eek Sensipie Elmétods éptime para determinar la etiologia eapecitica de una inlecesén por arbowius requlere el aislamlente de ‘virus a porte de una mucsira obtenida del paciente durante la stapa aguca de ls enfermedad y le demestraciée {do un aumento en of ttulo de ansicuerpes contra el virus aisads durante la convalacencia. Por varias razon ‘alolamiento exttoso de la mayonia de los arbovirus a partir de mussiras de pacientes es la excepcien, yasea poraut la muestra a examinarse;no ae recoge a tlompo, no 89 manipula correctamente, ono se trasiada de manera ciigort« {at Laboratorio para su inoculacién. La viremia en humanos en muchas infecciones por arbovirus, sles detectab len algon momento, casa en el momento © ripidamente dexpuée del inicio de los sintomas, una etapa en [que generaimente se puede demostrar Ia presencia de anticuerpos. Dabido a que en Ia faze aguda algunos vinut ‘crculantes pueden ser recuperades y los anicuerpos pueden estar ausentes, 0 presentes en itutes bajea, 26 debt recoger Ia muestra de sengre de forma inmediata ante la seapecha de etologia val. Una demora de més de ure ‘hora, puede comprometer Ia capaciiad de aolar a virus; el eri20 acentable depends dal tipo de virue involuerado ‘Giertos arcouirus, come CHIKV, producen una viremia de magnitud y durscién sutciente para permis su alsiamientc ‘on sangre curanta Ia fae agueia da a enfermedad, por 00.26 cas despues del nicio de ks entered. ‘Se pueden cbtoner alslamientos virales de lar viscera obtenidas por bicpsiat © aulopsia de pacientes cot ‘enfermedad aguda, J corteza, Jos nucieos cerebrales. el cerebelo y eI trance encelalice, Los arbovitus neurottepicos pueden Sar ‘aslados on ocasiones « partir el LCR abtenico por Puncion lumbar durante las etapas apudes de a encetaltie © meningitis aesptica. Se han sistado alfavirus. como CHIKY, a partir del iquido sinovial de pacientes con pokartnie faguda. En algunas cireunstanciae oe han recuperade artovinus de orina, leche, semen y humor wire. [sian aleponibies sistemas da cultvo calulares susceptbles para intontar el alsiamionto cel precunto agente etiologice de Ia enfermedad. Dezpute de un alslamiento exitoso, el virus puede Kientificarae ponitivamenta y un entigono preparado a partir de este aisamiento @ el virus mismo pueden ulllzaree pra demoatar la presence shill atari Nl mi mie he lhe ret ref cage, OV aaah ‘rcunstancias, se debe confiar an el reaislarento del virus a partir de la muestra original: De cuslauier maners fe dabe intentar ol reaislamiento, eat disponible © no ei auero del paciente. Cults creme item Meet street ve mceeunnton ri eth teeny ‘Se doben dividir los teiidos © Hquidoe dlaponibles pare aislamiento viral, microscopia electrénica y examen Inmunchistoquimico, Los teidos deben recogerse da forma aréptica y tansportarse rapidamente al laboratoriodiagnéetico de arsowrus de Ia OVED, COC, ae usa tanto a! Kt Bloftad IScript 1 Step RT-qPCR (#170-8895) como el kt QIAGER ‘Quantifect Probe FIFP-CR (#204443). Los dos kits son cas identicos on la preparacion de la pricba Con un excepcion: el volumet “de enzima ueado por reaccién en af kt QIAGEN 28 0.5 i. en lugar de 7,0 ul: 6! volumen ce agua de la mezcla macstra se mosifica ! (0.5 ul para ajistar eata diferencia. La preparacion que se mueatra a continuacion ex para al kt GIAGEN. Obsérvese tambien que volumen de ARIN agregade por reaccién es 10 pi pero puede incrementarse © reduce ahustands adecuadamente el volurien tots ‘Agua Ubre de Nass 43.241 132 ui 2X Mezcta ist 2501 250 wi Cebader 2 (100 4M stock) oer ou FAM, eons 25 4M stock) 0:30 ui sou Proparar ia mezcia macctra raactiva de acuerdo con el numero te reacciones deseadas. La mazcia maesira se debe preparar Ln “euarto implo™ que e9t6 fisicamente Separado de todas Iae otras actividades dol laboratory que tenga reactWvos y equipo exclusives (pore, pipetas). Para 10 muestas se debe preparar una mazcla maestra 10X (ver arriba) multipleande lez volumene Ge todos los reactvas indivicuales por 10. Combinar Ios reactives en e! orden menclonade anteriormente en un tubo para certiifug, pre de RNase sobre hielo. Dividir la mezcia maestra en 10 porciones de 40 js! cada uns, ya sea en tubos éptices de 0.2 mi para PCI (especiicos para pruebas TaqMan: la emision dela fuorescencia se lee a través de la tapa). 0 en una placa éptica de 96 pocilos par POR. Finalmente ae debe agregar 10 ude la musatra de ARN sola a cada tube o pacilo. Todas laa pruchas 2¢ examinaran en poco uplicados. Incluir varios controtes negatives “NO ARN (NT) agregando agua en lugar de ARN. Inclur un control positive © un serie de diluciones de cantidades conceidas de AFIN con contiel positive ot ee prepara una prueba cuanttativa, A eiete: {50°C por 30 min (eaccion FT) 95°C 15 509 ee eer reererrer ae ey Intorpretacion Eliguiento algontmo es usado por ol laboratorio para el lagnéstico de arbovitus do la DVBD, CDC para evaluar los resultados do ‘TeaMan. Positive: += Valor de corte (Ct) =38 on posilos duplicados. positive en cualquiera de los controles negatives invalda la corrida completa, Si el contro! positive ne genera un resultado positive también se invalida la corrida completa,PROTOCOLO DE LA PRUEBA DE INMUNOABSORCION ENZIMATICA DE CAPTURA DE IgM Print PRoTOcoLo DE ‘cefalorraquideo (LCR) de una variedad de especies animales (por ).. humanas, equines. aviares), Adora, 8 La pruaba de inmunoabsoreion ensimatien de eaptura de anticuarpos IgM Q4AC-ELISA) brinda una alternativa Liu a la inmnunofluerencencia para documentar la reapuata norologicn. La pruaba ELISA aa manos aubsjativa UA PRUEDA DE INMUNOABSORGION ENZIMATICA DE CAPTURA DE Ist “Tempe de reveatimiente: tampén carbonaie/bicatbonats pH 9.6. 1.5Dg Na2CO3 + 2:09 NeHCO3 daca an 1L ce agus. “Tampon de Invado: Tarpon fosfato saline (PES, 0.05% Tween 20, pi 7.2. PBS ents capone en polve = parte enulptes fuenton comers, ‘Tampon Bioqueante: PESS/ 59% leche/ 0.5% Tasen 20. ‘Anticuerpo de revestimiento: Ant kf humana de cabra. Laboratories Kirkegaard y Pony eat 07-10-03, ‘Antigone viral: Antigonos vaies inactivads. proviamente Mlulados, Preparados an cemabro de raten lactate ¥ ‘arate Arihoatinsprorartion ory canebro da inn bhai SAS yauaaiitainetaasiaiacaultie ‘Sustrato: 9.9.5.5 tetramctnibencicina Base (TMA ELISA), Gibco cat 15900-0414 Pincas: Placas de 86 pasion ce fondo plana Iremdon il HB. Dynatach Techmalogins cnt 9485. [Eapecimence de suera humana de la fase convalacionte y aguda y/o musatras do auido cofalorracuides (LCR)Resultados PROTO! Proved (DO media del suero de control positive reactivado en antigeno viral P) [D0 media del suere de contol negative reactvado en antigens viral (N) El cocionte debe sor mayor o igual a 2,0. Esto es al P/N dol control postive. ‘Se debe determinar a vaidez de a prusba para cada placa. Los resultados para las muestras cinicas s6lo se [pueden determinar sila prusb ee vida. Sia prueba no es valida, ge debe repetirla placa. Sila prueba fala inctuso despude de una repetcién, entonces uno © mis reactivs © parémettos de ls prucba pueden estar equivocados y 26 ‘debe buscar la sokuclin cal problema. Para dotorrinar si las musstras ctricas (S158) contienen IgM cortra el antigen viral que indicara infeccién raciente por ese virus} Se dobo calcula lo Siguiente: (DO media de ta musetra examineda reactivada an antigeno via?) [BO media dal suero de coniral negative reactvada en aniigane viral Esto 06 el P/N de fa muestra examinada. Para que una muestra se considers IgM-postiva para ovis, P/N ‘debe ser mayor 0 igual @ 2,0. ‘Adiomas, el valor de P para la muestra examinada debe ser mayor 0 igual al dobie do la DO media dela mucsira ‘examinada reactivada on antigeno nermal. Sino se cumple con este requisito, se ha gonerado un entome no PROTOCOLO DE LA PRUEBA DE INMUNOABSORCION ENZIMATICA DE CAPTURA DE IgM Interpretacion PROTOK Consider “Tacos los valores P/N mayores o igusles @ 2,0 deben repertarse come presuntos IgM-positivos (ver ot psrrafo siguiente), stempre que cumplan con los raquisitos enumerados anteriormanta. En caso de que al LCR 9 uero da la ‘ase aquda temprana sean nogatives segtin esta prueba, se debs pedir examinar el sure do la fase corwalocionto antes de reportar a aste paciente como negative, sin evidencia serelégica de infeccién vial reciente. Sin al examen de una musetra de le fase convaleciente, un resuitade negative puede rellejar que la muestra de la fase aguda se fobtuvo antes de que o! anticuerpe haya legado a niveles detectables. En la mayora de los pacientes, la IgM se puede detactar acho cise depute del inicio de loa intomas de una inleccién por Vitus del grupo ale, Navi, © Catiomia. La tel persiste por lo menos por a5 dias, y ganeralmente hasta 90 dias Er punto do corte para o valor PAN positive de 2,0 20 ompitice, on base ala experiencia y of consonee. Los valorea PIN entre2,0y3.0.deben considerarse come probeblesfaiso-posits. Se deben realizar otras pruebas adicionsles para contiemar el resuitade de estas mucstras. Se debe destacar que et valor P/N de una prucba a la dilucién de 1:400 no 9s indicativa de su concentracién absoluta de anticuerpos, es decir el valor P/N no es cuantitativo. prctica Interpretacion Se recomienda ademés que para las muestras de suero, todos los resultados posives se confimmen mediante titulacién usando 6 diuciones dobles de las muestras de suero comparéndolas con una tulacion similar del suero de control negatvo. Las curvas de ttuiacién lineaies indican seropositvidad verdadera. Las curvas de titulacién sa Los antiganos y el conjugado deben dliuirse a las diticiones de trabajo inmediatamente antes de usar. La prusba MAC-ELISA se dobe reostandarizar periédicamente. Esto deberia hacorse cuando introducen Resultados huevos nimeres de ote de reactives, y como minimo, una vez alae. Se recomienda que la densidad éptica (00) ‘media de lareaccién del suero de contro} positive con el antigeno viral se establezca en aproximadamente 1,0. La reaccién del suero de control normal cone! antigen viral debe estar en alrededor de(0,2 (esto varia). Generalmente se logra la estandarizacién de los reactivos mediante titulacién, comparando siempre las densidades 6pticas de Jos reactivos cuando reaccionan con e! antigeno viral y normal ‘Antes de calcula los resultados de cada musstra clinica, se debe determinar que la prusba es valida, Para que una jpructa se considere valida, debe curmpila siguiente:ry Cee Poe era) PROTOCOLO DE LA PRUEBA DE INMUNOABSORCION ENZIMATICA DE IgG Introaueeién Principio Seguridad Materiaios | Reactivos {La inmunoglobutina G (gG) 68 menos especitica para el us que a IgM, aparece en suero un poco despuss ‘Que ésta on el curso de ta inteccién, y permanece detectable hasta mucho después que la IgM deja de ‘star presente, Usando IgG-ELISA on parallo com la prusba de Inmunoabsorcién Enzimetica de Captura {de Anticuerpos IgM (MAC-ELISA), se pueden observar el aumento y disminuci6n elativos de fos niveles de anticuerpos en las muestras de suero pareadias. La prueba es simple y sensible. Es aplicable a muestras de ‘suet pero generalmente no a muestras de LCR. Las reacciones falso-positivas debido al factor reumatoide: ‘ectin minimizades. ‘La prueba IgG-ELISA ofrece una aternatva iti frente a la inmunofivorescencia para la Kdentiicacion de un alslamionto viral © para documentar la respuesta serotégica. La prueba IgG-ELISA es menos subjetiva que fa Inmunotluorescencia y se pueden procesar una gran cantidad de muestras. E) anticuerpe monoclonal reactivo «a1 grupo viral es recubierto en placas de 96 pocilos, seguide secuencialmente por el antigeno viel conocido, el ‘suero del paciente, IgG humana conjugada con una enzima y finalmente sustrato para el conlugado utlizado, En esto consiste la prucba IgG-ELISA usada en el laboratoro para e! diagnéstico de arbovirus de la DVBD, CDC. El procedimianto ae debe realizar en condiciones de laboratorio saguras que tengan en cuenta la naturaleza potenciaimente intecciosa de tas muestras de suore iavolucradas. Se recomienda ol uso de bata de laboratorio, ‘quantes y campana de fuje laminar “Tampén de revestimiento: Tampdn carbonata/bicarhonato pH 9,6, 1,599 Na2G08 + 2,89g NaHCOS ilvide en 11 agua. “Tampén de lavado: Tampdn fostato sane (PBS), 0.05% Tween 20, pH 7.2. PBS disponible en polve a partir de ‘altiptes tuentes comerciales. ‘Tampén bloqueante: 3% suero de cabra, 196 Tween 20, on PES. Anticuerpo de revestimiente: Anticuerpo menocional eepeciice de grupo, previamente tulad ‘Antigone vira: Antigencs virales inacivadies, previamente ttulados, preparades en cerebro de ratén lactante y ‘extraidos mediante ol método de sacarosa-acstona. ‘Antigone normal: Antigenos preparados en corabro de ratén lactanto no infectado y extraldes mecianto o! método de sacarosa-acetona, Conjugade para deteccién de anticuerpos: anti lg humana de cabra porcién Fey conjugada con fosfatasa alcalina, previamente ttulada (Jackson Immunoresearch catt 109-055-098), ‘Sustrato: 3 mg/ml p-nitrofenlfosfato, dsocio (Sigma 108, Sigma diagnostics cat# 104-105) en 1M THs (base) PH 8.0 (nota: EI Tis requiere considerable cone. de HCI para et ajuste del pH). ‘Solucién quolante: 3M NaOH.Procadimiento | Neta: El siguiente procedimiento incluye Informacion sobre control de calidad @ interpretacion de los resultados. Cada muestra de cuero se examina por triplicado tanto para antigenos vrales come normales. Se pueden analizar ocho muestras para estudio por pisca. 1. Gon un marcador indelable de punta fina, numerary rotular las placas.Identificar le ubicacién de cada musstra clinica (S1-S8) utizando ot codigo de laboratoria corresponciente, Para mantener los tempos ‘para 0! agregado de reactives de manera consistente, procesar las placas en el orden en que estén ‘pumeradas durante todos les pasos det procecimionto. Las placas debon mantenerse en un amibionto ‘corrade y humiiicade durante todo ol tiempo de incubacién, excepto en el paso de revestimiente. Para ello es Gt una bolsa Ziploc grande que contenga una toalla de papel named 2, Revestir los 60 pocilosinternos de las placas do 96 pociios con 754 por pocilo de anticuerpo monoclonal reactive de grupo adecuado, diuido en tampén de revestimiento de acuerdo con fa titulacién anterior Incubar a 4°C durante toda la noche. 3. Vaciar ol anticuerpo de revestimionto y socar las placas sobre toallas de papel. Bloquear las placas con ‘20041 de tampon bloqueenta por nocilo. Ineuber a temperatura ambiente durante 20 minutos. 4. Lavar loa pociloe 5X con tampén de lavade usando una lavadora de placas automstica. Se deben lena tos pociios completamente para cada ciclo. ‘5. Dilur al antigeno vial en tampan de lavado de acuerdo con la ttulacién provia. Agregar SOpl por pocilo en los tros pocllos izquerdos de cada bloque de sueros. Ales tres pocilos de la derecha de cada blogu agregar 50)! por pocillo de antigeno normal cituido en tampon de tavado en ta misma concentracion que ot “entigeno vial ieubar durante la noche a 4°C en camara humitieada, 6. Lavar 8x. ar eee or) Apéndice C. Protoc PROTOCOLO DE LA PRUEBA DE INMUNOABSORCION ENZIMATICA DE 19. Procedimionto | 7. Agregar 504 per poco del suere del paciente (S) clu al 1:400 en tampén de lavado a un Bloque de sels pocilos. Agregar suere humane de contro! posite (Ref uo en tampén de lavado de acuerdo 2 a ‘itulacion previa, y un control de suero humane negative (N) dude 1:400 en tampén do lavade a un Bloque do 6 pociios cada uno. Incubar las placas durante una hora a 87°C on una camara humviicada. 8, Laver 8X. 8. Agregar 50u por pocilo de ant aG humana de cabra conjugeda con fostatasa alcaina duida en tampén Dlequeante, de acuerdo con la ttiaeisn ante: Ineubar durante une hora a 37°C en una c&mara humiicada, 10. Encender ol lector de placas para quo se calionte dicolver las tablotas do sustrato en tampén tris, Apéndice C. Protocolos de las pruebas serolégicas (IgM e 196) (< PROTOCOLO DE LA PRUEBA DE INMUNOABSORCION ENZIMATICA DE IgG. ‘Materiales y| Placas: Piacas de 96 pocilos de fondo plano immulon iI HB. Dynatech Technologies cat 3485. Lavadora de microplacas Lector de microplacas Incubacora| Pipotas sencilas y muiticanal Rosorvorios para reactivos Bolsas Ziptoe, toallas de papel Muestras ‘Suores humans de la fase aguda y convalecionte clinicas Nota: Conservar todas las musstras para diagnéstico a 4°C antes de someterlas a analisic, y@-20°C después: {0 haber completado todas las pruebas provistas. Evitarciclos repatides de congelamionto-descongolarnonto,Pere eee PROTOCOLO DE LA PRUEBA DE INMUNOABSORCION ENZIMATICA DE IgG Interpeatacion ‘Se debe determina la validez de la prusbe para cada placa. Los resultados para las muestras clinieas s6lo ‘Se pueden determinar sla prueba es valida. Sila prueba no oe vd, se debe repetir esa placa. Sila prueba {alia incluso despise do une ropeticién, entoncee une 2 mae reactivee © parmotros de prueba pueden estar ‘equivocados y 59 debe buscar la solucion del problema, Para determinar si las musstras cinicas (S1-S8) contionen lgG contra el antigono vial do que indicaria infeccién reciente © previa con ese virus) 59 debe calcula lo siguiente: (DO macia de la musatra examinada resctivada en antigeno vial (P) ‘Do media dat suers de control negative reactvado en anligana veal) PIN de la muestra examinada. Para que une muestra sea considerada IgG-positiva para a virus, el PIN debe ser mayor 0 igual a 2.0. ‘Adiomée, ol valor de P para Ia muestra examinada debe ser mayor 0 igual al doble de la DO media de Ia ‘muestra oxaminada reactivada en antigeno normal. Sine se cumple con este requisite, se ha generado un lontorno no espectico,y el recuitado debe ser reportado como no interpretable. “Todos tos valores P/N de los pacientes superiores 0 iguales a 2,0 deben ser reportades come presuntos 1G positives (ver parrafo explicative en la sigulente pagina). mientras cumplan con los raquistos enumerados _anteviormente. Lae interpretaciones de IgG-ELISA siempre deben hacerse en el contexto del MAC-ELISA ‘correspondiente, y le fecha de recoleccién de la muestra en relacién con el inicio de loe sintomas. Un resultado positive de 1gG-ELISA por si mismo no puede dlatingulr una infeccién reciente de una paseda, debido ‘la persistencia de Ia IgG de infecciones anteriores. Le IgG también tlene una mayor reactivided eruzada que Ja IoM, por lo que un resultado positive por IgG-ELISA puede en realidad indicar la presencia de anticuerpos: ‘tente aun virus relacionade. En la mayoria de los casos, la 1gG se puade detectar 12 dias despude del inicio de ls sintomas de une infaccién por vieus dal grupe alfa lavi-, © Cailornia y persiste por largos periodes de ‘tempo, posiblemente por ates. ‘A continuacién se enumeran algunos ejemplos de escenarios posibles: 1. Un recuttado positive de lgG-ELISA con un resuitad postive de MAC-ELISA indicara la presencia de infeccién 2. Un resuitad negative de lgG-ELISA con un resuitade postive de MAC-ELISA en una musa aguda incaran una, Infecién recente en la cual ol antiouerpo lg todavia no ha alcarizado niveles detects, 8. Un ecultado positive de lgG-ELISA y un resitado negative de MAC-ELISA en una muestra tamada, _aproxiraciaminte entre 8 45 das después ce inicio de os sintomas sugerria a Scurrencia de una infoccién asada (recordar que la laG para. un virus tine con frecuencia raaccion eruzada con otros vieus del mismo aero) “Todos tos valores P/N de lox pacientes superiores 0 igualos 2 2.0 detien ser rportados como presuntos 1g posktvos (ver perrafo expiicativ en la sigulente pains). mentras cumplan con tos requlctos enumerados Lanteviormente, Las interpretactones de IgG-ELISA siempre deben hacerse en el contexto del MAC-ELISA, ‘correspondiente, yla fecha de recoleccién de la mucstra en relacién con el inicio de toe sintomas. Un resultad positive de 1gG-ELIGA por at mismo ne puede dlatinguir una infeccion reciente de una asada, debi {la persistencia de la IgG de infacciones anteriores. La IgG tambien tlene una mayor reactivided eruzada gue la lak, por le quo un resultado positive per laG-ELISA puede en realidad indicar la presencia de anticuerpee ‘ante a un vines relacionade. En ta mayoria de tos casos, ta 19G se prada detectar 12 das despuidn dl incl A continuacin xe enumeran algunos ejemplos da aacenarios posibles: 1. Un resultado postive de laG-ELISA con un resutade positve de MAC-ELISA incr a prosenscia de nfeccion 2. Un rsuitadio negative de Ig@-EL1SA con un racuitlade postive de MAC-ELISA@n una musi aguea alain une ‘ntoccion reconta oni. cual el anticuerpe IgG todavia no ha alcanzaco nivoion otectbe. 5. Un resuitad pontine de IgG-ELISA y un resultado negative dle MAC-ELISA en uns muestra tomad soroxmadernente entre By 45 da desputes det Nein de los anternas super couric ene accion ‘psadda Fecorday que a lgG ava un vis ane con cuencia maccion exizada Gon otros vine del ism mero)Tobi Vata o a Vomites: a a Owes a a Asteria a a Artraigias o g cetalitis a 5 Edema Ponarticular a 3 Manestaciones cutaneas = |_O. 5 En caso afirmativo, desenbir: ‘También se recomienda que, pare las muestras de suero, todos los resultados postvos se confirmen mediante —| tulacién usando 6 diuciones dobles de las muestras de suero, comparéndolas con una ttulaci sila del sue de control ngativ. Las curvas de tulaconlinealesindican seropostividad verdadera Las curvas de o No o a Negatvo —Fechage resultado — o No o Posed Negatvo —-Fechage resuttado __/_/ 4 o No o Positive NegatvoS — Fecha de resuttado — o No 9 Posteo NegawwoS — Fechade resultado y (Continue 102