UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN

MARCOS
FACULTA DE QUIMICA E INGENIERIA QUIMICA
E.A.P. INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

BIOTOXINAS MARINAS

CURSO:
TOXICOLOGIA

o
PROFESOR:
o

OSCAR SANTIESTEBAN ROJAS

INTEGRANTES:
o
o
o
o

INGA CACERES, WILLIAMS. (11070154)

LLATAS DELGADO FRAN JOEL. (11070061)
TANTA VILLAGARAY, MONICA. (10070164)
VILLENA ANDRES, MIGUEL. (10070210)

VIERNES 5 9PM

TURNO:

VIERNES 12 DE SETIEMBRE DEL 2014

BIOTOXINAS MARINAS

INDICE
1.

RESUMEN.........................................................................................3

3.

OBJETIVOS........................................................................................4

4.

MARCO TERICO...............................................................................4
4.1.
4.2.
4.3.
4.4.
4.5.

BIOTOXINAS MARINAS.............................................................................4
TOXINA PARALIZANTE DE LOS MOLUSCOS (PSP)- MAREA ROJA.......5
INTOXICACIN DIARREICA DE LOS MOLUSCOS (DSP).........................6
INTOXICACIN NEUROTXICA DE LOS MARISCOS (NSP)....................6
INTOXICACIN AMNSICA DE LOS MARISCOS (ASP)...........................6

4.6.

CIGUATERA................................................................................................. 7

4.5.1. Sntomas................................................................................... 6
4.6.1. Sntomas................................................................................... 7

4.7.

TETRADOTOXINA.......................................................................................7

4.7.1. Sntomas................................................................................... 7

4.8.
DETERMINACION DE LAS TOXINAS.........................................................7
4.9. PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIN DE NITRGENO BSICO
VOLTIL................................................................................................................ 8

4.9.1. Fundamento.............................................................................. 8

5.

MATERIALES Y REACTIVOS...............................................................10

6.

PROCEDIMIENTO (MOLUSCOS BIVALVOS)..........................................10

6.1.
6.2.

EXPERIENCIA N1:..................................................................................10
EXPERIENCIA N2:..................................................................................12

6.2.1. Fundamento............................................................................12
6.2.2. Instrumental...........................................................................13
6.2.3. Reactivos................................................................................. 14
6.2.4. Indicador................................................................................. 14
6.2.5. Procedimientos......................................................................14

7.

RESULTADOS...................................................................................15

8.

DISCUSIN DE RESULTADOS.............................................................19

9.

CONCLUSIONES...............................................................................20

10.

RECOMENDACIONES.....................................................................20

11.

BIBLIOGRAFA..............................................................................21

12.

ANEXO.........................................................................................21

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

BIOTOXINAS MARINAS
1. RESUMEN
La primera practica consiste en la determinacin de biotoxinas en mariscos
mediante el bioensayo con ratones machos de peso 20g y 30g, se prepar
un extracto de musculo de mejillones luego se acidifico con HCl 0.1N y
luego se calent con la finalidad de estabilizar toxinas y desnaturalizar
protenas en el extracto. Luego se centrifugo, el sobrendate que se
obtuvo se aplic al reactivo biolgico en ampollas de 1ml por va
intraperitoneal, de las aplicaciones, el primero en el ratn de bajo peso
se aplic de manera correcta a los primeros minutos se observ efectos en
el cmo picazn, dolores ventrales, Descoordinacin motora, complicacin
al respirar, disminucin motora ,estos dos ltimos efectos se observ en
los minutos 5 y 7 , luego de 15 minutos el ratn empez a mostrar signos
de recuperacin de la actividad motora, por lo que no se concluy su
muerte. En el ratn de peso mayor sea aplico mal el extracto acido,
aunque si se hubiera colocado de la manera correcta tambin habra
presentado una alta probabilidad de vivir, ya que los de mayor pesos son
ms resistentes a la dosis de toxinas en fin los factores que evitaron la
mortandad de los roedores fueron el peso , sexo y el estado de los
mejillones en este caso
fueron frescos con bajo contenido de
contaminantes. Para esta prctica se recomienda trabajar con ratones que
cumplan las caractersticas que registra la gua, saber aplicar la inyeccin
en el
roedor y
usar mejillones contaminados, ya que permitirn
determinar mejor el clculo de toxicidad para luego comparar con tablas,
como el de sommer-mayer.
En la prctica de N.B.V de pescado se aplic el mtodo por destilacin de
arrastre de vapor donde se coloc en un baln Kjendahl 10 g de la muestra
preparada, y se agreg 2 g de Mg (OH) 2, 300 mL de agua, unas gotas de
antiespumante. Calentamos el baln, hasta destilar por arrastre con vapor
de agua todas las bases voltiles, las que recogimos en una solucin de
cido brico. A un matraz de Erlenmeyer de 250 mL aadimos 50 mL de
solucin de cido brico al 2% y varias gotas del indicador. Se conect el
aparato y colocamos el Erlenmeyer receptor de tal manera que la punta o
extremo del refrigerante qued sumergido en la solucin de cido brico. Se
calent el baln Kjendahl de manera tal que el lquido contenido entre en
ebullicin en exactamente 10 min. Luego de destilar durante 25 min
mantuvimos la misma intensidad de calentamiento. Enjuagamos el
refrigerante con agua destilada recogiendo tambin en el matraz
Erlenmeyer. No obstante este mtodo tiene limitaciones en su uso, porque
solo reflejan la prdida del grado de frescura del pescado en estadios
avanzados de deterioro, y son generalmente poco fiables para medir
adecuadamente el grado de frescura del pescado almacenado en hielo
durante los primeros das , por tal motivo no se obtuvo el % adecuado de
recuperacin de bases absorbida en la solucin acida, evitando su
valoracin y calculo en esta prctica no se recomienda trabajar con
pescado congelado ms de 12 das ya que este es un factor que limita la
aplicacin del destilado por arrastre de vapor.

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BIOTOXINAS MARINAS

2. INTRODUCCION:
Las biotoxinas marinas son sustancias txicas acumuladas en los
organismos marinos, principalmente por ingestin de fitoplancton, es decir,
algas microscpicas capaces de producir dichas toxinas. Los moluscos
bivalvos, los equinodermos, los tunicados y los gasterpodos marinos, con
origen en la pesca, marisqueo o la acuicultura, son susceptibles de
acumular biotoxinas y de ser consumidos por el ser humano. Los episodios
txicos que constituyen en nuestro mbito geogrfico un problema de salud
pblica se producen como incremento significativo de la concentracin de
una poblacin de alguna de las especies txicas en las aguas marinas, de tal
manera que se origine una acumulacin de biotoxinas en los organismos
marinos o exista una alta probabilidad de que sta se produzca. Los
moluscos que estn ms frecuentemente implicados son las almejas, los
mejillones y, ocasionalmente, las vieiras y las ostras. En este grupo de
moluscos se han descrito las intoxicaciones paralizante (PSP), diarreica
(DSP), neurotxica (NSP) y amnsica (ASP). Todas las toxinas son de
naturaleza no proteica y extremadamente estables. As, el cocinado,
ahumado, secado o salado no las destruye, y tampoco puede determinarse
por el aspecto del producto si el alimento es o no txico.
3. OBJETIVOS
o

Realizar la prueba de bioensayo de ratn para descartar la presencia

de toxinas en mariscos

Determinar el grado de frescura de una muestra de pescado

mediante la prueba de determinacin del Nitrgeno Bsico Voltil
(N.B.V) a travs del Mtodo de Antonacopoulus.

4. MARCO TERICO
4.1.

BIOTOXINAS MARINAS

Las biotoxinas marinas son responsables de un nmero importante de

enfermedades asociadas a los productos pesqueros. Entre ellas pueden
citarse: la intoxicacin paralizante por moluscos (PSP), la intoxicacin
diarreica por moluscos (DSP), la intoxicacin neurotxica por moluscos
(NSP), la intoxicacin amnsica por moluscos conocida tambin como
intoxicacin por cido domoico (ASP), la ciguatera y la tetradotoxina.

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BIOTOXINAS MARINAS
En general, estas toxinas son producidas por algas del fitoplancton
(diatomeas, dinoflagelados). No todos los dinoflagelados del plancton
marino elaboran toxinas. Los moluscos bivalvos que se alimentan por
filtracin de agua, incorporan el plancton y acumulan la toxina. En el caso
del caracol de mar (no es filtrador sino predador), acumula la toxina al
alimentarse con bivalvos txicos. El hombre al ingerir moluscos txicos
manifiesta un cuadro de intoxicacin cuya gravedad depender de la
cantidad de toxina ingerida.
La toxina es resistente a altas temperaturas (resiste la coccin casera),
estable en medio cido (vinagre, limn), no genera inmunidad y no se
conoce antdoto. Los moluscos txicos no pueden identificarse por
evaluaciones organolpticas ya que la toxina no altera su color, olor ni
sabor.
4.2.
TOXINA PARALIZANTE DE LOS MOLUSCOS (PSP)- Marea
Roja
Producida por dinoflagelados del gnero Alexandrium, Gymnodinium y
Pyridinium.
Los dinoflagelados tienen la capacidad de enquistarse y depositarse en el
fondo marino cuando las condiciones ambientales son adversas. Frente a
condiciones favorables (temperatura del agua, luz, salinidad, presencia de
nutrientes) pierden su cobertura protectora y desarrollan un ciclo
reproductivo exponencial llamado florecimiento.
Comnmente se la conoce como Marea Roja debido a la descoloracin del
agua de mar donde se ha producido la multiplicacin del plancton. Sin
embargo, no siempre las mareas rojas txicas estn acompaadas con la
presencia de color en el agua y tambin .se han reportado casos de
florecimientos de especies inocuas que producen descoloraciones.
Foto de Alexandrium catenella (Fuente:
Instituto de Fomento Pesquero de Chile
http://www.ifop.cl/marearoja/index.cfm
)

Foto de Gymnodinium catenatum

(fuente Instituto Nacional de Pesca del
Uruguay
(http://www.inape.gub.uy/)

Los moluscos alimentados de dinoflagelados txicos pueden retener la

toxina por perodos variables de tiempo, algunos son txicos durante el
florecimiento y otros durante muchos aos. Sntomas (segn la gravedad)
pueden aparecer luego de 20 o 40 minutos de la ingestin, e incluso en
algunos casos 5 minutos despus. Parlisis perifrica, sensacin de
hormigueo, somnolencia, entumecimiento, movimientos voluntarios con
dificultad, ataxia e incoordinacin, reflejos normales y mente clara, vrtigo,
sensacin constrictiva en garganta, andar tambaleante, cefalea, aumento
5

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BIOTOXINAS MARINAS
de la secrecin salivar, taquicardia, sed intensa, ligera hipotermia, visin
borrosa, vmitos, diarrea, dolor abdominal.
Muerte (12 horas) por parlisis respiratoria y colapso cardiovascular.
4.3.

INTOXICACIN DIARREICA DE LOS MOLUSCOS (DSP)

Producida
por
dinoflagelados
del
gnero
Dinophysis
y
AurocentrumSntomas. Aparecen de 30 minutos hasta 12 horas despus del
consumo de mariscos alimentados de algas txicas. Los pacientes tienen
diarrea, nuseas, vmitos, dolor abdominal y escalofros. Las vctimas se
recuperan dentro de los 3 a 4 das, sin dejar secuelas.

4.4.

INTOXICACIN NEUROTXICA DE LOS MARISCOS (NSP)

Producida por el dinoflagelado Ptychodiscus breve.

Esta intoxicacin est causada por las breves toxinas de las que han sido
diferenciadas por lo menos nueve. Parece ser que las toxinas actan
fijndose a los nervios y abriendo los canales de los iones de Na en
circunstancias en las que normalmente estaran cerrados, originando varios
efectos neurotxicos en las personas.
Los sntomas aparecen poco despus del consumo del marisco txico y
generalmente remiten en un plazo de horas, a lo sumo, transcurridos unos
pocos das. Consisten en hormigueo y entumecimiento de los labios, de la
lengua, de la garganta y de la zona perioral, dolores musculares, trastornos
gastrointestinales y vrtigo. En esta intoxicacin tampoco se han descripto
secuelas. Raramente es fatal.
4.5.

INTOXICACIN AMNSICA DE LOS MARISCOS (ASP)

Debida al cido domoico, un aminocido producido por la diatomea

Pseudonitzschia pungens.
A esta intoxicacin se le denomina generalmente intoxicacin por cido
domoico, ya que este cido es la nica toxina que se sabe est implicada.
En dosis bajas, este compuesto originara trastornos gastroentricos, pero
en dosis ms elevadas puede ocasionar una lesin grave a clulas
cerebrales provocando sntomas neurolgicos que incluyen la prdida de
memoria. El cido domoico interrumpe la transmisin neuroqumica normal
en el cerebro fijndose a los receptores de glutamato, hecho que causa la
mayor excitacin de las neuronas y la rotura final de las clulas. Por esta
razn, es una toxina nociva que puede provocar la muerte cuando se ingiere
en dosis elevadas.

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BIOTOXINAS MARINAS

4.5.1.

Sntomas

Los sntomas incluyen nuseas, vmitos,

espasmos abdominales, diarrea, cefalalgia,
anorexia, prdida de equilibrio, vrtigo y
prdida de memoria. En la mayora de los
casos, los sntomas son benignos y
desaparecen a las 24 horas, pero en algunos
pacientes de edad avanzada los efectos han
persistido durante varios meses.
4.6.

CIGUATERA

Producida
principalmente
por
dinoflagelado Gambierdiscus toxicus.

el

Este dinoflagelado crece alrededor y en el interior de los arrecifes tropicales

de coral. El envenenamiento por ciguatera resulta de la ingestin de
pescados de aguas tropicales o clidas alimentados con este dinoflagelado.

4.6.1.

Sntomas

Gastrointestinales y neurolgicos. Pueden durar 2 o 3 das o persistir por

semanas. La muerte puede producirse por colapso nervioso.
4.7.

TETRADOTOXINA

No es producida por algas. La tetradotoxina se encuentra en el hgado,

ovarios e intestinos varias especies de pez globo, siendo los ms txicos los
de la familia Tetraodontidae, pero no todas las especies de esta familia
contienen la toxina. El mecanismo por el cul la toxina es producida es
desconocido, aunque aparentemente estaran involucradas bacterias.
4.7.1.

Sntomas

Aparecen de 10 a 45 minutos despus de la ingesta.

Hormigueo en rostro, extremidades, parlisis, colapso respiratorio y
cardiovascular.
4.8. DETERMINACION DE LAS TOXINAS
En algunos pases, la vigilancia de las aguas permite dar el primer aviso de
mariscos potencialmente txicos.
Esto se consigue mediante la observacin directa del color del agua (marea
roja), examen microscpico del fitoplancton para identificar las especies
sospechosas e incluso monitoreo de manchas marinas con tecnoloa
satelital.
7

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BIOTOXINAS MARINAS
Desde el punto de la salud pblica, la clave de la determinacin es la
concentracin de toxinas en los pescados o en los mariscos. Esto requiere el
muestreo y el anlisis de animales indicadores o de animales
representativos. Los mejillones son con frecuencia los animales indicadores
de eleccin ya que manifiestan una captacin de toxinas ms rpida, pero
se puede analizar otro marisco por razn de su importancia comercial o por
la especificidad de la toxina implicada. La prueba ms universal es el
bioensayo del ratn y en la mayora de los casos es la nica prueba
legalmente admisible para la suspensin de la captura. En los ltimos aos,
los anlisis qumicos han adquirido una gran aceptacin porque son ms
rpidos, ms exactos y, desde el punto de vista social, menos censurables
que las pruebas animales.
Los mtodos especficos de anlisis de la toxina paralizante y neurotxica,
se encuentran en la AOAC (1984) y en la FDA (1989). Estos mtodos
suponen la extraccin de las toxinas del marisco, la separacin de las
protenas y otras sustancias interferentes y la inyeccin del extracto por va
intraperitoneal a ratones. Los resultados se evalan como unidades ratn
ug/100 g del tejido del marisco.
4.9.
PROCEDIMIENTO
PARA
NITRGENO BSICO VOLTIL

LA

DETERMINACIN

DE

La frescura de la merluza, merluccius merluccius hubbsi, ya sea entera o en

filetes es evaluada, a priori, por medio de la observacin de las
caractersticas organolpticas. Ya que sta puede estar afectada por la
subjetividad del observador, se realiza la determinacin de las Bases
Voltiles Totales.
El personal de laboratorio de una planta pesquera debera realizar, segn el
tamao de produccin, al menos tres determinaciones diarias por medio de
un muestreo representativo de,
Diferentes lotes de materia prima,
Materia prima semi procesada de un da para otro
Diferentes etapas del proceso diario de produccin
Se lleva un registro diario de dichos anlisis, indicando origen, hora,
resultado y observaciones del producto.
El nivel de NBV mximo de cada producto depende de los requisitos del
cliente, el valor mximo admisible para consumo humano en peces magros
es de 30 mg/100 g de muestra. Superado ste se debe decomisar el lote.
El deterioro del pescado desde la muerte se manifiesta en los tejidos
musculares por procesos de degradacin debidos a la accin de enzimas
endgenas y bacterias presentes sobre la piel e intestinos. Se extienden y
multiplican en los tejidos por motivo de un medio favorable, pH elevado y
abundante materia de bajo peso molecular (aminocidos, aminas) dando
lugar a compuestos malolientes, caractersticos en la descomposicin de
productos pesqueros; trimetilaminas, amoniaco, etc.
4.9.1.
8

Fundamento

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BIOTOXINAS MARINAS

La muestra es tratada con oxido de magnesio disuelto en agua, formndose

hidrxido de magnesio.
MgO + H2O => Mg (OH)2
Los iones hidrxidos liberan las bases voltiles de las sales que hubiera.
NH4+ +
HO=>
H 2O +
Catin
Anin
agua
amonio
hidrxido
(CH3)2NH2+ + HOCatin

NH3
amoniaco

=> H2O + (CH3)2 NH

Anin
agua

dimetilamina
dimetilamina
(CH3)3NH+

+ HOCatin

hidrxido
=> H2O
Anin

+ (CH3)3 N
agua

trimetilamina
Trimetilamina hidrxido
Las bases voltiles son destiladas por arrastre con vapor de agua y
recogidas en solucin de cido brico.
Las bases voltiles reaccionan con el cido brico, dando las sales
correspondientes.

NH3
+
H+
=> NH4+
amoniaco
Catin
catin
hidrgeno amonio
(CH3)2NH
+
H+
dimetilamina

=>
(CH3)2 NH2+
Catin
Catin
hidrgeno
dimetilamonio

(CH3)3N
+ H+ =>
(CH3)3 NH+
Trimetilamina
Catin
Catin
hidrgeno
trimetilamonio
Al valorar la solucin resultante con un cido fuerte, ste desplaza al cido
brico de la sal.
H2BO3-

+
H+
=>
H3BO3
Anin
Catin
cido brico
de hidrogeno hidrgeno
borato

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BIOTOXINAS MARINAS

En el punto final, una gota de solucin de cido fuerte hace virar ms al

indicador
5. MATERIALES Y REACTIVOS
Tabla N1: Materiales y reactivos
MATERIALES
REACTIVOS
Ratn blanco (pericote)
Carne de pescado
fresco
Pipetas de 5 y 10 mL
Cortado en cuadraditos
Beaker de 100, 250,
Mariscos (mejillones o
500 mL
similares)
Cocinilla elctrica
HCl 5N y 0,1N
Licuadora
NaOH
Esptula
Mg(OH)2
Tabla de picar
Antiespumante de
Bureta de 10 mL
silicona
Erlenmeyer de 250 mL
cido brico al 2%
Tuberculina 1 mL
cido sulfrico al 0,1N
Rojo de metilo
Verde de bromo cresol

EQUIPOS

Balanza granataria
pH metro
Centrfuga
Equipo de destilacin
simple de conexiones
esmeriladas.

6. PROCEDIMIENTO (Moluscos bivalvos)

6.1.

EXPERIENCIA N1:

EVALUACIN DE LA TOXICIDAD AGUDA POR VA INHALATORIA.

Preparacin de la muestra
o Lavar cuidadosamente el exterior del marisco con agua dulce.
o Abrir cortando el msculo aductor,
o Se lava el interior con agua dulce para eliminar arena y otras
sustancias extraas.
o Se separa la carne de las valvas.
o Se recoge de 100 g y se coloca en un tamiz para dejar escurrir 5 min.
El lquido filtrado se desecha.
o Se procesa en una licuadora hasta consistencia homognea.

10

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BIOTOXINAS MARINAS

Preparacin del extracto cido

o Se coloca 100 g del material bien mezclado en un recipiente
resistente al calor.
o Se aade solucin acuosa 0.1N de HCl: 100 mL.
o Se calienta la mezcla y se hierve suavemente, al hervir controlar 5
min.
o Se deja enfriar,
o Se toma pH del lquido. Debe ser menor de 4.5 con papel medidor del
pH.
o Si se necesita disminuir el pH: utilizar una solucin 5 N HCl gota a
gota.
o Si se necesita aumentar el pH: utilizar una solucin 0.1 NaOH gota a
gota.
o Se traslada la mezcla a una probeta graduada y se completa a 200
mL con agua pura o levemente acidulada.
o Se agita, se coloca en tubos de centrfuga y se centrifuga a 3000 rpm
durante 5 minutos.
o El lquido sobrante es el extracto cido.

Prueba en ratones (Respuesta biolgica- SOMMER- MAYER 1957)

o
o
o
11

Extracto cido de moluscos: pH 3-4

Unidad Ratn: Cantidad de toxina para matar un ratn de 20 g de
peso en 15 min.
Estandarizacin: tiempo de muerte 5-7 min.

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BIOTOXINAS MARINAS
o
o
o

Se utilizan ratones sanos, hembras, de 19- 21 g, cepa CF1. Si pesan

menos de 19 o ms de 21 se aplica el factor de correccin de masa
del mismo (tabla de SOMMER)
Va intraperitoneal: 1 mL de extracto cido. Se anota el momento de
inoculacin y el tiempo de muerte (ltimo movimiento respiratorio).
Si el tiempo de muerte es menor a 5 min de varios ratones, se diluye
con solucin fisiolgica acidulada pH 3 para obtener un tiempo de 5 a
7 min.

Clculo de toxicidad
o
o

Determinar tiempo medio de muerte de los ratones y usar tabla de

SOMMER
Clculo para determinar unidades ratn

VALOR TIEMPO MUERTE * FACTOR DE CORRECCIN DE PESO * 200=

U.R. (si se realizan diluciones se agrega el FACTOR DE DILUCIN)
Tabla N2: Tolerancia y Mtodo de Anlisis de las toxinas.

6.2.

EXPERIENCIA N2:

DETERMINACIN DEL ESTADO DE FRESCURA DE LOS PRODUCTOS DE

LA PESCA POR MEDIO DE LA DETERMINACIN DEL NITRGENO
BSICO
VOLTIL
(N.B.V.)
A
TRAVS
DEL
MTODO
DE
ANTONACOPOULUS.

12

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BIOTOXINAS MARINAS

6.2.1.

Fundamento

Al tratar la muestra con oxido de magnesio disuelto en agua, este pasa a

hidrxido de magnesio, cuyos iones hidroxilos liberan las bases voltiles de
las sales que pudieran existir (amoniaco, dimetil y trimetil amina).
Estas bases voltiles son destiladas por arrastre con vapor de agua y
recogidas en una solucin de cido brico, reaccionando con este cido,
formando las sales correspondientes (cationes amonios, dimetil y trimetil
amonio).
Al valorar la solucin resultante con un cido fuerte, este desplaza al cido
brico de la sal dando el viraje de color del indicador.
6.2.2.
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o

Instrumental

Equipo de destilacin simple con conexiones esmeriladas (Ampolla

para la muestra, puente y refrigerante)
Cocinilla elctrica (manto calefactor)
Trozos de material porosos (perlas de vidrio, cuentas de vidrio)
Erlenmeyer de 250 mL de cuello ancho
Cuchillo para extraer muestra de filete
Tabla de acrlico (tabla para picar verduras)
Vaso de precipitado pequeo (100 o 250 mL)
Varilla de vidrio
Pipetas
Balanza de 0,1 g
Micro bureta de 5 cm3 o bureta comn

Esquema del Equipo para determinacin de NBV

13

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BIOTOXINAS MARINAS

Foto del Equipo para determinacin de NBV

6.2.3.
o
o
o
o
o

Reactivos

Agua destilada
Oxido de magnesio P. A.
Antiespumante de silicona
Solucin de cido brico al 2%
Solucin de cido sulfrico al 0,1 N

6.2.4.

Indicador

Mezclar un volumen de rojo de metilo 0,2% ms 3 volmenes de verde de

bromocresol
0,1%, o en su defecto Tshiro (mezcla de colorantes).
6.2.5.

Procedimientos

Ensayo en blanco
Preparacin de muestra
a) Si se trata de filete se raspa el msculo por el tercio medio inferior
hasta llegar a la piel. Deben obtenerse unos 50 gramos de muestra
que se los mezcla lo mejor posible.
b) Si se trata de pescados enteros se corta un filete del tercio medio y
se raspa como se indic en el paso anterior.
c) Si se trata de pescado congelado se sacan 3 cilindros con el
sacabocado, empleando el taladro elctrico a no menos de 10 cm. de
los bordes y luego se cortan en pedazos no mayores de 1 mm. Deben
obtenerse 50 gramos de muestra.
Proceso

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BIOTOXINAS MARINAS
a) Pesar 10 gramos de pescado.
b) Preparacin para la destilacin: se vierte en el baln 10 g de
pescado ayudados por una varilla, 2 g de xido de magnesio y 1 - 2
gotas de antiespumante de silicona. Luego se hace arrastre con agua
destilada con ayuda de una piseta.
c) Se coloca en un Erlenmeyer 50 mL de cido brico al 2%, un mL de
indicador y 100
mL de agua destilada.
Destilacin
a) Se calienta el baln con la llave del embudo del baln abierta, para
evitar la condensacin de agua en el aparato.
b) Se lleva a ebullicin dejando la llave abierta hasta que salga un
chorro continuo de vapor.
c) Se cierra la llave del embudo y se comienza a contar el tiempo.
d) Se destila durante 17 minutos con el vstago del refrigerante
sumergido en el Erlenmeyer y 3 minuto ms con el vstago si
sumergir. La regulacin del calentamiento debe ser tal que recoja un
volumen de destilado de 130 a 150 ml en los 20 minutos de
destilacin.
e) Se desconecta y se retira el manto calefactor
f) Se abre la llave del embudo del baln
g) Se desarma el equipo an caliente
h) Se lavan exteriormente el tubo de conexin, el refrigerante y el
extremo exterior del vstago del mismo con agua destilada,
recogiendo el agua de lavado en el Erlenmeyer
Valoracin
a) Se valora con la solucin de cido sulfrico agitando el Erlenmeyer
continuamente.
b) En la cercana del punto final deben lavarse las paredes del
Erlenmeyer y el pico de la bureta con chorros de agua destilada,
valorando gota a gota hasta alcanzar el punto final.
Punto final:
Se considera que se ha llegado a este cuando el color de la solucin
vira de verde a gris azulado. Si llega a rojo violceo es ndice que se
ha pasado el punto final.
Clculos
N.B.V. = 0,01401 x 1000 x V x N x 100
m
o

0,01401 = mili equivalentes del nitrgeno

V = volumen de la solucin valorada de cido sulfrico 0,1 N gastado

en la titulacin
(mL).

o
15

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BIOTOXINAS MARINAS
N: normalidad de la solucin de cido sulfrico.
m: masa de pescado (gramos)

o
o

EL VALOR MXIMO PERMITIDO PARA LA MERLUZA EN NUESTRO PAS

ES DE 30 MG. %

7. RESULTADOS

TABLA N3: Procedimiento para la administracin del medicamento

PROCEDIMIENTO PARA LA ADMINISTRACIN DE UN
MEDICAMENTO EN ANIMALES: RATAS
PRUEBA DE MANIPULACIN DE ANIMALES

Vencer el miedo a
las ratas

o
o
o

Sacar la el reactivo biolgico(rata) de la caja

Intentar vencer el miedo y la ansiedad. Si el sujetador no
est tranquilo, tampoco lo est el animal.
Sujetar a la rata del extremo de la punta de la cola
Dejar a la rata libre, que se acostumbre al ambiente de
laboratorio.
NOTA
Animal suficientemente agresivo para atacar a alguien.
Huele si la persona tiene miedo o no.
Nunca se intente llevar a cabo un procedimiento en un
animal hasta que este se encuentre completamente
sujetado y relajado.
Al tratar de sujetar a una animal extrao, usar guantes
de cuero cuando haya peligro de ser mordido.

CARGA DEL LQUIDO QUE SE VA A INYECTAR

Tomar el extracto
cido
Cargar con la
jeringa
Aspirar
Sacar la jeringa
Apuntar hacia
arriba
Golpear la jeringa
Empujar el embolo

Tomamos los tubos centrifugados con el extracto de cido,

observando el sobrenadante lo cual usaremos.
Tome la jeringa que previamente haba preparado con la
aguja de carga e inserte en el tubo de ensayo que contenga
el extracto cido.
Aspirar con la jeringa
Una vez cargada toda la medicacin, saque la aguja del
tubo.
Sostenga la jeringa con la aguja apuntando hacia arriba
para que el lquido se asiente en el fondo de la primera
Golpee la jeringa con un dedo para favorecer que asciendan
las burbujas de aire que se puedan haber aspirado
Empuje suavemente el embolo hacia arriba para expulsar el
aire, procurando que no se pierda nada del liquido
Ya tiene la medicacin cargada

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Va de administracin: intramuscular Tcnica de sujecin

ADMINISTRACIN DEL LQUIDO QUE SE VA A INYECTAR

Mtodo de inmovilizacin

Sujetar a la
rata

Sujete de manera firme si apretar demasiado a la rata,

detrs de las orejas y la cola (usar las dos manos), de
manera que la cabeza quede inmvil.

Estirar
pierna
Introducir
aguja
Administrar
el liquido

Administrar el medicamento, esperar unos segundos antes

de retirar la aguja (slo 0,5 mL.)

Soltar a la
rata

Soltar al animal y realizar apuntes de sntomas y

comportamiento inusual de la rata.

Estirar la patita de la rata

Introducir la aguja en forma paralela al fmur.

Fuente: elaboracin propia

TABLA N4: Procedimiento para la determinacin de frescura en un

producto
PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIN DEL ESTADO DE
FRESCURA DE UN PRODUCTO
(MTODO DE ANTONACOPOULUS)
Pesar muestra
Colocar muestra
en un baln
Preparar equipo
de destilacin
simple
Colocar en el
baln
Al otro extremo un
Erlenmeyer

17

Pesar muestra usando la balanza de precisin analtica

Colocar muestra en un baln abierta
Preparar equipo de destilacin simple con conexiones
esmeriladas.
Colocar 2 g de leche de magnesia, 1 a 2 gotas de
antiespumante de silicona y un poco de agua destilada.
Se coloca un Erlenmeyer 50 mL de cido brico al 2%, un mL
de indicador y 100 mL de agua destilada.

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Encender cocinilla
y abrir pileta de
agua

DETALLES DE LA OPERACIN

BIOTOXINAS MARINAS

Ebulle el solvente que se evapora hasta un

condensador a reflujo.

El condensado cae sobre un recipiente que

contiene la muestra en su interior

Ascenso del nivel del solvente cubriendo la

muestra hasta un punto en que se produce el
reflujo que vuelve el solvente con el material
extrado al baln.

Se vuelve a producir este proceso la cantidad e

veces que sea necesaria para que la muestra
quede agotada.

Apagar cocinilla y
pileta

Desconectar y retirar el manto calefactor, se abre la llave del

embudo del baln y se desarma el equipo an caliente.

Concentrar
muestra-solvente

Lavamos exteriormente el tubo de conexin, el refrigerante

con agua destilada y recogemos en el Erlenmeyer.

Valoracin

Se valora con la solucin de cido sulfrico agitando el

Erlenmeyer continuamente.

Punto final

Se considera que se ah llegado a este cundo el color de la

solucin vira de verde a gris azulado.

Error

Si llega a rojo violceo es ndice que se ha pasado el punto

final

TABLA N5: Datos del reactivo biolgico

PESAJE DE MUESTRA

18

Muestras

Pesos

Ratn 1

20 g

Ratn 2

30 g

Mariscos

92,0777 g

Extracto cido

350 mL

Pescado

10,3250 g

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cido Brico

5,1486 g

TABLA N6: Comportamiento del reactivo biolgico.

Reactivo
biolgico

Tiempo
(min)
00:10
00:30
00:45
01:00
01:30
02:00
02:50
03:15
03:50
04:00

Ratn 1

04:40
05:00
05:21
06:00
06:28
06:42
07:00
08:00
08:40
09:20
10:00
13:15

Ratn 2

Comportamiento
Camina, presenta irritacin nasal.
Detiene su movimiento.
Presenta contraccin del vientre.
Presenta movimiento de cabeza y su
respiracin es acelerada.
Presenta contraccin del vientre.
Inicia su movimiento con pasos lentos,
presenta agitacin.
Presenta agitacin y detiene su
movimiento.
Presenta contraccin del vientre.
Se mantiene en el mismo lugar y se
coloco sobre la superficie de la mesa.
Se levant, presenta irritacin en los
ojos.
Presenta agitacin, irritacin nasal.
Movimiento de cabeza.
Camina lentamente, la contraccin
disminuye.
Se coloco sobre la superficie de la
mesa y presenta contraccin del
vientre.
Presenta contracciones del vientre.
La intensidad de las contracciones del
vientre va disminuyendo.
No presenta nuevos cambios.
Se recupera, camina lentamente.
No presenta cambios.
La irritacin de los ojos disminuye.
Abre los ojos, presenta picazn en la
oreja y presenta movimiento ms
acelerado.
Presenta un comportamiento normal.
El comportamiento no se observo, ya
que la administracin del xenobiotico
no fue adecuada y el reactivo
biolgico no presento cambios
importantes en su comportamiento.

8. DISCUSIN DE RESULTADOS

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En la evaluacin de toxinas de mariscos, los puntos ms importante en la
preparacin del extracto toxico es el calentamiento y el pH acido 3-4, los
cuales estabilizan las toxinas y desnaturalizacin de protenas en el
extracto, las toxinas paralizantes de los maricos (PSP) son termoestables en
pH acido, pero inestables en condiciones alcalinas, oxidndose fcilmente
(Rojas,2014). No se logr causar la muerte de los ratones en el rango de
tiempo registrado, ya que los reactivos biolgicos no presentan las mismas
caractersticas descritas en la gua, como el peso y sexo, adems en una
de las aplicaciones del extracto acido en los ratones no fue lo correcto, no
obstante este resultado permito garantizar la baja contaminacin de los
mejillones y aunque no se obtuvo datos cuantitativos se logr observar los
efectos que causan las biotoxinas de marisco, como las toxinas paraliticas
de marisco (PSP), toxinas de mariscos diarreicas (DSP) cuales causan,
escalofros, picazn, debilidad muscular, falta de coordinacin motora y
dismetra, sensacin de ahogo (Rojas, 2014) estos efectos se presenta en
el ratn de menor peso.
En el anlisis de NBV en el pescado los resultados del % de recuperacin
de amonaco por destilacin por arrastre de vapor se puede decir que fue
muy baja a comparacin de otros mtodos como ejemplo el mtodo de
destilacin automtica, ya que para el mtodo de arrastre de vapor tiene
limitaciones en su uso, porque solo reflejan la prdida del grado de frescura
del pescado en estadios avanzados de deterioro, y son generalmente poco
fiables para medir adecuadamente el grado de frescura del pescado
almacenado en hielo durante los primeros das (UM.2010) , por lo que no se
pudo valorar las bases absorbidas ya que el pescado era congelado. Sin
embargo este concepto incluye la determinacin de compuestos
nitrogenados de carcter voltil que se librean como consecuencia del
proceso de degradacin post-mortem como: Trimetilamina (producida por
deterior bacteriano), Dimetilamina (producida por enzimas autolticas
durante el almacenamiento en congelacin), Amonaco (producido por
desaminacin de aminocidos y catabolitos de nucletidos) y otros
compuestos voltiles nitrogenados asociados con el deterioro de los
productos pesqueros.

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9. CONCLUSIONES
o

La prueba del ratn result fallida, ya que

pudo realizar el clculo de toxicidad.

el ratn no muri y no

Despus de colocada la inyeccin se pudieron observar ciertos

comportamientos en el animal, no se puede establecer el tipo de
biotoxina marina que estaba presente en la muestra de conchas de
abanico al no contar con los equipos y el mtodo adecuado, podemos
descartar algunas toxinas y dejar abierta dos posibilidades al
observar al ratn; se vio
que este evacuaba con frecuencia
podramos deducir que se podra tratarse de la toxina diarreica de los
moluscos (VDM)por ejemplo, pero este sntoma tambin se ve
reflejado en otras toxinas, as que es muy difcil establecer el tipo de
toxina contenida.

Las causas para que el ratn no haya muerto tambin podran ser
debido a la baja concentracin y/o ausencia de la toxina en de las
conchas de abanico.

En la actualidad, la mayora de los programas de control de la

toxicidad en mariscos an utilizan el bioensayo en ratn.

10. RECOMENDACIONES
o

No es necesario lavar cuidadosamente las conchas para evitar

prdidas de la toxina.

La pasta a base de las conchas de abanico debe estar homognea

para que la extraccin de la biotoxina sea adecuada y eficiente.

Se debe centrifugar el extracto cido para evitar que hallan partculas

slidas al inyectar al animal.

Observar detenidamente al ratn luego de ser inyectado

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BIOTOXINAS MARINAS
11.

BIBLIOGRAFA

Miguel Andrs Cap Mart, Toxinologa clnica, alimentaria y ambiental,

o
o

1era edicin, 2007, Editorial COMPLUTENSE, S.A. Pg. 156 158.

http://mapaperills.grisc.cat/pdf/perills/261_QuimTmarina-Biotoxinas.pdf
http://www.gencat.cat/salut/acsa/html/es/dir3226/acsabrief04-

2011_biotoxinas_marinas.pdf
http://www.clearwater.ca/site/media/Parent/706631%20CW%20Spanish

%20Web%20Site_Sell%20sheets%20Marine%20Biotoxins%20P1.pdf
http://www.mincetur.gob.pe/comercio/otros/penx/pdfs/Conchas_de_Abani
co.pdf

12. ANEXO
Debido que no se logro determinar o calcular las bases nitrogenadas
adsorvidas por el metodo de arrastre de vapor, debido al uso de
pescado congelado por mayor a 12 dias, en este documento se
presenta un trabajo realizado por INTI Mar Del Plata donde comparan
metodos para la determinacion de nitrogeno basico volatil en merluza
comun.

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