u jerru (manjim dijelom u guiteraiu), gdje se s pomocu metionina mecilira i nastajc
kreatin:
arqinin + Slicin
L-metionin + AIP
S-:rdenozjl-L-rnetionin

tran\imillirr'12't

tLansictazat

> ornitin + gvlnidooctena

kiselina

S-adenozil-L-metionin + ortofosfat + pirofbsfit

qvanidooctena kiselin:r

nr!rilrran\[er]zr>

S-adenozi[-L-homocistein

* kreatin

Kreatin krvlju dospijer.a dijelom u bubrege, gdje se u odraslih osoba filtrira u glon-rerularni
{iltrat i u tubulima se gorovo sav reapsorbira. Iz krvne ga plazme aktivnim transPortom preuzirnaju rniiiine sranice, u kojima se fosforilira te nastaje energijorn bogati kreatin-fosfat. Pri kontrakciji miiiia kreatin-fosfat sluii kao donor energije, pri temu se pono\rno oslobada kreatin:

sp oj

eui

205

206

Pogldulje

l0
krearin +

ArP

kreatin-kinaza

kreatin-fosfat + ADI,.

Kreatin-fosfat se u miSiinim stanicama spontano raspada, pri temu nastaje kreatinin. Thko
nastali kreatinin krvnom se plazmom prenosi do bubrega, gdje se glomerularnom filtracijom, a
tragovi i izluiivanjem u tubulima, uklanja iz organizma. Ti su procesi prikazani na slici 10-1.
Kreatinina ima u serumu, eritrocitima, gastrointestinalnim tekuiinama, Luti, znojt i likvoru.
bubreg, jetra, guiterata, miSiii

arginin+g cn

kreatin + ATP

I
I

kreatin-fosfat

kreatin

kreatinin

Slika 10-1. Metabolizam kreatina i kreatinina.

Konccntracija kreatina Ll serurlLr rezultrnta je r-rjegor'.r n:rstajanj:r, prjelaska u rni5iie i u kreatinin re reapsorpcije r-r rubulirna. U odr,islih je osoba njegova koncentracija vrlo niska te se jedr'.r
rloic dokazati. Koncentracija kreatina Ll serlu-nu povedana je kod atrofije i distrofije rniiica tc
nakon amputacija. Poveiana krc;rtinurijrr pojavljuje se ako je porerneiena reapsorpcija u tubulirna
ili ako, zbog povecane koncentr,rcije u serumu i rezultirajuce veie koncentracije u glomerularr-rom filcratu, prelazi kapacitcr reapsorpcije u tubulirn:r. IzlLrtivanje je poveitrno u n'rokraci i u
djecc za vrijeme rastil. Zl vrijerne trudnoie ili Lr er-rdokrinopatijama moZe takoder doci do hormonalnog koter-rja cubularne reapsorpcije i jadc krcatinr-rrije. Odredivanje kreatinurije dijagnostiiki
je vazno samo pri arrofiji i regeneraciji rniiica u mtoprtrualna.
Koncentracija kreatinin.r u scrumu ovisi pona.iprije o glomerularnoj filrraciji pa je to dobar
pokazatelj bubre)ne fur-rkcije. Zato se pri smanjcno.j funkcji bubreg:r nalazi povecrna koncentracija u serumu, ali tek kad jc bolest r-rzr-iapredovala, i sn.ranjeno je izludivanje u n-rokraii. Sn-ranjeno
izluiivanje kreatinir.ra mokraiorr-r moZe sc po;aviti i ako je smanjena miiicna rnasa i sn'ranjena razgradn; a kreatin-fosfata.

Cjelodnevna, 21+-satna, kolidina izluienog krearinina po kg tjelesne mase nazir.a se ,rkoeficijentom kreatinina.<. Taj je koe6cijent, smatra se, pokazarelj miiicne mase, jer se na dan u mokraci izluduje oko 2926 ukupnog kreatinintr u tijclu. U zdravih je osoba kreatinin u mokraii priliino
konstantan i ne ovisi o prehrar-ri i dir-rrezi. Zato se odredivanjern kreatinina u mokraci rnoie pro-

li

skupljena mokraca zaisra 24-satna ili nrye.

Oclnos koncentracije ure.je i kreatinina moie sc upotrijebiti kao kriterij za razlikor',rnje nekil-r
patoloikih prerenalnih od posrrenalnih stania. Zazdrayt osobu taj se odnos kre6e u interr.alu od
49 do 8t r-nol ureje/rnol kreatinina. Sni2enjc odnos,r prati akrltnu tubularnu nekrozu, srnanjen
unos proteina, gl;rdovar-rje, teike jetrene bolesti. Po','ecanje ureje u krvi uz istodobnu normalnu
koncentraci.ju kreatinina, tj. povecanje odnosa ureja/kre;rtinin, karakteristiino je zer prerena.lna
stanja kao ito su prehrtrna bogata proteinirna, povecani katabolizam proteina, zastoj u radu srca
i sl. Povecanje odnosa ureja/kreatinin uz poveianje koncentracije kreatinina rloie se povezari s
postrcnal nom opsrrukcijorn.
v.jeriti je

Neproteinski duiikoui

10.2.r.
ko

,a
o-

Metode odredivanja koncentracije kreatinina

Veiina metoda za odre divanje koncentracije kreatinina remelji

se

naJaffeovoj reakciji. Jaffe je

vei godine 1886. opazio da kreatinin s pikratom u alkalnoj ,r.ii.,i daje crvenonarandastu
boju
tiji je maksimum apsorpcij e oko 490 nm. Alkalni pikrat i kreatinin u
ekvimolarnim odnosima

stvaraju kompleks sljedede srrukrure:

o-

H2

C-NH

c_N
lll
OH

Jaffeova reakcija nije specifidna za krearinin. Nadeno je da oko 50 raznih tvari interferira u
reakciji i daje obojenost. od tvari koje interferiraju u serumu nalaze
se glukoza, piruvar, a katkad
i aceton, acetoctena kiselina i druge ketokiseline, bilirubin, te askorbinska
kiselin" i neki lijekovi,
npr' cefalosporini. Zbog toga, ovisno o prisutnosri i koncentraciji interferirajutih
tvari, re merode laino daju viSe rezultate. Zbog rcgaposto.ii mnogo modifikacija
klasitne Jaffeove metode, u
kojima se nastoialo da se 3to viSe ukloni ta interferencija. U .r.kir., metodama
upotrebljava se
adsorpcija kreatinina na aluminijske silikate (Loydov reagens, Fullerova

zemlja),di-. ,. L."+
nin odvaja od ostalih }romogena koji reagiraju. Te su
svakako
,p..idd.ri;.,
ali su relati-.tod.
vno dugotrajne i zato nezgodne za rutinski rad. Slitno su razvijene
-.,oi. i s ionskim izmjenjivadima na koje se l<reatinin veie i tako odvaja od interferirajuiih
kromogenr.
Metode s deproteinizacijom daju neito niie rezultar. oi
bez deprotei nizacije.

^.tod"
Razvijene su i >kontinuirane << metode temeljene naJaffeovoj
reakciji. Zi te je-.toi. ,r"i.ro
to sto ostali kromogeni sporije reagiraju s alkalnim pikrarom odkreatinina,
pa se mjeri podetna
brzina razvlianja boje. Time se u prilidnoj mjeri izbjegava utjecaj tvari
koje siorije ..rgi."l,r.
Postoje i enzimske metode za odredivanje krearinina. U tim se
-.roi"-" kr."tlnii d;.lou"njem kre atininaze (kreatinin-iminohid rolaza) razgraduje na N-metilhidantoin
i NH*4 ili s krea-

dnin-hidrolazom (kreatinin-amidohidrolaze) prevodi u kreatin, a ovaj

fosforilira s pomoiu
AIP-a i kreatin-kinaze. Nastali ADP u reakciji zatim reagira s fosfoenolpuruvatom
piruvat-kinaze te nastaje piruvat koji

uz djelovanye

se

krearinin +
kreatin +

AIp

odreduje optidkim resrom:

H.o

kreatinin-hidrolaza.

kreatin-kinaza,

ADP + fosfoenolpiruv",

krearin

krearinfosfar + ADp

Piruvat-kinaza.

AIp

+ piruvac

LD .

piruvat + NADH + H*
laktat + NAD*.
Enzimsku reakciju kode EDTA i oksalat, dok druge interferirajuie
tvari (glukoza, askorbinska kiselina) ne smetaju ni u velikim koncentracijama.
Postoje i neke metode koje se ne korisre reakcijom s alkalnim
pikratom. U nekima se kao
reagens na kreatinin upotrebljava 3,5-dinitrobenzoar, a ima i
pokusaja da se kreatinin mjeri s
pomoiu selektivne elektrode za amonijak koji nastaje enzimskom razgradnjom
kreatinina, ir."-

tininazom.

spojeui

2O7

208

Poglaufe 10

Preporudene metode za odredivanje koncentracije kreatinina jesu enzimska metoda i spekrrofotometrijska >rkontinuirana.. metoda s alkalnim pikratom. IJ >>kontinuiranoj<< je metodi kri-

tiino todno vrijeme odditavanja,

5to

tini potelkoiu pri manualnom radu. Zato je ta metoda po-

godna za automatske analizatore kod kojih se za vrijeme odditavanja automatski odriava roino
vrijeme.

OdreClivanje koncentracije kreatinina u serumu i mokra(i

spektrofotometrijskom >kontin u iranom( metodom s a ka
I

im pikratom

Princip
Kreatinin s alkalnim pikratom stvara kompleks crvenkaste boje. Tijek te klasitne Jaffeoye reakcije prati se mjerenjem promjene apsorpcije djekom odredenog vremena.

Referentni interval za odrasle osobe (serum):

muSkarci

79

- l25,gmol / L

i.ene 63-107 pmol/L.

10.3.

Mokra(nakiselina

Mokraina je kiselina konaini metabolidki produkt egzogenih, hranom unesenih, i endogenih, u organizmu sintetiziranih, purina u tovjedjem organizmu. Hranom se purini unose najvecim dijelom mesom, 5to je i uzrok da je koncentracija mokraine kiseline u serumu veia u razrije-

nih naroda koji tro5e viSe mesnate hrane nego medu siromalnijim pudanstvom.

10.3.r. Biosinteza

purina

Sinteza purina u tovjeka zapoiinje reakcijom riboze-5-fosfata i AIP-a pri demu nastaje fostb
ribozil-pirofosfat. Ovaj dalje reagira s amidnom skupinom glutamina, pri demu se oslobadaiu
glutamat i pirofosfat. Na taj se naiin nastali fosforibozilamin veie s molekulom glicina u fosforibozil-glicinamid. Daljnjim reakcijama s jednim C-atomom, koji se prenosi s formil-tetrahidrofolne kiseline, dulikovom skupinom, ugljidnom kiselinom u obliku bikarbonata i asparaginskom
kiselinom, nastaje inozinat, iz kojeg nastaju adenozin-5'-fosfat i gvanozin-5'-fosfat (sl. 10-2.).

10.3.2.

Razgradnja purinskih baza

Purini oslobodeni hidrolizom nukleozida mogu reagirati s 5-fosforibozil-1-pirofosfatom, pa

ponovno resintetiziraju mononuk.leoddi. Tu reakciju katalizira enzim hipoksantingvanin-fosforibozil-transferaza. Suvi5ni purini metaboliziraju se u mokrainu kiselinu. Pri tome se od gvanozina najprije odvoji riboza i slobodni se gvanin deaminira u ksantin, dok se adenozin najpriie
deaminira u inozin, a ovaj zatim gubi ribozu i prelazi u hipoksantin. Nastali hipoksantin i ksantin djelovanjem favoproteinskog enzima ksantin-oksidaze oksidiraju se u mokrainu kiselinu.
eovjek izluduje mokrainu kiselinu kao konaini metabolidki produkt purina, dok se u ostalih sisavaca mokraina kiselina dalje oksidira u alantorn.
se

r0.3.3.

Mokra(na kiselina u krvi

Krvni serum zdravoga odraslog mu5karaca sadriava 182 do 403 ymol/L mokraine kiseline,
dok je koncentracija u iena neSto manja i iznosi od 134 do 337 pmol/L. Novorodeniad ima ne-

I'

I'Iep ro teins

ktro-

NH.

i kdr Po-

oino

qlutamin

olutamat

PP

.-

t'

CH,

lot,
g

fosfo

ri

bozr l-pi

rofosfat

licin

:H, >,+P-o-tH,

\ lnmn
,/\
fosforiboza +
ATP

g' \
A
glicinamida gp
lT-* \
oH

oH

l.ioonrrr"otia

g\
A''

re-

,1,, -c-ry

L-.-"s];
<f"N' 6"N-gr)"
\#-;;&.

oH
\ oH
-.H
fosforibozilamin
'e

ki duiikoai

\,A*/
I

9^.\
',Q

RP

inozinska kiselina

%
9a,

RP\

yo-\

$+

gvanin
oge-

oo

ur.vije-

ttli

-\-*.

HH
adenin

-\-*.

A--lL-)@.n,,0.,"'\--L)
gH
Hi
ksantin

\/\,

hipoksantinr/

sfo-

Iaju

bri-

Slika 10-2. Biosinteza i razgradnja purina.

f,ol-

om

ito veie kor.rcentraci.je, ali se i'ei nakon godine

dana iivota smanje na vrijednosti odraslih. U

muikaraca se s godinama koncentracija pomalo smanjuje, a u iena se nakon menopauze izjednair-rje s koncentracijarna u muikaraca. Na koncentraciju mokraine kiseline Lrtjeiu genetidki timbenici, kao i Zivotni uvjed (prehrana itd.). Tgekorn dana koncentracija je neito veia nego noiu.
bs-

Mokraina se kiselina iz cirkulacije najvecim dllelom, oko 75%, izluduje mokraion-r, a samo
tcrvrtina izluduje se u crijevo, gdle ;e razgraduju crijevne bakterije (urikoliza). Iz glomerularnog

no-

filtrata gotovo

,PA

.ij.
en-

nu.
si-

ne,

le-

se sva mokraina kiselina u proksirnalnim tr-rbulima reapsorbira, a urati u konadnoj

rnokraci pot.jedu od aktivnog luienja mokraine kiseline u distalnim tubulima.
Izlutivanje urata kode ketonske kiseline i mlijeina kiselina.
Dijagnostitko znatenje mokraine kiseline. Uzrok poveianja mokraine kiseline u serumu
moie biti pojatana sinteza purina, poveian unos purina hranom, inrenzivniji metabolizam pulina ili smanjeno izludivanje br-rbrezima. Por.eiana koncentracija n-rokraine kiseline u serumu (hiperuricemijr) moie biti primarna ili sekundarna. Primarna se hiperuricemija pojavljuje vjerojatno zbog poremecaja kontrolnog mehanizma povratne sprege na stvaranje kljuinog meduprodukta u sintezi purina, fbsforibozilarnina. Sekundarna hiperuricemija posljedica je ubrzanog merabolizma purina, a nalazi se u zloiudnirn bolesrima, osobito u ler-rkemiji, kod infekcija, psorijaze
i terapije citostaticima - derivatima purina.

s? oj eu

209

210

Poglaulje 10

Izluiivar-rje mokraine kiseline smanjuje se u akutnim i kronidnim bubreinim bolestima zbo!bubreine insuficijencije, pri terapiji tiazidnirn diureticima i katkad u l-iiperuricemiji i acidozr
Ulozi (giht) bolest su u ko.joj se nrokraina kiselina odla2e u zglobovc. Obidno je tomu uzroi
primarna hipcruricemija, zbog pojaiane sinteze purina, iako se u ulozima katkad mogu naci .
koncentracije mokraine kiseline unutar reftrenrnog intervala. Ipak, ako se ieice priti, obidno s.
nade porast koncentracije. Poi,ecanje koncentracije mokraine kiseline u serumu najvainiji je 1"borarorijski ntiaz zlt dijagnosriku te bolesti.
Poveiana koncencracijir rnokraine kiseline nalazi se i u tzr'. obiteljskoj idiopatskoj hiperuricemiji koja se pojavljuje u dvama tipovinu. U jednorn je povecano srvaranje rnokraine kiselinc u:
normalno izluiivanje, a u drugom je srnan.jeno izlutivan.je uz normalno stvaranje mokraine kiseline. Postoji i nasljcdni poremeiaj rner,rbolizmir purina, koji se pojavljuje u muike djece. To i.
Lesch-Nvhanov sindrom. Pri tom porerneiaju metabolizma, koji sc prcnosi recesivno, hiperuric.nriju uzrokuje n'ranjak enzirna hipoksantin-gvanin-fbsfbribozil-transfer;ae. Z6o9 manjka tos e nzlma ne mogu se rz purrna ponovno srntetrzrrlti nukleocidi, p,r se slobodni gvanin, adenin i hipoksrntin u cijelosti oksidiraju n mokrainu kiseliriu.
Hiperuricernija se katk;rd nalazi i u hipertrieliceridemiji, alkoholizmu, ek-larnpsiji, respiracij'
skoj acidozi (smanjen pH pogoduje ralo2enju rnokraine kiseline) ili pri potpunorn posrrl.
Oko petine bolcsnika s ulozima ima bubreine karncnce mokraine kiseline u mokrainome
rraktu. Nedisocirana mokraina kiselina ima nisku topljivost, dok je urirt oko 10 pura copljirilr
Tako u bolesnika tiji je pH rnokraie stal-ro niii od 6,0 normalna kor-rcer-rtracija mokraine kiseline u mokraci moie prouzroiiti supersaturaciju. eisti kamenci mokraine kiseline tir-re oko 8or
svih mokracnih karnenacrr. Poveiana koncentr'.rcij:r rnokraine kiseline u mokraii rizidni je iimber-rik za nastanak kalcijevih kamenaca.
Smanjena koncentraci.ja rnokraine kiseline (hipouricemija) pojavljtge se rjede. Moie biti posljedic:r terapije uloga alopurinolon-r koji inl-ribira akrivnost ksantin-oksidaze i srvaranjc mokr,r'
cne kiseline iz hipoksantina i ksantina, i1i veiih doza aspirinrr, a mogu je prouzroiiti i rentgensk;i
kontrastna sredstva. Kadito se pojavljuje u raznirn neoplazmama i poremeiaf irna bubreinih tubula (Fanconijev sindron-r) zbog slabe reapsorpcije mokracne kiseline u tubulirna. Postoje i dr-a
nasljedna metabolitka poremecaja, n kojima se nalazi rnala koncenrracija mokracne kiseline u
serLlrru: ksantir-rLrrija s izlutir.anjen.r ksantina, l uzrok je manjak jetrene ksantin-oksidaze, i poremeiaj purin-nukleozi d-fosforilaze. -

r0.3.4.

Metode odredivanja mokra(ne kiseline

l!{okracna je kiselina u srumu i mokraci stabilna nekoliko dana na sobnoj temperaturi, a pogotovo r-ra +4 "C. Kao uzorak n'roie se uporabiti i plazma. Ako se mokraia drii u hladnjaku,
mogu se istaloiiti urati. Z.rto rr-rokraiu trcba prijc analize n-ralo alkalizirati (pH 7,5-8,0) i grijari
n.r oko 50 "C d.r *c r,rlog ur.rrl oropi.
Za odredivan.je mokracne kiselir-re postoje dvije skupine metoda, reduktivne i enzimske.
1. U recluktivnirn rnetoclarna mokraina se kiselina oksidira s fbsfovolfi'amatom u alantoin, pri
iemu se fosfovolfran-rat reducira u plavo obojcne \poJevc.
2. U enzin.rskim n.retodarna rnokraina se kiselina oksidira djelovanjem enzima urikaze n alantoin
i pri tome nlstaje vodikov peroksid.
Postoji r-riz rneroda u ko.jirr-ra se ili rnjeri izravno prjelazak rnokrair.re kiseline u alantoin ili se
na r'.lzne nadine odreduje nastali vodikov peroksid. Izravno se taj prjelazak mjeri u UV-podrutju,
jer rnokrainl kiselina ima apsorpcijski maksimum kod 293 nn, a alantoin ne apsorbira, pa se iz
pada :rpsorpcae prije i nakon djelovanja urikaze moie odrediti mokraina kiselina. Osim izravnog
m.jerer-rja u UV-podruiju, postoje i posredne metode u ko;ima se primjenjuje reakcija s fbsfbvol-

l_

Neproteinski duiikoai

spojeui 211

framatom prije i nakon djelovanja urikaze. Razlika odgovara enzimski razgradenoj mokradnoj
kiselini, a preosrali obojeni produkd odgovaraju nespecifiinoj reakciji interferirajuiih spojeva.
Metode u kojima se mokraina kiselina odreduje preko vodikova peroksida nastalog u reakciji s
urikazom takoder su mnogobrojne. U jednima vodikov peroksid katalitidkim djelovanjem peroksidaze oksidira neki kromogen, kao dianizidin, ili reagira s 2,4-di[orfenolom i 4-aminofenazonom (PAP). Te merode takoder obidno iziskuju deproteinizaciju, jer indikatorskoj reakciji
smetaju razni spojevi koji se taloienjem proteina uklanjaju.

Hro,

zH2O2

CI

2,4-dik-lorfenol

4-aminofenazon

r.r-"rl.lr:;ffi.;;::-"'^"

U drugim metodama Hrortzkatalazttoksidira metanol r

nom i amonijakom Hantschovom kondenzacijom stvara obojeni lutidinski derivat ili oksidira
etanol u acetaldehid, koji djelovanjem aldehid-dehidrogenaze prelazi u acetat, 5to se moZe odre-

diti opdikim tesrom.

mokraina kiselina

zHzO + O,

H,o, + cFrcHroH

,O

-i+g2*

,'

^atalaza

alancoin + CO2 + H2O2

-\H
' cHr(

aldehid- dehidrogenaza'

cHlc \H + NAD*

+ 2Hro

cHrcooH

+ N,

Preporuiene metode za odredivanje koncentracije mokraine kiseline jesu spektrofotomeuijska UV-metoda s urikazom i spektrofotometrijska metoda s urikazom uz askorbat-oksidazu.

koncentracije mokratne ki sel i ne spektrofotometrij ski

u ultravioletu s urikazom u serumu i mokrafi

Od

reCf

iva nje

Princip
kiselina djelovanjem urikaze oksidira u alantoin. Buduii da mokraina kiselina
ima apsorpcijski maksimum kod 293 nm, a alantoin kod te valne duljine ne apsorbira svjetlo,
mjeri se pad apsorpcije u UV podruiju.

Mokraina

se

Referentni interval za odrasle osobe (serum)

mulkarci l8Z-403 pmol/L
i,ene 134-337 pmollL

212

Poglaulje

l0
10.4.

Amonijak

Duiik iz amonijaka dini samo oko 0,4 do 0,5% ukupnoga neproteinskog duiika u krvi. Gl. niizvoramonijakau krvijestprobavni trakt.Tunasraje djelovanjemProreazt,ureaze i.rtnir.:oksidaza iz bakterija u kolonu i hidrolizom glutamina u tankom i debelom crijevu. Iako se nep:-kidno stvara dearninacijom aminokiselina, duiik se vrlo brzo uklanja iz organizma, malin-r d;'.'

d-ketoglutarna

lom vezanjem za glutaminsku kiselinu, a na.jvecin-r dijelom Krebs-Henseleitovim ciklusom sinr.ze ureje (v. pogl. 19.). Brzo r-rklanjanje amonijaka prijeko je potrebno jer je amonijak vrlo tok.-ian. Veie koncentracije urjeiu na acido-baznu ravnoteiu, a u mozgu inclirektno uzrokuju oitec.nja koja dovode do smrti. Buduii da se iz amonijaka i glutaminske kiseline sintetizira glutarnr:veie koncentr:rcije amoni.jaka n:r taj nadin uklanjaju iz n.rozga glutaminsku kiselintt i intermedr'-.re ciklusa trikarbonskih kiselina (sl. 10-3.). N;ihov manjak koii oksidativni metabolizam tl mo-gu, na ito je mozak jako osjetljiv i, ako takvo stanje potraje, dolazi do kome.
Toksiini uiinci hiperamonijemije na SZS pc
sebno su razorni za tnozak u razr.'oju, a trajanlc
glutaminska kiselina S glutamin
kiselina *
intenzitet hiperamonijemijc utjedu na Prognozir\
Do hiperamonijemije dolazi u slutajevim.
bolesti.
kiselina

7-aminomaslaina

\
semialdehid
/

jantarne kiseline

sukcinil-CoA

Slika 10-3.

tkiva, a takav je sludaj u alkalozi kad se remerr

ravnote2:r NHr*/NHr u korist NH,.
U plazmi zdravog odraslog muikarca nalazi se

Lr

Povezanost sinteze glutamina

trikarbonskih kiselina.

kada stvaranje amonijaka prelazi kapacitet njeeove eliminacije. \'eliko znadcn.ie ima oblik u kojern
se nalazi amonijak, jer NH, bolje i lakie difundir:

intermedijarima ciklusa

a u 2ena I I '2-48.1
veie koncenznatno
umol/L. Novorodeniad ima
tracije amonijaka od odraslih osoba. No, r,rijednosti ovise o metodi odredivanja amonijaka. U
starijir-r'r metodama dobivale su se veie vrijednosri, ,r navedene se vrijednosti odnose na enzimsku
11,7 -55,3

gmol/L arnonijeka.

n-retodu.

Iako je amonijak prorlukr mer;bolizma dLriikovih tvari, u dijagnostici bubreinih bolesci nema vainosti upravo zato ito ga zdrava jetra brzo uklanjaju iz cirkulacije. Zxo je odredivanje
an-ronijaka u plazmi od interesa u jetrenim bolestrma.
Poveiana konccntracija ar-nonijaka u plazmi (hiperarnonijemija) nalazi se kod vrlo teikih oSteienja jetre u hepatidnoj korni, pri teikim kn,arenjin-ra crijeva, katk,rd i kod opseinih dermacozr.
ali i pri nekim r-rasljednim poremeiajin-ra sinteze ureje i merabolidkih puteva povezanih s ciklr-rsom ureje (argir-rinemija, ornitinemija, citrulinurija, argininosukcinurija, lizinurija i intolerancij;r

lizina). U mokraii je poveiano izlutivanje amonijaka u acidozi, a smanjeno u alkalozi (r'. pog1.
).

).

r0.4.1.

Metode odredivanja amonijaka u plazmi

odreduje u plazmi. No, problem je u samom uzorku, jer koncentracija se arnonijaka stalno po\reca\ra u krr.i koja stoji, buduci da se nastar4ja enzimska razgradnja glutamir-ra i
nukleotida. Za nckoliko sari, ako krv stoji na sobnoj ternperaruri, koncentracija amonijaka poveca se i do dvostrukih vrijednosri. Na +.1 "C ta je razgradnja usporena, ali vrije dnosti ipak neito

Amonijak

se

porasru. Povecanje koncentracije amonijaka sprjedava se samo ako kn'stoji na -20 "C. Zato tzetu krv valja sraviti u led i ito prije analizirati. U metodama s deproteinizacijom trikloroctenon.r
kiselinom ili volframatom, filtrat moie neko vrijeme stajati, a da amonijak ne poraste.

Neproteinski duiikoai

Postoji mnogo metoda za odredivanje amonijaka. U jednima se odreduje u obliku

da sustav NH,/NH
drugima kao
mora se odrZ
ilacija)
jima se odred
sti, dok je

za

NH}

au

Pogodan niZi PH'

podijeliti u pet skupina: 1. metode u kojima se destilacijom, ae

m odreduje titracijom ili nekom obo2. metode u kojima se NHr* veLe za

i reakcija (npr. Berthelotova metoda);

amonijak; 4. metode u kojima se krv
metode odredivanja s pomoiu ionamonijak;
5'
ili plazma deproteiniziraju i u filtratu odreduje
-selektivne elektrode.

Enzimsko odreclivanje koncentracije amonijaka u plazmi

Princip
Amonijak reagira

s a-ketoglutaratom

i NADPH, u prisutnosti GLD-a:

a-keroglutarar + NH4+ + NADPH +

GLD

L-glutamat + NADP* + H2O

pad apsorpcije kod 339 nm.

Kru ie uzima iz vene bez staze u epruvetu koja sadriava natrijevu sol EDTA,
lJzimaijek
"i. se Sto prije centrifugira i do analize stavi u led (najvi5e 2 sata).
mg po mL }rvi. Krv

Mjeri

H*

se

Reagensi

1. Tiietanolamin-pufer pH 8,6, 30 mmol/L rrietanolamina, 13 mmol/L

2.

natrijeva a-ketoglutara-

ta, 1 mmol/L trinatrijeve soli ADP-a.

Reakcijska smjesa. Neposredno prije uporabe otopi se 0,84 mg tetranatrijeve soli dihidronikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfata po I mL reagensa 1 (1 mmol/L NADPHT).

3. Glutamat-dehidrogena

za. 5 tJ / mL'

50%-tnom glicerolu'

Postupak

U kivete od 10 rnm

se

Proba
Reakcijska smjesa (reagens 2)

1,0

Plazma

0,5

Pon-riieia se

i nakon toino

10 t-ninttta rnjeri apsorpcija

Ai)

rnl

roba mL
1,0

probe i shlepe probe Prema

doda:
te ponovno doda:

Raiun
(A,

- Ar) - (A, - A,) = AA probe' odnosno AA slijepe probe'

Buduci da je konadni volumen slijepe probe manji od volumena uzorka, mora

probe korigirati na volumen uzorka:

se

AA slijepe probe x ryrn= OOslijepe probe x 0,67 = AA slijepe probe, korigiran

AA slijepe

spojeui 213

214

Poglaufe

l0

'

Amonijak prmmolra

AA probe

- AA

sliiep.e probe

exd

korigiran

,
"Vplazme^'"
" J-qIg!. 16n.

Kod 339 nm onda je:

Amonijak pmmol/L =

Ako

se

4Ao'* - AA''1""'oo'uo''*'*" l'5?

mjeri kod 365 nm |li334 nm, umjesto 6,3

apsorpcijski koeficijent (etts= 6,18

"

63rlo\l

103, srn,

= 3,4 x

703

o,)

rcn

uvrirava se odgovarajuii molerni

lO3).

Referentni interval za odrasle osobe

mu5karci 14,7 -55,3 pmol/L
i,ene I 7,2-48,2,4mo1/ L

Napomene
ADP

se nalazi u reagensu jer sprjedava inaktivaciju GLD-a kod pH g,6.

Glicerolna otopina GLD-a razbistruje lipemidnu plazmu. Z^ti ,, nakon zavriene
reakciF
Ponovno dodaje GLD i mjeri pad apsorpcije, koji odgovara razbistravanju uzorka, ali se raj dodatak ne uzima u radun tako da je razrjedenje uzorka l,SZtO,;.
Male aktivnosti GGT-a mogu utjecati na koncentraciju amonijaka s obzirom na
to da GGT
katalizira reakciju nastanka amonijaka iz glutamata.
Kod lako visokih pote mih apsorpcija, kao i koncentracije NH. veie od 200
pmol/L u posnF
_
pak se uzima manje plazme (npr. 0,2 mL) i to treba uzeti u obzir pri izratunu.

Literatura
1. Bachmann c. Mechanisms of hyperammonemia. crin chem Lab Med
2002;40:653-62.
2' Bishop ML, Fody EP, SchoeffLE. Clinical Chemistry: Principles, Procedures, Corelations.

Lippincott W'illiams &'!7'ilkins, 2004.

5. izd. phi.ladelphia:

3' Burris CA, Ashwood ER. Tietz Fundamentals of Clinical Chemiscry. 5. izd, Sr. Louis: Saunders/Elsevier,200l.
4' BurtisCA,AshwoodER,BrunsDE.,ur.TierzTextbookofClinicalChemistryandMolecularDiagnostics.4.'uL
St. Louis : Elsevier/Saund ers, 2006.

5' eepelak I, Scraus B, Dodig S, Labar B. Medicinsko-biokemijske smjernice. Zegreb:Medicinska

nakl ada,20M.
6' DevlinTM'TexbookofBiochemistrywichClinicalConelation.5. lrd.N.*lork:Wiley-Liss,2001.
7. Gamulin S, Marujii M, Kovad Z, i sw,ur. patofiziolog ija.. 5. izd,.Zagreb:Medicinska
nakl ad,a,2002.
8' Guyton AC, HallJE. Medicinska fiziorogija. r0. izd.zagrer::Mediclska naklada, 2003.
9' Kaplan LA, Kazmierczak S, Pesce AJ, Kazmierczak SC. Clinlcal chemistry: Theory Analysys

Correlation.

izd. London: Mosby, 2003.

10. Robins SL. Osnove parologije. Zagreb: Skolska kryiga, 1994.
& co Ltd,,2002,
]1' !"ytr!'BergJM, TymoczkoJl. Biochemisrry. 5. izd. Newyork: Freeman
l2' Straus B, Sravll'enii-Rukavina A, PlavSii F, i sur., ur. Analiriike rehnike u kliniikom laborarorij t.Zagreb:Medicinska naklada, 1997.
13' Thomas L' Clinical laboratory diagnostics. [Jse and assessment of clinical
laboratory results. Frankfurr/Main: THBooks Verlagsgesellschaft mbH, 1 998.
14' Topii E, Primorac D, Jankovii s' Medicinskobiokemijska dijagnostika
u klinidkoj praksi. Zagreb:Medicinska na-

vH

Hada,2004.
15' Zllva'JF, Pannall PR. Klinidka kemija u dijagnostici i cerapiji. 3. izd.Zagreb:Skotska
knjiga, 1992.