Padronizao do mtodo de produo do antgeno para Intradermorreao de

Montenegro

Janana Pinho da Silva Passos

Programa de Ps-Graduao em Vigilncia Sanitria

Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade
Fundao Oswaldo Cruz

Orientao:
Dra Keyla Belizia Feldman Marzochi.

Rio de Janeiro
2004

FOLHA DE APROVAO

Padronizao do mtodo de produo de antgeno para Intradermorreao de

Montenegro

Janana Pinho da Silva Passos

Dissertao submetida Comisso Examinadora composta pelo corpo docente

do Programa de Ps-Graduao em Vigilncia Sanitria do Instituto Nacional de
Controle de Qualidade em Sade da Fundao Oswaldo Cruz e por professores
convidados de outras instituies, como parte dos requisitos necessrios obteno do
grau de Mestre.

Aprovado:
Dra Keyla Belizia Feldman Marzochi

_____________________________________

Dr. Akira Homma

_____________________________________

Dr. Jos Godinho da Silva

_____________________________________

Orientador:
Dra Keyla Belizia Feldman Marzochi

_____________________________________

Rio de Janeiro
2004
ii

Passos, Janaina Pinho da Silva

Padronizao do Mtodo de Produo de Antgeno de

Montenegro. Bio- Manguinhos, FIOCRUZ / Janaina Pinho da
Silva Passos: INCQS / FIOCRUZ, 2004
xv, 74 pginas

Dissertao em Vigilncia Sanitria, Programa. Ps

Graduao em Vigilncia Sanitria / INCQS, 2004. Orientador :
Dra. Keyla Belizia Feldman Marzochi

1 Leishmaniose. 2 Intradermorreao de Montenegro. 3 Produo

de Montenegro 4 Controle de qualidade. Prazo de Validade.

I Ttulo

iii

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Agradeo a Deus e a Nossa Senhora das Graas, por me protegerem e terem
iluminado o meu caminho at aqui.
Aos meus pais, Jorge Carlos e Geanete, pelo amor, carinho, companheirismo e por
serem to presentes em minha vida.
Ao meu marido Jairo Passos, pelo

amor, carinho, companheirismo e pelas

madrugadas em frente ao computador, ajudando-me na redao dos textos.

A minha filha Brbara, sempre presente com seu sorriso e carinho e ao meu beb,
ainda em gestao, que renova a minha f e esperana de que a vida vale a pena;
Enfim, a todos os que acreditaram, com o seu apoio e incentivo, contribuindo para
que eu chegasse at aqui.
Muito Obrigada!

iv

MENSAGEM

Para as pessoas que pensam ter razo,

para aquelas que tm um prazer especial
de fazer as coisas bem feitas,
ento, que isso no seja s para elas,
mas para todas aquelas que sabem
que a vida algo mais do que aquilo
que os nossos olhos vem!

Ferno Capello Gaivota

AGRADECIMENTOS

Doutora Keyla Belizia Feldman Marzochi, pela orientao deste trabalho e por me
fortalecer nos momentos de dificuldades;

A coordenao da Ps Graduao em Vigilncia Sanitriia do Instituto Nacional de

Controle de Qualidade em Sade/ FIOCRUZ;

Ao Chefe de Departamento de Reativos Para Diagnsticos, Antnio Gomes, pela

confiana depositada na realizao desse trabalho;

Ao Gerente de Produo de Reativos Para Diagnsticos, Emlson Domingos da Silva,

por tudo que representa para o meu desenvolvimento profissional e pessoal;

Doutoranda Aline Fagundes da Silva, pela co-orientao desta tese;

Ao Doutor Jos Godinho da Silva, por entender minhas dificuldades e ajudar-me de

forma desprendida no desenvolvimento do meu trabalho;

Ao Doutor Renato Marchevsky, pela colaborao e orientaes;

Doutoranda Maria de Ftima Madeira e equipe do Servio de Parasitologia do

Departamento de Microimunoparasitologia,

do Instituto de Pesquisa Clnica Evandro

Chagas;

Ao doutorando Hilton Jorge da Silva, pelo o apoio, orientao e ajuda incansvel que
me dedicou;

Ao Mestre Edmlson Domingos da Silva, por estar ao meu lado, apoiando e

ensinando-me, nos momentos de dificuldade;

A Jorge Augusto Paulo da Silva (Billy) meu irmo e amigo que muito me ajudou e
ajuda na execuo desta Tese;

vi

 minha amiga e comadre Cludia Barroso, pelo apoio e incentivo nos momentos
mais difceis;

Marcelle Brall, pela ajuda na elaborao das tabelas;

Regina Clia, pelo preparo e esterilizao de todas as vidrarias utilizadas durante

este trabalho;

Elizabeth dos Prazeres, pelo companheirismo e por estar presente nos

experimentos animais me substituindo;.

Ana Paula Bezerra da Silva, pela ajuda que me dispensou, no inicio at o final
desta tese;

A Eduardo Paulino da Silva, pelas Fotografias durante a experimentao animal;

A todos os companheiros e funcionrios do Departamento de Reativos para

Diagnstico que diretamente ou indiretamente me ajudaram;

Aos companheiros do Departamento de Controle de Qualidade de Bio-Manguinhos/

FIOCRUZ;

Ao

Departamento

da

Garantia

da

Qualidade

Bio-Manguinhos/FIOCRUZ

especialmente Virginia Salgueiro Caetano;

Aos integrantes do de Centro de Referncia Nacional em Leishmaniose Tegumentar,

do Departamento de Microimunoparasitologia, sob coordenao do Dr. Armando
Schubach IPEC / FIOCRUZ;

Ao Departamento de Imunologia do Instituto Oswaldo Cruz / FIOCRUZ,

especialmente ao Luiz Eduardo de Carvalho Paes, integrante do Centro de Referncia
Internacional de Caracterizao de Cepas de Leishmania coordenado pela Dra. Elisa
Cupolillo.

vii

Resumo

O teste intradrmico para o diagnstico da Leishmaniose foi preconizado por Montenegro

em 1926. Tratava-se de um extrato alcalino de formas promastigotas de Leishmania que se
acreditava livre de partculas e de parasitos inteiros. Atualmente, os antgenos mais
utilizados constituemse ainda de formas promastigotas, algumas ntegras e outras
sonicadas, a partir de pool cepas de Leishmania ou cepas nicas, diludas em solues
preservadoras como salinas fenoladas 0,4% ou mertiolatadas 1:10.000.
A produo do antgeno, no tem portanto uma padronizao definida no Brasil e no
Mundo e vrios preparaes

antignicos em diferentes apresentaes

so descritas

comprometendo a qualidade e a comparabilidade das respostas. Justificou-se assim, a

necessidade de padronizao da metodologia para a produo do antgeno de Montenegro,
em diferentes fases. Este estudo props definies de padres na produo do antgeno
para a intradermorreao de Montenegro em relao a melhor inculo padronizado de
promastigotas, mtodos de quantificao de concentrao de protenas, prazo de validade
e controles de qualidade, universalmente aceitos.

viii

Abstract

Montenegros antigen was advocated publicly by Montenegro in 1926 for leishmaniasis

diagnosis through intradermal test. It was an alkaline extract of Leishmania promastigotes
forms, which was thought to be particles of and parasites free. However, nowadays the
most used antigens are of promastigotes forms, some of which are integral and others are
sonicated as from pool of Leishmania strains or single ones diluted in preserving solutions
like phenol or merthiolate saline.
The production of this antigen has not been standardized in Brazil or worldwide; thus
several antigen preparations, in different doses, are described jeopardizing the quality and
comparison of answers.
Therefore, it was made necessary a standardized methodology to produce Montenegros
antigen in different phases. This study propose antigen definitions for Montenegros
intradermal reactions related to the best promastigotes inoculum, protein concentration
checking methods, validity and quality controls equivalent to the vaccines ones.

ix

LISTA DE SIGLAS / ABREVIATURAS

ANVISA-

Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria

BSA

Albumina Bovina

BOD-

Estufa Bacterilogica

FNS-

Fundao Nacional de Sade

IDRM

Intradermorreao de Montenegro

IPEC-

Instituto de Pesquisa Clnica Evandro Chagas

HCL-

cido clordrico

LT A-

Leishmaniose Tegumentar Americana

LTA

Leishmaniose Tegumentar

g-

Micrograma

mL-

Mililitro

nm-

Nanometros

NaOH-

Hidrxido de sdio

RDC-

Resoluo do Diretrio de Colegiados

Rpm -

Rotaoes por minutos

Ptn -

Protinas

SNS/MS-

Secretaria Nacional de Sade/Ministrio da Sade

SVS-

Secretria de Vigilncia em Sade

SUS-

Sistema nico de Sade

TCA-

cido Tricloroctico

UV-

Ultra-violeta

LISTA DE TABELAS, GRFICOS, FIGURAS E FOTOS

Tabelas
Tabela 1 - Crescimento de Leishmania amazonensis cepa PH8. Medida por contagem de
parasito em cmara de Neubauer e por Absorbncia.
24
Tabela 2 -Crescimento de Leishmania amazonensis cepa PH8, demonstrado pela
contagem de parasitos em Cmara de Neaubauer aps diluio em azul de de Tripan
26
Tabela 3 Dosagem do Nitrognio Protico pelo Mtodo Kjeldahl correspondente aos
nove dias de crescimento em cultura de Leishmania amazonensis cepa PH8
27
Tabela 4 Comparao entre os experimentos para determonaes de concentrao
de antgenos segundo inoculo, obtido no 4 dia de cresimento, atravs de contagem de
parasitos em cmara de Neuabauer eo mtodos de nitrognio protico e total
29

Tabela 5 - Frascos de antgenos obtidos, para intradermorreao de Montenegro e

respectivas dosagens de nitrognio protico, antes e aps a definio do inculo
correspondente a 107 parasitos /mL
31
Tabela 6 Comparao entre as dosagens do nitrognio protico e protenas totais para
defini do melhor mtodo de aferio antignica
32
Tabela 7 - Fatores de converso entre as concentraes proticas determinadas pelo
(mtodo Biureto e Kjeldalh Cp Biureto e Cp Kjeldah )
34

xi

Grficos

Grfico I - Crescimento de Leishmania amazonensis cepa PH8. demonstrado pelo numero

de parasitas, contados em cmara de Neaubauer e por absorbncia durante dez dias.
25
Grfico II - Crescimento de Leishmania amazonensis cepa PH8, demonstrado pelo
nmeros de parasitos, contados em Cmara de Neaubauer e por absorbncia,aps
diluio com azul de Tripan.
26
Grfico III - Curva da concentrao do Nitrognio Protico pelo Mtodo Kjeldahl durante
aos nove dias de crescimento em cultura de Leishmania amazonensis cepa PH8.
28
Grafico IV- Districuio de inculos de parasitos em cultura e
determinaes de nitrognio protico e total, segundo experimento I.

correspondentes s
30

Grfico V- Distribuio de inculos de parasitos em cultura e correspondentes

determinaes de nitrognio protico e total, segundo experimento II.
30
Grafico VI- Comparao entre as dosagens de nitrognio protico e protenas totais para
definio do melhor mtodo de aferio antignica
33

xii

Figuras

Figura 1 Apresentao comercial do antgeno de Leishmania para reao de Montenegro

08
Figura 2 Fluxograma de produo

12

Figura 3 Histopatolgia de pele de camundongos

36

Figura 4 Fluxograma proposto para produo

45

xiii

Lista de Anexos

Anexo1 Preparo de Azul de Tripan

54

Anexo2 Clculos dos Experimentos das Dosagens de protenas

55

Anexo3 Laudo do Teste de Esterilidade do Lote de Antgeno de Montenegro

58

Anexo 4 Laudo do Teste de Endotoxina do Lote de Antgeno de Montenegro Dentro do

Prazo de Validade
61
Anexo 5 Laudo do Teste de Pirognio do Lote de Antgeno de Montenegro Dentro do
Prazo de Validade
62
Anexo 6 Laudo do Teste Histopatolgico do Lote de Antgeno de Montenegro e Salina
Dentro do Prazo de Validade
63
Anexo 7 Laudo do Teste de Esterilidade do Lote de Antgeno de Montenegro com Prazo
de Validade Vencida
67
Anexo 8 Laudo do Teste de Endotoxina dos Lotes de Antgenos de Montenegro com
Prazo de Validade Vencida
69
Anexo 9 Laudo do Teste de Pirognio dos Lotes de Antgenos de Montenegro com Prazo
de Validade Vencida
70
Anexo 10 Laudo do Teste Histopatolgico dos Lotes de Antgeno de Montenegro com
Validade Vencida
72

xiv

SUMRIO
I INTRODUO .................................................................................................................. 1
I.1 Aspectos Gerais ....................................................................................................................... 1
I.2 Morfologia e Bioqumica da Leishmania .............................................................................. 2
I.3 O Antgeno de Montenegro .................................................................................................... 3
I.4 Diferentes Antgenos de Montenegro Produzidos ................................................................ 5
I.5 O Antgeno de Montenegro de Bio-Manguinhos e sua Produo....................................... 6
I.5.1 Detalhamento da Rotina Preconizada de Produo do Antgeno de Bio-Manguinhos ( 1992-2002 )9
I.5.2 Prazo de Validade do Antgeno para Reao de Montenegro ......................................................... 10

I.6 Consideraes Crticas ......................................................................................................... 10

II JUSTIFICATIVAS DO TRABALHO ........................................................................... 13

III OBJETIVOS ................................................................................................................. 15
III.1 Objetivo Geral.................................................................................................................... 15
III.2 Objetivos Especficos ........................................................................................................ 15

IV METODOLOGIA .......................................................................................................... 16
IV.1. Determinao das Curvas de Crescimento ..................................................................... 16
IV.2 Determinao do Melhor Inculo para a Produo Antignica ................................... 18
IV.2.1 Verificao da Repetibilidade das Curvas................................................................................... 18

IV.3 Determinao do Mtodo mais Adequado para Aferio da Concentrao Antignica

...................................................................................................................................................... 19
IV.3.1 Utilizao do Mtodo Kjeldahl ................................................................................................... 19
IV.3.2 Utilizao do Mtodo Biureto. .................................................................................................... 20
IV.3.3 Verificao da Repetibilidade das quantificaes. ...................................................................... 20

IV.4

Determinao dos Controles de Qualidade.................................................................. 21

IV.4.1 Determinao do Controle Microbiolgico................................................................................. 21

IV.4.2. Controle Histopatolgico -Teste de Inocuidade ......................................................................... 22

IV.5 Avaliao do Prazo de Validade do Antgeno para Intradermorreao de Montenegro

Bio-Manguinhos.......................................................................................................................... 23

V RESULTADOS ............................................................................................................... 24
V.1 Curvas de Crescimento ....................................................................................................... 24
V.2 Melhor inculo destinado para produo......................................................................... 28
V.3 Mtodo Definido para Aferio da Concentrao Antignica........................................ 32
V.4 Controles de Qualidade do Antgeno ................................................................................ 35
V.4.1 Controles Microbiolgicos ............................................................................................................ 35
V.4.2 Teste de Pirognio ......................................................................................................................... 35
V.4.3 Teste de Inocuidade - Controle Histopatolgico.......................................................................... 35

V.5 Definio do Prazo de Validade do teste para Intradermorreao de Montenegro ..... 37

V.5.1 Controles Microbiolgicos ............................................................................................................ 37

V.5.1.1 Exame direto............................................................................................... 37

V.5.1.2 Presena de Endotoxina............................................................................ 37
V.5.1.3.Teste de Pirognio ...................................................................................... 37
VII CONCLUSES ............................................................................................................ 46
VIII REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ..................................................................... 47

xv

I INTRODUO
I.1 Aspectos Gerais
As leishmanioses representam um grave problema de Sade Pblica,
considerando sua ampla distribuio mundial, seu espectro de manifestaes clnicas, o
envolvimento de uma multiplicidade de espcies de Leishmania e de vetores, de
hospedeiros e reservatrios animais, e as dificuldades para o diagnstico da doena e o
tratamento dos doentes.
No Brasil, tanto a leishmaniose tegumentar, como a leishmaniose visceral
ocorrem em praticamente em todas as regies do Pas. Em 2002, foram notificados 36.601
casos de leishmaniose tegumentar e 2.754 de leishmaniose visceral no Brasil (FUNASA,
2002).
Clinicamente, a doena tegumentar se caracteriza por leses na pele e (ou)
mucosas, nicas ou mltiplas. Abrange desde formas inaparentes, ou com leses de pele
discretas com evoluo cura, at formas com ulceraes mltiplas, abrangendo mucosas
da face, com evoluo arrastada, tendncia a metstases e recidivas, de tratamento difcil
(Marzochi, 1992). A leishmaniose visceral, por outro lado, doena sistmica,
comprometendo principalmente os rgos linfides (bao, fgado e medula ssea),
produzindo principalmente hepato-esplenomegalia, anemia, pancitopenia e depresso da
resposta imune celular especfica (FUNASA/ 2002).
A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) apresenta-se em fase de
expanso geogrfica. Nas ltimas dcadas, estudos epidemiolgicos acerca da LTA
(FUNASA, 2002) tm sugerido mudanas no comportamento epidemiolgico da doena.
Inicialmente considerada zoonose de animais silvestres que acomete ocasionalmente
pessoas em contato com florestas, a LTA pode ocorrer em zonas rurais j praticamente
desmatadas, bem como em regies periurbanas (Marzochi & Marzochi, 1997). Observa-se
a coexistncia de um duplo perfil epidemiolgico expresso tanto pela manuteno de casos
oriundos dos focos antigos, ou de reas prximas a eles, como pelo aparecimento de surtos
associados a fatores decorrentes do surgimento de atividades econmicas como garimpos,
expanso de fronteiras agrcolas e extrativismo, em condies ambientais altamente
favorveis transmisso da doena.
No perodo de 1985 a 2001, a LTA no Brasil apresentou coeficientes de
incidncia que oscilaram de 10,45 a 21,23 por 100.000 habitantes. Ao longo desse perodo
observou-se uma tendncia ao crescimento, registrando-se os coeficientes mais elevados

nos anos de 1994/1995, quando atingiram nveis de 22,83 e 22,94 por 100.000 habitantes,
respectivamente (FUNASA, 2002).
Ao analisar a evoluo da LTA no Brasil, observa-se uma expanso geogrfica,
sendo que, no incio da dcada de 80, foram registrados casos em 19 unidades federadas e,
nos ltimos anos, quase todas as unidades federadas registraram casos autctones da
doena.
Diferentes espcies de parasitos esto envolvidos no ciclo das leishmanioses
tendo sido identificados at o momento 21 espcies capazes de infectar o homem em todo
mundo (Shaw, 1994). No Brasil, os principais protozorios causadores da leishmaniose
tegumentar so:

Leishmania (Viannia) braziliensis (Vianna, 1911), agente de leishmaniose cutnea

e mucocutnea, que ocorre em diversas regies brasileiras. Est presente nos ciclos
peridomsticos da LTA, associa-se a uma grande variedade de espcies de flebotomneos e
pode infectar vrios animais domsticos e silvestres.

Leishmania (Leishmania) amazonensis (Lainson e Shaw, 1972), agente de

leishmaniose cutnea e da leishmaniose cutnea-difusa, encontram-se nas florestas

primrias e secundrias da regio amaznica, na Bahia, Minas Gerais e Gois (Silveira,
1984).

Leishmania (Viannia) guyanensis agente de leishmaniose cutnea, ocorre ao norte

da Bacia Amaznica (Barret & Senra 1989; Marzochi & Marzochi, 1994).

Leishmania (Leishmania) chagasi, agente da leishmaniose visceral, ocorre na

regio nordeste, porm est franca expanso nas regies Sudeste e Centro-Oeste,
(Marzochi & Marzochi, 1997).
As estratgias para o controle da LTA devem variar conforme a situao
epidemiolgica local. Para implementao e fortalecimento das aes de controle no
Brasil, envolvendo o controle vetorial alm do aprimoramento do sistema de vigilncia
epidemiolgica e entomolgica, destacam-se entre outros : o conhecimento do maior
nmero de casos suspeitos; o diagnstico e tratamento precoce dos casos confirmados e a
identificao do agente etiolgico circulante na rea (FUNASA 2002).

I.2 Morfologia e Bioqumica da Leishmania

A Leishmania um protozorio pertencente ao gnero Leishmania (famlia
Trypanosomatidae). Estes parasitos abrigam-se em clulas do sistema fagoctico
mononuclear (SFM) de seus hospedeiros vertebrados e tm como hospedeiros

invertebrados os insetos da famlia Phlebotominae, no Brasil compreendendo os gneros

Lutzomyia e Psychodopygus (Garrido, 1983).
O parasito apresenta-se em duas formas:
1-

Forma promastigota, encontrada no tubo digestivo do inseto vetor. Nesta forma a

Leishmania encontra-se em forma flagelada, alongada, e inoculada pelo inseto durante o

repasto sanguneo. No inseto, as formas promastigotas passam por processo de
diferenciao celular, com alterao da composio de antgenos de superfcie que as
tornam infectivas para as clulas fagocitrias (Sacks, 1989 apud Silva, 1999). Aps a
diferenciao, as formas promastigotas migram para o aparelho sugador do inseto e so
inoculadas na derme do hospedeiro vertebrado.
2-

Forma amastigota, encontrada nas clulas do hospedeiro vertebrado. Aps a

inoculao das formas promastigotas na derme, parasitas que escapam do mecanismo de

defesa inespecfica do hospedeiro so interiorizados pelas clulas do sistema mononuclear.
No interior dessas clulas, ocorre novo processo de diferenciao, com arredondamento
celular e perda do flagelo aparente. Dentro das clulas fagocticas, nos vacolos
parasitforos, conseguem resistir aos mecanismos de defesa do hospedeiro (Chang, 1983
apud Silva, 1999; Camus et al., 1995) e se multiplicar por diviso binria, ocorrendo a
destruio da clula e a liberao de parasitos na derme, os quais sero novamente
ingeridos por outro flebtomos.

I.3 O Antgeno de Montenegro

Com a finalidade de auxiliar o diagnstico clnico da leishmaniose tegumentar,
Montenegro, em 1926, introduziu na pratica mdica um teste realizado por intermdio da
injeo intradrmica de uma suspenso de promastigotas mortas de Leishmania
braziliensis (Montenegro, 1926). Ainda hoje o Teste de Montenegro ou Intradermorreao
de Montenegro (IDRM), que provoca uma reao cutnea de hipersensibilidade retardada,
considerado o exame complementar mais importante no diagnstico da LTA por sua
grande especificidade e sensibilidade, apresentando-se positivo em 86,4 a 97,5% dos casos
de LTA (Coutinho, 1981; Marzochi, 1992).
Os trabalhos de Montenegro foram confirmados por Buss em 1929 (apud Salles
Gomes, 1939), e outros autores, porm com um nmero limitado de pacientes. Utilizando
suspenses alcalinas fenoladas de promastigotas de L. braziliensis, Salles Gomes testou
120 pacientes, dos quais 25 confirmados parasitologicamente, encontrando 117 (97,5%)
positivos, respectivamente. As reaes eram classificadas de 1 a 4 cruzes, como reaes

duvidosas at fortemente positivas, e lidas entre 48 e 72 horas aps a aplicao.

Comparando extratos com diferentes idades, verificou apenas uma ligeira perda de
potncia, no significativa, dos antgenos mais velhos.
Pessoa & Pestana (1940) confirmaram os dados de Salles Gomes e
demonstraram que a intensidade da IDRM associava-se com a presena de leso mucosa e
que permanecia a positividade da reao em indivduos curados. Concluram que a alergia
aos antgenos de Leishmania deveria permanecer por toda a vida do indivduo. Assim, a
IDRM constituiria ferramenta importante tambm no diagnstico retrospectivo da
leishmaniose, portanto til para inquritos epidemiolgicos.
Echandi (1953) descreveu casos de possveis reaes falso-negativas em
indivduos com leses cutneas ou histria de LT, acreditando que estes casos poderiam
estar associados a possveis fatores imunodepressores atuando em paralelo realizao da
IDRM como infeces virticas (sarampo, rubola, febre amarela) e vacinao contra febre
tifide. O critrio de leitura foi a medida da rea da ppula apresentada e como ponto de
corte da reao o dimetro de 5mm, o qual tem sido utilizado at o presente momento.
Embora a leitura da reao normalmente seja realizada 48 horas aps a
aplicao do teste, Rabello et al. (1945) (apud Silva, 1999) e Fagundes et al (2000),
relatam o aparecimento de reaes locais no ponto de inoculao do antgeno de
Montenegro cerca de dez dias aps a aplicao do teste, em indivduos sadios negativos
leitura em 48 horas, sento tais reaes morfologicamente indiferenciveis da resposta
positiva clssica IDRM.
Em relao leishmaniose visceral, a IDRM tornou-se importante para estudos
epidemiolgicos, destacando-se o encontro de indivduos positivos sem desenvolvimento
de doena, que logo foi associado infeco subclnica.
De regra geral, considerava-se a IDRM como altamente especfica para o
diagnstico da LTA, apresentando sensibilidade em torno de 90,0% e manuteno da
positividade por toda a vida do indivduo. Muito mais tarde, estudos prospectivos
mostraram que pode ocorrer negativao da IDRM em indivduos inicialmente positivos,
cerca de cinco anos aps o teste inicial, conforme demonstrado por Mayrink et al. (1976) e
Marzochi et al. (1980). A alta especificidade e sensibilidade da IDRM como mtodo
diagnstico, associada sua praticidade e facilidade de execuo, fez com que esse teste
fosse considerado o melhor exame para o diagnstico da LTA.
Vrios estudos confirmaram posteriormente a utilidade da IDRM no
diagnstico clnico (Sessa et al.1976; Cuba Cuba et al.1980; Furtado,1980; Guerra et
al.1985; Oliveira-Neto et al.1988; Arbaji et al. 1993; Acedo Sanchez et al. 1996).
4

I.4 Diferentes Antgenos de Montenegro Produzidos

Em sua tese de mestrado, Silva (1999) fez uma reviso ampla sobre o antgeno
de Montenegro, sobre a qual estamos nos referenciando nesta seo. A autora partindo de
1926, quando o antgeno de Montenegro foi descrito, destacou os trabalhos dos vrios
pesquisadores que, em diferentes pocas, vm relatando estudos acerca do antgeno.
Em uma ordem cronolgica so apontados esses estudos, a seguir:
1939/ 1940 - A intradermorreao de Montenegro foi utilizada e avaliada em
larga escala e Salles Gomes a denominou de Intradermorreao de Montenegro" (IDRM),
para que fosse usado no diagnstico em seres humanos (Salles-Gomes, 1939).
1941- Passa a predominar a utilizao de suspenso parasitria fenolada a
0,4% (Correa, 1941 apud Silva, 1999).
1951- utilizada

frao polissacardica de L.braziliensis em timerosal 1:

5000, em dois pacientes e 8 controles sadios, mas esse antgeno no foi avaliado (Pelegrino
e Macedo, 1958 apud Silva, 1999).
1952 Rotberg demonstrou que os extratos originais de Montenegro continham
alguns parasitos ntegros ou mesmo restos parasitrios particulados, os quais seriam
desencadeantes da reao intradrmica. No mesmo trabalho, mostrou a correlao linear
entre a concentrao da suspenso de parasitas e o tamanho da endurao IDRM,
propondo a concentrao de 10.000.000 de parasitos nos antgenos para diagnstico .
1958 - Corra & Amato Neto, (1958) descreveram o processo de produo de
antgenos de Montenegro com promastigotas de Leishmania braziliensis rompidas por
ultra-som e diludas em timerosal a 1:10. 000.Aps o perodo de dois anos de sua produo
o antgeno sonicado apresentou-se estvel.
1969 / 1973 - Os trabalhos de Imperato e Diakite (1969) e Imperato et al.
(1974) na frica, mostraram a ocorrncia de reaes positivas salina fenolada a 0,5 em
cerca de 5% dos indivduos testados concomitantemente com antgeno de Montenegro e
soluo veculo controle, e a ausncia de reaes falso positivas soluo veculo
mertiolatada (Imperato et al. (1974). Aps esses trabalhos iniciou-se a utilizao em larga
escala do Timerosal (Merthiolate) como preservativo nos antgenos de Montenegro.
1972 - Barbosa et al. (1972) descreveram a utilizao de antgenos de outros
parasitos humanos e animais, compararam antgenos de Leptomonas pessoai e Leptomonas
braziliensis com antgeno de Leishmania braziliensis em 30 pacientes de leishmaniose
tegumentar e 64 portadores de outras afeces, obtendo 100% de especificidade nos
pacientes e 100% de negatividade entre os controles. O ponto de corte utilizado foi de

10mm e 76,0% dos resultados foram concordantes entre os 3 antgenos utilizados (apud
Silva, 1999)
1974/1975 - Shaw & Lainson (1975) produziram antgeno solvel a partir de
sobrenadantes de cultivo de Leishmania em sacos de dilise, obtendo reaes tardias e
imediatas em 28 de 36 pacientes de leishmaniose cutnea. Esses antgenos no tm sido
usados em outros estudos
1977- Melo et al (1977) padronizaram antgenos de Leishmania braziliensis
pela concentrao padronizada de nitrognio protico/ml em veculo mertiolatado a
1:10000, obtendo correlao positiva entre a rea endurada apresentada e a concentrao
de nitrognio do antgeno. Foram testados 100 pacientes com diagnstico parasitolgico de
LTA e 30 indivduos sadios, de reas no endmicas, como controles. Com a concentrao
de 40 g/ml, a sensibilidade foi de 96,0% entre os 100 pacientes e foram obtidas reaes
negativas em todos os controles. O critrio de leitura foi a medida da rea da endurao, de
acordo com o proposto por Pelegrino & Macedo(1956) para leitura de intradermorreaes
na esquistossomose. A produo de antgenos de acordo com Melo et al (suspenso
sonicada, na concentrao de 40 g/ml de nitrognio protico), tem sido a mais utilizada
nos antgenos de Montenegro produzidos no Brasil.
1986 - Reed et al(1986) produziram antgeno solvel de Leishmania chagasi
para IDRM em pacientes de leishmaniose visceral, obtendo 95-100% de sensibilidade em
pacientes curados de calazar e nenhuma reao positiva em controles sadios. O extrato foi
padronizado com 25 g de protena/mL e esterilizado por filtrao.
1990 - Badar et al(1999) avaliaram a estabilidade do extrato aps 1 e 3 anos
de produo, mostrando a manuteno da sensibilidade e potncia do extrato, apesar da
degradao.
Contudo ainda hoje, como ressaltou Silva (1999), no esta estabelecido um
antgeno padro para a IDRM de uso universal.

I.5 O Antgeno de Montenegro de Bio-Manguinhos e sua Produo

Desde 1992, Bio-Manguinhos, uma unidade tcnico-cientifica da FIOCRUZ
cuja principal misso a produo de vacinas e insumos para diagnstico, vem produzindo
Antgeno para reao de Montenegro a partir de cultivo de Leishmania amazonensis, cepa
PH8, fornecida pelo Centro de Referncia Internacional de Caracterizao de Cepas de
Leishmania, Departamento de Imunologia do Instituto Oswaldo Cruz. Aps o cultivo dos
parasitos e o processamento da suspenso de Leishmania de forma estril e a sonicao,
6

determina-se a concentrao do nitrognio protico e o ajuste para 40 microgramas/ml

(Melo et al, 1977). Em seguida a esta etapa, ocorre o envase do produto e a estocagem. O
produto encaminhado para o controle de qualidade, onde submetido a testes de
esterilidade e inocuidade envolvendo avaliao histopatolgica.
O quadro I demonstra a distribuio de Antgenos de Leishmania P/ Reao de
Montenegro Bio-Manguinhos nos ltimos sete anos, apresentados atualmente em frascos
de 1 mL. Cada frasco de 1 mL contm 10 doses; os frascos de 5mL no esto sendo mais
produzidos. Cada lote

de antgeno corresponde, a cerca de 500 frascos, ou seja a

aproximadamente 5000 testes.

Quadro I: Produo do antgeno de Montenegro Bio-manguinhos em nmero de frascos

e de doses no perodo de 1998 ate junho de 2004.
Ano

Frascos 1 mL

Frascos 5 mL doses

1998

677

342

23.870

1999

196

390

21.460

2000

1898

306

34.280

2001

4393

687

78.280

2002

2422

68

27.620

2003

1791

17.791

2004

650

6.500

Total

11377

1.793

209.801

Figura 1- Apresentao Comercial do Antgeno de Leishmania Para a Reao de

Montenegro.

O antgeno de Montenegro, aps a sua aprovao pelo controle de qualidade ,

armazenado em cmara fria com temperatura que varia entre 4 e 8 C na Central de
Armazenamento de Produtos Acabados. Em relao ao prazo de validade de 1 ano, foi
estabelecido por avaliaes de esterilidades e inocuidades. O prazo para se obter um lote
apto a distribuio de aproximadamente 45 dias.
Cada frasco de 1ml antgeno de Montenegro custa para Rede de Sade Publica
cerca de quarenta e trs reais.
As informaes contidas na bula referem-se ao princpio do teste, cepa e
salina fenolada 0,4% utilizadas, conservao e validade do produto, cuidados e precaues,
leitura e interpretao, referncias bibliogrficas e assistncia ao usurio.
A legislao na ANVISA, que regula o registro de produo do antgeno de
Montenegro corresponde s Portarias n 686 e n 8 e s RDCs n 59 (sobre Boas Prticas
de Fabricao de Produtos para sade) e n210 (sobre boas prticas de fabricao de
medicamentos). Atualmente esse produto de Bio-Manguinhos encontra-se registrado na
ANVISA dentro da categoria correlatos(produtos para sade) com registro VS/ MS e n
101063300014.
Recentemente, Fagundes et al (1999), considerando a hiptese do Teste de
Montenegro apresentar reaes falso-positivas devido ao Timerosal presente como
conservante, definiram o melhor conservante a ser utilizado comparando o timerosol a

1:10.000 e o fenol a 0,4 %. A partir dessa pesquisa de cooperao entre o Centro de

Referncia

Nacional

em

Leishmaniose

Tegumentar,

Departamento

de

Microimunoparasitologia do IPEC/FIOCRUZ e o Departamento de Reativos para

Diagnstico de Bio-Manguinhos, atravs de amplo estudo randomizado e duplo cego, o
antgeno BIOMANGUINHOS passou a ser produzido em salina preservada com fenol a
0,4 %, a partir de maio de 2001.

I.5.1 Detalhamento da Rotina Preconizada de Produo do Antgeno de BioManguinhos ( 1992-2002 )

Para esse processo de produo, inicialmente inoculase uma garrafa de 100
mL de cultura contendo Leishmania amazonensis

na concentrao de 3,8 x 107

promastigotas/ mL, em 1000 mL de meio de cultura Schneider, acrescido de 5% de soro

fetal bovino. Depois, incuba-se a cultura em estufa BOD, temperatura de 23 - 25 C por
4 dias.
Aps este perodo, prepara-se uma lmina para visualizar e contar os parasitas.
Em seguida, centrifuga-se a cultura com salina fisiolgica 0,9% estril e ressuspende-se o
sedimento com salina fenolada 0,4% .
A suspenso antignica de Leishmania sonicada (Correa & Amato Neto,
1958; Melo, 1977), depois visualizada, e uma alquota encaminhada ao Laboratrio de
Anlise Fsico-Qumico, Departamento de Controle de Qualidade, para dosagem do
nitrognio protico e total pelo mtodo de Kjedahl. Com a liberao deste resultado,
determina-se a quantidade de salina fenolada 0,4% que ser adicionada para atingir a
concentrao de 40g /mL. A suspenso envasada em frascos de 1mL e depois
encaminhada ao Laboratrio de Controle Microbiolgico, Departamento de Controle de
Qualidade para controle de esterelidade. Com a emisso de laudos contendo aprovao,
desta fase, inocula-se o antgeno em 2 camundongos fmeas pesando aproximadamente 19
gramas, so observados por um perodo de 14 dias.
Aps esse tempo, sacrificam-se os camundongos, retirando-se o bao, fgado,
pulmo e pele para avaliao histopatolgica. O Laboratrio de Neurovirulncia,
Departamento de Controle de Qualidade, executa esta etapa, que aps a concluso da
avaliao emite o laudo. Estando tudo dentro dos padres, o lote do antgeno estar pronto
para ser enviado. Desde a obteno da massa parasitria de o antgeno de Montenegro, fica
armazenado em temperatura a 4C ,assim permanecendo at o perido de estocagem.

Acerto da Concentrao Antignica.

Aps o trabalho de Melo et al. (1977), que correlacionou a eficcia do antgeno
de Montenegro concentrao de antgenos proticos presentes, foi estabelecida dose de
40 microgramas de nitrognio protico /mL de suspenso, ou seja, 4 microgramas de
nitrognio protico/ 0,1mL . Com no mais dispomos do mtodo utilizado pelo trabalho
referido (neslerizao) para padronizao dos 40g/ mL de nitrognio protico, nos
baseamos no antgeno utilizado por Melo et al. (1977) como padro e o testamos em
conjunto ao antgeno de Bio-Manguinhos, dosando o nitrognio protico pelo mtodo de
Kjeldalh (Farmacopia japonesa 1986).
Aps a testagem dos dois produtos, representados pelo antgeno de Melo
produzido pela

Biobrs e por Bio-Manguinhos, realizada simultaneamente, foi

estabelecido um fator de correo (2,29), o qual relaciona a quantidade de nitrognio

protico obtida para o atual antgeno padro quantidade obtida para o antgeno teste. Para
o acerto da concentrao antignica para 40g de nitrognio protico/mL do antgeno teste,
divide-se o resultado da dosagem de nitrognio protico pelo fator de correo (2,29). O
resultado dessa diviso multiplicado pelo volume de suspenso de Leishmania existente,
resultando no volume final de suspenso a ser obtida para que o antgeno fique na
concentrao desejada.

I.5.2 Prazo de Validade do Antgeno para Reao de Montenegro

O prazo de validade do Antgeno de Leishmania para Intradermorreao de
Montenegro Bio-Manguinhos foi estabelecido arbitrariamente no ano de 1992, por
inferncia ao produto padro Biobras o qual correspondia a 12 meses. poca, no havia
normas legais de controle de qualidade.
I.6 Consideraes Crticas
O processo descrito de produo do Antgeno de Bio-Manguinhos para a
Intradermorreao de Montenegro, e apresentado esquematicamente no fluxograma a
seguir (figura 1), demonstra que, apesar de devidamente regulamentado pelos rgos de
controle do Ministrio da Sade, o atual processo requer o aprimoramento das seguintes
etapas : (a) determinao da concentrao do parasito conforme perodo de incubao ;
(b) definio da fase de maior rendimento do antgeno; c) controle de qualidade incluindo
(c1) dosagens de endotoxinas e pirognio; (c2) avaliao da especificidade do antgeno;
(c3) avaliao do prazo de validade; ( c4) qualidade da soluo preservadora. Alm disso,
10

seria relevante poder utilizar um melhor mtodo para a quantificao e o ajuste da

concentrao antignica .
Uma vez atendidos os diversos pontos considerados, poderamos produzir lotes
de antgenos com maior rendimento e melhoria da qualidade, ainda, possivelmente,
reduzindo os custos.

11

Figura 1- FLUXOGRAMA DE PRODUO

ANTGENO DE LEISHMANIA PARA REAO DE MONTENEGRO
BIO-MANGUINHOS

LOTE SEMENTE

MANUTENO DA
L.amazonensis (PH8)

EXPANSO DA CEPA

OBTENO DE
MASSA
SONICAO

DOSAGEM DO
NITROGNIO
PROTICO

ACERTO DA
CONCENTRAO
ENVASAMENTO E
ROTULAGEM

ESTERILIDADE

CONTROLE DE
QUALIDADE

INOCUIDADE

ARMAZENAMENTO
E DISTRIBUIO DO
PRODUTO

12

II JUSTIFICATIVAS DO TRABALHO
A implementao de programas coordenados pela Secretria de Vigilncia em
sade/MS, visando ao controle das leishmanioses, vem mobilizando diversas instituies
em mbito Nacional, na tentativa de minimizar o problema.
A FIOCRUZ, por intermdio de Bio-Manguinhos, desde 1992 vem apoiando os
Programas coordenados pela SVS/MS para o controle das Leishmanioses Tegumentar e
Visceral Humana e Canina, com a produo e distribuio de antgenos para Reaes de
Imunofluorescncia Indireta (IFI) e Intradrmica de Montenegro (IDRM). Atualmente
concentra-se na FIOCRUZ a produo e distribuio destes reativos para toda a rede
pblica de sade do Brasil.
Por outro lado, em parceria com Bio-Manguinhos, o Centro de Referncia
Nacional em Leishmanioses sediado no Instituto de Pesquisa Clnica Evandro Chagas /
FIOCRUZ, vem desenvolvendo, entre outros, estudos acerca da especificidade e valor
diagnstico/epidemiolgico do Teste de Montenegro. Embora sendo um teste de uso
universal para o diagnstico das leishmanioses tegumentares, muitas questes necessitam
ser melhor elucidadas, incluindo seus

processos de

produo que precisam ser

aprimorados e padronizados principalmente tratando-se de um teste para uso in vivo.

Ainda que venha sendo utilizado na rotina diagnstica desde a dcada de 30-40
(Salles Gomes, 1939), e permanea atualmente como o teste de mais ampla indicao por
sua sensibilidade, simplicidade e seu baixo custo relativo, as normas para sua produo e
distribuio no sofreram, at hoje, uma padronizao universal. Em conseqncia, uma
grande variedade de antgenos utilizada por laboratrios produtores, dificultando, no
mnimo, a comparao de resultados entre diferentes grupos clnicos.
Assim, pela grande acessibilidade e utilizao decorrente na rotina diagnstica
do Teste de Montenegro no Brasil, a necessidade de sua padronizao

tem sido

freqentemente assinalada, a comear pela seleo do antgeno .

A relevncia do presente estudo fortalece se pelo fato de estar dirigido
melhoria tecnolgica de utilizao do antgeno de Montenegro e sua imediata aplicao ao
SUS, e de associar-se s leishmanioses, importante endemia brasileira includa entre as
ditas negligenciadas, portanto, cuja ateno, limita-se ao setor pblico.
Alm do mais, a justificativa do objeto do trabalho reforada ao se considerar
a capacidade instalada de Bio-Manguinhos como centro produtor e a FIOCRUZ como
rgo de pesquisa e controle de qualidade em sade, entre outras finalidades. Deve ser
levada em conta tambm entre as facilidades para o desenvolvimento do trabalho, as
funes do Departamento de Reativos para Diagnstico de Bio-Manguinhos e do Centro
13

de Referncia Nacional em Leishmaniose Tegumentar do IPEC, associando a experincia

acumulada tanto em produo quanto em avaliao clnica e de campo do insumo em
questo.
Tambm, como mestranda do curso de PsGraduao em Vigilncia Sanitria
do Instituto Nacional de Controle Qualidade da FIOCRUZ e trabalhando na Tecnologia de
Produo do Antgeno de Montenegro no Departamento de Reativos para Diagnstico em
Bio-Manguinhos, dispomos do local ideal para o desenvolvimento da pesquisa de natureza
metodolgica, que o SEPRO (Setor de Protozorios desse Departamento) onde contamos
com o apoio local, alm do interesse das trs unidades cientficas

da FIOCRUZ

envolvidas.
Finalmente, mesmo compreendendo que o estudo do teste de Montenegro no
se esgotar, no tempo demandado, todas as etapas consideradas ( item 1.6), pretendemos
dar um passo importante na normatizao tcnica e melhoria da qualidade do teste.

14

III OBJETIVOS
III.1 Objetivo Geral
Padronizar o processo de produo do antgeno de Leishmania para a
Intradermorreao

de Montenegro, visando a sua produo em maior escala para

atender s necessidades crescentes no diagnstico clnico e de inqurito de campo das

leishmanioses.

III.2 Objetivos Especficos

Estabelecer padres de procedimentos tcnicos no processo de produo de
antgeno para o teste de Montenegro quanto a:

Concentrao antignica - melhor inculo;

Controle fsico-qumico;

Controle biolgico - teste de inocuidade;

Prazo de validade;

15

IV METODOLOGIA
O processo de trabalho foi desenvolvido em Bio-Manguinhos, envolvendo o
Departamento de Reativos para Diagnstico atravs do Setor de Protozorios e Setor de
Qumica de Protenas; e o Departamento de Controle de Qualidade,

atravs do

Laboratrio de Controle Fsico-Qumico ( Setor de Apoio e Pesquisa), Laboratrio de

Controle Microbiolgico( Setor de Esterilidade e Setor de Controle Biolgico ) e o
Laboratrio de Neurovirulncia.

Estabelecimento do Lote Semenete Com Cepa de Leishmania

obteno do antgeno

para

Manteve-se a utilizao da cepa PH8 (IFLA /BR/ 1967/ PH8) de Leishmania

amazonensis, isolada a partir de flebotomneos da regio amaznica. A escolha desse
parasito deve-se a sua facilidade de crescimento em meio de cultivo in vitro, boa
antigenicidade e utilizao por diferentes laboratrios. Como de rotina, foram usadas na
produo formas promastigotas do parasito e efetuada a manuteno da cepa atravs de
repique a cada 72 horas, em garrafas contendo 25 mL de meio Schneider (Sigma)
acrescido de 5% de soro fetal bovino (Sigma) mais 5% de cultura de Leishmania
(volume/volume) sendo as culturas armazenadas em estufa BOD temperatura de 2325 C.
A escolha dessa faixa de temperatura deve-se experincia de cultivo do parasito ao
longo dos ultimos anos de observao semanal da cepa em microscopia.

IV.1. Determinao das Curvas de Crescimento

Determinao da Curva Padro

Para A determinao da fase logartmica, ou seja, a fase na qual os parasitas em

cultivo esto em maior nmero e com boa viabilidade, foram realizadas trs curvas
bsicas de crescimento, a partir do inculo de 106 leishmanias considerando a prtica
geral na escolha desse quantitativo.
Foram utilizadas, para cada curva, 300mL do meio Schneider acrescido de 10% de
soro fetal bovino, sendo distribudos 10 mL em cada garrafa totalizando 30 garrafas
Corning para cultivo celular medindo 25cm3. Para cada dia, 3 garrafas foram contadas
em cmara de Neubauer. As culturas foram observadas diariamente, pelo perodo de 10
dias, e a contagem quase sempre foi realizada no mesmo horrio. Paralelamente, por

16

determinao a 555 nanmetros, foi efetuada a quantificao dos parasitos atravs da

medida da densidade tica das culturas em espectrofotmetro UV1203, durante o
mesmo perodo.

Determinao da Curva com Azul de Tripan

O objetivo da realizao desta curva foi observar as formas integras de

parasitas existentes durante o perodo de cultivo. Utilizou-se a colorao de azul de

Tripan para quantificar as leishmanias em Cmara de Neubauer, visando a contar
somente as formas completas das leishmanias, que no se impregnam pela ao do
corante, possibilitando uma contagem mais correta e real. Esse processo foi repetido
pelo perodo de dez dias, quase sempre se respeitando o mesmo horrio. Alm da
contagem, tambm foi determinada a densidade ptica correspondente medida de
aborsbncia, feita por espectofotomtro. Assim, pde-se obter duas curvas de
quantificao de leishmanias: por contagem direta e densidade ptica.

Quantificao dos antgenos proticos para cada dia de crescimento da

cultura

Depois da contagem, as culturas contadas foram lavadas com salina

fisiolgica estril 0,9%, centrifugadas a 3.000 rpm (2984 g) em 3 ciclos de 20 minutos
cada e ressuspensas tambm em salina. Em seguida foram submetidas a um aparelho de
ultrasom. E para que os parasitos estivessem totalmente rompidos (sonicados), em
aparelho de ultrasom utilizou-se cinco ciclos de 20 minutos cada com intervalo de 5
minutos. No final, uma alquota foi retirada e observada ao microscpio tico para
confirmar o rompimento dos parasitos pelo ultra-som. Aps isso, a massa parasitria foi
armazenada em freezer -20C. De cada dia de cultivo, foram retirados 5 mL de
suspenso sonicada e enviados ao Laboratrio de Controle Fsico-Qumico desta
unidade para quantificao de antgenos proticos atrves da determinao do teor de
nitrognio pelo metodo de Kjeldahl.
O melhor ponto da curva de crescimento das leishmanias para a obteno de
antgenos correspondeu ao momento de maior multiplicao parasitria, detectada por
maior nvel de absorbncia, e maior dosagem protica.

17

IV.2 Determinao do Melhor Inculo para a Produo Antignica

A partir da determinao do melhor ponto da curva de crescimento para o
cultivo, foi determinado o melhor inculo visando a obteno de lotes mais
homogneos, e maior rendimento da produo.
Para essa determinao, foram produzidos lotes pilotos com diferentes
inculos inicias, os quais foram submetidos ao mesmo processamento para obteno,
quantificao, sonicao e posterior dosagem de antgenos proticos das massas
parasitrias. Para o crescimento, foram inoculados 4 frascos de 300mL de meio
Schneider, acrescido de 10% de soro fetal bovino, com 30 mL de suspenso de
parasitos, nas seguintes concentraes iniciais:
Frasco 1: 30mL de suspenso de parasitos contendo 105 parasitos/ mL
Frasco 2: 30mL de suspenso de parasitos contendo 106 parasitos/ mL
Frasco 3: 30mL de suspenso de parasitos contendo 107 parasitos/ mL
Frasco 4: 30mL de suspenso de parasitos contendo 108 parasitos/ mL
Quando as culturas atingiram a fase logartmica, conforme determinado pela
curva de crescimento, as massas parasitrias foram lavadas com salina fisiolgica estril
0,9%, centrifugadas a 3.000 rpm (2984 g) em 3 ciclos de 20 minutos cada e
ressuspensas tambm em salina fisiolgica. Em seguida, foram sonicadas (em 5 ciclos
de 20 minutos cada, com intervalo de 5 minutos) e as massas armazenadas em freezer 20C. A seguir, foram quantificadas as protenas totais, o nitrognio protico e o
nitrognio total.
Assim, o melhor inculo corresponde, no final do processamento e
quantificao dos antgenos proticos, ao que apresentou melhor rendimento,
determinado pela maior concentrao de antgenos obtida.

IV.2.1 Verificao da Repetibilidade das Curvas

As determinaes pelos mtodos de contagem de parasitos em cmara de

Neaubauer e dosagem de nitrognio protico e total pelo mtodo de Kejldahl foram
realizados em dois experimentos para comparao dos resultados.

18

IV.3 Determinao do Mtodo mais Adequado para Aferio da Concentrao

Antignica
Foram

comparados

dois diferentes mtodos de dosagem de antgenos

proticos para a determinao do melhor mtodo de quantificao do extrato parasitrio

atravs de dosagem de nitrognio protico e nitrognio total (Mtodo de Kjeldahl), e de
protenas totais (Mtodo do Biureto). Como etapa prvia utilizao dos mtodos de
Kjeldahl e Biureto, foi efetuada a precipitao da amostra com cido triclorocetico.

Precipitao com cido tricloroactico

Para realizao do Mtodo de Kjeldahl, visando determinao de

nitrognio protico e total , utilizou-se 1 mL de suspenso proveniente dos diferentes

inculos (105, 106, 107, 108 ) aos quais foram adicionados 2,0mL de gua destilada e
0,5mL da soluo aquosa de cido tricloroactico 10%. A precipitao ocorreu em 60
minutos.
Para a posterior utilizao do mtodo do Biureto, que visa quantificao
de protenas totais, partiu-se de 5 mL de suspenso proveniente dos diferentes inculos
( 105, 106, 107, 108 ), s quais foram adicionados os 10,0 mL de gua destilada e 2,5mL
da soluo aquosa de cido tricloroactico 10%. A precipitao ocorreu em 60 minutos
temperatura ambiente.
Aps a centrifugao por 2700 rpm (2684 g) durante 30 minutos foram
descartados os respectivos sobrenadantes, enquanto o precipitado, aps dissoluo
adequada, teve seu teor protico determinados pelo mtodos de Kjeldahl e do Biureto.

IV.3.1 Utilizao do Mtodo Kjeldahl

O precipitado formado ( item IV.3 ) foi dissolvido em 10 mL de NaOH 2%
e transferido para um balo de mineralizao onde foram adicionados 2 mL de cido
sulfrico concentrado e uma pitada de catalisador de Demazert ou mistura selnica.
Mineralizou-se a referida amostra em chapa mineralizadora durante 2 horas ou at que a
mesma ficasse incolor. Em seguida, a amostra mineralizada foi destilada em aparelho
de destilao tipo Kjeldahl, sendo utilizados 10 mL de soluo hidrxido de sdio 40%
para a liberao da amnia. A amnia liberada foi recolhida em um frasco Erlenmeyer
com capacidade de 50 mL, contendo 2 mL de cido brico 4% e 2-3 gotas de indicador
misto. Interrompeu-se o recolhimento quando o volume atingiu cerca de 30 mL.

19

Procedeu-se a titulao usando-se HCL 0,014N. Por fim foi efetuado um

ensaio em branco e duplicata das amostras.

IV.3.2 Utilizao do Mtodo Biureto.

Para a quantificao protica pelo mtodo do Biureto partiu-se da realizao
de uma curva , tendo como padro a soluo de BSA ( ver anexo 2 ).
O precipitado acima formado ( IV.3.1.) foi dissolvido em 1mL de NaOH
0,01N e, desta soluo, foi utilizado 0,2 mL ao qual volume foi adicionado 0,05 mL de
gua destilada e 1mL do reativo de Biureto. Deixou-se em repouso por 30 minutos
temperatura ambiente ao abrigo da luz. Foi feita a determinao das absorbncias das
amostras no comprimento de onda de 555nm.Tambm foi feito um branco consistindo
de 15 mL de gua e 2,5 mL de TCA10%. A soluo referente a este branco foi
trabalhada igualmente s amostras do inculo e utilizada para zerar o
espectrofotmetro (absorbncia = 0 ou transmitncia = 100%).
Alm da dosagem de protenas das suspenses com diferentes inculos iniciais
conhecidos, foi dosado tambm o teor protico de antgenos de Montenegro j na
concentrao de uso (40g nitrognio protico/ mL).
Uma amostra de suspenso de Leishmania contendo 4,49 mg/mL de nitrognio
protico foi ajustada aps a diluio adequada para a concentrao de 40g de
nitrognio protico/ mL. Em seguida, 5mL dessa suspenso ajustada foi adicionada a
10 mL de gua e 2,5 mL de TCA 10%.
Deixou-se repousar por 30 minutos; centrifugou-se a 2.700 rpm durante 30
minutos; desprezou-se o sobrenadante e ressuspendeu- se em 1mL de NaOH 0,01N.
Aps o tratamento foi dosada a protena pelo mtodo do Biureto, em duplicata.
As quantificaes so apresentadas no Anexo 2.
IV.3.3 Verificao da Repetibilidade das quantificaes.
Foram comparados, em dois experimentos os resultados das quantificaes
de nitrognio protico e total pelo mtodo de Kjedahl e de protenas totais pelo mtodo
do Biureto, sendo este ltimo realizado em triplicata.
Considerando-se a indicao posterior de avaliao da reprodutibilidade da
metodologia, aps a definio do melhor inculo e sua repetibilidade, necessrio
definir a correspondncia entre

a quantidade de antgeno dosado pelo mtodo de

Kjeldahl e do Biureto.
20

Para isso ser calculado um fator de correo utilizando-se as dosagem

estimadas pelo o mtodo do Biureto, levando-se em conta os resultados obtidos a partir
dos diferentes inculos iniciais.
IV.4

Determinao dos Controles de Qualidade

O controle de qualidade do antgeno padro (inculo 107) constituiu-se de:

controle microbiolgico para evidenciao de contaminao bacteriana e por fungos e

controle histopatolgico (teste de inocuidade) para aferio da segurana in vivo ( com
animais de experimentao).

IV.4.1 Determinao do Controle Microbiolgico

Exame Direto
Foram utilizados tubos contendo 20mL do meio Tioglicolato de Sdio
(MERCK) e tubos de meio Casena Soja ( MERCK) , para inocular 1ml da amostra e
incubar por 14 dias.
O tubo contendo o meio Tioglicolato de Sdio foi mantido temperatura de
30 a 35C e o tubo contendo Casena Soja temperatura de 25C, durante 14 dias;
ambos os tubos foram observados todos os dias macroscopicamente ( Otto Bier 1985 ).
Caso a observao macroscpica revelasse alguma alterao no meio de
cultura (turvao, formao de grumos), era feita um esfregao em lmina do material
para colorao de Gram e observao em microscpio ptico para identificao do
contaminantes. Qualquer alterao macro ou microscpica nos meios de cultura
utilizados indicava contaminao do antgeno e reprovao do mesmo para distribuio.

Dosagem de endotoxinas
Foi utilizado o teste gel Clot, para avaliar qualitativamente a presena de
endotoxinas de acordo com o grau de sensibilidade (Anexo 4 ). Os testes fazem parte do
kit Endosafe.
O teste pela tcnica de gel Clot, fornece resultados binrios, positivo ou
negativo, conforme a formao de cogulo ou no; constituindo um teste muito
objetivo, apesar de no ser quantitativo considerado muito objetivo (Coopre,1990).

21

Teste de pirognio
Foi utilizado o teste in vivo em coelhos, de acordo com a Farmacopia
Brasileira. Para cada amostra foram utilizados 3 coelhos de ambos os sexos. Estes
coelhos foram submetidos a um exame preliminar pelo perodo de 72 horas, quando foi
acompanhada a variao da temperatura corporal dos animais. Terminado este perodo
somente os coelhos que no apresentaram variaes acima de 0,5C foram utilizados
para

o teste.

Este consiste na introduo anal do antgeno nos trs coelhos

(respectivamente 1,9 ; 1,8 e 1,9 mL ), seguida do registro de temperatura a cada 30

minutos durante 5 horas. No final do teste a temperatura no dever ultrapassar a
variao de 0,6C para que seja considerado dentro do padro de qualidade. (Anexo 5).

IV.4.2. Controle Histopatolgico -Teste de Inocuidade

Para o teste de inocuidade, realizado in vivo foram utilizado in vivo em Mus
musculus Suios, fmeas, pesando 20 gramas nos quais foi avaliado o antgeno aps a
padronizao do inculo

antgeno padro com soluo salina fenolada 0,4% (

preservante) e com soluo salina fisiolgica 0,9% (controle). Foram utilizados os

seguintes reativos:

Cada

Antgeno de Montenegro padro 03UMN006Z

Salina fenolada 0,4%

Salina fisiolgica 0,9%

Grupo controle de animais no inoculados.

produto

foi

inoculado

em

camundongos

fmeas,

pesando

aproximadamente 20 gramas. Os 20 camundongos de linhagem Swiss foram oriundos

do Centro de Criao de Animais de Laboratrio Animal (CECAL) /FIOCRUZ. Foram
mantidos em gaiolas de polipropileno especficas para a espcie e receberam rao
peletizada e gua filtrada ad libitum.
Os animais foram tricotomizados na regio dorsal (crvico-torcica). A seguir,
foram inoculados por via intradrmica 0,1mL da suspenso do antgeno de Montenegro
(Bio-Manguinhos), correspondente mesma dose humana. Durante o perodo de
quatorze dias os camundongos foram examinados com a finalidade de se observar as
reaes inflamatrias no local da inoculao. No final do perodo, todos os animais

22

foram submetidos eutansia por inalao de carbono Co2 em cmara hermtica e

prpria para o procedimento.
Aps exame macroscpico, colheram-se fragmentos de pele, fgado e bao os
quais foram fixados em formalina tamponada a 10%.
Uma vez fixados, fragmentos do fgado, bao e pele foram recortados em
microtomo, lavados em gua corrente, desidratados, clarificados, infiltrados por
parafina, cortados a quatro micrmetros e corados pela tcnica de hematoxilina-eosina,
para serem examinados ao microscpio ptico.
Os critrios para aprovao do teste de inocuidade foram :
-Ausncia de morte dos animais durante o teste.
- Ausncia de alteraes macroscpicas na necropsia.
- Padro histolgico normal dos rgos examinados.

IV.5 Avaliao do Prazo de Validade do Antgeno para Intradermorreao de

Montenegro Bio-Manguinhos
O cronograma da pesquisa impediu no momento, a analise do prazo de validade
do teste aperfeioado pelo presente estudo, uma vez que esse produto requereria um
tempo maior para acompanhamento. Por isso utilizamos como modelo de avaliao
produtos estocados para incluso no processo de padronizao.
Diferentes frascos de antgenos estocados a 37C, foram avaliados 20 meses
aps o vencimento do prazo de validade dos mesmos, estabelecidos previamente (sem
estudo anterior) como de 12 meses. Corresponderam aos seguintes reativos:
Antgeno de Montenegro com validade at maro de 2002 ( lote 013MN005Z);
Antgeno de Montenegro com validade at janeiro de 2003 ( lote 021MN001Z),
Antgeno de Montenegro dentro do prazo de validade como controle (lote
03UMN006Z).
A avaliao constituiu-se dos controles microbiolgicos (item IV.4.1), sendo
injetvel, aplicao das normas de boas prticas de laborattio, ara bio-limpa,
procedimentos operacionais obedecendo as mesmas metodologias.

23

V RESULTADOS
V.1 Curvas de Crescimento
Curva Padro

A tabela 1 mostra o crescimento de Leishmania amazonensis cepa PH8, durante

nove dias (excludo o dia zero) demonstrado pela contagem em cmara de Neubauer e
por Absorvncia, representado pela mdia das 3 garrafas. No dcimo dia de observao
a cultura sofreu contaminao, tendo sido excluda do processo.

Tabela 1: Crescimento de Leishmania amazonensis cepa PH8. Medida por contagem de

parasitos em cmara de Neubauer por Absorvncia.

Dias Cmara de Neubauer

Absorvncia

(106 )
2,6

(600nm)
0,233

3,7

0,306

4,8

0,536

7,3

0,916

8,2

0,124

11,8

0,213

12,3

0,236

1 2,7

0,234

12,3

0,195

Os valores tabelados foram usados para a confeco do grfico conforme

demonstrado na tabela1. No caso no se levou em conta somente as formas viveis do
parasito, mas sim todas as formas (viveis e no viveis) contadas na cmara de
Neaubauer.

24

Grfico I Curva de crescimento de Leishmania amazonensis cepa PH8

demonstrado pelo nmero de parasitas, contados em cmatra de
Neubauer e por absorbncia durante dez dias .
14

1000
900
800

10

700

600
500

400

300

abs a 600 nm

n de parasitas x 107

12

Absorvncia
Cmara de Neubauer

200
2

100

0
0

10

dias de contagem

A tabela 2 e o grafco II registram as concentrao de parasitos desde o momento aps

o repique, at o dcimo dia, medida em Cmara de Neubauer, e encontradas por
absorvncia, a partir da diluio da cultura em azul de Tripan que preserva as formas
ntegras das leishmanias
Considerando-se ambos os mtodos, identificou-se que o crescimento mximo a
partir do inculo de 107 correspondeu aos 4 e 5 dias, respectivamente, sendo que a
visualizao dos parasitos ntegros em cmara de Neaubauer de contagem decresceu a
partir do 6 dia progressivamente (at negativar-se no 9 dia ).

25

Tabela 2 : Crescimento de Leishmania amazonensis cepa PH8, demosntrado pela

contagem de parasitos em cmara de Neubauer aps diluio em azul de
Tripan.

Contagem em Cmara de
Neubauer (x107)

Medida de
Absorvncia

1,97

0,010

2,10

0,027

2,25

0,038

2,90

0,047

3,40

0,059

3,80

0,050

3,40

0,048

2,75

0,033

2,39

0,030

2,00

0,021

Dias de
contagem

Grfico II - Curva de crescimento. Leishmania amazonensis cepa PH8 demonstrado

pelo nmeros de parasitos, contados em cmara de Neubauer e por

0,07

3,5

0,06

0,05

2,5

0,04

2
0,03

1,5

0,02

abs a 600 nm

n de parasitas x 107

absorbncia, aps diluio com azul de Tripan .

Cmara de Newbauer
Absorvncia

0,01

0,5
0

0
0

10

15

dias de contagem

A curva de crescimento com a adio de azul de Tripan, um corante que

permitiu apenas as formas parasitrias viveis fossem contadas. A comparao entre os
26

grficos I e II mostra que as formas mortas presentes na suspenso parasitria e

contadas na curva sem azul de Tripan podem influir na medida da densidade ptica das
culturas. Na medida por absorvncia, a contagem maior que na contagem em cmara
de Neubauer das leishmanias e indicou que o 4 dia de cultura correspondeu fase de
maior multiplicao do parasito.

A tabela 3 e o grfico III mostram a concentrao de nitrognio protico

estimada pelo mtodo de Kjeldahl durante nove dias de crescimento da cultura visando
determinao do ponto de maior concentrao de antgeno.

Tabela 3: Dosagem do Nitrognio Protico pelo Mtodo Kjeldahl correspondente aos

nove dias de crescimento em cultura de Leishmania amazonensis cepa PH8.

Dosagem de Nitrognio
Dias de contagem da curva

protico mg / mL

0,15

0,14

0,28

0,24

0,34

0,27

0,21

0,28

0,19

27

Grfico III - Curva da concentrao do nitrognio protico pelo Mtodo Kjeldahl

durante nove dias de crescimento em cultura de Leishmania amazonensis

Nitrognio Proteico (mg/mL)

cepa PH8.

0,40
0,35
0,30
0,25

Seqncia1

0,20

Polinmio (Seqncia1)

0,15
0,10
0,05
0,00
0

Dias

A tabela 3 e o grfico III mostram, atravs da dosagem do nitrognio protico,

que no 5 dia da cultura dos parasitos, estes se apresentaram em maior nmero tendo
sido o ponto tambm onde foram obtidos os maiores valores para a dosagem de
nitrognio protico. No entanto, foi o dia que antecedeu ( vide tabelas 1 e 2 e graficos I
e II ) o aumento da mortalidade das culturas e menor viabilidade dos parasitas
cultivados. Assim, considerando o desempenho das curvas de crescimento, definido
pelos trs diferentes mtodos, associadamente `a necessidade de uma boa viabilidade
das culturas para obteno e produo dos antgenos proticos, sem contaminantes
provenientes da degradao parasitria e das protenas no meio, optamos por trabalhar
com o 4 dia de cultivo como padro para os repiques de manuteno e produo de
antgeno de Montengro.
V.2 Melhor inculo destinado para produo.
Reprodutibilidade dos Experimentos
Aps a seleo do melhor do melhor dia da curva de crescimento para a
produo, determinou-se a padronizao do inculo em termos quantitativos para os
repiques de produo de massa parasitria.

28

A tabela 4 relaciona os inculos diferenciados, com seus quantitativos em

cmara de Neubauer correspondentes s diferentes aferies determinadas pela
dosagem de nitrognio protico e total, em dois experimentos realizados em pocas
distintas.
Analisando a Tabela 4, no podemos observar uma correlao linear entre
nmero de parasitos inoculados, crescimento observado em cmara de Neubauer, e as
dosagens de nitrognio protico e total, nos dois experimentos. Em ambos, o nmero de
parasitos foi similar, embora os resultados das dosagens de nitrognio correspondente
no tenham sido igualmente reprodutveis.
Considerando a dosagem de nitrognio protico como mais diretamente
representativa da quantidade de antgenos proticos, admitimos que os melhores
resultados foram os que aproximadamente se repetiram, correspondendo aos inculos na
faixa de 107 parasitos.

Tabela 4 Comparao entre os experimentos para determinaes de concentrao de

antgenos segundo inculo, obtido no 4 dia de crescimento, atravs de
contagem de parasitos em cmara de Neubauer e os mtodos de nitrognio
protico e total.
Experimentos

II

Inculo

Cmara de
Neaubauer
5,4 x 105

Nitrognio
Protico
(g/mL)
35

Nitrognio
Total
(g /mL)
10

105
106

4,1 x 106

05

20

107

3,8 x 107

47,5

98

108

6,0 x 108

45,5

117

105

3,2 x 105

24,7

395

106

3,9 x106

23,1

500

107

4,4 x 107

43,1

605

35,2

47,9

10

5,9 x 10

Os grficos 4 e 5, expressam a correspondncia entre os resultados demosntrados

na repetibilidade dos dois experimentos visando determinao do melhor inculo para
a produo.

29

Grfico IV Distribuio de inculos de parasitos em cultura e correspondentes

determinaes de nitrognio protico e total, segundo o experimento I.

inculos iniciais

Grfico V Distribuio de inculos de parasitos em cultura e correspondentes s

dosagens de nittrognio protico e total segundo o experimento II

inculos iniciais

30

Rendimento da produo a partir da padronizao do inculo

A tabela 5 mostra que a opo do 4 dia de crescimento parasitrio para a
ampliao do cultivo visando produo e a adoo de inculo padronizado para a
obteno de massa, trouxe melhoria significativa para o rendimento da produo.
Analisando-se quatro lotes produzidos antes dessa padronizao, entre junho e setembro
de 2002, e outros quatro produzidos aps, entre abril e novembro de 2003, observamos
que o rendimento medido pelas quantidades de nitrognio protico e pelo nmero de
frascos obtidos, para cada lote, foi expressivamente maior aps a padronizao.
Representou, em mdia, uma elevao de rendimento de, respectivamente, 83,2% e
93,4% ( tabela 5).

Tabela 5: Frascos de antgenos obtidos para intradermorreao de Montenegro e

respectivas dosagens de nitrognio protico, antes e aps a definio do
inculo padronizado correspondente a 107 parasitos/ml.

Perodo

Anterior a

Aps a

padronizao

Padronizao:

inculo 108

inoculo - 107

( 6 a 9/ 2002)

(4 a 11/ 2003)

Lote do Produto

027MN003Z

034MN003Z

(n do lote )

028MN007Z

033MN004Z

029MN010Z

03OMN005Z

029MN011Z

03UMN006Z

774

2217

N de Frascos
Mdia

de 258

499

Elevao
Rendimento

93,4 %

Frascos/lote
Dosagem

de 027MN003Z (3,1) 034MN003Z (4,49)

Nitrognio

Protico 028MN007Z (2,89) 033MN004Z ( 5,72)

(mg %)

029MN010Z (2,89) 03OMN005Z ( 3,75)

029MN011Z (2,26) 03UMN006Z (6,47)

Mdia Dosagem N2

2,79

5,11

Desvio Padro

0,36

1,22

83,2 %

31

V.3 Mtodo Definido para Aferio da Concentrao Antignica.

Em paralelo

dosagem de nitrognio protico, foram testados mtodos de

dosagem de protenas totais , com vistas a possvel substituio do mtodo de Kjeldahl

para aferio da concentrao antignica. As massas parasitrias obtidas a partir dos
experimentos I e II foram utilizadas para padronizao dos experimentos de dosagens de
protenas totais pelo mtodo do Biureto.
Visando comparao dos dois mtodos utilizados, os valores obtidos para a
dosagem de nitrognio protico foram usados para clculo de estimativa do teor de
protenas totais correspondentes. A Tabela 6 e o grfico VI resumem os resultados
obtidos, e os calculos referentes aos mesmos so apresentados no anexo 2. Os
experimentos foram realizados em triplicata, estando a tabela representando os valores
mdios dos 3 experimentos. Detectou-se uma

maior sensibilidade do mtodo de

Biureto, tendo sido a quantidade de protena detectada bem maior do que a estimada
pela inferncia a partir do mtodo Kjeldahl.
Tabela 6 : Comparao entre as dosagens do nitrognio protico e protenas totais para
definio do melhor mtodo de quantificao antignica.
Inculos

EXPERIMENTO I
Concentrao Concentrao Concentrao

EXPERIMENTO II
Concentrao Concentrao de Concentra

N2 Protico*

de prtn

de ptn

N2 Protico*

prtn estimada *

o de prtn

((g/ml)

estimada *

Met.

(g/mL) Met.

(g/mL)

obtida **

Met.Kjeldahl

(g/mL)

Biureto**

Kjeldahl

Met.

(g/mL)

(g/mL)

Kjeldahl
(g/mL)

105

3,5

21,87

243,75

24,0

154,37

411,94

106

5.0

31,25

436,30

23,1

144,37

489,13

107

47,5

296,87

675,97

43,1

269,37

674,37

108

45,5

284,37

755,60

35,2

220,00

687,47

* Os valores estimados

so resultados do produto de concentrao do nitrognio

protico determinada pelo mtodo de Kjeldalh X 6,25 (assumindo-se o valor mdio de

16% do nitrognio em protenas
** Valores obtidos pelo mtodo do Biureto X Fator de correo 4,785 (19,5 x 1,25)
considerando as diluies da amostra e da curva padro.

5
32

Grfico VI: Comparao entre as dosagens do nitrognio protico e protenas totais

para definio do melhor mtodo de aferio antignica.

Grfico VI - Nitrognio X Biureto

1-Experimento

2- Experimento

Concentrao Proteica
( Microg/ml)

800
700
5

a10

600
500

b10

400
300

c10

200

100

d10

I1

II

II

I - Kjeldahl
II- Biureto

Admitindo-se que o padro do antgeno para intredermorreao de Montenegro

definido pela concentrao de 40 microgramas de nitrognio protico / ml ( Mello e
col. 1977); que a dosagem pelo mtodo de Kjeldah apresentou discrepncias na
repetibilidade e que o mtodo do Biureto apresentou maior consisntncia de resultados,
considerou-se que este pode substituir com vantagens o mtodo de Kjeldahl ,
Os clculos referentes aos dados da tabela 6 e grfico VI so apresentados no
Anexo 2.
Para a correlao entre a estimativa da dosagem de protenas pelos dois mtodos
utilizados, foi elaborada uma tabela de converso, considerando os valores dos dois
experimentos.
Os valores mostrados na tabela de converso resultam da diviso da mdia de
valores da dosagem de protena pelo mtodo do Biureto, que foram divididos pelos
resultados obtidos de estimativa de protena pelo mtodo de Kejdalh , para cada inculo
inicial.

33

Tabela 7 Fatores de converso entre as concentraes proticas determinadas pelo

mtodo Biureto e Kjeldahl (Cp Biureto e Cp Kjeldahl)
105

Inculo

EXPERIMENTO

I -

106

107

108

2,28

2,66

3,39

2,507

3,12

Fator de Correo

EXPERIMENTO II

2,66

Fator de Correo

Cp Concentrao de protenas
Eliminando-se os valores obtidos pelo mtodo do Kjeldahl para os inculos 105
e 106 do experimento I, que, conforme dito anteriormente parecem os mais inadequados,
possvel calcular-se um fator mdio de converso entre as concentraes proticas
estimadas por ambos os mtodos . Esse ser da ordem de 2,52 (Cp Biureto e Cp
Kjeldahl), se eliminarmos o fator de converso de 3,39, o mais discrepante entre todos,
ou de 2,66 se levarmos em conta o aludido fator discrepante (ver tabela 7). O valor de
converso a ser assumido de 2,52 mostra o desvio em relao a todos os fatores de
converso obtidos exceto o de 3,39 portanto correspondente a um erro relativo < 10 %.

Clculo:
Experimento I
105

* desprezado

106

* desprezado

107 -> 2,28

108 -> 2,66
107 -> 675,97 296,87 = 2,28
108 -> 755,60 . 284,60 = 2,66

34

Experimento II
105 -> 411,94

154,37 = 2,66

106 -> 489,13

144,37

= 3,39

107 -> 674,37 269,37

= 2,50

108 -> 687,47 / 220,00

= 3,13

O fator 2,52 resultado de mdia do experimento I + os experimentos II

V.4 Controles de Qualidade do Antgeno
V.4.1 Controles Microbiolgicos
Exame Direto
O controle microbiolgico do Antgeno, por exame direto, do material da cultura
mantida em meio de Tioglicolato e no Fludo de Casena de soja, realizado conforme a
rotina estabelecida, Aps dias de cultivo acompanhado de observaes macroscpica e
microscpica no foi identificado crescimento de microorganismo. O mesmo aconteceu
nos 7e 8 dias e depois no 14 dia de cultivo. Os laudos so apresentados no Anexo 3.
Presena de Endotoxinas
No foi observada presena de endotoxinas, conforme laudo emitido pelo setor
de Controle Microbiolgico . O laudo apresentado no Anexo 4.
V.4.2 Teste de Pirognio
Em relao, ao teste de pirognio no se verificou que a soma da variao da
temperatura dos coelhos no atingiu 0,6C, estando dentro do limite para aprovao do
teste, conforme laudo emitido no Anexo 5 .
V.4.3 Teste de Inocuidade - Controle Histopatolgico
Aps o perodo de 14 dias de observao, em que no se observou nenhuma alterao
no ponto de inoculao do antgeno, a histopatologia da pele, do fgado e bao tambm
no apresentou alteraes conforme laudo no Anexo 6. A figura 3 corresponde ao
conjunto histopatolgico da pele, referente ao teste de inocuidade em camundongos
inoculados com antgeno padro, camundongos incoculados com salina fenolada e no
inoculados.
35

Figura 3 Histopatologia de pele de camundongos inoculado com Antgeno Padro

(A), Salina fenolada (B),No Inoculados ( C ), lote vencido (D) e lote de antgeno
reprovado (E).

A (controle 118 03)

C (salina fenolada 122 03)

B ( lote padro 161 03)

D (Ag Vencido 121 03)

E ( reprovado 53 02)

36

V.5 Definio

do Prazo de Validade do teste para Intradermorreao de

Montenegro
V.5.1 Controles Microbiolgicos
V.5.1.1 Exame direto

O exame macro e microbiolgico realizado pelo mtodo de Gram nos lotes

013MN005Z e 021MN001Z aps 20 meses, em estufa 37C, resultaram negativos,
no se detectando crescimento de bactrias e/ou fungos, nas amostras e no controle ,
conforme atesta-se em laudo no Anexo 7.
V.5.1.2 Presena de Endotoxina

Em relao presena de endotoxina em ambos os lotes testados o resultado

foram satisfatrios conforme laudo no Anexo 8.

V.5.1.3.Teste de Pirognio

Quanto ao teste de pirognio em ambos os lotes analisados os coelhos

apresentaram variao da temperatura de 0,5C pelo perodo de 5 horas estando dento
do limite de aprovao do teste de acordo com laudo no Anexo 9.

37

VI DISCUSSO

A leishmaniose tegumentar american (LTA) endmica em 88 pases do mundo,

dentre os quais o Brasil, e apresenta diferentes desafios aos profissionais envolvidos em
seu diagnstico, tratamento e controle, principalmente levando se em conta a
multiplicidade de formas clnicas que apresenta, a relativamente baixa sensibilidade do
diagnstico etiolgico de certeza, a multiplicidade de parasitas, vetores e reservatrios
envolvidos em seu ciclo biolgico, as dificuldades com a teraputica e a falta de
quaisquer medidas satisfatrias de preveno ( Marzochi & Marzochi 1994).
Quanto ao aspecto de diagnstico, a Intradermorreao de Montenegro (IDRM)
vem sendo largamente utilizada desde o final da dcada de 1930, no Brasil e no mundo,
como teste preliminar indicativo de leishmaniose tegumentar, sendo, ainda hoje, o
exame complementar mais sensvel e especfico disponvel para a Rede de Sade de
diversos pases.
No Brasil, o teste largamente utilizado em todas as regies, admitindo-se a
ampla distribuio da doena. Considerando a mdia anual de 35 mil casos notificados
da doena/ ano, poderamos estimar que, ao menos, um nmero equivalente de testes
deveriam ser realizados anualmente no pas. Isso sem considerar inquritos de campo
para avaliao da prevalncia da infeco.
Contribuem para a ampla utilizao da IDRM, alm da sua alta sensibilidade e
especificidade, a facilidade de aplicao, o baixo custo do teste e a no exigncia de
equipamentos para sua utilizao, como requerem os testes sorolgicos e mesmo os
mtodos de diagnstico de certeza. Este fato, associado ao predomnio da LTA em reas
pobres do pas, leva-nos bvia deduo de que, em muitas regies, a IDRM a nica
ferramenta disponvel para o diagnstico da LTA.
No entanto, devemos lembrar que estamos nos referindo a um teste realizado in
vivo, ou seja, o paciente recebe em seu prprio organismo o antgeno de Leishmania, ao
contrrio de outros exames, realizados com amostras de soro e outros materiais
coletados e enviados ao laboratrio. Do ponto de vista da Vigilncia Sanitria (VISA),
portanto, a IDRM constitui-se em agente de risco. Logo, pertinente que seja alvo de
observao e controle pela VISA em todas as etapas de sua utilizao: produo do
insumo, aplicao e leitura da reao, notificao de efeitos adversos e resultados
alcanados (eficcia e efetividade do teste).

38

No incio da utilizao da IDRM as normas para pesquisa clnica e laboratorial

no estavam claramente estabelecidas quanto aos seus aspectos ticos, nem quanto a
avaliao e qualidade do produto, que, no caso, h muitas dcadas, caiu no mercado e
foi consagrada pelo uso. No entanto, alm das demandas regulamentares, sabemos
que h falta de padronizao na produo desse insumo. Consideramos ento, de
fundamental importncia, investimentos que visem a aprimorar a IDRM e adequar sua
produo e utilizao s normas vigentes, com o fim de avaliar, monitorar e minimizar o
risco ao paciente e maximizar a efetividade do teste.
Neste trabalho especificamente, procuramos investir na padronizao do insumo
necessrio para a realizao da IDRM, o antgeno de Leishmania (leishmania). A
importncia dessa padronizao deve-se principalmente a dois pontos:1) falta de uma
cepa padro para a produo de um teste diagnstico utilizado por toda a rede do pas,
associada a uma multiplicidade de espcies de Leishmania envolvidas na LTA e seus
diferentes ciclos epidemiolgicos, com vistas comparabilidade dos resultados da
IDRM em diferentes reas endmicas,. 2) ao atendimento a normas tcnicas de
segurana e controle de qualidade, visando a minimizar o risco ao paciente que recebe o
produto .
O antgeno de Montenegro produzido atravs da sonicao de uma cultura de
parasitas, o que leva a uma suspenso antignica, contendo antgenos solveis, semisolveis e particulados, de diferentes caractersticas moleculares. A padronizao da
composio dessa suspenso torna-se portanto, extremamente difcil, bem como a
reprodutibilidade do seu processo produtivo. Para a melhoria dessa reprodutibilidade e a
melhor homogeneidade dos lotes de antgeno produzidos, optamos por padronizar
essencialmente a fase de crescimento parasitrio utilizada no processo de produo,
atravs da utilizao de parasitas na mesma fase de cultivo, estabelecida pela curva de
crescimento. Tratando-se de aprimoramento de produto para uso em escala comercial,
escolhemos como o melhor dia para utilizao dos parasitos para o antgeno aquele no
qual as promastigotas estavam no somente em grande nmero, mas tambm com sua
melhor viabilidade e presumidamente uma boa expresso de antgenos, que
corresponderia ao final da fase logartmica de crescimento e incio da fase estacionria,
o qual, em nossa curva correspondeu ao 4 dia de crescimento, como demonstramos por
absorbncia ( tabela 2 e grfico II ). Exclumos a avaliao com base na contagem de
parasitos em Cmara de Neaubauer pelo valor subjetivo implicado nessa observao.

39

Alm disso, procuramos, no aprimoramento do processo produtivo, utilizar

mecanismos que possibilitassem a melhoria do rendimento da produo, de forma a
aumentar o tamanho dos lotes, e, por conseqncia, reduzir custos. Para isso, buscamos
investigar qual o melhor inoculo, a ser utilizado na produo da massa parasitria, que
levaria ao maior lote possvel, sem perda da qualidade da suspenso. Nossos resultados
mostraram que essa abordagem fez sentido, j que, com a padronizao do inculo, o
rendimento da produo, medido em nmero de frascos produzidos, aumentou
significativamente. Alm disso, o processo de padronizao do inoculo no implicou em
retardamento do tempo de produo do antgeno, nem novos investimentos.
A partir da, a quantificao dos antgenos proticos na suspenso de
leishmanias, relacionadas ao inculo da maneira mais precisa possvel, torna-se de
fundamental importncia para a obteno de um antgeno de qualidade. A concentrao
de antgenos proticos para o antgeno de Leishmania foi estabelecida em 1977 e at
hoje considerada ideal. As metodologias de quantificao desses antgenos que
variaram ao longo do tempo, indo do mtodo de nesslerizao at o mtodo de Kjeldahl,
utilizado hoje em dia por Biomanguinhos. Considerando a baixa sensibilidade deste
mtodo e a existncia de outros mais sensveis, rpidos e adequados para a dosagem de
protenas, optamos por estabelecer o mtodo do Biureto como o de escolha para a
quantificao de antgenos proticos em nosso extrato.
Assim, pudemos comparar os resultados obtidos com os mesmos inculos
iniciais e com a mesma metodologia (Kjeldalh) em dois tempos distintos, bem como
com as duas metodologias testadas (Kjeldalh e Biureto) tambm em tempos diferentes.
Na primeira situao, observou-se que os valores obtidos para os experimentos I
e II
( ver tabela 6 e anexo 2) com o mtodo de Kjeldahl foram bastante discrepantes
entre si (comparar 21,87 X 154,37; 31,25 X 144,37), mostrando a pouca
reprodutibilidade do mtodo e ausncia de correlao entre o inculo utilizado para a
dosagem e a quantidade de protena estimada. Em relao aos inculos 107 e 108 os
valores em geral obtidos foram melhores que os referentes aos inculos mais diludos,
em ambos os experimentos, sendo que para os dois inculos os desvios observados
nesses experimentos, assumindo-se sempre o maior valor como 100%, foram menores
que 9, 4% (comparar 296,87 X 269,37 e 284,37 X 220,00).
No segundo caso, referente comparao dos valores obtidos com os dois
mtodos utilizados, pde-se observar que as concentraes proticas estimados pelo
40

mtodo do Biureto foram sempre superiores quelas estimadas pelo mtodo de Kjeldahl,
comparando-se os mesmos inculos e dentro do mesmo experimento. Alm disso,
confrontando-se as dosagens de protena pelo Biureto para os 4 inculos nos
experimentos I e II, vimos que os resultados foram de uma forma geral mais similares
do que os

decorrentes da dosagem de nitrognio protico, mostrando maior

repetibilidade pelo mtodo de Biureto.

Essas anlises comparativas tm ainda mais sentido se considerarmos que as
tcnicas de tratamento das amostras dos antgenos, prvias s dosagens proticas, foram
idnticas incluindo at a precipitao com TCA.. E, se assim o caso, como um dos
mtodos de dosagem de protenas mostrou, aproximadamente, uma concentrao
protica aproximadamente 2,5 vezes maior do que a outra? Deve-se lembrar que os
mtodos usados so baseados em propriedades diferentes, ou melhor, o mtodo do
Biureto prev a ligao de Cu+2 em meio alcalino aos pares de eltrons disponveis no
nitrognio das ligaes peptdicas, enquanto o mtodo de Kjeldahl dosa ou quantifica o
nitrognio de qualquer material como NH4+, incluindo o nitrognio protico. Nesta
situao, geralmente, assume-se o valor mdio de 16 % de nitrognio nas protenas, da
o fator 6,25 que utilizado para multiplicar os valores do nitrognio protico e assim
fornecer a concentrao protica aproximada. Mesmo que se assuma que o TCA
precipita todas, e somente, protenas, os valores de correlao protica podem estar
errados se o teor mdio de nitrognio das protenas no for igual a 16 %. Classicamente,
o mtodo do Biureto tem vantagens sobre o mtodo de Kjeldahl e mesmo sobre outros
mtodos espectrofotomtricos mais modernos (CBG-250, Folin-Lowry

clssico e

modificado, Bicinchoninico e outros) ( Zaia et all,1998). Mesmo sendo, menos sensvel

dos mtodos citados ele mais preciso, fcil utilizao e com conservante adequado
pode ser armazenado indefinidamente.
Assim, cumpre-se sugerir que o mtodo de Biureto seja doravante usado em
substituio ao mtodo de Kjeldahl. Se este for o caso, deve-se levar em conta que, para
efeitos da amostragem futura, o valor da concentrao de protena estimada pelo Biureto
deva ser dividido por 2,5 para alcanar-se o valor da concentrao protica estimada
pelo nitrognio protico, levando-se em conta o fator 6,25 (16% de nitrognio de
protenas). Alm disso, antes da produo em larga escala e distribuio de antgeno
rede de sade com base na dosagem de protenas, os mtodos de Kjeldahl e Biureto
devero ser avaliados por outros laboratrios, para validao dos resultados obtidos
neste trabalho, ainda em fase pr-clnica.
41

A partir do insumo tecnicamente padronizado, segue-se a etapa dos controles de

qualidade necessrios sua utilizao como produto, mais uma vez levando-se em conta
as caractersticas particulares como antgeno veiculado e sua forma de uso.
Na rotina j estabelecida em Bio-Mamguinhos, so realizados o controle
microbiolgico a partir do exame direto, e o teste de inocuidade em animais
experimentais, a partir do exame histopatolgico de fragmentos de pele e vsceras de
animais inoculados com o antgeno produzido. Como complemento desses controles,
objetivamos avaliar a introduo dos testes para deteco de endotoxinas e pirognios.
As endotoxinas so estruturas encontradas na parede celular de bactrias Gram
negativas, as quais podem causar problemas de sade a quem as recebe, incluindo a
elevao da temperatura corporal, mesmo na ausncia do microrganismo vivo. de
suma importncia a investigao de sua presena em injetveis, considerando que
quantidades muitssimo pequenas dessas substncias so suficientes para o
desencadeamento de manifestaes clnicas. Para a dosagem de endotoxinas, optamos
pelo mtodo de LAL, por ser o utilizado no controle da vacina da Febre amarela, em
diversos diluentes e gua para injetveis.
No encontramos na literatura relatos de dosagem de endotoxinas nos antgenos
de Montenegro produzidos, portanto, no poderamos definir, a priori, os nveis
mximos aceitveis para esse produto. Logo, optamos por trabalhar dentro dos limites
estabelecidos para o controle de vacinas e diluentes. No foi observada a presena de
endotoxinas em nenhuma das amostras examinadas, em todos os experimentos, de
acordo com a sensibilidade e limites de deteco do teste utilizado, o que sugere que o
insumo foi produzido em condies apropriadas de esterilidade, aumentando a
segurana daquele que o recebe. Novamente, tratando-se de uma abordagem recm
introduzida, a interpretao dos resultados dos testes de endotoxina dever ser
cuidadosamente avaliada. Por outro lado devemos destacar que, de forma positiva, a
introduo do mesmo no controle de qualidade da produo do antgeno, no trouxe
aumento do tempo de produo dos lotes estudados.
Em relao ao pirognio, trata-se de um importante teste que determina os
limites aceitveis de riscos para reaes febris em pacientes que recebem produtos
injetveis. Este teste tambm recomendado no controle de qualidade de vacinas,
diluentes e gua para injetveis. Novamente, no encontramos registros anteriormente
publicados de dosagem de pirognios em antgenos de Montenegro produzidos. Em
nosso trabalho, no foram encontrados nveis de pirognios em quantidade que elevasse
42

a temperatura corporal a mais de 0.6C dos coelhos examinados como determina o

critrio de normalidade do teste. Sendo assim, todos os antgenos testados foram
considerados livres de pirognios. Mais uma vez, ressaltamos a necessidade da
continuidade da repetio e avaliao contnua desses resultados e destacamos que a
incluso deste teste tambm no trouxe acrscimo significativo ao tempo de produo
do insumo.
Quanto ao teste de inocuidade in vivo (prova de segurana ) utilizado na rotina
como teste padro para a aprovao de um lote de antgeno de Montenegro, sendo
semelhante ao teste de toxicidade inespecfica utilizado no controle da vacina contra
Sarampo. No protocolo de nosso estudo,

esse teste foi seguido de avaliao

histopatolgica no s do local de inoculao do produto, mas tambm de diferentes

vsceras (fgado e bao) para deteco de possvel toxicidade sistmica. Nenhum
camundongo apresentou qualquer alterao local ou sistmica que determinasse a
reprovao do lote do produto, de acordo com os critrios considerados (citados na
Metodologia) nem comprometesse a sade e a viabilidade dos animais inoculados.
Dessa forma, acreditamos que esse teste importante para auxiliar a deteco da
presena de contaminantes e/ou substncias indesejveis as quais poderiam desencadear
manifestaes clnicas adversas, num modelo mais sensvel do que os testes in vitro. Em
nosso experimento, avaliamos tambm, de forma comparativa, um grupo controle de
camundongos no inculados e um grupo inoculado com o preservante do antgeno
diludo em salina fisiolgica, para identificarmos possveis reaes adversas decorrentes
da presena do fenol na composio do insumo. Consideramos que esses novos grupos
controle, cujo nmero de animais dever ser determinado pelo setor que realiza o teste,
obedecendo s condies determinadas pela Comisso de tica Animal (CEUA) da
FIOCRUZ e a definio de amostragem, devam ser absorvidos rotina de controle de
qualidade do antgeno de Montenegro.
Por fim, iniciamos estudos preliminares para determinar, com o maior grau de
preciso possvel, o prazo de validade desse tipo de produto. Para isso, deixamos alguns
lotes j produzidos, estocados a 37 C e por tempo superior ao prazo de validade (20
meses) pr estabelecido, submetendo-os aos mesmos testes realizados no antgeno
padro que definimos. Os resultados obtidos foram basicamente idnticos aos
observados nos antgenos recentemente produzidos e nos controles, mostrando que, sob
esse aspecto, e estocado em condies mais extremas que as utilizadas rotineiramente, o
produto no sofreu contaminao e/ou alterao significativa capaz de comprometer a
43

sua segurana. Um estudo clnico a seguir devidamente necessrio para completa

definio do melhor prazo de validade do novo produto.
Consideramos que essas abordagens, em seu conjunto, conforme proposto, e
complementadas por estudos posteriores controlados de potncia do antgeno, devem
contribuir para a necessria oferta de um teste clssico e universal para o diagnstico
das leishmanioses, porm devidamente padronizado e com controle de qualidade como
insumo e produto final, simples e acessvel, e com provvel reduo de custo.
O fluxograma a seguir (figura 4) ilustra como poder se desenvolver o processo
de produo da leishmania em rea biolimpa, controlada, utilizando-se Boas Prticas de
Laboratrio( BPL) e Boas Prticas de Fabricao ( BPF) com a incluso dos novos
controles fsico-qumicos e de qualidade padronizados.

44

FIGURA 4 - FLUXOGRAMA PADRONIZADO PROPOSTO

LOTE SEMENTE

MANUTENO DA
L.amazonensis (PH8)

EXPANSO DA CEPA
4 dia - INCULO 107

OBTENO DE MASSA

SONICAO

DOSAGEM DE PROTENA
PELO MTODO DO
BIURETO

ACERTO DA CONCENTRAO

ENVASAMENTO E ROTULAGEM

CONTROLE DE QUALIDADE

ARMAZENAMENTO
E CONTROLE DE VALIDADE

ESTERILIDADE

ENDOTOXINA E
PIROGNIO

INOCUIDADE

DISTRIBUIO DO PRODUTO

45

VII CONCLUSES
1-O inculo para a produo de massa parasitria devero ser de 107 parasitas/
mililitro de meio de cultura para a produo do maior nmero possvel de frascos
por lote de produto.

2-Os repiques de expanso da cepa para a produo de massa parasitria devero ser
realizados com promastigotas no 4 dia de crescimento in vitro em meio de cultura
Schneider mais soro fetal bovino.

3 -O rendimento da produo aumentar de forma significativa com a adoo do

inculo e dia de cultivo padronizados, sem aumento de custos e de tempo de
produo do Antgeno.

4- O mtodo de dosagem de protenas pelo Biureto mostrou-se mais adequado que o

mtodo atualmente em uso para dosagem de nitrognio protico ( mtodo de
Kjeldahl), sendo sugeridos mais estudos para que o referido mtodo do Biureto seja
utilizado na rotina padro de produo dos antgenos da leishmania.

5 -Novos mtodos de controle microbiolgico e ampliao dos testes de inocuidade

in vivo devem ser incluidos na rotina da produo do insumo para maior garantia de
qualidade.

6 -So necessrios estudos complementares paralelos para a determinao dos

prazos mximos

de validade do novo produto em diferentes condies de

estocagem, bem como estudos controlados de potncia do antgeno pr-clinicos e

clincos.

46

VIII REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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Trop So Paulo,40,41-47, 1998.
WHO Expert Commitee on Biological Standardization, n 329, ano 1966
ZAIA,D.M., Z AIA, C.T., LICHTIG, J. Determinaes de Protenas Totais Via
Espectrofometria: Vantagens e Devantagens . Qumica Nova, 21 (6) 787- 793,1998

53

ANEXO 1- Preparo da tcnica Azul de Tripan

Preparo da soluo Azul de Tripan
0.1 g de azul de Tripan
50 mL de salina 0,9% estril
Procedimento
Fazem-se diluies seriadas de 1:10; 1:100; 1:1000;
ex: 0,9 mL de azul tripan + 0,1mL de cultura de leishmania.
Monta-se a cmara de Neubauer.
Adiciona-se aproximadamente 100L da diluio 1:100.
Conta-se cada quadrante.
Somam-se os quadrantes e dividi-se por 4;
ex: 200: 4 = 50 x 102 x 104 = 5 X 10 7

54

ANEXO 2- Clculos de Experimentos

Clculos referentes a tabela 6
Clculos dos Experimentos
Curva Padro
2.1 Mtodo de Kjeldhal
Out/2003

Inculos

( Quantifiao de nitrognio protico ) : Teste executado em

Kjeldahl

105

0,0035 mg/mL x 6,25 = 0,021875 = 21,87g/ ml

106

0,005 mg/mL x 6,25 = 0,03125 = 31,25 g/ml

107

0,0475 mg/mL x 6,25 = 0,26987 = 296,87 g/ml

108

0,0455 mg/ml x 6,25 = 0,24837 = 284,37 g /mL

2.2 Metodo de Biureto

Outubro/2003

( Quantificao de protenas ) : Teste executado em

Inoculo

Biureto

105

0,049

Clculo ( 19.5 X 1,25 ) = 4.875

5
0,2389 mg/ ml = 238,9 g/ml

0,059

0,2876 mg/mL = 287,6 g/ml

0,051

0,2486 mg/mL = 248,6 g/ml

106

107

0,096

0,4680 mg/ ml = 468,0 g/ml

0,089

0,4339 mg/ ml = 433,9 g/ml

0,090

0,4387 mg/ ml = 438,7 g/ml

0,138

0,6727 mg/ ml = 672,7 g/ml

55

108

0,139

0,6776 mg/ ml = 677,6 g/ml

0,139

0,6776 mg/ ml = 677,6 g/ml

0,163

0,7976 mg/ ml = 797,6 g/ml

0,155

0,7556 mg/ ml = 755,6 g/ml

0,155

0,7556 mg/ ml = 755,6 g/ml

2.3 Mtodo de Kjeldahl (Quantificao de nitrognio protico): Teste executado em

Jan/2004
Inculos

Kjeldahll

105

0,0247 mg/mL x 6,25 = 0,15437 = 154,37g/ ml

106

0,0231 mg/mL x 6,25 = 0,14437 = 144,37 g/ml

107

0,0431 mg/mL x 6,25 = 0,26937 = 269,37 g/ml

108

0,0352 mg/ mL x 6,25 = 0,22

2. 4 Mtodo de
Janeiro/2004

Biureto

= 220 g/ ml

( Quantificao de protenas ) : Teste executado em

Inoculo

Biureto

105

0,085

0,4144 mg/ ml = 414,4g/ml

0,084

0,4095 mg/mL = 409,5 g/ml

0,081

0,3949mg/mL = 394 ,9 g/ml

106

Clculo ( 19.5 X 1,25 ) = 4.875

5

0,101

0,4924 mg/ ml = 492,4 g/ml

0,099

0,4826 mg/ ml = 482,6 g/ml

56

107

108

0,101

0,4924 mg/ ml = 492,4 g/ml

0,141

0,6874 mg/ ml = 687,4 g/ml

0,136

0,6630 mg/ ml = 663,0 g/ml

0,138

0,6727 mg/ ml = 672,7 g/ml

0,141

0,6874 mg/ ml = 687,4 g/ml

0,142

0,6925 mg/ ml = 692,5 g/ml

0,140

0,6825 mg/ ml = 682,5 g/ml

2.5 Curva Padro com BSA

Densidades ticas

0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0

10

mg/mL

57

ANEXO 3- Controles Microbiolgico Laudo dos Testes de Esterilidade( Exame

Direto)do lote de Antigeno de Montenegro e Salinas dentro do prazo de validade.

58

59

60

ANEXO 4 - Controle Microbiolgico - Laudo de Presena de Endotoxinas do

Lote de Antgeno de Montenegro Dentro do Prazo de Validade

61

ANEXO 5 Controle Microbiolgico - Laudo do Teste de Pirognio do Antgeno

de Montenegro dentro do Prazo de Validade

62

ANEXO 6 Controle Histopatolgico Laudos dos Testes de Inocuidade Lote de

Antigeno de Montenegro e Salinas Dentro do Prazo de Validade.

63

64

65

66

ANEXO 7 - Laudos do Exame Direto dos Lotes de Antigeno de Montenegro com

Prazo de Validade Vencida

67

68

ANEXO 8 Resultado do Teste de Endotoxinas dos Lotes de Antigenos de

Montenego Com Prazo de Validade Vencida

69

ANEXO 9- Laudos do Teste de Pirognio dos lotes Antigenos de Montenegro com

Prazo Validade Vencida.

70

71

ANEXO 10 - Laudos do Controle Histopatolgico dos Lotes de Antigeno de

Montenegro com Prazo de Validade Vencida.

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73

74