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OBJETIVOS
INFORMACION GENERAL
Las plantas verdes y algunos microorganismos que abundan en la superficie terrestre llevan a cabo un
proceso llamado fotosntesis, por el cual, mediante la energa solar, transforman el bixido de carbono en
carbohidratos como la glucosa y su polmero el almidn, que son compuestos con alto contenido en energa
qumica y, por ello, estos seres vivos son productores primarios de los ecosistemas. La glucosa formada es
utilizada por ellos mismos y por otros seres vivos durante el proceso de respiracin, en el cual se oxida hasta
CO2 y H2O, obteniendo as la energa necesaria para llevar a cabo sus diversas funciones.
Para atrapar la energa solar e iniciar el proceso de transformacin de energa luminosa a energa qumica, las
plantas superiores contienen en sus clulas un organelo llamado cloroplasto, en donde se encuentran los
llamados centros de reaccin, formados por protenas y diversos pigmentos, en especial las clorofilas. Las
clorofilas a y b se encuentran en las plantas y las bacterioclorofilas a o b se encuentran en las bacterias
fotosintticas. Adems de estas molculas, los organismos fotosintticos tienen otros pigmentos con
capacidad para absorber luz. Los pigmentos accesorios incluyen por ejemplo a los carotenos, xantofilas,
antocianinas y otras molculas con colores caractersticos.
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Estas sustancias son coloridas por el nmero elevado de dobles ligaduras conjugadas que poseen, lo que
permite que las excite la radiacin con longitud de onda en la regin del visible. La clorofila absorbe bien en
la regin del rojo y el azul y muy poco en la zona del verde. Las plantas que contienen clorofila son verdes
porque la luz verde se refleja, no se absorbe.
Estos pigmentos no son solubles en agua, pero pueden extraerse con solventes orgnicos cuando las clulas
que los contienen se rompen. Los extractos tienen, adems de pigmentos, grasas y algunos otros compuestos
incoloros. Entre los tipos de pigmentos ms solubles en solventes orgnicos, se encuentran las clorofilas
(azul-verde) y los carotenoides (amarillo-naranja). Algunos colores rosas y rojos en las plantas (por ejemplo
en el betabel, la col morada, la jamaica y en las flores) se deben a xantocianinas, las cuales si son solubles en
agua y no se extraen con solventes orgnicos.
Mtodos cromatogrficos
Los mtodos cromatogrficos son mtodos de separacin que involucran la transferencia reversible de un
compuesto que est adsorbido en una fase estacionaria (adsorbente) a una fase mvil (solvente) que fluye a
travs de la fase estacionaria.
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La separacin surge de las interacciones mutuas de componentes de una muestra, solvente y adsorbente. El
adsorbente est presente en un gran exceso, con una gran superficie y con sitios polares capaces de unir
reversiblemente pequeas concentraciones de sustancias por un proceso esencialmente electrosttico. El
solvente compite con los componentes de la muestra por los sitios de unin. Estos componentes son
desplazados reversible y continuamente en la direccin del flujo del solvente. El proceso descrito puede
escribirse como un equilibrio competitivo en donde hay una particin de los componentes entre la fase
estacionaria y la fase mvil:
componentes-adsorbente
solvente-adsorbente
componente-solvente
Entre ms polar sea un compuesto, ms fuertemente se adsorbe en la fase estacionaria, por lo que su
migracin a lo largo de ella es menor, siendo eludo (arrastrado) ms lentamente por la fase mvil, que los
compuestos menos polares. De este modo, la separacin selectiva de los componentes de una muestra, por
cromatografa, se debe a las diferencias en la migracin de los componentes individuales a lo largo de la fase
estacionaria.
En la cromatografa en fase lquida se usa una fase mvil (lquida) y una fase estacionaria (slida), siendo los
adsorbentes ms comunes la slica gel (SiO2.H2O), almina (A2O3) y celulosa.
La distribucin de los componentes entre la fase slida y lquida es determinada, adems de por la polaridad
propia de cada compuesto, por el grado de actividad del adsorbente (el cual depende principalmente del grado
de hidratacin y de la polaridad del solvente).
El principal factor para controlar el movimiento de los diferentes compuestos en un cromatograma es la
polaridad del solvente. Una lista de los solventes ms usados en los diferentes tipos de cromatografa, en
orden de polaridad creciente, se indica en la Tabla 1. Entre ms polar sea un solvente, ms rpido es el
movimiento de los compuestos y menos efectiva la separacin.
Menos polar
Ms polar
Hexano
Tolueno
Cloruro de metileno
Cloroformo
ter
Acetato de etilo
Acetona
Propanol
Etanol
Metanol
Agua
cido actico
Cromatografa en columna
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polar que disuelva a la muestra y que permita el movimiento de los compuestos a una velocidad prctica.
Generalmente es necesario ir cambiando a solventes ms polares para efectuar la elusin de los compuestos,
dependiendo de los grupos funcionales que tengan los componentes de la mezcla. La facilidad de ser eludo
ms rpidamente, depender de la menor polaridad de los grupos funcionales, como se muestra en la Tabla 2.
El cambio de solventes debe efectuarse gradualmente, mediante mezclas de los solventes (5 a 10% del
solvente siguiente en polaridad), para evitar que se alteren las zonas que ya han sido desarrolladas
(separadas).
Las sustancias demasiado polares, como azcares o aminocidos, no pueden separarse de sus mezclas por
cromatografa en columna, ya que con los adsorbentes anteriormente mencionados no pueden utilizarse agua
o cido actico porque, con estos solventes demasiado polares, el equilibrio componentes-adsorbente se
desplaza hacia el de solvente-adsorbente y de ah al de componentes-solvente y, de esta manera, todos los
componentes de la mezcla se eluyen simultneamente.
VELOCIDAD
menos polar
RAPIDEZ DE ELUSIN
ms rpido
ms polar
ms lento
GRUPO FUNCIONAL
alcanos
halogenuros de alquilo
alquenos
dienos
hidrocarburos aromticos
halogenuros aromticos
teres
steres
cetonas
aldehdos
aminas
alcoholes
fenoles
cidos carboxlicos
cidos sulfnicos
En la prctica, los pasos de desarrollo y elusin frecuentemente son distinguibles, ya que la banda que se
mueva ms rpido puede empezar a emerger de la columna antes de que se complete la separacin de las
bandas que se mueven ms lentamente.
Frecuentemente, los compuestos a separar en la mezcla son incoloros por lo que no pueden verse las bandas.
En este caso se recolectan fracciones de volumen pequeo. se evapora el solvente y los residuos se comparan
por cromatografa en placa delgada para determinar cules fracciones tienen igual composicin y pueden ser
reunidas.
La columna se prepara en un tubo de vidrio que, en uno de sus extremos, lleva una llave de paso (puede
utilizarse una bureta). El adsorbente se sostiene en un disco de vidrio poroso o un tapn de algodn o lana de
vidrio cubierto con una capa de arena para retener partculas finas. La relacin usual de dimetro de la
columna a altura del adsorbente es aproximadamente de 1 a 10 y debe haber suficiente espacio adicional en la
columna para permitir que haya solvente arriba del adsorbente. Si el tubo tiene un dimetro de 1 cm o mayor,
se llena parcialmente con el solvente que se vaya a usar para disolver la muestra. Se aade el adsorbente, ya
sea seco, dejndolo caer como un chorro muy fino, o bien, suspendindolo en un vaso de precipitados con el
mismo solvente y aadiendo la suspensin a la columna. Mientras se aade el adsorbente, debe mantenerse
entreabierta la llave de la columna para que el solvente siga fluyendo lentamente. Si la columna tiene un
dimetro menor a 1 cm (como las usadas en tcnicas de microescala, en las que se puede usar una pipeta
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Pasteur como columna)) no se pone solvente y el adsorbente se aade en seco. En cualquiera de los casos, la
columna debe ser compacta y uniforme; una columna no uniforme, en la que haya capas disparejas de
adsorbente, cuarteaduras o burbujas, no es utilizable. Arriba del adsorbente se coloca una pequea capa de
arena para prevenir que la parte superior del adsorbente sea alternada. El exceso de solvente es drenado de la
columna, justo hasta arriba del adsorbente y entonces se aade, usando una pipeta Pasteur, la muestra disuelta
en un volumen mnimo de solvente. La muestra debe adsorberse en la zona ms angosta posible, ya que las
bandas se vuelven ms difusas a medida que la columna se desarrolla. Al llevar a cabo un cromatograma es
importante mantener siempre el nivel de solvente arriba de la columna de adsorbente para prevenir la
formacin de cuarteaduras en el adsorbente.
Las mezclas complejas de pigmentos de plantas presentan un gran problema de separacin. Generalmente la
separacin completa de todos los pigmentos de un extracto no se logra en un solo cromatograma; por
ejemplo, las diferentes clorofilas pueden separarse utilizando azcar pulverizada como adsorbente pero la
separacin de carotenos, menos polares, requieren de un adsorbente ms activo. Esta separacin fina no se
llevar a cabo en esta prctica.
En las condiciones de separacin usadas en esta prctica ocurren algunos cambios en los pigmentos ms
sensibles durante la extraccin y cromatografa, logrndose nicamente una separacin parcial; adems, los
compuestos incoloros se detectaran en el residuo si se evaporaran las fracciones. En este caso no se analizar
la pureza de las fracciones para comprobar que la separacin fue completa; sin embargo, los principios del
mtodo si podrn ser observados.
Los resultados de esta cromatografa dependern de variables como la fuente de los pigmentos, la eficiencia
de la extraccin, la actividad de la almina utilizada como adsorbente, las dimensiones de la columna, los
volmenes de cada solvente y las mezclas de cada solvente utilizadas en el desarrollo. Cambios muy
pequeos en algunos de estos factores pueden afectar la separacin e incluso causar cambios en las posiciones
individuales de los pigmentos en el cromatograma.
Ya que es imposible especificar todas estas variables, no importa que tan detallado sea el procedimiento
indicado para llevar a cabo el cromatograma, no en todos los casos se obtendrn resultados ptimos. En el
procedimiento dado en la parte experimental, se sugiere una secuencia general de cambio de solventes y
recoleccin de fracciones pero los detalles dependern del cromatograma individual. El principal objetivo es
obtener tantos pigmentos individuales como sea posible en tubos de ensaye separados.
Espectroscopa de absorcin
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- Espectroscopa de resonancia magntica nuclear, que da informacin sobre el entorno de todos los tomos
de hidrgeno de la molcula en estudio y, por lo tanto, sobre la estructura de la cadena aliftica y/o aromtica
y sobre los grupos funcionales cercanos a los hidrgenos.
- Espectrometra de masas, tcnica en la que se bombardean las molculas con electrones para romperlas. El
anlisis de las masas de los fragmentos obtenidos da informacin sobre el peso molecular, los heterotomos y
los grupos funcionales presentes en la molcula original.
El espectro electromagntico incluye todas las posibles frecuencias, desde cero hasta infinito. En la prctica,
el espectro abarca desde frecuencias muy bajas, como las de radio utilizadas para la comunicacin con
submarinos, hasta frecuencias muy altas, como las de los rayos gama. La Tabla 3 muestra la frecuencia, la
longitud de onda y las relaciones de energa de las diversas zonas del espectro electromagntico.
mayor frecuencia
menor longitud de onda
longitud de
onda
10-10 m
regin del
espectro
rayos gama
energa por
mol
106 kcal
efectos
moleculares
10-8 m
rayos X
104 kcal
ionizacin
102 kcal
10-6 m
Ultravioleta
lejano
Ultravioleta
cercano
Visible
10-4 m
Infrarrojo
1 kcal
10-2 m
Microondas
10-4 kcal
10 0 m
Radio
10-6 kcal
102 m
transiciones
electrnicas
color
10 kcal
vibraciones
moleculares
movimiento
rotacional
transiciones en
el spin del
electrn
El espectro electromagntico es continuo y la posicin exacta de la divisin entre cada regin es ms o menos
arbitraria. En la parte superior se encuentran las frecuencias ms altas y, por lo tanto, longitudes de onda ms
cortas y mayor energa. En la parte inferior se encuentran las frecuencias menores y, por lo tanto, longitudes
de onda mayores y menor energa.
Las molculas orgnicas sufren diferentes efectos de acuerdo a la energa de la radiacin que incide sobre
ellas: Si se utilizan ondas de radio de baja frecuencia, se puede modificar el spin de los electrones, en especial
el del hidrgeno, lo que aprovecha la tcnica de NMR. La energa en la regin de las microondas permite la
rotacin de las molculas. En la regin del infrarrojo hay vibracin de los enlaces entre los tomos de una
molcula. En el ultravioleta los electrones se excitan y pasan a niveles de energa ms altos dentro de las
molculas. Los rayos X tienen tanta energa que excitan los electrones por encima de los niveles de energa
del enlace y permiten la ionizacin de la molcula.
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En la prctica # 1 se puede utilizar la espectroscopa de infrarrojo para determinar la presencia de los grupos
funcionales en una muestra problema. En esta ocasin, utilizaremos la espectroscopa de ultravioleta-visible,
nicamente en la regin de visible, para determinar las longitudes de onda de absorcin de algunos de los
pigmentos de plantas, que fueron separados por cromatografa en columna. Posteriormente se verificarn los
resultados con los datos reportados en la literatura.
La excitacin de los electrones de una molcula orgnica puede requerir desde 40 a 300 kcal/mol. Las
longitudes de onda correspondientes a estas energas abarcan la regin del visible (400-800 nm), el
ultravioleta cercano (200-400 nm) y el ultravioleta lejano (100-200nm). La informacin ms til se obtiene
de los electrones y los pares de electrones no compartidos, pues estos enlaces son ms dbiles y requieren
menos energa (y mayor longitud de onda) para pasar del estado basal al estado excitado.
En especial en los alquenos, el fotn absorbido corresponde a la energa requerida para la transicin *.
A estos grupos que facilitan la absorcin de energa para la transicin electrnica se les llama cromforos. Si
el alqueno est conjugado, y entre mayor sea el nmero de dobles enlaces conjugados, la energa requerida
para llevar a cabo esta transicin disminuye (y la longitud de onda aumenta), como puede observarse en la
siguiente tabla:
nombre
etileno
1,3-butadieno
1,3,5-hexatrieno
1,3,5,7-octatetraeno
estructura
CH2=CH2
CH2=CH-CH=CH2
CH2=CH-CH=CH-CH=CH2
CH2=CH-CH=CH-CH=CH-CH=CH2
(nm)
165
217
268
290
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Tubo 3. Fraccin de polaridad baja, de color verde, eluda con cloruro de metileno.
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Tubo 4. Fraccin de polaridad media, de color amarillo, eluda con acetato de etilo.
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Nombres:
Equipo:
TCNICA EN MICROESCALA:
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Grupo:
PREGUNTAS PARALELAS:
36
37
38
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HOJA DE RESULTADOS
Nombres de los integrantes del equipo:
# de equipo:
Grupo:
Solvente
Color e
intensidad del color
de la fraccin
Volumen
aproximado
de la fraccin
max 1
max 2
max 3
max 4
max 5
max 6
max 7
max 8
PREGUNTAS DE PRELABORATORIO
1.
El contenido de agua en los tejidos de plantas es muy elevado. Tomando esto en cuenta, explique porqu
la extraccin de pigmentos se lleva a cabo en metanol y luego se pasan al hexano. Sera conveniente
extraer directamente con hexano?
2.
Cul sera el efecto en los resultados de la cromatografa en columna si ocurriera alguno de los
siguientes errores:
a) Al aadir la muestra a la columna se usa una cantidad excesiva de solvente.
b) No se mantiene el nivel del solvente arriba del adsorbente y la columna se agrieta.
c) No se elimina completamente el metanol del extracto de pigmentos antes de hacer la cromatografa.
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3.
4.
5.
Responda a la pregunta 15-21 de la pgina 712 del captulo 15 del libro Qumica Orgnica de Wade.
(La copia de la informacin necesaria est incluida en el manual de este laboratorio).
El extracto de las plantas, adems de pigmentos contiene compuestos incoloros. Explique qu hara para
detectar estos compuestos y tener una buena separacin entre estos compuestos y los pigmentos.
2.
3.
4.
5.
Busque en el Merk Index u otro manual las max de los - y -carotenos y de las los - y -clorofilas.
6.
Qu informacin dan los datos espectroscpicos de los componentes separados en esta cromatografa?
Compara los datos experimentales de la tabla 2 con los valores reportados (pregunta 5)? Qu
conclusiones pueden sacarse de esta informacin respecto a la identidad y pureza de los compuestos
separados?
REPORTE
1.
2.
3.
BIBLIOGRAFIA
Wilcox, Jr. Charles F. & Wilcox, Mary F.; Experimental Organic Chemistry. A Small-Scale Approach,
2nd. Ed., Prentice-Hall, New Jersey, USA, 1995. pp. 122-145 y UV 154-162.
Mayo, Dana W., Pike, R. M. & Trumper Peter K., "Microscale Organic Laboratory with Multistep and
Multiscale Syntheses", 3rd. Ed., John Wiley, USA, 1994. pp. 97-101.
Williamson, Kenneth L., "Macroscale and Microscale Organic Experiments", 2nd. Ed., Heath and
Company, USA, 1994. pp. 170-182.
Eaton, David C., "Laboratory Investigations in Organic Chemistry", McGraw-Hill, USA, 1989. pp. 127139.