FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

DEPARTAMENTO ACADMICO
DE
CIENCIAS BSICAS

ASIGNATURA

BIOQUMICA
GUA DE PRCTICA

SEGUNDO AO
II Semestre

Lima - Per
2012

INSTRUMENTACIN
CENTRIFUGACIN

rocedimiento por el cual se aplica la FUERZA CENTRFUGA para

separar partculas que se encuentran en suspensin en un
medio lquido. El incremento de la fuerza centrifuga
condicionar que las partculas migren alejndose del eje de
rotacin de la centrifuga. El proceso migratorio de las partculas se
denomina sedimentacin y la velocidad con que sedimentan es
proporcional a la fuerza centrifuga expresada como incrementos de
la gravedad (G).
La constante gravitatoria es proporcional a la velocidad de giro del
rotor soporte del medio que se centrifuga y del radio del mismo.
El radio del rotor de la centrifuga depende si sta es del tipo ngulo
fijo o flotante. En el primer caso es un promedio entre el radio
mnimo y el mximo, y en el segundo es la distancia entre fondo del
tubo y el eje.

La velocidad de la sedimentacin se altera por la fuerza centrfuga,

pero adems por la forma de las partculas, y por la viscosidad del
medio lquido que las suspende. Tambin depende de la
temperatura en cuanto sta altere la viscosidad del medio o de las
cargas elctricas de las partculas.

Los equipos que permiten la centrifugacin se llaman centrfugas y

constan de un motor con controles, que mueven un rotor que
sostiene los tubos de centrifugacin. Los rotores son de dos clases,
de ngulo fijo y flotantes, tal como se ve ms arriba.
2

La mayora de la centrfugas de laboratorio alcanzan las 5000 rpm,

aunque algunas alcanzan los 16 000 rpm. Algunas centrfugas
tienen refrigeracin lo que permite separar partculas
biolgicamente activas tales como factores de coagulacin,
enzimas, etc.
Las ultracentrfugas son centrfugas con vaco, refrigeracin y
velocidades de ms de 500 000 x g. Permiten la separacin de los
componentes tisulares, tal como se aprecia en el cuadro adjunto y
poder estudiar cada uno de ellos a partir del homogenizado de un
tejido cualquiera.
Para evaluar con certeza la capacidad de
separar los componentes celulares debemos
en lugar de revoluciones por minuto, por lo
usamos el nomograma de Dole y Cotziar
continuacin.

una centrfuga para

manejar gravedades
que frecuentemente
que presentamos a

Suspender el tejido al 10%

Homogenizar en Potter E.

Centrifugar a 600g x 10

Sedimento: ncleos, restos

celulares
Centrifugar el sobrenadante
a 4000g x 15
Sedimento:
mitocondrias
Centrifugar el sobrenadante
a 16 500g x 15
Sedimento:
lisosomas
Centrifugar el sobrenadante
a 100 000g x 40
Sedimento:
microsomas
Sobrenadante: citosol
3

TIPOS DE CENTRIFUGACIN

1.

2.

Diferencial: separa de acuerdo a las diferentes velocidades

de sedimentacin de distintas partculas. La usamos en la
clnica para separar sedimentos de orina, o componentes del
plasma.
Zonal: usando una gradiente de densidad lograda con un
soluto denso, la ms usada la sacarosa, las molculas
sedimentan de acuerdo a su coeficiente de sedimentacin. La
sacarosa densa evita que las bandas se mezclen.

La gradientes pueden ser discontinuas preparadas mediante la

colocacin de soluciones de diversa densidad una sobre otra- y
continuas preparada mediante un equipo de mezcla de
soluciones, que va incrementando la densidad progresivamente.

NOMOGRAMA DE CALCULO VELOCIDAD Y RADIO DE CABEZAL DE CENTRFUGA

TUBOS DE CENTRIFUGACIN:
Existen tubos de centrfuga de diversa composicin:
1.
Policarbonato: vidrio transparente, autoclavable y resistente
a los cidos y bases de baja dilucin.
2.
Borisilicato: vidrio muy resistente a qumicos de alta
concentracin .
3.
Polietileno: plstico muy resistente a los qumicos, pero
sensible a la temperatura.
4.
Propileno: plstico bastante resistente a la temperatura
autoclavable- y resistente a casi todos los qumicos.
PORTATUBOS
Son de plstico o de metal y poco resistente a cidos y bases
fuertes. Deben ser conservados muy limpios.
COLORIMETRA
Es el anlisis de la concentracin de una muestra por el color que
presenta. Todos hemos tenido la experiencia de valorar la
concentracin de sustancias coloreadas en solucin, por
observacin directa, una taza de caf o t, un vaso de refresco, son
apreciados de esa manera. El examen se funda en la mayor o
menor absorcin de luz de acuerdo al mayor nmero de molculas
y tonalidad depender de la capacidad de absorber una u otra
longitud de onda de luz, especficamente. La fotocolorimetra
manipula las variables de este fenmeno controlando la luz
incidente proveniente de un foco luminoso y su pureza, de modo tal
que slo incida aquella luz que es especficamente absorbida por la
partcula que medimos.
450nm
540nm
640nm

Rayos X
1nm a 1pm

Rayos
< 1pm

Ultravioleta:
400nm a 1nm

Microondas:
25um a 1mm

Infrarrojo:
750nm a 25 um

Ondas de radio
> 1mm

Los cuerpos luminosos como el sol o las lmparas elctricas emiten

un gran espectro electromagntico que comprende amplias
longitudes de onda, de las cuales muy pocas corresponden al
espectro visible. En el cuadro anterior se aprecian todas las
radiaciones electromagnticas conocidas.
Los cuerpos coloreados, absorben luz de determinada longitud de
onda y reflejan el resto del espectro luminoso visible e invisible
(colores complementarios) Esta luz reflejada es la que observamos
como color propio del cuerpo coloreado. No interesa
particularmente los colores que absorbe la solucin que queremos
medir. La selectividad de absorcin que queremos medir. La
selectividad de absorcin de una partcula por una longitud de onda
se basa en el hecho de que cada longitud de onda de luz
corresponde a un distinto nivel de energa, y para excitar los
electrones de cada partcula necesitamos un particular nivel de
energa.
Si consideramos que cada molcula absorbe luz de acuerdo a la
concentracin en que se encuentre dentro de la solucin, a mayor
absorcin de luz y menor luz trasmitida. Estos factores estn
considerados en la ley de Lambert y Beer.

Longitud de onda
400-435
435-480
480-490
490-500
500-560
560-580
580-595
595-610
610-750

Color
violeta
azul
verde-azul
azul-verde
verde
amarillo-verde
amarillo-verde
anaranjado
rojo

Colores complementarios
amarillo-verde
amarillo-verde
anaranjado
rojo
purpura
violeta
azul
verde-azul
azul-verde

Los cuerpos coloreados, absorben luz de determinada longitud de

onda y reflejan el resto del espectro luminoso visible e invisible
(colores complementarios). Esta luz reflejada es la que observamos
como color propio del cuerpo coloreado. Interesa particularmente
los colores que absorben la solucin que queremos medir. La
6

selectividad de absorcin de una partcula por una longitud de onda

se basa en que cada longitud de onda de luz corresponde a un
distinto nivel de energa y para excitar los electrones de cada
partcula se necesita un particular nivel de energa.
S consideramos que cada molcula absorbe luz de acuerdo a la
concentracin en que se encuentre dentro de la solucin, a mayor
concentracin de sustancia, mayor absorcin de luz y menor luz
trasmitida. Estos factores estn considerados en la Ley de Lambert
y Beer, que es la siguiente:

Log Io/It = e.l.c

Donde: Io = Luz incidente, It = Luz transmitida, C = concentracin,
L = longitud de paso, e = constante.
FOTOCOLORIMETRIA ESPECTROFOTOMETRIA
La fotocolorimetra es la medida de la luz absorbida por una
solucin mediante un aparato que es un fotocolormetro. El equipo
consta de una fuente de luz artificial, un monocromador que separa
exclusivamente luz de una sola longitud de onda (la que sea
preferente para la medida), un recipiente o tubo de vidrio (que
alberga la solucin a medir), una clula fotoelctrica que transforma
la luz trasmitida en corriente elctrica y una unidad de medida de la
corriente elctrica o galvanmetro.

Luz Incidente Io

Luz trasmitida It

La calificacin de colormetro o espectrofotmetro depende del

monocromador, s ste es un filtro tendremos un fotocolormetro,
pero si es un prisma, o cualquier aditamento que proporcione luz de
diversas longitudes de onda tendremos un espectrofotmetro.

Fuente de luz
blanca

Muestra: Absorcin

Monocromador

Galvanmetro

Celda

Los fotocolormetros y los espectrofotmetros reportan sus

resultados bajo dos formas: absorbancia o luz absorbida por las
partcula de la solucin y transmitancia a o luz transmitida luego de
atravesar el tubo con la solucin. La transmitancia se expresa en
valores numricos entre 0 y 100%, es decir que una solucin que no
tiene particular trasmitir el 100% y una perfectamente opaca el 0%.
La absorbancia, tambin llamada densidad ptica DO, se expresa
en valores semilogartmicos entre 0 y 2 correspondiendo el 0 a
aquella solucin que no tiene partculas y por lo tanto no absorbe la
luz.
Para encontrar la concentracin de una solucin problema,
debemos comparar su lectura frente a un blanco agua destilada o
reactivos sin modificarse con la lectura de un patrn o solucin
estndar bajo las mismas condiciones. Una solucin estndar es
generalmente una que contiene el problema con una concentracin
perfectamente medida en el laboratorio.
CLCULO DE LA CONCENTRACIN DE UN PROBLEMA

Para hallar la concentracin de una muestra problema tenemos dos

procedimientos:
1.
2.

Factor de Calibracin
Curvas de calibracin

Factor de calibracin: es la concentracin de sustancia que

corresponde a una unidad de medida, generalmente 0,001 de
absorbancia.

concentracin del patrn

Se obtiene Factor de calibracin:

Lectura del patrn (en absorbancia)

Esta frmula deriva de la densidad ptica o absorbancia del

problema:
DOP= eP lP cP
Si el coeficiente de extincin (e) es el mismo en ambos casos y el
dimetro del tubo de lectura(l) es el mismo, la nica diferencia est
en la concentracin. Luego:
DOst

CS

=
DOp

CP

Despejando la concentracin del problema cp, obtenemos la

siguiente formula:
cs

cp=Dp x -------Dost
Concentracin del problema = Densidad ptica del Problema X
Factor de calibracin
La curva de calibracin consiste en la obtencin de las lecturas de
absorcin 0 de % de trasmitancia que corresponde a una secuencia
creciente de concentraciones, estas son graficadas en un papel
milimtrico si se trata de absorbancia o densidad ptica y de papel
semilogartmico si se trata de % de transmitancia.
POTENCIOMETRA
La potenciometra es el procedimiento de eleccin para la medida
del pH. El pH en una expresin numrica que corresponde al
logaritmo de la inversa de la concentracin de iones H+. La
potenciometra se basa en la diferencia de potencial (voltaje) entre
dos electrodos, el de medida y el de referencia, ambos sumergidos
en la solucin y bajo condiciones de equilibrio.

El instrumento consta de un ELECTRODO DE REFERENCIA que

se mantiene constante durante la medida, un ELECTRODO DE
MEDIDA que varia de acuerdo a la concentracin de hidrgeno de
la solucin y un dispositivo o potencimetro que mide la
diferencia de potencial. El electrodo de referencia puede ser de dos
clase: de calomel, mercurio metlico y cloruro mercurioso y de plata
plata y cloruro de plata. El potencial de ese electrodo depende de la
solucin de cloruro de potasio en que est sumergido internamente.
El electrodo de medida, es tambin llamado electrodo de vidrio, est
constituido por un tubo de vidrio cuyo extremo es particularmente
selectivo al paso de iones hidrgeno. En su interior hay cido
clorhdrico HCl 0,1 M y un alambre de plata, cloruro de plata,

Batera

0V

AAg.Aa
HclgCl.HCl.Vidrio

1V

Solucin
Problem
a.

KCl.Hg2Cl2.Hg

En el potencimetro, un voltaje variable se opone al de la celda de

medida. Un galvanmetro acta como detector del punto nulo para
indicar que es igual al voltaje opuesto de la celda de medida.
Conectando la celda desconocida al circuito se produce un desnivel
de voltaje que debe corregirse hasta alcanzar el punto nulo. La
magnitud de la correccin puede leerse como fuerza electromotriz o
como pH directamente.
En la prctica se ha usado los electrodos de pH para medir la
concentracin de otros iones. Los electrodos tienen una membrana
adicional que slo es selectiva al paso de determinado electrolito,
sodio, potasio, calcio son medidos bajo esta manera con facilidad.
Tambin existe el electrodo de CO2 que deja pasar molculas se
10

este gas las que modifican el pH y por lo tanto son medidas con el
electrodo de vidrio de pH.
PRACTICAS DE LABORATORIO

EXPERIMENTO.- Preparacin de una curva de

calibracin: el experimento consiste en preparar tubos de
concentracin creciente de un colorante y leerlos al
fotocolormetro o al espectrofotmetro, llevando a cero (0)
el aparato con agua destilada. Construir una grfica usando
papel milimetrado para las lecturas hechas en DO
(densidad ptica) o papel semilogartmicos para las
lecturas hechas en % transmitancia.
Para el efecto, preparar cinco tubos de acuerdo al
esquema y leer las soluciones al espectrofotmetro a 540
nm de longitud de onda. Practicar esta lectura tanto en DO
como en % de transmitancia.
Construir dos curvas de calibracin, una en papel
milimetrado y otra en papel semilogartmico.
Contenido
mL Azul metileno al (5 mg/mL)
mL Agua destilada

1
2
8

Concentracin (mg/mL)

%T

2
4
6

Tubo N
3
4
6
8
4
2

5
10
0

A (A=2-logT%)

Desconocido 1
Desconocido 2
1.40
1.20

Abs (540 nm)

1.

1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
0

Concentracin (mg/mL)
11

COMENTARIO

...
Usando los valores obtenidos en % de trasmitancia, grafique
usando el papel semilogartmico de esta pgina.

% T (540 nm)

100
80
60
40
20
0
0

Concentracin (mg/mL)

COMENTARIO

Firma del alumno

2.

Firma del profesor

EXPERIMENTO: Titulacin de un cido dbil con una base

fuerte.

Se trata de determinar el pH de un grupo de tubos con varios niveles de

titulacin de cido actico con hidrxido de sodio. Cuando se titula un cido
dbil con una base fuerte se produce un aumento de pH inicialmente rpido
para luego hacerse lento, dentro de ciertos mrgenes y al final se alcaliniza
rpidamente. La identificacin del cambio de pH en cierto perodo de la
titulacin, se debe a la formacin transitoria de una combinacin de cido dbil
y la sal correspondiente. En el caso del experimento ser la combinacin de
cido actico y acetato de sodio y son los componentes ordinarios de una
solucin amortiguadora o solucin buffer.

12

Para la experiencia preparar 11 tubos de acuerdo al siguiente esquema:

Tubo No

mL actico 0,1 N

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

mL NaOH 0,1 N

5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0

mL agua destilada

0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0

5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0

pH

Leer los tubos en el potencimetro y graficar los resultados

14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
4

10

11

12

Volumen (mL)

COMENTARIO

13

CINTICA ENZIMTICA
Las enzimas son protenas que aceleran las reacciones qumicas hasta su
punto de equilibrio.
La ecuacin general de las enzimas es:

E + S

ES
C

E+P
C

La actividad enzimtica se manifiesta y mide por:

Desaparicin de sustrato
Formacin de producto
Modificacin de cofactor
Muchos factores modifican la actividad enzimtica:
pH
Temperatura
Concentracin de sustrato
Concentracin de enzima
Tiempo de incubacin
En nuestra prctica observamos el efecto de la pepsina sobre la albmina del
huevo. La actividad enzimtica se apreciar por la prdida de la turbidez
proteica. La actividad enzimtica reportar en funcin del % de formacin de
producto par ello hacer uso de la siguiente ecuacin:
% Formacin de producto (FC) = 100 (Abs tubos/Abs albmina)*100
Donde: Abs tubo = Absorbancia de los tubos despus del incubado.
Abs albmina = Absorbancia de la albmina (Abs = 0.995)
3.

EXPERIMENTO.- Efecto del pH

El pH acta sobre los grupos ionizados que pertenecen a los centros activos
de las enzimas. Los grupos que pierden la ionizacin pierden la capacidad de
interaccionar con el sustrato. Cada enzima tiene un pH ptimo de trabajo.
Preparar cinco tubos con:
TUBO N
1
pH
1,0
mL albmina
5,0
mL HCL 1N
2,0
mL CO3Na2
0,0
mL agua destilada
0,0

2
1,5
5,0
0,5
0,0
1,5

3
6,0
5,0
0,0
0,0
2,0

4
9,5
5,0
0,0
0,5
1,5

5
11
5,0
0,0
2,0
0,0

14

Preincubar los cinco tubos ms un tubo conteniendo 20 mL de pepsina al 1%

a 37C por 5 minutos. Luego aadir rpidamente 3 mL de la pepsina
preincubada a cada uno de los tubos 15. Mezclar e incubar a 37C por 10 min.
Observar la diferencia o leerla en fotocolormetro con filtro azul (420 nm).
4.

EXPERIMENTO: Efecto de la temperatura.

Todo aumento de temperatura incrementa la actividad enzimtica por aumento

de la energa de activacin. Pero paralelamente se va produciendo una
desnaturalizacin parcial de la enzima que la inactiva.
Preparar cinco tubos con:
TUBO N
1
mL albmina
mL HCL 1N
mL agua destilada

5,0
0,5
3,5

5,0
0,5
3,5

5,0
0,5
3,5

5,0
0,5
3,5

10

1,0

1,0

1,0

1,0

5,0
0,5
3,5

Preparar otros cinco tubos con:

TUBO N
6
mL pepsina 1%

1,0

Incubar por 5 minutos de acuerdo al siguiente esquema de temperatura:

TUBO N
1y6
2y7
3y8
4y9
5
10
Temperatura

O C

Amb.

37 C

70 C

37 C

100 C

Agregar los respectivos tubo N 6 al N 10 a los que hay que incubar a las
temperaturas a que se pre-incuban los tubos 1 5.
5.

EXPERIMENTO. -Efecto de la concentracin de la enzima

Aunque las enzimas no se destruyen ni con las reacciones, el aumento de ellas

en la cubeta de reaccin incrementa la velocidad.
Preparar 5 tubos con:
TUBO N

mL albmina

5,0

5,0

5.0

5,0

5,0

mL HCL 1N

0,5

0,5

0.5

0,5

0,5

mL agua destilada

1,5

2,5

3.5

4,0

4,5

mL pepsina

0,0

0,0

0.0

0,0

0,0

Incubar los 5 tubos a 37C por 5 minutos y enseguida aadir:

TUBO N
1
2
3
4
mL pepsina incubada

3,0

2,0

1,0

0.5

5
0,1

15

Incubar por cinco minutos a 37C. Observar al fotocolormetro a 420 nm

(filtro azul), contra una lectura de agua.
6.

EXPERIMENTO.-Efecto de la concentracin del sustrato

Si es una reaccin enzimtica incrementamos progresivamente la
concentracin del sustrato, aumentar la velocidad enzimtica (velocidad
inicial) hasta un punto en que la velocidad llega a una meseta plana que
no modifica aunque sigamos aumentando el sustrato, habremos
saturado la enzima.

Preparar 6 tubos con:

TUBO N

mL albmina

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

mL HCL 1N

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

mL agua destilada

7,0

6,0

5,0

4,0

3,0

2,0

mL pepsina 1%

0,0

0,0

0,0

0,0

0,0

0,0

Leer a 420 nm (filtro azul). Anotar los resultados: incubar a 37C. Colocar 0,5
mL que pepsina pre-dirigida. Incubar por otros 5 minutos a 37C. Leer al
fotocolormetro a 420 nm (filtro azul). Restar la segunda lectura de la primera.
Graficar y comentar los resultados.
Experimento: Efecto de la
temperatura

Experimento: Efecto del pH

% Formacin producto

% Formacin producto

100
80
60
40
20
0

100
80
60
40
20
0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
pH

Comentario:

20

40

60

80

100

Temperatura (C)

Comentario:

16

Experimento: Efecto de la
concentracin de sustrato
% Formacin producto

% Formacin producto

Experimento: Efecto de la
concentracin de enzima
100
80
60
40
20
0
0

10

12

Concentracin enzima (mg/mL)

Comentario:

100
80
60
40
20
0
0

Concentracin de sustrato

Comentario:

17

DIGESTIN DE CARBOHIDRATOS
El carbohidratos ms importante en la alimentacin es la glucosa, la cual
ingerimos bajo la forma de disacridos (maltosa, sacarosa y lactosa) o de
almidn, polisacridos formado por muchas molculas de glucosa. El almidn
es el constituyente esencial de cereales, leguminosa, tubrculos y races. La
digestin del almidn se produce en el intestino delgado gracias a la presencia
de enzimas digestivas producidas por las glndulas salivares, el pncreas y la
pared intestinal. Estas enzimas son:
La alfa amilasa salivar
La alfa amilasa pancretica
La amilo 1,6 glucosidasa de la pared intestinal
Las alfa amilasas son enzimas que actan a pH neutro y en presencia de iones
cloro. Rompen los enlaces amilo 1,4 dando como resultado oligosacridos y
glucosa.
Existe dos formas de evaluar la actividad enzimtica de la amilasa:
Por desaparicin de sustrato: forma como desaparece el almidn el que
se aprecia por la reaccin del lugol.
Por formacin de producto: forma como aparecen carbohidratos
reductores (glucosa) en el medio, los que se aprecian por reduccin del
cobre.
En nuestra prctica evaluaremos la actividad enzimtica de la amilasa sobre el
almidn mediante la reaccin del remanente de almidn frente al yodo a mayor
decoloracin, mayor actividad enzimtica.
7.

EXPERIMENTO.- Digestin del almidn por la amilasa salivar.

Para la experiencia preparar cuatro tubos de ensayo de acuerdo al siguiente

esquema.
TUBO

ml almidn 1%

ml Buffer fosfato pH 6,6

ml HCL 0,3N

3,4

ml Suero fisiolgico

2,4

ml Agua destilada

2,4

0,6

0,6

Colocar en bao de Mara a 37C por 5 minutos. Agregar:

ml solucin de saliva
0
0,6
Colocar en bao de mara a 37C por 20 minutos

Pasado este tiempo tomar 0,5ml de cada tubo y preparar cuatro tubos ms de acuerdo al
esquema

18

TUBO

ml digestin tubo 1

0, 5

ml digestin tubo 2

0,5

ml digestin tubo 3

0,5

ml digestin tubo 4

0,5

ml HCL 0,05N

0,5

0,5

0,5

0,5

ml Solucin yodada

Dejar en reposo por 15 minutos. Leer al fotocolormetro con filtro rojo (660nm)

INFORME DE LA PRCTICA III

Nombre:
Grupo :

Fecha:

Experimento 7.- Digestin del almidn por la amilasa salivar

1.05
0.90

Abs

0.75
0.60
0.45
0.30
0.15
0.00
Tubo 1

Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

Tubo 5

COMENTARIO:

Firma del alumno

Firma del profesor

19

ABSORCIN DE CARBOHIDRATOS
Despus de la digestin de los carbohidratos por efecto de amilasas salivar y
pancretica, amilo 1,6 glucosidasa, y disacarasas tenemos como resultado
monosacridos: glucosa, fructosa, galactosa, que debern ser absorbidos por
la mucosa intestinal para su ingreso a la circulacin sangunea. Los
carbohidratos se absorben en el yeyuno mediante dos mecanismos, la simple
difusin favorecida por la gradiente de concentracin y el transporte activo, an
contra la gradiente. El orden de facilidad en la absorcin es de galactosa
glucosa: ribosa.
El borde en cepillo de las clulas intestinales tiene varios sistemas
trasportadores. Un transportador de glucosa dependiente del sodio (SLGT1) se
enlaza tanto a la glucosa como al sodio en sitios separados aumentando el
tenor de sodio intracelular.
La energa necesaria para este transporte se obtiene de la hidrlisis del ATP
vinculado a una bomba de sodio que intercambia sodio con potasio.

20

Tambin participa un transportador facilitador independiente del sodio llamado

GLUT 5. La hidrlisis de los polisacridos, oligosacridos y disacridos es muy
rpida por lo que usualmente los procedimientos de absorcin se saturan con
rapidez.
8.

EXPERIMENTO.-Absorcin de la glucosa por el intestino de la rata

1. Se usan ratas con 24 a 36 horas de ayuno. Se les anestesia con eter
bajo una campana de vidrio. Abrirles el abdomen y se retira una porcin
de 5 cm de intestino, de modo que no puede mesenterio adherido.
2. Se lava la luz intestinal varias veces mediante una jeringa con solucin
Ringer Fosfato pH 7,4 Mediante el uso de una baqueta de vidrio se
empuja un extremo del intestino dentro del mismo buscando evertir la
porcin mucosa hacia fuera. Mantener el intestino en solucin Ringer
Fosfato pH 7,4 a temperatura ambiente.
3. Cerrar un extremo del intestino con hilo y dejar otra ligadura suelta en el
otro extremo del intestino.
4. Introducir en el saco intestinal formato 2 ml de solucin Ringer Fosfato
pH 7,4 con 0,2% de glucosa. Cerrar la ligadura suelta y revisar que no
haya prdida de lquido.
5. Introducir el saco lleno en un tubo con 2 ml solucin Ringer Fosfato pH
7,4 con glucosa 0,2% Incubar a 37C por 30 minutos. Pasado del tiempo
sacar el saquito, secarlo por fuera con papel de filtro. Cortarlo con tijera
y vaciar el contenido en u tubo de ensayo.
6. Diluir 1:10 con agua destilada, tanto el contenido del saquito, como el del
tubo que lo recibi durante la incubacin. Luego proceder a preparar 4
tubos de acuerdo al siguiente esquema.
TUBO
1
2
3
4
ml reactivo para glucosa
2
2
2
2
l agua destilada

50

l patrn 20 mg/dL

50

l solucin diluida intra saco

50

l solucin diluida extra saco

50

Incubar a 37C por 10 minutos. Enfriar y leer en el fotocolormetro a 520nm. Usando el

tubo 1 como blanco
COMENTARIO:

.
Firma del alumno

Firma del profesor

21

GLICLISIS
La va metablica ms importante para la glucosa es la va glicoltica o de Embden
Meyehof. Esta presente, naturalmente, en todos los tejidos y es responsable del
aprovechamiento energtico de la glucosa y an de otros carbohidratos. Tiene dos
formas de manifestarse: la forma anaerbica cuando la concentracin de oxgeno es
baja, produce cido pirvico y cido lctico, y genera escasamente dos molculas de
ATP, tal como se aprecia en la siguiente frmula global.

GLUCOSA + 2ADP + Pi

2 lactato + 2ATP + 2H2O

Cuando la gliclisis transcurre en presencia abundante de oxgeno, tiene como

producto final el cido pirvico, el cual se transforma en actil CoA mediante el
proceso de decarboxilacin oxidativa, en ingresa al Ciclo de Krebs donde produce 38
molculas de ATP.

9.

EXPERIMENTO.- Gliclisis.
La gliclisis anaerbica (parcialmente) se demuestra por el aumento de
compuestos cidos (pirvico y lctico) en el tubo de reaccin. Para el efecto
preparar cuatro tubos de acuerdo al esquema.

22

TUBO

ml solucin de Potter pH 7,4

2,5

2,5

2,5

2,5

ml Glucosa 0,1 m

0,5

0,5

0,5

0,5

ml NAD 10m g/ml

0,2

0,0

0,2

0,2

ml ATP 5m g/ml

0,2

0,2

0,2

ml Nicotinamida 0,4m

0,1

0,1

0,1

0,1

ml Yodoacetato 0,1m

0,1

0,1

0,3

0,3

ml Agua destilada

Colocar en bao de mara 37C por 5 minutos

Gotas de rojo de fenol
ml homogenizado de hgado

Ii

Ii

ii

Ii

0,5

0,5

0,5

0,5

Tapar e incubar 1 hora a 37C

Titular cada tubo con NaOH 0,01N hasta el color original
COMENTARIO:

Firma del alumno

Firma del profesor

RESPIRACIN TISULAR
La respiracin tisular es el proceso por el cual se
aprovecha la energa almacenada en los
nutrientes (glucosa, cidos grasos, aminocidos)
a travs del Actil CoA, mediante procesos de
oxidacin.
Durante el proceso de oxidacin del Acil Coa se
forman equivalentes reductores en forma de
hidrgeno o electrones que ingresan a la cadena
respiratoria, localizada en las mitocondrias y
genera muchas molculas de ATP. Como puede
apreciarse en el esquema adjunto hay tres
fuentes de generacin de electrones que
producen 3 molculas de ATP, el isocitrato, el
cetoglutarato y el malato y una que slo
proporciona dos ATP que es el succinato, debido
a que ingresa al ciclo de Krebs a nivel de la
Coenzima Q y no del NAD como las otras.
El punto final del transporte de los electrones por
la cadena respiratoria es el oxgeno. Dos tomos
de hidrgeno se unen a molcula de oxgeno
para forma una molcula de agua. El proceso

23

oxidativo de los nutrientes se puede seguir por el consumo de oxgeno. .

10.

EXPERIMENTO: Respiracin Tisular

El experimento estudia la respiracin tisular mediante la manometra. Un

manmetro es un instrumento que mide los cambios en la presin de los
gases. Esta basado en el principio de vasos comunicantes, si colocamos un
lquido en dos recipientes que se comunican entre s, ambas ramas sern
iguales siempre que sobre ellas exista la misma presin sobre una de ellas
disminuye los niveles de lquido se desigualan. Los equipos que usaremos
sern iguales o semejantes a los que se observan en el grfico, es decir
constan de un ambiente cerrado para la reaccin, un medio de absorcin de
CO2 que puede combinar
Preparar dos frascos de acuerdo al siguiente esquema:
FRASCO N

ml Solucin de Potter pH 7,4

ml Succinato de potasio 0,5m

0,3

ml Agua destilada

0,7

ml Homogenizado

0,5

Cerrar bien los frascos. Incubar a temperatura ambiente. Medir cada 2 minutos
la modificacin del nivel del manmetro. Prepara un grfico de consumo de
oxgeno vs tiempo.
Consumo de oxgeno en el tiempo

0.4
(cm3)

Volumen O2 consumido

0.5

0.3
0.2
0.1
0
0

10 12 14 16 18 20

Tiempo (Minutos)

Comentario:

24

COLESTEROL DE LAS FRACCIONES LIPOPROTECAS

Las protenas son lpidos complejos resultado de unir la grasa con
protenas. Los lpidos sanguneos se encuentran bajo esta forma y
divididos en cuatro tipos de lipoprotena:
Alfa lipoprotena (HDL) ricas en protenas y fosfolpidos
Pre beta lipoprotenas (VLDL): ricas en triglicrido
Beta lipoprotenas (LDL): ricas en colesterol
Quilomicrones (Q): ricos en triglicridos dietticos

Toda las lipoprotenas tienen colesterol, triglicridos, fosfolpidos y

protenas, pero en distinta concentracin relativa.
El colesterol es la grasa que genera la arterioescleroris al
depositarse en las paredes de los vasos sanguneos. El colesterol
de las betalipoprotenas est en actitud de depositarse en los vasos
constituye la mayor parte del colesterol sanguneo. El colesterol de
las alfa lipoprotenas (HDL) es aquel que est siendo retirado de los
vasos, por lo que su presencia es beneficiosa.
Para investigar el colesterol de las alfa lipoprotenas usamos un
reactivo precipitante (fosfotngstico-cloruro de calcio) que precipita
a las betas y prebetalipoprotenas dejando en solucin a las alfa,
sobre las que se realiza la reaccin de color tpica del colesterol.

25

10. EXPERIMENTO Dosaje colesterol total y colesterol HDL en sangre.

Se toma una muestra de sangre del paciente en ayuno de por lo menos 24

horas. La sangre se coloca en tubo limpio sin anticoagulante.
Preparar un tubo al que se le coloca:
1ml de suero lmpido
0.1 ml de reactivo precipitante HDL o II gotas
Agitar y dejar en reposo por minutos al ambiente Centrifugar a 3 000 por 10
minutos separar el sobrenadante.
Preparar cuatro tubos lmpidos y colocar:

TUBO N
ml Suero lmpido
ml Sobrenadente anterior
ml Patrn de colesterol
ml Agua destilada
ml Reactivo de color

0,02

0,02

0,02

0,02

Agitar: Incubar por 15 minutos a 37C.

Leer al fotocolormetro a 520 mu los tubos 1,2 y 3, llevando a cero con el
blanco (tubo4)
Clculos
200

Colesterol mg/dl= -------- X D.O.(1 2)

D.O (3)

26

11. EXPERIMENTO : Dosaje de triglicridos

Preparar tres tubos con:
TUBO N
ml Suero
ml Patrn de triglicridos
ml Reactivo de color

0,02

0,02

Agitar, incubar a 37C por 15 minutos

Leer al fotocolormetro a 520 nm los tubos 2 y 3 llevando a O con el tubo 1

Conc. patrn

Triglicridos mg/dl = ------- x D.O.(2)

D.O (3)

INFORME DE LA PRCTICA V: RIESGO CORONARIO

Nombre:
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................

Experimento 11: Dosaje de colesterol total y colesterol HDL en sangre

Patrn:
Lectura:
Concentracin:
Factor de Calibracin:
Colesterol total:
12. EXPERIMENTO : Valoracin de las lipoprotenas por electroforesis
en acetato de celulosa

27

La electroforesis es una tcnica para la separacin de molculas (protenas o

cidos nucleicos) sobre la base de su tamao molecular y carga elctrica. Los
cidos nucleicos ya disponen de una carga elctrica negativa, que los dirigir al
polo positivo, mientras que las protenas son molculas cuya carga neta
depende del contenido de una serie de aminocidos (fundamentalmente cido
glutmico, cido asprtico, lisina, arginina e histidina). Para la separacin se
usa un gel de agarosa, poliacrilamida o acetato de celulosa. Al poner la mezcla
de molculas y aplicar un campo elctrico, stas se movern y debern ir
pasando por el papel, por la que las pequeas se movern mejor y
rpidamente. As, las ms pequeas avanzarn ms y las ms grandes
quedarn cerca del lugar de partida.
En resumen, puede decirse que cuando una molcula cargada se coloca en un
campo elctrico se mover hacia uno u otro electrodo dependiendo de:
1) su carga elctrica
2) su tamao
3) la intensidad del campo elctrico y
4) la temperatura del medio.
Las protenas estn compuestas de aminocidos que poseen grupos ionizables
(principalmente -COO-y -NH3+), pueden encontrarse cargadas positiva o
negativamente, o bien permanecer elctricamente neutras segn la proporcin
de los diversos grupos ionizados a un determinado pH.

En suero humano la composicin normal es:

Protena total: 6,4 a 8,3 g/dL
Albmina: 3,5 a 5,0 g/dL
Alfa-1 globulina: 0,1 a 0,3 g/dL
Alfa-2 globulina: 0,6 a 1,0 g/dL
Beta globulina: 0,7 a 1,2 g/dL
Gammaglobulina: 0,7 a 1,6 g/dL
ELECTROFORESIS EN ACETATO DE CELULOSA
Se usa para la separacin y caracterizacin de protenas y otras molculas. El
soporte consiste en tiras delgadas de acetato de celulosa, con propiedades de
adsorcin mnimas, por lo que se evita la formacin de colas y los solutos
pueden ser separados en bandas bien definidas. Otras ventajas son:
1) La separacin es muy rpida
2) Se pueden analizar cantidades de muestra pequeas
3) Las tiras pueden hacerse transparentes
4) La tira se puede disolver, recuperando los componentes separados
5) Presentan un fondo bajo cuando se separan compuestos radiactivos
MATERIAL Y REACTIVOS
Material
- Tiras de acetato de celulosa (Cellogel)
- Papel de filtro para secar las tiras de acetato
- Cubeta de electroforesis
- Aplicador
- Fuente de electroforesis
Reactivos
-Tampn Tris-HCl 10 mM y EDTA 1 mM pH=8,6
-Solucin de tincin: 0.1% (p/v) ponceau S stain en cido actico 1%

28

-Solucin de lavado: cido actico 1%

-Suero
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Electroforesis:
- Humedecer en tampn las tiras de acetato de celulosa 10 minutos antes de su
uso, para su equilibrado.
- Extender las tiras sobre el puente de la cubeta de modo que la superficie
- penetrable quede hacia la parte superior. El lado penetrable es el que se ve
cuando la tira se coloca en vertical delante de nosotros con el corte en la
esquina inferior derecha
- Depositar la muestra de suero en la tira de acetato de celulosa, en el extremo
prximo al ctodo.
- Conectar la corriente, aplicando una diferencia de potencial de 100 voltios
durante 60 minutos.
Revelado:
- Finalizada la separacin, depositar las tiras en una cubeta con solucin de
tincin, de modo que queden cubiertas por el lquido, durante 10 minutos.
- Lavar las tiras en solucin de destincin hasta que se observen bien las
bandas de protena (rojo) sobre un fondo blanco.
TRATAMIENTO Y DISCUSION DE LOS RESULTADOS
Dibujar el patrn de bandas que se ha obtenido tras la electroforesis de
protenas sricas, indicando la posicin de nodo y ctodo as como el punto
de aplicacin de la muestra. Identificar las protenas que corresponden a cada
banda y justificar el orden.
Comentario:

TRANSAMINACIN
Una de las reacciones generales de los aminocidos es la
transaminacin o trasporte de un grupo amino de un aminocido a
un cetocido, trasformado al primero en cetocido y al segundo en
aminocido.
Esta transformacin posibilita la formacin de carbohidratos a partir
de aminocidos, esto es el fenmeno de la neoglucognesis.
LA ecuacin general de estas reacciones es:
R=CH-COOH + R-C-COOG
Nh2

R-C-COOH+R-CH-COOH
O

NH2

29

En el caso de nuestro experimento la transaminasa que

estudiaremos es la transaminasa glutmico pirvica que transforma
el alfa cetoglutrico (cetocido) en glutmico (aminocido) y a la
alanina (animocido) en pervico (cetocido).
Esa enzima que es particularmente rica en el tejido heptico es un
excelente herramienta de estudio clnico de ese rgano, en
problemas como la hepatitis o la cirrosis heptica.
El procedimiento de anlisis se llevar a cabo mediante la
cromatografa en capa fina.

PROCEDIMIENTO CROMATOGRFICOS

La cromatografa es un procedimiento de anlisis por el cual una

mezcla de molculas es separada en sus componentes mediante el
uso de una fase estacionaria y una mvil.
La fase estacionaria o soporte da nombre al tipo de cromatografa:
papel, columna, capa fina y la fase mvil es lquida o gaseosa.
La separacin de componentes se produce por el fenmeno de
particin por solventes, esto es ante una mezcla de lquidos no
miscible entre s, algunos componentes tendrn mayor posibilidad
de localizarse en uno u otro componente, aquellos que se localicen
en el componente ms lejano del soporte migraran ms y aquellos
cercanos sern adsorbidos por el soporte.
Existen una forma identificatoria de medir la migracin de las
molculas analizadas y es el Rf. Este valor corresponde a la
relacin entre los cm migrados por la molcula y aquellos migrados
por el medio mvil.

30

13. EXPERIMENTO: Demostracin de transaminacin por cromatografa

Preparar 4 tubos de acuerdo la esquema:
TUBO N
ml cetoglutarato 0,2 M
ml alanina 0,2M
ml piruvato 0,2M
ml glutamato 0,2M
ml arsenito 0,1M
ml Enzima activa
ml Enzima inactiva

0,3

0,3

0,3

0,3

0,3

0,3

0.,3

0,3

0,4

0,4

0,4

0,4

a
RF =-----------------

a
a

31

Incubar todos los tubos por 45 minutos a 37C. Retirar los tubos del bao de
Mara y agregar 6ml de alcohol etlico a cada tubo. Agitar y esperar por dos
minutos. Centrifugar y usar los sobrenadantes para la cromatografa.

Cromatografa
Marcar a 3 cm del borde una lnea suave con un lpiz, tratando de no daar la
slica gel. Marcar en esa lnea seis puntos separados por 2 cm cada uno.
Colocar en cada punto cinco gotas del respectivo sobrenadante y en las dos
ltimas 5 gotas de alanina y cinco de glutamato respectivamente. Dejar secar
Colocar la cromatoplaca en una cmara de cromatografa con una mezcla de
propanol: agua en la proporcin de 8: Dejar correr hasta que el nivel lquido le
falte 1 cm para llegar al extremo de la placa. Marcar el nivel al que alcanz el
lquido con un lpiz y dejar secar.
Aplicar con un spray una solucin de ninhidrina al 0,1% e butanol. Colocar a la
estufa por 10 minutos. Marcar las manchas obtenidas.
Obtener el Rf de cada mancha mediante la frmula:
Distancia de origen al punto medio de la mancha

Rf:
Distancia de origen al nivel mximo del solvente

Comentario:

32

EVALUACIN NUTRICIONAL
Experimento 1.- Manejo de Tablas de Composicin de
Alimentos

La forma ms exacta de evaluar la ingesta de nutrientes por un

sujeto es a travs del clculo de la ingesta alimentaria, bien
documentada y exacta y mediante las Tablas de Composicin de
Alimentos. En la presente prctica analizaremos:

1. Las necesidades calricas de un sujeto: tomando en cuenta,

peso y trabajo. As conocemos que una persona gasta como
Metabolismo Basal 1 kcalora /kg. Peso/hora. A ello aadimos
aproximadamente un 50% por trabajo de mediana intensidad.
2. Las necesidades protecas de un sujeto: tomado su peso,
aceptamos una necesidad de 1g/kg de peso/da( en
condiciones mnimas 0,5/kg peso/da).
3. Las necesidades de nutrientes (protena, carbohidratos y
grasa) de un da al azar. Con ello podemos establecer su
ingesta calrica y proteca y por lo tanto su dficit o
adecuacin.
Para el efecto usaremos la siguiente Tabla de Composicin de
Alimentos resumida.
TABLA DE COMPOSICIN DE ALIMENTOS
g/100g de alimento
Alimento
Atn (conserva)
Bacalao (seco)
Calamar
Camarn
Carne (cerdo)
Carne (Pavo)
Carne (pollo)
Carne (pulpa)
Carne Seca
Chicharrones
Cojinova
Corvina

Protena
29,0
81,8
16,4
17,3
15,0
20,1
18,2
21,3
48,1
11,3
20,2
19,9

Lpido
4,8
2,8
0,9
0,2
15,1
20,2
10,2
1,6
9,4
61,4
0,7
0,9

Carbohidratos
0,0
0,0
0,0
2,5
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0

33

Hgado
Huevo (total)
Jamn del Pas
Jamn Ingls
Leche fresca
Lenguado
Merluza
Pejerrey
Queso Fresco
Queso mantecoso
Tocino
Trucha

Alimento
Arroz (seco)
Arveja (verde)
Avena
Bizcocho
Camote
Fideos
Frejol negro
Frejol soya
Frejol tarhui
Galletas (soda)
Galletas (Vainilla)
Garbanzo
Alimento

Lentejas
Maz (cancha)
Maz (choclo)
Man
Nuez
Olluco
Pallares
Pan (frances)
Papa blanca
Papa Seca
Quinua
Yuca
Aceitunas
Blanquillo
Cebolla
Coco
Col
Coliflor

19,5
12,8
15,9
25,8
2,9
19.0
19,3
18,7
16,0
25,8
9,1
18,2

Protena
6,5
8,3
10,6
8,8
1,2
8,7
21,2
33,4
40,9
9,4
6,0
19,1
Protena

22,8
6,7
3,3
28.8
13,7
0,8
19,9
9,2
2,1
8,3
11,9
0,8
1,2
0,6
0,9
3,8
1,4
2,0

6,6
11,8
26,6
20,5
3,3
0,5
0,8
1,2
10,3
20,2
65,0
1,0

Lpido
0,7
0,7
0,9
6,9
0,2
0,3
1,7
16,4
13,4
14,7
12,7
5,1
Lpido

1,2
2,7
0,8
46,9
67,2
0,1
1,1
0,3
0,3
0,5
4,7
0,2
33,2
0,1
0,1
18,9
0,0
0,6

3,6
1,0
0,0
0,0
7,0
0,0
0,0
0,0
3,7
7,4
1,6
0,0

Carbohidratos
78,1
24,2
68,5
64,4
27,1
78,3
53,3
35,5
27,3
67,9
75,0
61,4
Carbohidratos

59,4
79,8
27,8
18,1
13,2
14,2
61,8
68,2
22,4
73,2
67,6
39.3
6,8
17,1
7,4
19,7
5.2
5,8

34

Lechuga
Nabo
Pepina
Rabanitos
Tomate
Zanahoria
Zapallo

Alimento
Aceite
Azucar
Chocolate
Cocoa
Gelatina(seca)*
Limn
Maizena
Margarina
Naranja
Palta
Papaya
Platano isla
Uva negra

1,4
0,8
0,5
0,8
0,8
0,6
0,7

0,2
0,2
0,1
0,0
0,2
0,4
0,2

Protena

Lpido

0,0
0,0
2.0
9,0
85,6
0.5
8,0
0,6
1.2
1,7
0,4
0,8
0,3

3,3
5,2
2,7
3,1
4,0
9,5
6,4

Carbohidratos

100
0,0
30,0
19,0
0,1
0,0
3,0
81
0,0
12,6
0,1
0,2
0,1

0,0
99,5
60,0
31,0
0,0
11,2
74,0
0,4
11,2
6,5
8,3
23,8
17,9

* Se usan al 3-4g%

GASTOS DE ENERGIA DE ACUERDO A ACTIVIDAD Y SEXO

ACTIVIDAD
Durmiendo
Muy Ligera: manejo de auto,
laboratorio, mecanografa, coser y
planchar
Ligera:
caminar,
carpintera,
mecanica, lavado de ropa
Moderada: fregar pisos, ciclismo,
tenis, baile
Pesada: albail, natacin, ftbol,
bsquetbol.

MUJER :
Kcal /kg/hora
1,1
2,0

HOMBRE :
Kcal /k Kg/hora
1,0 1,2
,91,2 2.5
1,1-

3,9

2,5-4,9

2,0-

5,9

5,0-7,4

4,0-

10,0

7,5-12,0

6,0-

35