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GUA DE PRCTICA
INMUNOLOGA VETERINARIA
INDICE
INTRODUCCIN
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REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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INTRODUCCIN
La presente gua tiene como finalidad organizar de manera secuencial las diferentes
actividades prcticas a realizar durante el desarrollo del curso de inmunologa veterinaria.
Las prcticas en base a muestras biolgicas (aislamiento de PBMC, pruebas de unin
primaria y secundaria), animales de laboratorio (reconocimiento de rganos linfoides,
protocolo de inmunizacin), as como la exposicin de artculos cientficos de publicacin
reciente en revistas de impacto en el rea de la inmunologa veterinaria y comparada
complementarn la formacin del estudiante abarcando las temticas indicadas en el
silabo del curso.
Cada prctica est estructurada de la siguiente manera: Una introduccin general al
tema de la actividad, una lista de materiales a emplear, y los procedimientos a ejecutar
para el adecuado desarrollo de las diferentes tcnicas o mtodos. Al final de cada actividad
se encuentra un formato de informe de prctica as como un cuestionario con dos a cuatro
preguntas que tienen como objetivo reforzar los conceptos ms importantes brindados
durante la sesin, as como evaluar el criterio y el aprendizaje del alumno.
Los informes de las prcticas sern entregados de manera grupal, por mesa de
trabajo, a la semana siguiente de haber concluido cada actividad para su respectiva
calificacin por los docentes responsables del curso.
I. Animales y materiales
Animales: Cobayos y pollos menores de 4 semanas de edad.
II. Procedimiento
A) Procedimientos de extraccin de rganos linfoides en mamferos
1. Sacrificar al animal por sobredosificacin de cloroformo en campana.
2. Retirar al animal de la campana y colocarlo decbito dorsal.
3. Disecar la piel y observar la presencia de ganglios linfticos superficiales
4. Realizar una incisin abdominal central y proceder a la apertura del peritoneo.
5. Identificar el bazo y ganglios linfticos, relacionar la ubicacin anatmica con la
funcin.
6. Extraer los rganos linfoides y observarlos en el estereoscopio.
7. Desprender el intestino, abrir el lumen intestinal e identificar y disecar las placas
de Peyer.
8. Abrir la caja torcica e identificar el timo y los ganglios linfticos mediastnicos
9. Extraer los rganos linfoides con ayuda de unas pinzas y observarlos en el
estereoscopio.
Timo
Bursa
Mdula sea
Ganglio linftico
Bazo
Placa de Peyer
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Ttulo de la prctica:
Seccin:
Mesa:
Fecha:
Integrantes:
tems a desarrollar:
Introduccin (Breve marco terico)
Metodologa
Resultados y discusin
Conclusiones
Referencias bibliogrficas (Estilo Vancouver)
Cuestionario:
1. Cules son las principales funciones de los rganos linfoides primarios
y secundarios
2. Qu son y cul es la importancia del divertculo de Meckel y la
glndula de Harder?
3. Grafique y seale los principales rganos linfoides observados en
mamferos
4. Tienen las aves ndulos linfticos? Ample.
I. Materiales y equipos
Muestras de sangre
Tubos falcon x 15 50 ml
Micropipetas automticas
Puntas de 1000 ul
Histopaque
RPMI
Azul de tripn
Cmara de Neubauer
Centrfuga
Microspcopio
II. Procedimiento
1. Obtener muestras sanguneas con EDTA de animales o humanos
2. Transferir la muestra de sangre hacia un tubo de 15 ml y adicionar el mismo
volumen de RMPI.
ANTES DE LA CENTRIFUGACIN
DESPUS DE LA CENTRIFUGACIN
Plasma
Sangre diluida
(v/v)
Histopaque
Histopaque
Eritrocitos y
granulocitos
Figura 2.1. Orden de los estratos formados despus de la centrifugacin con histopaque
Ttulo de la prctica:
Seccin:
Mesa:
Fecha:
Integrantes:
tems a desarrollar:
Introduccin (Breve marco terico)
Metodologa
Resultados y discusin
Conclusiones
Referencias bibliogrficas (Estilo Vancouver)
Cuestionario:
1. Cul es el fundamento de la tcnica de aislamiento de PBMC
realizada en clase?
2. Describa brevemente una tcnica alternativa para el aislamiento de
leucocitos
3. Referencie un artculo cientfico en el que se emplee alguna tcnica
de aislamiento de leucocitos, e indique la razn de su utilizacin.
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I. Animales y materiales
Animales: Conejas blancas de 3 kg.
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Termmetro y estetoscopio
Balanza romana
Gasa y algodn
Suero fisiolgico
Alcohol
II. Procedimiento
A) Sujecin de los conejos
Para proceder con la evaluacin clnica del animal, es necesario realizar una correcta
sujecin. Con la mano derecha sujetar tranquilamente al conejo de la parte trasera del
cuello, firme pero con suavidad, luego colocar la mano izquierda debajo de las ancas
del conejo para soportar su peso. Tambin se puede sujetar la piel de los hombros con
la mano izquierda y con la derecha sujetar al conejo de la piel del lomo. Nunca levantar
al animal de las orejas, ni cargarlo slo de los hombros, esto es muy doloroso para el
animal.
Figura 3.1. Izquierda: Sujecin del conejo por la nuca y ancas. Derecha: Sujecin del
conejo por el lomo con ambas manos *
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Mesa:
Fecha:
Integrantes:
tems a desarrollar:
Introduccin (Breve marco terico)
Metodologa
Resultados y discusin
Conclusiones
Referencias bibliogrficas (Estilo Vancouver)
Cuestionario:
1. Realice un esquema comparativo entre las vas de inoculacin IM, SC
e ID. Brinde 2 ejemplos de sustancias que son inoculadas por esas
vas.
2. Qu cantidad de volumen sanguneo se puede obtener de un
conejo adulto, y con qu frecuencia?
3. Cul es la diferencia entre suero y plasma sanguneo?
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por los linfocitos T colaboradores. En una respuesta primaria, se estimulan a los linfocitos
vrgenes productores principalmente de Ig M, y ante una estimulacin ulterior se
estimularn a los linfocitos de memoria, lo cuales tras su diferenciacin en clulas
plasmticas producirn Ig G en mayor proporcin.
El periodo latente entre la inoculacin inicial del antgeno y la aparicin de anticuerpos
vara segn la va, la dosis, la naturaleza del antgeno y el tipo de adyuvante utilizado. En
la prctica, se pueden detectar anticuerpos entre los 3 y 14 das despus de la inoculacin,
registrndose entre el noveno y el dcimo da en promedio una tasa mxima de
produccin. Los sueros pueden ser enteros o purificados, y la concentracin de
inmunoglobulina especfica es valorada a travs de pruebas de reaccin primaria y
secundaria.
El objetivo de esta prctica es reforzar los conceptos de respuesta inmune primaria y
secundaria, adyuvantes, los cuales son la base de las vacunaciones, as como familiarizar
al estudiante con la sueroterapia.
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II. Procedimientos
A) Preparacin de inmungenos
Albmina srica bovina (ASB).1. Disolver la ASB a razn de 50 mg en 2 ml de solucin salina fisiolgica.
2. Verter en una placa petri o en un tubo plstico, 2 ml del ASB disuelto y 2 ml de
adyuvante completo de Freund.
3. Con una jeringa de 20 ml y una aguja 18G x 1.5 proceder a cargar y descargar la
mezcla repetidas veces hasta obtener una solucin cremosa.
4. Confirmar que la emulsin ha sido completada colocando una gota de la suspensin
sobre un recipiente con agua. Si la gota no se diluye y flota o permanece intacta, la
emulsin estar lista para usarse, caso contrario repetir el paso 3.
5. Para preparar la emulsin con adyuvante incompleto de Freund repetir los mismos
pasos cambiando el adyuvante completo de Freund por el incompleto.
Componentes estructurales bacterianos.1. Como primer paso se puede elegir entre el procedimiento a o b.
a. Centrifugar un cultivo bacteriano en caldo a 6000 rpm x 10 minutos.
b. Realizar una suspensin antignica en solucin salina fisiolgica o agua
ultrapura a partir de cultivo bacteriano en placa, hasta alcanzar una
concentracin equivalente a 3 segn la escala de Mc Farland.
Posteriormente centrifugar la suspensin a 6000 rpm x 10 minutos.
2. Para ambos casos, descartar el sobrenadante y realizar 2 lavados (centrifugar y
decantar) consecutivos del sedimento con PBS.
3. Resuspender el sedimento en 2 ml de agua ultra pura
4. Lisar las bacterias obtenidas en el sedimento sometindolas a choque trmico
mediante cambios bruscos de temperaturas de - 80C a 100C (5 minutos en cada
temperatura). Repetir esta operacin de 3 4 veces.
5. Verter en una placa petri o en tubo plstico los 2 ml del lisado bacteriano y
mezclarlo con 2 ml de adyuvante completo de Freund.
6. Repetir los pasos 3, 4 y 5 del procedimiento A.
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Exotoxinas bacterianas.1. Centrifugar un cultivo en caldo de una especie bacteriana productora de exotoxinas
a 6000 rpm x 10 minutos.
2. Tomar 2 ml del sobrenadante, 0,2 ml de formol 40% y 2 ml de adyuvante completo
de freund y mezclarlas en una placa petri o en un tubo plstico
3. Repetir los pasos 3, 4 y 5 del protocolo Antgeno I (A).
B) Inoculacin de inmungenos
1. Inocular a los conejos la suspensin inmunognica emulsionada con adyuvante
completo de Freund o adyuvante saponina Quil A, por va intramuscular (0.25 ml)
subcutnea e intradrmica (0.05 - 0.1 ml, en 8 sitios diferentes sobre el dorso).
2. A los 14 das post inoculacin se aplicar, va intramuscular (0.25 ml) y subcutnea
(0.25 ml), la segunda dosis de inmunizacin de las mismas suspensiones
inmunognicas pero esta vez emulsionadas con adyuvante incompleto de Freund.
3. Opcionalmente, a los 7 das despus de la segunda dosis, se aplicar va
intramuscular la tercera y ltima dosis (0.25 ml) de inmunizacin de las mismas
suspensiones inmunognicas emulsionadas con adyuvante incompleto de Freund.
4. A los 7 das despus de la ltima inoculacin realizar una sangra del conejo por
puncin cardiaca con una jeringa con anticoagulante (EDTA) de 15 a 20 ml de
sangre. Como alternativa a la puncin cardiaca se puede obtener las muestras de
sangre a partir de la puncin de la vena marginal de la oreja. Ver las indicaciones
de mtodos de sangra en la prctica anterior.
5. Centrifugar la sangre obtenida a 5000 rpm por 10 minutos y posteriormente con
ayuda de una pipeta pasteur transferir el plasma obtenido a un tubo estril.
6. A partir del plasma obtenido se proceder purificar las gammaglobulinas para
posteriormente verificar la presencia de anticuerpos especficos mediante las
prueba de precipitacin y/o inmunodifusin doble en gel de agar.
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Figura 4.1. Sitios anatmicos y ngulos referenciales para las inyecciones intramuscular,
subcutneo, endovenoso e intradrmica.
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* Extrado del libro Prcticas de inmunologa general y aplicada a veterinaria
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Mesa:
Fecha:
Integrantes:
Items a desarrollar:
Introduccin (Breve marco terico)
Metodologa
Resultados y discusin
Conclusiones
Referencias bibliogrficas (Estilo Vancouver)
Cuestionario:
1. Cules son los efectos que los adyuvantes producen en el sistema
inmunitario?
2. Liste 5 adyuvantes empleados en vacunas de uso veterinario
3. Cules son las diferencias entre los anticuerpos policlonales y
monoclonales?
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La inmunologa utiliza las tcnicas comunes a varios dominios de la biologa. Sin embargo,
las tcnicas ms especficas han sido desarrolladas a la iniciativa de inmunlogos y son
particularmente utilizados por estos ltimos. Estas tcnicas de inmunodiagnstico han
sido divididas clsicamente en pruebas de unin primaria, secundaria y terciaria. Las
pruebas de unin primaria miden o cuantifican la cantidad de inmunocomplejos (Ag-Ac) a
travs de radioistopos, fluorocromos o enzimas. En las pruebas de unin secundarias la
reaccin antgeno-anticuerpo va seguida de una segunda reaccin como la precipitacin o
la aglutinacin, perceptibles visualmente. Por ltimo, las pruebas de unin terciaria
evalan la capacidad de los anticuerpos de neutralizar la actividad biolgica de antgenos
como los virales o toxinas bacterianas.
Dentro de las pruebas de unin primaria ms importantes tenemos al ELISA,
radioinmunoanlisis, western blot, inmunofluorescencia, inmunohistoqumica, citometra
de flujo, inmunofiltracin, inmunocromatografa, entre otras. En la presente prctica se
conocern las tcnicas de inmunofluorescencia directa, as como pruebas de diagnstico
rpido de uso en la clnica veterinaria para la deteccin de antgenos o anticuerpos
especficos contra patgenos de importancia en peros y gatos.
El test SNAP, de laboratorios IDEXX, es una de las prueba rpidas ms empleadas en
veterinaria y se basa en la tecnologa de ELISA, lo que permite realizar anlisis de calidad
de una manera fcil y rpida sin tener que recurrir al anlisis de un laboratorio. Esta prueba
se basa en la bsqueda de antgenos y/o anticuerpos en diferentes medios: heces, sangre,
suero. Este mtodo es bsicamente referencial, por lo que se debe complementar el
resultado con pruebas adicionales y/o con los hallazgos a la evaluacin clnica.
El diagnstico de laboratorio de rabia est orientado hacia el examen del tejido nervioso
de animales muertos bajos sospecha de infeccin rbica. Para esto se examinan
conjuntamente el cerebro, cerebelo y Asta de Ammon o hipocampo, en busca de
antgenos del virus de la rabia. Estos antgenos son detectados a partir de improntas
mediante el empleo de anticuerpos especficos marcados con fluorocromos como el
isoticionato de fluorescena (FITC). Esta tcnica se conoce como inmunofluorescencia
directa (IFD).
El objetivo de la prctica es familiarizar al alumno con los mtodos de inmunodiagnstico
primario utilizados en medicina de animales de compaa.
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I. Materiales y equipos
Canine SNAP 4Dx (IDEXX)
Botella de 8 ml de conjugado anti-HW/AP/LY/EC:HRPO
Soporte de reactivos
Pipetas cuentagotas
Tubos de ensayos
Dispositivos SNAP
Suero canino positivo para Ehrlichia, Anaplasma o Borrelia
Micropipetas automticas y puntas para 10, 200 y 1000 ul
Impronta de cerebro positivo para rabia
Microscopio de inmunofluorescencia
II. Procedimiento
A) Kit para la deteccin de antgeno de Dirofilaria immitis, anticuerpos frente a
Anaplasma phagocytophilum Borrelia burgdorferi- Ehrlichia canis (SNAP 4Dx Canino)
1) Equilibrar a temperatura ambiente durante 30 minutos
2) Con la pipeta del kit verter 3 gotas de muestra en un tubo de ensayo nuevo
3) Agregar 4 gotas de conjugado al tubo de ensayo sosteniendo la botella en posicin
vertical
4) Tapar el tubo de ensayo y mezclarlo a fondo invirtindolo entre 3 y 5 veces
5) Colocar el dispositivo sobre una superficie horizontal. Agregar todo el contenido
del tubo de ensayo en el pocillo de muestras (Ver figura abajo). La muestra fluir a
travs de la ventana de resultados, alcanzando el crculo de activacin en unos 30
60 segundos.
6) En cuanto la muestra aparezca en el crculo de activacin, presione con fuerza el
activador hasta que quede alineado con el cuerpo del dispositivo.
7) Leer los resultados del anlisis cuando hayan pasado 8 minutos. Ver el cuadro a
continuacin para la interpretacin de los datos.
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Imgenes del
test
test positivo
3 6 semanas desde la
exposicin. Si el perro es
sintomtico y el test es
negativo,
confirmar
resultado con PCR (en fase
aguda todava no hay
anticuerpos)
5 7 meses tras la
exposicin
Especificidad: 100%
Detecta Anticuerpo contra:
- Borrelia burgdorferi
Sensibilidad: 98.8%
3-6 semanas
exposicin
tras
la
1-3 semanas
exposicin
tras
la
Especificidad: 100%
Detecta Anticuerpo contra:
- Ehrlichia canis
Sensibilidad: 96.2%
Especificidad: 100%
Fuente IDEXX
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Mesa:
Fecha:
Integrantes:
tems a desarrollar:
Introduccin (Breve marco terico)
Metodologa
Resultados y discusin
Conclusiones
Referencias bibliogrficas (Estilo Vancouver)
Cuestionario:
1. Cul es el fundamento de las pruebas de diagnstico rpido tipo SNAP?
2. En las pruebas serolgicas, qu es un anticuerpo secundario?
3. Grafique las diferentes etapas de la tcnica de IFD desarrollada en la
sesin
4. En la prueba de inmunofluorescencia, qu es un fluorocromo y para
que sirve?
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I. Materiales
Antgeno Brucella abortus + Rosa de Bengala
Placa de vidrio para aglutinacin
Suero obtenido de bovinos positivos a Brucella abortus
Platos de inmunodifusin radial (IDR)
Sueros de referencia para kit IDR
Sueros de alpacas para la cuantificacin
Capilares
Lminas portaobjetos
Agar noble / Agarosa
Placas Petri
Pipetas automticas de 200 ul
Puntas de 200 ul
III. Procedimiento
A) Prueba de rosa de bengala (Brucella abortus)
1) Llevar las muestras de suero y de antgeno a temperatura ambiente (22 + 4C).
2) Colocar 25-30 l de cada muestra de suero en una baldosa blanca, placa esmaltada
o de plstico, o en una placa para aglutinacin.
3) Agitar suavemente la botella de antgeno, y colocar el mismo volumen de antgeno
prximo a la gota de suero.
4) Inmediatamente despus de aadir la ltima gota de antgeno en la placa, mezclar
cuidadosamente el suero y el antgeno hasta producir una zona circular u oval de
aproximadamente 2 cm de dimetro.
5) La mezcla se agita suavemente durante 4 minutos a temperatura ambiente en un
agitador circular o manualmente.
6) Comprobar la aglutinacin tan pronto como se completa el perodo de 4 minutos.
Cualquier reaccin visible se considera positiva.
7) Lectura:
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Reaccin negativa: Suspensin uniforme sin cambio visible alguno, tal como se
presenta en el control negativo.
Reaccin
positiva:
Aglutinacin
dbil
intensa,
fcilmente
visible
macroscpicamente.
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Mesa:
Fecha:
Integrantes:
tems a desarrollar:
Introduccin (Breve marco terico)
Metodologa
Resultados y discusin
Conclusiones
Referencias bibliogrficas (Estilo Vancouver)
Cuestionario:
1. Cul es la diferencia entre una precipitacin y una aglutinacin?
2. Qu es el fenmeno de prozona?
3. Cules son las principales ventajas y desventajas de la prueba Rosa de
Bengala en el diagnstico de brucelosis?
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REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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