Bioassays

Erna Sulistyowati

Types of Assays
Chemical Assays: Spectrophotometry,
Spectrofluorimetry, Chromatography,
Immunoassays
Microbiological assays

Definition
Estimation of the concentration / potency of a
substance by measuring its biological response
in living systems
i.e.Observation of pharmacological effects on
[1] living tissues, or cells
[2] microorganisms
[3] animals

Indications for Bioassay

Active principle of drug is unknown
Active substance cannot be isolated, e.g. insulin,
posterior pituitary extract etc.
Chemical method is either
not available
if available, too complex,
insensitive to low doses e.g. Histamine can be bioassayed in
microgram conc.

Unknown Chemical composition, e.g. long acting thyroid

stimulator.
Chemical composition of drug variable but has same
pharmacological action e.g. cardiac glycosides isolated
from different sources, catecholamines etc.

Principles of Bioassay
Active principle to be assayed should show the same measured
response in all animal species
The degree of pharmacological response produced should be
reproducible under identical conditions [Eg Adrenaline shows
same rise in BP in the same species under identical conditions:
wt, age, sex, strain / breed etc]
The reference standard must owe its activity to the principle for
which the sample is being bioassayed
Activity assayed should be the activity of interest
Individual variations must be minimised / accounted for
Bioassay might measure a diff aspect of the same substance
compared to chemical assay [Eg testosterone & metabolites

Types of Bioassays
[1] Quantal Assays [ Direct endpoint ]
Elicits an All or None response in different animals
Eg.

Digitalis induced cardiac arrest in guinea pigs

hypoglycemic convulsions in mice.
Digitalis induced head drop in rabbits
Calculation of LD50 in mice or rats

[2] Graded Response Assays [mostly on tissues]

Graded responses to varying doses
Unknown dose response measured on same tissue

Methods of Bioassay con1

[2] Graded Response Assays [ Direct comparison on same
tissues]
Interpolation: Conc. of unknown is read from a standard plot of a
log dose response curve of at least 4 sub maximal concentrations
Matching / Bracketing: Const dose bracketed with varying doses
of standard till exact match is obtained
Used when test sample is too small
Inaccurate & margin of error difficult to estimate
Eg histamine on guinea pig ileum, Posterior pituitary on rat uterus

Multiple Point Assays

3 point assay [combines pples of matching with interpolation]
4 point assay [combines pples of matching with interpolation]

3 point assay [2+1 dose assay]

Fast & convenient

Procedure [Eg Ach bioassay]
Log dose response [LDR] curve plotted with varying conc of std Ach

solutions and given test solution

Select two std doses s1& s2 [ in 1:2 dose ratio] from linear part of LDR
[ Let the corresponding response be S1, S2]
Choose a test dose t with a response T between S1 & S2
Record 4 sets data [Latin square: Randomisation reduces error] as
follows

s1
t
s2
s1

s2
s1
t
s2

t
s2
s1
t

Plot mean of S1, S2 and T against dose. Calculate

Log Potency ratio [ M ] = [ (T S1) / (S2-S1) ] X log d
[d = dose ratio]

4 point assay [2 +2 dose assay]

Procedure [Eg Ach bioassay]
Log dose response [LDR] curve plotted with varying conc of std Ach
solutions and given test solution
Select two std doses s1& s2 from linear part of LDR [ Let the
corresponding response be S1, S2]
Choose two test doses t1 & t2 with response T1 &T2 between S1 & S2 ;
Also s2/s1 = t2/t1 = 2
Record 4 data sets [Latin square: Randomisation reduces error]

s1
s2
t1
t2

s2
t1
t2
s1

t1
t2
s1
s2

t2
s1
s2
t1

Plot mean of S1, S2 and T1, T2 against dose. Calculate

Log Potency ratio [M] = [ (T1 S1 + T2 S2) / (S2-S1 + T2-T1) ] X log d
[d = dose ratio]

Preparasi Bioassay (contoh pada aorta)

Setelah tikus dibunuh, selanjutnya thorax segera dibuka dicari aorta yang
dekat dengan jantung dan sejajar dengan esofagus (aorta descendens pada
cavum thoracalis).
Aorta diambil mulai dari arcus aorta sampai sepanjang mungkin ke arah distal,
dipindahkan ke petri dish yang berisi larutan Krebs dingin yang sudah diaerasi
dengan karbogen (95% O2 dan 5% CO2).
Aorta dibersihkan dari jaringan ikat sekitarnya, kemudian dipotong spiral
sehingga dihasilkan lembaran aorta seperti pita dengan lebar 3 mm dan
panjang 1,2 cm.
Kedua ujung aorta diikat dengan benang dan dimasukkan dalam organ bath
volume 10 ml posisi vertikal. Salah satu ujung diikat pada fiksatif dan ujung
yang lain dikaitkan dengan transducer isotonik Ugo Basile dengan berat
beban 2 g yang dihubungkan dengan rekorder (McLab).

Preparasi Bioassay (contoh pada aorta)

Kontraksi aorta dicatat akibat tarikan mekanik
pada transduser yang dikonversi ke energi listrik.
Jaringan dibiarkan untuk ekuilibrasi dalam double
jacketed organ bath yang terus diaerasi dengan
karbogen selama 2-3 jam atau sampai kontraksi
dinilai stabil.
Selama ekuilibrasi larutan Krebs diganti (wash
out) setiap 15 menit.

Hasil Pengukuran Kemampuan Vasodilatasi

Aorta dengan Teknik Bioassay
Efek quercetin terhadap kemampuan relaksasi pembuluh darah, dilakukan
dengan menggunakan organ terpisah melalui metode pengukuran bioassay.
Pengukuran kemampuan vasodilatasi pembuluh darah aorta menunjukkan
bahwa pada kondisi obesitas, pemberian acethylcholine sedikit memberikan
efek dilatasi.
Namun pada kelompok obesitas 160 hari terlihat kemampuan dilatasi yang
lebih kecil daripada kelompok obesitas 90 hari.
Pada pemberian quercetin dosis 2 mg/kg BB, acethylcholine memberikan
efek dilatasi yang lebih besar dari pada kondisi obesitas pada aorta.
Pada pemberian dosis 10 mg/kg BB, acethylcholine memberikan efek
dilatasi pada aorta yang lebih besar daripada pemberian quercetin dosis 2
mg/kg BB, demikian pula pada pemberian quercetin 50 mg/kg BB.

Hasil Pengukuran Kemampuan Vasodilatasi

Aorta dengan Teknik Bioassay
Hal ini menunjukkan adanya perbaikan fungsi sel endotel pada dosis 2,
10 mg/kg BB maupun 50 mg/kg BB, tetapi pemberian quercetin 10
mg/kg BB menunjukkan adanya perbaikan fungsi endotel yang lebih
besar daripada kedua dosis quercetin lainnya. Efek dilatasi yang terjadi
sebagai respon terhadap acethylcholine pada setiap perlakuan dapat
dilihat pada tabel berikut.

Tabel 5.2 Besar vasodilatasi pada aorta terpisah terhadap Ach 10 -4 M

dari tikus (V), yang sebelumnya diprekontraksi dengan PE 10 -4M.
Kelompok
Kontrol

Mean SD *
56.317 11.234 d

Kontrol Obes 90 hari

6.059 2.458 ab

Kontrol Obes 160 hari

3.040 0.900 a

Obese+Quercetin 2 mg/kg BB

18.043 17.459 ab

Obese+Quercetin 10 mg/kg BB

49.952 10.463 cd

Obese+Quercetin 50 mg/kg BB

30.009 16.489 bc

Keterangan : notasi yang sama menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata (p<0,05)

Hasil Pengukuran Kemampuan Vasodilatasi Aorta

dengan Teknik Bioassay

Angka diatas menunjukkan efek dilatasi pada

pembuluh darah aorta yang sebelumnya
diprekontraksi dengan phenylephrine 10-4 M.
Kemampuan dilatasi ini merupakan respon
pembuluh darah terhadap acetylcholine.
Kontraksi dan dilatasi ini diukur dengan Power
Lab.

Hasil Pengukuran Kemampuan Vasodilatasi Aorta dengan Teknik Bioassay

Diagram rerata besar vasodilatasi pada aorta terpisah terhadap Ach 10-4 M dari tikus (V),
yang sebelumnya diprekontraksi dengan PE 10-4M berdasarkan kelompok perlakuan.
Kelompok 1: Kontrol, Kelompok 2: Kontrol Obes 90 hari, Kelompok 3: Kontrol Obes 160 hari,
Kelompok 4: Obese+Quercetin 2 mg/kg BB, Kelompok 5: Obese+Quercetin 10 mg/kg BB,
Kelompok 6: Obese+Quercetin 50 mg/kg BB

Gambar Hasil pengukuran kemampuan relaksasi dengan organ terpisah.

Keterangan : tanda panah menunjukkan posisi respon relaksasi pada grafik hasil pembacaan dengan menggunakan PowerLab.
Kelompok 1: Kontrol, Kelompok 2: Kontrol Obes 90 hari, Kelompok 3: Kontrol Obes 160 hari, Kelompok 4: Obese+Quercetin 2 mg/kg BB,
Kelompok 5: Obese+Quercetin 10 mg/kg BB, Kelompok 6: Obese+Quercetin 50 mg/kg BB

 http://digitalunion.osu.edu/r2/summer09/jaeger/B
ioassays.html