Strukturna organizacija

organizacija eukariotskih
eukariotskih genoma
GENOMIKA- oblast molekularne biologije
GENOMIKAkoja se bavi istra
istraivanjem
ivanjem strukturne i
funkcionalne organizacije genoma
GENOM EUKARIOTAEUKARIOTA-skup naslednih
informacija jedne haploidne elije

KARAKTERISTIKE GENOMA :
VELIINA broj baznih parova u haploidnoj garnituri hromozoma i
oznaava se kao CC-VREDNOST
PARADOKS CC-VREDNOSTI -odsustvo korelacije izmedju CC-vrednosti
i evolutivne sloenosti eukariotskih organizmapove
organizmapoveanje
anje veliine
genoma ne znai i poveanje broja gena
GUSTINA GENA broj gena u sekvenci DNK dugoj 1Mb (milion
baznih parova)

Gustina gena

Valjkasti
crvi
Vinska
muica
kvasci
virusi
i

bakterije

1.2 x 10 7 180 x 10 6

97 x10 6

ta je gen?
I

Region genoma koji se segregira tokom mejoze kao jedna jedinica i

dovodi do pojave jedne definisane fenotipske osobineosobine-Mendel

II Archibald Garrod je 1902. god

god.., prvi put predlo
predloio koncept da je
gen odgovoran za produkciju specifi
specifinog proteina:
proteina: Deo genoma
koji diriguje sintezom jednog enzima/jednog proteina prva
molekularna definicija
III Deo DNK koji se transkribuje u iRNK koja kodira jedan
polipetidni lanac ili u strukturni RNK molekul (rRNK ili tRNK)
IV Niz nukleotida u DNK (ili RNK, kod nekih virusa) koji obavlja
specifinu funkciju:
funkciju:
STRUKTURNI GENI -kodiraju polipeptidne lance ili RNK
molekule
REGULATORNI GENI -ne transkribuju sei predstavljaju
mesta vezivanja specifinih regulatornih molekula

Sekvence kompletnih genoma

pekarskog kvascakvasca-Saccharomyces
cerevisae ( 1.2 x 107 bp DNK) Genom
S.cerevisae sadri
sadri oko 6000 gena: 5885
protein ko
kodirajuih sekvenci (70%),
(70%), 140
ribozomalnih RNK gena, 275 gena za
transportne RNK, 40 gena koji kodiraju
male jedarne RNK ukljuene u obradu
RNK. (1992
(1992--1996)

genom crva Caenorhabditis elegans (97 x106)

sekvenciran je 1998. God.God.-sadri oko 19000
protein kodirajuih sekvenci, to ini oko 25
% genoma
genom Drozofile (180
180xx106 bp ) sekvenciran je
2000.. god
2000
god.. I otkriveno je otprilike 13600 gena,
sa protein
protein--kodirajuim sekvencama koje ine
oko 13
13%
% genoma.
genoma.

Organizmi

vrsta

broj hromozoma

kodirajui %

broj
gena

Bakterije

Escherichia
coli

4377

88 %

kvasac

Saccharomyces cerevisiae

16

6241

70 %

crvi

Caenorhabditis
elegans

19,820

27 %

muica

Drosophila
melanogaster

13,601

20 %

Mi

Mus musculus

20

~30,000

<3%

Humani
genom

Homo sapiens

23

~30,000

<3%

Trend smanjivanja gustine protein kodirajuih gena, kako se poveava

kompleksnost organizama- zbog poveanja duine gena i duine
intergenskih sekvenci

Veliina genoma u elijama eukariota premauje

zbir gena koji kodiraju sve elijske proteine!
Postojanje vie kopija gena ?

Kinetika renaturacije denaturisane

hromozomske DNK
Brzina reakcije drugog reda:
Co x t1/2=M/k m
Co=poetna koncentracija fragmenata jednolanane DNK,
t1/2=vreme potrebno da se renaturie 50% DNK,
M=relativna molekulska masa ispitivane DNK, k = konstanta brzine
reakcije i m = relativna molekulska masa niza nukleotida (fragmenta)
koji je u ukupnoj DNK zastupljen u samo jednoj kopiji.

Kinetika renaturacije eukariotskih DNK

Jedinstvenim redosledima nukleotida odgovaraju Cot1/2 vrednosti vee od 100

25%
500000 x

1 kopija
30%
100 x

45%

Sloena organizacija genoma kod

eukariota

Podseanje: bakterijski genom

Podse
1 hromozom
Po jedna kopija svakog gena
Nizovi nukleotida koji se ponavljaju nisu
zastupljeni

U eukariotskom genomu se nalaze

sledei tipovi gena:
1. Jedinstveni, protein kodirajui nizovi
2. Ponovljene sekvence
3. Tandemske genske strukture
4. Familije gena i
5. Transpozabilni elementi

GENOM EUKARIOTA
Jedinstveni protein kodirajui geni (45%
genoma):: nalaze u po jednoj kopiji po
genoma)
haploidnom genomu - geni
geni koji kodiraju
proteine , rRNK i tRNK
Ponovljene sekvence:
sekvence: ponavljaju se u
haploidnom genomu u nekoliko stotina do
nekoliko miliona kopija
1. INTERMEDIJERNI NIZOVI
2. SATELITSKE DNK

Satelitske DNK
VISOKO PONOVLJIVE SEKVENCE
ine ih kratki nizovi nukleotida (5(5-10, 10
10--100 u genomima
kimenjaka i biljaka) koji se uzastopno ponavljaju 100000100000milion puta kao TANDEMSKI PONOVCI (kopije postavljene
jedna uz drugu, u nizu: GTTAC
GTTACGTTAC
GTTACGTTAC
GTTAC...
...

Prva satelitska DNK otkrivena je kod kraba, kod kojih ona

predstavlja viestruki ponovak redosleda od samo dva
nukleotida (A i T) koji ine 30%
30% genoma krabe
krabe..
Ukupna duina 10 -10
Satelitska DNK se ne transkribuje i uvek se nalazi u
regionima konstitutivnog heterohromatina,
heterohromatina, najee u
regionu centromera
Uloge:strukturna
Uloge:
strukturna--odravanje strukture i organizacije jedra
i hromozoma, sparivanje hromozoma tokom deobe
Razlikuju se od glavnine hromozomalne DNK po
nukleotidnom sastavu, izmedju vrsta po svojoj primarnoj
strukturi i po lokalizaciji u hromozomuhromozomu- genetiki
nestabilne strukture
5

Satelitska DNK

Posebne satelitske DNK sisara

3% genoma
Krae od tipinih satelita i rasute na vie mesta
MINISATELITI:: 15MINISATELITI
15-100 nukleotida koji se ponavljaju
1010-100 puta , ukupna duina 100
100--10000 bp, kod
oveka su u telomernim regionima. Poto broj
ponovaka varira od individue do individueindividue-tandemski
ponovci promenljivog broja (VNTR, variable number
tandem repeats )
MIKROSATELITI:: 1MIKROSATELITI
1-4 nukleotida koji se ponavljaju
dajui regione duine 1010-100 bp. Rasuti po celom
genomu pa i unutar kodirajuih nizova nukleotida

Intermedijerni nizovi nukleotida

2525-40% sisarskih genoma
umereno ponovljene
ponovljene sekvence;
sekvence; duine od
nekoliko stotina (SINEs(SINEs-short interspersed
elements) do nekoliko hiljada (LINEs(LINEs-long
interspersed elements) nukleotida koji se
ponavljaju po nekoliko hiljada puta;
puta;
ratrkani po celom genomu
ratrkani
Parazitske (selfish) DNK,
DNK,
mnogi od njih se transkribuju bilo kao deo velikih
RNK transkripta, koji se tokom obrade RNK
isecaju,bilo kao kratki RNK molekuli. Samo
interemedijerni nizovi koji ine tzv. spoljanje
margine ili graninike izmedju gena se nikada ne
transkribuju
Geni za rRNK,tRNK I 5S RNK, histone I sl.

Uloge intermedijernih nizova

mesta na kojima zapoinje replikacija,

signali za obradu primarnog transkripta,
nizovi nuklotida koji imaju regulatornu ulogu u transkripciji
predstavljaju materijal od koga nastaju novi funkcionalni geni
odranje stabilnosti genoma

Tandemski ponovljeni geni

viestruko ponovljene kopije istog gena (geni za histone, rRNK i
tRNK)) Kod Drosophila, pet gena za histone su nagomilani u niz
tRNK
duine 50005000-6000 bp, i svaka gomila se grupno ponavlja izmedju
100 i 1000 puta;
puta; Tri gena koja kodiraju 18S, 5.8S i 28S rRNK su
grupisani zajedno inei transkripcionu jedinicu koja se
transkribuje RNK polimerazom I;
I; 5S rRNK se sintetie odvojeno ;
njen gen je u vidu tandemski ponovljenih sekvenci koje se
razlikuju od onih prisutnih u ostala tri gena za rRNK. Kod X.laevis
ponovljeni blok ine 5S rRNK gen, pseudogen (segment 5S rRNK
koji se ne transkribuje) i jedan netranskribovani deo promenljive
duine od oko 400bp. 5S rRNK se transkribuju van nukleolusa
RNK polimerazom III, a zatim se transkript transportuje u
nukleolus radi inkorporacije u veliku ribozomalnu subjedinicu.
subjedinicu.
Genom oveka ima 350 gena za rRNK, nalaze se u sekundarnim
suenjima hromozoma13,14,15,21 i 22.)

Familije gena
Sastoje se od gena sline,
ali ne identine primarne
strukture
genske familije vode
poreklo od jednog
zajednikog pretka ijom
duplikacijom i mutacijama
tokom evolucije dolazi do
pojave razliitih ali srodnih
formi
albumin, alfa fetoprotein,
serin proteaze, interferoni i
imunoglobulini,aktin,
imunoglobulini
,aktin, i
subjedinice hemoglobina

Geni koji kodiraju i varijante Hb subjedinica nalaze se u blokovima na razliitim

hromozomima. Kod ljudi i drugih sisara geni u globinskom bloku su aranirani po redosledu
njihove ekspresije tokom razvia.
Alfa globinski blok zauzima oko 28 kb i sadri 3 funkcionalna gena i 2 pseudogena
Beta globinski blok zauzima oko 50 kb i sadri 5 funkcionalnih gena i pseudogene

PSEUDOGENI-neaktivni geni, ne transkribuju se, nefunkcionalni zbog

PSEUDOGENInagomilanih mutacija

Mobilni genetiki elementielementi-skoi geni

Barbara McClintock (Nobelova nagrada 1983.)
Barbara
1983.)-- sekvence
koje se premetaju kroz genom preko DNK ili RNK
intermedijera unutar istog ili razliitih hromozoma.
Transpozon se ugradjuje u sluajno odabrana mesta u
hromozomu te moe da naru
narui integritet vitalnih
gena..T
gena..
Transpozicija replikativnim mehanizmom je
odgovorna za programirane DNK rearanmane koji reguliu
ekspresiju gena.;p
gena.;premetanje
remetanje je inicirano delovanjem
mesto--specifinih nukleaza koje seku specifino ciljno
mesto
mesto u kome se kopija transpozabilnog elementa ubacuje.

Transpozicija forma
genetike rekombinacije kojom
se genetiki elementi ,
transpozoni, premetaju sa
jednog na drugo mesto u DNK
delovanjem transpozaza
Cut-and -paste
transpozicija

Replikativna transpozicija

STRUKTURNA ORGANIZACIJA
EUKARIOTSKIH GENA

Diskontinuiranost eukariotskih gena

Koliina DNK u genomu eukariota premauje zbir gena koji kodiraju sve
prisutne proteine u elijama
1977.- replikacija adenovirusa u
kulturi elija (Philip Sharp ,
Richard Roberts)
hibridi nekih gena adenovirusa i
njima odgovarajuih iRNK sadre
jednolanane petlje to znai da
se iRNK ne sparuje sa celom
duinom gena naspram koga se
sintetie
egzoni (eng. exons, regions that
will be expressed)
introni (eng. introns, intragenic
regions ili ''junk'' DNK)

Karakteristike introna
Po definiciji gen poinje i zavrava se egzonima to
odgovara 5' i 3' kraju iRNK. Introni su sekvence
izmedju egzona koje bivaju uklonjene u procesu
obrade primarnog transkripta pri dobijanju zrele
iRNK.

Introni se mogu nai i u 3' netranslatirajuem delu iRNK, u

protein kodirajuem kao i u 5' lider regionu iRNK.
iRNK.
Dok neki geni mogu imati samo nekoliko introna, drugi mogu
imati i preko 50 introna.
Njihova veliina moe biti manja od 50 baznih parova, ali i
vea i od 200 000 baznih parova. Ukupna duina introna u
genu najee je vea od ukupne duine egzona. Egzoni u
veini gena imaju izmeu 100 i 250 baznih parova.
Broj introna u genima koji kodiraju iste proteine nije isti za
sve organizme, pa ni u istom organizmu (geni za insulin
pacova npr.)
genetiki fosilifosili- mogua uloga u rani fazama genetike
evolucije
Nestabilniji od egzona, podloni insercijama i delecijama

prokarioti
jednoelijski
eukarioti
pekarski kvasac
vinska muica
Sisari,ovek

proten distrofin

diskontinuirani geni

prisustvo introna

nisu prisutni

retka pojava

mali broj

mali broj

4%

mali broj

83%

gen sa 1-4 introna

vie od 90%

veliki broj introna

Nediskontinuirani geni:
multipni geni koji kodiraju histone ;
gen kod kimenjaka koji kodira interferon;
interferon;
mitohondrijska DNK sisarskih elija;
elija;
geni jednostavnijih eukariota, poput kvasca ;
geni za tRNK gena izuzev gena za tirozin tRNK,
fenilalanin--, serinfenilalanin
serin-,leucin
,leucin--, izoleucin
izoleucin--,triptofan,triptofan-, prolinprolin- i
lizin tRNK.

Genske karakteristike

karakteristike

opis

CpG ostrva

Mnogi geni imaju GC bogate uzvodne regione koji mogu da ukjue prvi egzon. Za razliku od ostatka
genoma ne postoji deficit dinukleotida CpG.

Egzoni

Predstavljaju delove gena koji e se prepisati u iRNK nakon to se primarni transkript obradi.

Introni

deo gena koji se uklanja iz primarnog transkripta splajsovanjem

ifarski region

region gena koji nosi informaciju za sintezu proteina.

5'UTR

Region egzona 1 izmeu kapice i startnog kodona AUG od koga zapoinje translacija

3'UTR

Region krajnjeg egzona izmeu stop translacionog kodona i poli A mesta na kraju transkripta

VRSTE I FUNKCIJE RNK

iRNK - informacija za sintezu proteina
rRNK - strukturne komponente ribozoma
tRNK - adapteri u procesu translacije,
prevodioci genetike ifre
Osnovna gradja ista, razlikuju se po baznom sastavu,
sekundarnoj strukturi i veliini, sintetiu se u eliji u procesu
transkripcije

iRNK

S sedimentacioni koeficijent, brzina sedimentacije molekula u gustinskom gradijentu,

jedinica 1 Svedberg (S)

Heterogene i po baznom sastavu, I po veliini

rRNK unutar jedne vrste ista primarna

struktura
prokar.: 16 S (1600 n) + 23 S (3200 n) + 5 S
eukar.: 18 S (2500 n) + 28 S (5500 n) + 5,8 S + 5 S

modifikacije baza
G-C sadraj

tRNK najmanje : 4 S (70-90 n)

modifikacije baza
Bogate G-C parovima

Svaka iRNK se sastoji iz:

5 netranslatirajueg regiona, 5UTR (eng. Untranslated region, UTR) - deo iRNK
od prvog nukleotida do protein kodirajueg regiona.
Protein-kodirajueg regiona -otvoreni okvir itanja (eng. Open reading frame, ORF) i
3 netranslatirajueg regiona, 3UTR - deo iRNK od kraja protein-kodirajueg
regiona do zadnjeg nukleotida same iRNK

Prvi kodon u ORFORF-u se naziva start kodon, a poslednji stop kodon.

Startni kodon kod eukariota je uvek ifra za aminokiselinu metionin i
nikada se ne nalazi na samom poetku 5-kraja iRNK, ve mu
prethodi niz nukleotida koji se ne prevodi u protein, a naziva se
eoni niz ili lider vodeavodea- sekvenca.
Start kodoni kod prokariota su 5 AUG 3 ili 5 GUG 3, a nekada i 5
UUG 3, dok je start kodon kod eukariota uvek 5 AUG 3.
Start kodon ima dve vane funkcije:
Odreuje prvu ak koja e biti ugraena u rastui polipeptidni lanac.
Definie okvir itanja za sve ostale kodone.
Stop kodon definie kraj ORF i predstavlja signal za terminaciju sinteze
polipeptida. Stop kodoni su 5 UAG 3, 5 UGA 3 i 5 UAA 3. Nakon
stop kodona postoji deo koji se ne prepisuje u protein

TRANSKRIPCIJA
Sinteza RNK kao kopije ogranienog regiona DNK, katalizovana
RNK polimerazom

Transkripcija podrazumeva sledee korake:

korake:
(1).. Vezivanje RNK polimeraze za mesto inicijacije.
(1)
inicijacije.
DNK sekvenca koja predstavlja mesto inicijacije transkripcije se
naziva promotor
promotor..
Prokariotske polimeraze mogu da prepoznaju same promotor i da se
veu direktno za njega ali eukariotske polimeraze da bi se vezale za
promotor zahtevaju prisustvo proteina koji se nazivaju transkripcioni
faktori
(2) Rasplitanje, topljenje dvolananog molekula DNK moe da
ostvari enzim helikaza. Prokariotske polimeraze imaju helikaznu
aktivnost ali eukariotske polimeraze nemaju. Razmotavanje
eukariotskuh DNK se nalazi pod kontrolom transkripcionih faktora
(3) Elongacija sinteza RNK se sprovodi prema sekvencama
zapisanim u DNK templetutempletu- matrici
matrici.. RNK polimeraza koristi
nukleozid 5 trifosfate (NTPs) za sintezu RNK lanca
(4) Terminacija sinteze
sinteze.. Prokarioti i eukarioti koriste razliite
terminacione signale za zaustavljanje transkripcije.

Opti pregled transkripcionih dogadjaja

Transkripciona jedinica-segment DNK koji se
prepisuje
1.Vezivanje RNK polimeraze za promotor
2.Odvijanje DNK (17n), povezivanje prva
dva ribonukleozid trifosfataATP;GTP;CTP;UTP, (faza inicijacije)
3. produivanje RNK lanca u smeru 5- 3;
(faza elongacije)
3. Terminacija i odvajanje RNK polimeraze i
RNK produkta

Proizvodi transkripcije: iRNK, tRNK,rRNK, snRNK (mala nuklearna RNK),

snoRNK (mala nukleolusna RNK) i druge nekodirajue RNK

Osnovna
reakcija
transkripcije
Formiranje
fosfodiestarske veze

Orijentacija promotora i
izbor lanca-matrice

Prepisuje se uvek samo jedan deo

jednog lanca DNK, a drugi ne. Koji
od lanaca e biti prepisan diktiraju
enzimi polimeraze koji mogu da
deluju samo u pravcu 5'-3' , znai da
e lanac matrica biti u pravcu 3 '- 5'

Novosintetisani (sense ili smisleni lanac) lanac RNK je i po smeru i po

redosledu nukleotida identian lancu DNK koji nije prepisan osim to
umesto T ugradjuje U (nonsense ili besmisleni lanac )

Transkripcija kod prokariota

Kod prokariota transkripcija se odvija u nukleoidu.
nukleoidu.
Sve tri vrste RNK prepisuje isti enzim, RNK
polimeraza
Transkripciona jedinica -segment DNK koji se
prepisuje
Molekul iRNK, koji nastaje na ovaj nain se ne
obrauje, odmah po sintezi je funkcionalan, nosi
informaciju za sintezu obino vie proteina, koji su
potrebni za obavljanje jednog metabolikog procesa.
procesa.
Poto se set susednih gena prepisuje na jednu RNK
koja onda kodira vie proteina, ova RNK je oznaena
kao POLICISTRONSKA
Kod eukariotaeukariota-1gen1gen-1RNK
1RNK--1 protein
protein-MONOCISTRONSKA RNK

TRANSKRIPCIJA KOD PROKARIOTA

Istovremeno sa translacijom
iRNK - kratkoivee

RNK polimeraza E.coli

RNK polimeraza se kod prokariota sastoji iz 6 polipeptidnih lanaca; , , ,
', i , u momentu kada gradi holoenzim. Jezgro enzima predstavljaju 5
subjedinice (, , , ' ), a kada se jezgru pridrui sigma subjedinica,
nastaje holoenzim; kanal irine dsDNK i duine 16 bp.

Jezgro: -katal. centar: - nespecifino vezuje za DNK

kanalom i klizi du lanca. Ugradjuje 50 nukleotida/sec
Sigma subjedinica ima ulogu u prepoznavanju promotorskog regiona.
Jezgro katalizuje formiranje fosfodiesterske veze

RNK polimeraze po svom obliku podeseaju na

rakova kleta. Ruice rakovih kleta se sastoje od
dve najvee subjedinice i Kompletan enzim RNK
polimeraza klizi du DNK molekula dok sigma
subjedinica ne prepozna specifian redosled
nukleotida, i koji se nalazi u okviru promotorskog
regiona.

5 kanala: za ulaz i ugradnju NTP, za ulaz i izlaz DNK, za izlaz RNK

RNK polimeraza,
polimeraza, za razliku od DNK pol, moe
da inicira sintezu RNK molekula de novo,
novo, to
zahteva da inicijacioni ribonukleotid ue u
aktivno mesto gde e biti stabilno dran u
sparenom stanju sa matricom dok se ne doda
drugi ribonukleotid, odnosno dok se ne formira
prva fosfodiestarka veza. Skoro svi RNK
molekuli na poetku imaju A nukleotid, to je
posledica toga to RNK pol moe da uspostavi
specifine intreakcije sa A ribonukleotidom, koje
su dovoljne da stabilno odre poetni nukleotid
do ugradnje sledeeg.

Bakterijski promotori (E-coli)

Konsenzusni nizovi: 2 x 6 n nizova na rastojanju 16 19 n koje prepoznaje subjedinica, na istoj strani
DNK molekula
TTGACA (recognition domain; oko -35)
TATAAT (Pribnovljev blok; unwinding domain; oko 10)
Orijentacija promotora zavisi od medjusobnog
poloaja dva heksanukleotida
Mesto poetka
transkripcije
-35
-10
+1
5' TAGTGTATTGACATGATAGAAGCACTCTACTATAATCTCAATAGGTCCACG 3'
3' ATCACATAACTGTACTATCTTCGTGAGATGATATTAGAGTTATCCAGGTGC 5'

DNK

Uzvodno

Transkripcija
5'
iRNK

Nizvodno

Razliiti bakterijski promotori

UP element vezuje CTD

INICIJACIJA TRANSKRIPCIJE
I: Zatvoreni kompleks subjedinice i DNK na poziciji -35
II: Lokalna denaturacija DNK (17bp) helikazom oko regiona 10 (AT parovi)
III:Otvoreni kompleks RNK pol sa lancem matricom
IV: Disocijacija subjedinice, jezgro ostaje vezano

ELONGACIJA LANCA RNK

Brzina 20-50 n/s
Velika tanost
Za vreme elongacije RNK polimeraza obavlja itav niz funkcija:
Odmotova DNK ispred sebe
Sintetie RNK
Disocira rastui lanac RNK od DNK matrice
Renaturie DNK iza sebe

Transkripcija E.coli RNK polimerazom

TERMINACIJA TRANSKRIPCIJE
E.coli

5 - CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAACTTTCTTTAATGA - 3
3 - GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAAGAAATTACT - 5
DNK
Transkripcija
5 - CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU -3-OH
RNK
Savijanje RNK

C
U
C
U
G
GC
AU
CG
CG
Intramolekulska zavojnica
GC
CG
CG
GC
A
A
5 - CCCAC
UUUU - 3-OH

Invertovani ponovci

Simetrini nizovi u
kojima su nukleotidi
itani sa dva kraja u
suprotnim pravcima
komplementarni

Poli-U/Poli A RNK-DNK hibrid ubrzo

disosuje I RNK kao I RNK polimeraza se
odvajaju

TRANSKRIPCIJA KOD
EUKARIOTA

Razlike izmedju inicijacija transkripcije kod

prokariota i eukariota

(1)
Bakterije sadre jedan tip RNK polimeraze dok eukariote
sadre 3 tipa koje transkribuju razliite tipove gena.
(2)
Bakterijska RNK polimeraza moe sama inicirati
transkripciju dok eukarioteske zahtevaju pomo odredjenih
proteina-transkripcionih faktora
(3) Proteini koji reguliu ekspresiju gena eukariota mogu uticati
na inicijaciju transkripcije i kada se veu za DNK hiljadama
baznih parova daleko od promotora

(4) Inicijacija transkripcije kod eukariota je kompleksnija i zbog

pakovanja DNK u nukleozome.

Tranksripcija i translacija vremenski i prostorno

odvojene
RNK polimeraze (14(14-18 subjed.) Pored jedarnih
eukariotske elije sadre RNK polimeraze i u mitohondrijama i
hloroplastima

RNK polimeraza II (geni koji kodiraju proteine; 202040% ukupne aktivnosi))

RNK polimeraza I (18S i 28S rRNK;
5050-70% ukupne aktivnosti))
RNK polimeraza III (tRNK, 5S RNK;
10% ukupne aktivnosti)

RNK polimeraze u eukariotskoj eliji

lokalizacija

produkti

RNK pol I

nukleolus

28S , 18S , 5.8S rRNK

RNK pol II

nukleus

m(i) RNK i neke snRNK

RNK pol III

nukleus

tRNK , 5S rRNK i neke snRNK

Za vezivanje RNK polimeraza za

promotore neophodni su
TRANSKRIPCIONI FAKTORI (TF)

Promotor - definie se prema

mestima za koje se vezuju TF
(promotorskim elementima)

PROMOTORI ZA RNK POLIMERAZU I

Struktura specifina za vrstu, enzim date vrste moe se vezati
samo za promotore iste, ili vrlo srodnih vrsta

Sve rRNK - 1 transkripc. jed. - 1 promotor

Promotor bipartitan - npr. humani
1. niz: -45 do +20 = jezgro promotora
2. niz: -180 do -107 = uzvodni kontrolni
element (UCE; poveava efikasnost)

Za promotorske sekvence se vezuju dva transkripciona faktora, uzvodni vezujui

faktor (UBF) i selektivni faktor 1 (SL1) koji se kooperativno vezuju za promotor i zatim
regrutuju polimerazu I za formiranje inicijacionog kompleksa.

Poto promotor ribozomalnih RNK ne sadri TATA blok, TBP se

ne vezuje za specifinu promotorsku sekvencu, ve asocira sa
rRNK genima preko vezivanja drugih proteina iz SL1 kompleksa
za promotor.

PROMOTORI ZA RNK POLIMERAZU III

Intragenski (prepoznaje promotore koji se nalaze unutar
strukturnih gena) i bipartitni

(1) za 5S RNK - nizovi A i C (poz. +55 do +80)

(2) za tRNK - blokovi A i B
Potrebni TF:
TFIIIC pomae vezivanje TFIIIB
TFIIIB = TBP + 2 prot.; dovodi E

RNK Pol III

Uloga A bloka je da postavi polimerazu u poloaj koji odredjuje
tano mesto inicijacije transkripcije, dok se za B blok vezuju
proteini koji uestvuju u regulaciji transkripcije

PROMOTORI ZA RNK POLIMERAZU II

Jezgro promotora ili minimalni promotor

( ~ 40 bp; dovoljno za transkripciju na bazalnom nivou)
ini ga 4 elementa :1) kratka inicijatorska (Inr) sekvenca (Py2ANPy5)koja
okruuje transkripcioni poetak (A) , 2) TATA box, 3)BRE-TFIIB
recognition element i 4) DRE-Downstream promoter element

Regulatorne sekvence gena

Promotor: TATA blok + uzvodni promotorski elementi
-Proksimalni regulatorni (kontrolni) elementi,
lee uz promotor (elementi unutar 100-200 nukleotida od startnog
mesta) i vezuju regulatorne transkripcione faktore.
-Uzvodne promotorske sekvence
/GC blok: GGGCGG (konst. geni); CAAT blok (mnogi geni;
odreuje efikasnost); CACCC blok; Oct = oktameri (8 bp)/,
-- Distalni regulatorni (kontrolni ) elementi:
Pojaivai,
(enhancers)-pojaavaju transkripciju i vezuju AKTIVATORE
- Utiivai
(silencer)- inhibiraju transkripciju i vezuju REPRESORE
- Koaktivatori (kontroliu aktivnost i posreduju u interakcijama
izmedju aktivatora kompleksa RNK polimeraze vezane za promotor )
Broj, raspored i kombinacija regulatornih sekvenci
razliiti od gena do gena

Promotori su modularni

Podela TF prema ulozi:

Opti TF (faktori inicijacije; formiraju

preinicijacioni kompleks)

TF koji se vezuju za UPE

Inducibilni

Regulatorni
proteini; aktivatori,
represori

Transkripcioni faktori predstavljaju veoma

heterogenu grupu proteina koju ine :
(1) generalni ili opti trans
transkripcioni
kripcioni--faktori i
(2) inducibilni trans
transkripcioni
kripcioni faktori
faktori..
Generalni transkripcioni faktori se vezuju za
promotore svih gena koji se transkribuju
gradeI preinicijacioni kompleks koji ostvaruje
bazalni nivo transkripcije gena.
Tkivno--specifini i/ili inducibilni transkripcioni
Tkivno
faktori specifino prepoznaju pojaivae gena
u onim tkivima u kojima se ti geni
eksprimiraju

Mehanizam delovanja transkripcionih faktora

Tipian transkripcioni faktor sadri
DNK vezujui domen (DVD) koji je odgovoran za specifinost
interakcije sa DNK,
multimerizacioni domen odgovoran za formiranje homo
homo-- ili
heterooligomera i
domen za aktivaciju/inhibiciju procesa transkripcije
(transaktivacioni domen, TAD

DNK vezujui motivi

Strukture DNKDNK-vezivnih domena
TF

1). motiv cinkanih prstiju

Strukturu ovog motiva ini jedinica

jedinica:: X3-CYS
CYS--X2-4-CYS
CYS--X12
12--HIS
HIS--X3,4-HIS
HIS--X4
gde X predstavlja bilo koju aminokiselinu
aminokiselinu.. U okviru ove jedinice atom Zn se
tetraedarski vezuje za 2 Cys ostatka smetena u ukosnici i 2 His ostatka iz heliksa
formirajui petlju dugu 12 a.k. Transkripcioni faktori uvek sadre vie ovih jedinica (137
37)) formirajui prste po kojima je ovaj motiv i dobio naziv (TFIIIA ima 9 prstiju, Sp1
Sp1
ima 3, itd)

2) bazni helix
helix--petlja
petlja--helix motiv (Helix
(Helix-loop--helix, bHLH)
loop
Ovaj motiv sastavljen je od 2 helina lanca koja su razdvojena
petljom nepoznate strukture. Unutar ovih heliksa na svakom 33-4
poloaju javlja se hidrofobna aminokiselina koja uestvuje u
formiranju dimera. Iza ovih regiona nalazi se trei helikoidni
region bogat baznim aminokiselinama, argininom i lizinom, koji
je odgovoran za vezivanje za DNK

3) bazni heliksheliks-zavoj
zavoj--heliks motiv (Helix
(Helix-turn--helix, b HTH)
turn
Sastavljen je od3
od3-4 helina regiona od kojih se po dva nalaze
pod pravim uglom; jedan par je paralelan sa DNK zavojnicom i
vezuje se za nju

4) motiv leucinskog "rajfelusa" (Leucine(Leucinezipper)

Strukturu ovog motiva ine 2 helina regiona od kojih je jedan na
karboksi--terminalnom kraju i njega karakterie prisustvo periodino
karboksi
rasporedjenih leucina, na svakoj sedmoj poziciji tako da su postavljeni
uvek sa iste strane DNK lanca. Na aminoamino-terminalnom kraju leucinskog
regiona nastavlja se region bogat pozitivno naelektrisanim amino
kiselinama, argininom i lizinom.
lizinom. Ovaj bazni region prevashodno
ukljuen u protein
protein--DNK kontakte, dok region bogat leucinom uestvuje
u dimerizaciji. Formiranjem dimera, dva leucinska regiona postavljaju
se sa obe strane DNK heliksa, to omoguava postavljanje dva DVD
dimernog molekula u poloaj dostupan za vezivanje za DNK.

POU motiv
Homeodomen

3 = recognition
helix

Homeodomen + heliks-zavoj-heliks

Podela TF prema motivima preko kojih

dimerizuju
(1)bZIP proteine koji imaju dimerizacioni
domen tipa "leucinskog rajfelusa", i
(2) bHLH proteini kod kojih se dimerizacija
ostvaruje preko "heliks"heliks-petlja
petlja--heliks"
domena

TAD transaktivacioni domeni

: kiseli (snano negativno naelektrisanje
uveava transkripciju)
bogati glutaminom I
bogati prolinom.

REGULACIJA EKSPRESIJE
GENA

Ekspresija gena = sinteza funkcionalnog

produkta

Veina gena se ne eksprimira svo vreme

Sve elije, od bakterija do sisara, imaju
sposobnost da reaguju na signale iz spoljanje
sredine tako to menjaju aktivnost gena u skladu
sa svojim trenutnim potrebama.
Regulacija je vaan deo skoro svakog procesa u
prirodi
ta aktivira gene? ta ih iskljuuje/inaktivira?
ta odredjuje nivo aktivnosti gena?

REGULACIJA EKSPRESIJE
GENA U PROKARIOTSKIM
ELIJAMA

 KONSTITUTIVNI GENI geni koji su stalno aktivni

(npr. Geni koji kodiraju enzime glikolize) i njihova
ekspresija NIJE REGULISANA
REGULISANI GENI- kodiraju enzime metabolikih
procesa (katabolikih/degradativnih ili
anabolikih/sintetskih) koji nisu stalno potrebni

Adaptabilnost i ekonominost genoma

bakterijske elije
Transkripcija i
translacija su spregnute

Fleksibilna organizacija
bakterijskog genoma predstavljena
je transkripcionom jedinicom:
Francois Jacob

Jacques Monod

OPERON

Geni bakterija su grupisani tako da se jedan do drugog nalaze geni koji

kodiraju funkcionalno povezane enzime, najee uesnike jednog
biohemijskog puta. Ceo set takvih gena sadri 1 promotor i transkribuje se
kao 1 transkripciona jedinica, a iRNK je policistronska
Set gena koji predstavlja jednu ekspresionu jedinicu, tj. ukljuuje strukturne
gene i elemente koji kontroliu njihovu ekspresiju, naziva se OPERON
Prednost operonske organizacacije- sinteza vie polipeptida regulisana
2
.
jednim mestom

Skoro kompletna regulacija ekspresije gena kod bakterija odvija se na

nivou transkripcije mehanizmom cis-trans interakcija
Gen je sekvenca DNK molekula koja kodira funkcionalni produkt (protein
ili RNK) koji odlazi sa mesta sinteze i deluje negde drugde-trans-delujui
genski produkt
Geni unutar operona:
strukturni-bilo koji gen koji kodira proteinski produkt
gen regulator-strukturni gen koji kodira protein ukljuen u
regulaciju ekspresije drugih gena
Cis-delujue sekvence- mesta u DNK (OPERATOR) koja reguliu
ekspresiju gena kroz interakcije sa produktima regulatornih gena
Regulacija ekspresije gena kod bakterija odvija se na nivou transkripcije
kroz interakcije produkta regulatornog gena (trans-faktora) sa cisdelujuom sekvencom (promotor i operator)
Regulacija moe biti pozitivna (interakcija sa AKTIVATORIMA,
regulatornimproteinima koji aktiviraju ekspresiju gena/ transkripciju) ili
negativna (dolazi do gaenja genske ekspresije interakcijom sa
REPRESORIMA, regulatornim proteinima koji inhibiraju transkripciju)

LAKTOZNI OPERON
Bakterijski operon za katabolizam laktoze.

Laktoza-beta galaktozid , izvor energije i atoma

ugljenika

DNK

25 n

5'

P Lac I

3'

1040

O
82

lacZ
3510

lacY
780

iRNK

lacA
825

iRNK

monocistronska

Galaktozid
permeaza

policistronska

-galaktozidaza
Lac represor

Tiogalaktozid
transacetilaza

P-promotor,sekvenca koja kae da transkripcija mora zapoeti i koji kontrolie njenu

brzinu;ne prepisuje se u iRNK, O-operator, cis delujui element koji sadri sekvencu od
14bp ogranienu sa obe strane nizom ACAA koju prepoznaju regulatorni represori

Negativna kontrola laktoznog

operona
RNK polimeraza
Lac I

U odsustvu laktoze
represor se vezuje
za O i spreava
vezivanje RNK pol

lacZ

lacY

lacA

Transkripcija je blokirana
(neaktivan operon)

Lac represor u kompleksu sa DNK

Lac represor je alosterini tetramerni
protein sa dva vezna mesta, za DNK i
za induktor-alolaktozu (izomer D-laktoze
koji je u eliji prisutan kad i laktoza)

Galaktozid
permeaza

Laktoza

Laktoza

-galaktozidaza

Alolaktoza
-galaktozidaza

Galaktoza

Glukoza

Alolaktoza je sporedni proizvod

-galaktozidazne reakcije Dlaktoza

Negativna kontrola laktoznog operona

(Jer se transkripcija odvija u odsustvu represora)

RNK polimeraza
Lac I

lacZ

lacY
neakt.
represor

U prisustvu laktoze njen izomer alolaktoza

(induktor) vezuje se za represor,
menja mu konformaciju i slabi afinitet
za operator (alosterina kontrola)

Transkripcija
aktivna

iRNK
Enzimi

Derepresija

lacA

Represor moe da:

onemogui vezivanje RNK polimeraze (lac represor) jer

se preklapa njegovo mesto vezivanja sa mestom RNK pol

inhibira inicijaciju vezujui se za RNK polimerazu koju
spreava da se kree du DNK i zapone transkripciju

inhibira inicijaciju odravajui promotor u konformaciji
nepodesnoj za inicijaciju

Alosterina kontrola Lac operona- alosterinim represorom

koji egzistira u dva konformaciona stanja od kojih je jedno
aktivno a drugo neaktivno

Kompleks lac represor-DNK

Zatvorena konformacija

Konformaciona promena represora

indukovana vezivanjem induktora
otvorena konformacija

Promotor
Strukturni geni

U prisustvu
induktora
represor se ne
vezuje za
operator

O
Neaktivan
represor
+
Aktivacija
transkripcije

Induktor /efektor
induktor

moe imati razliite

efekte na afinitet
represora prema
operatoru

Promotor
Strukturni geni

U prisustvu
induktora
vezivanje
represora za
operator je
olakano

O
Inhibicija
transkripcije
induktor


Regulatorni proteini (represori /aktivatori) su

najee kontrolisani substancama-malim
organskim molekulima prisutnim u eliji ili
njenom okruen (induktori/efektori)- koje su
medjuproizvodi metabolizma proteinskog
produkta gena koga reguliu

Efektori reguliu ekspresiju gena indukujui
alosterne promene proteina

Za katabolike puteve efektori su skoro uvek
substrati (laktoza npr.) koji indukuju ekspresiju
gena i samim tim sintezu proteina

Za anabolike puteve efektori su obino krajnji
produkti metabolikog puta koji represuju gensku
ekspresiju i sintezu enzima

Pozitivna kontrola Lac operona

aktivatorima
operator

DNK
promotor

Kada je aktivator vezan za operator, RNK polimeraza se vezuje za promotor i

zapoinje transkripciju:
Aktivan gen
aktivator

RNK polimeraza

U odsustvu aktivatora RNK polimeraza se ne vezuje za operator. Nema

transkripcije:
Neaktivan gen

Aktivatori
Veina aktivatora ima dva vezujua mesta: jedno za
DNK i jedno za RNK polimerazu
Tipino, aktivator vezuje DNK i RNK polimerazu
istovremeno i dri RNK Pol dovoljno dugo da ona
zapone transkripciju mehanizam
regrutovanja,okupljanja
Ne aktiviraju se svi promotori na isti nain. Nekad RNK
Pol moe efikasno da se vee za promotor, ali kompleks
promotor-RNK pol nije efikasan da konvertuje otvorenu
konformaciju za inicijaciju transkripcije. Tada se
aktivator vee za ovaj kompleks i indukuje
konformacione promene ili u DNK ili u RNK Pol, to
vodi otvaranju DNK i otpoinjanju transkripcije

RNK polimeraza
aktivator
Aktivan gen

U prisustvu
induktora
aktivator se
ne vezuje za
operator

Induktor moe imati

razliite efekte na
afinitet aktivatora
prema operatoru

iRNK
induktor

uklonjeni
aktivator

protein

RNK polimeraza
aktivator
Aktivan gen

U prisustvu
induktora
aktivator se
vezuje za
operator

induktor

CAP ili CRP AKTIVATOR

CAP (catabolite gene activator protein) poznat i kao cAMP
receptor protein (CRP) je dimerni protein, transkripcioni
aktivator E.coli koji aktivira transkripciju mnogih gena
ukljuenih u metabolizam eera (laktoze, galaktoze, arabinoze)
kada u eliji nema dovoljno glukoze, koja je osnovni izvor
energije. Vezuje za DNK samo kad je u kompleksu sa cAMP i
aktivira transkripciju interakcijom sa RNK Pol tako to
poveava frekvenciju inicijacije transkripcije ili menjajui
konformaciju DNK u oblasti promotora
Manjak glukozevie cAMPCAP
kompleksovanjevezivanje za Lac ili druge operone u odsustvu
represorastimulisanje transkripcije
Ovakav mehanizam regulacije omoguava bakterijskoj eliji da
u odsustvu glukoze dodje do potrebne energije razgradnjom npr.
Laktoze
Fenomen represije katabolita

Niska glukoza

Catabolit
activator
protein

ARABINOZNI OPERON (araBAD)

Primer + i kontrole istim proteinom (AraC)
Aktivator

+ L-arabinoza

Transkripciju reguliu kompleks

CAP-cAMP i protein AraC koji
vezuje L-arabinozu

protein AraC

Represor

Strukturni geni
kontrolna mesta

araC

araO2

araO1

CAP

araI

ara B

ara A

ara D

Operator AraC

Regulatorni gen

araBAD iRNK

araC iRNK

Enzimi za razgradnju arabinoze

Ara C

Regulacija transkripcije araBAD operona

Odsustvo AraC

Visok nivo glukoze=

cAMP i L-arabinoza
AraC = represor
cAMP i L-arabinoza
kompleksovanje
AraC i arabinoze
AraC = aktivator

TRIPTOFANSKI OPERON-regulacija
ATENUACIJOM
Sintetie enzime biosinteze aminokiseline triptofan
Regulacija ekspresije na dva naina:
1. Interakcijom
triptofan) i kompleksa represor (trpR gen)-korepresor (Loperatora smanjuje se brzina transkripcije trp-operona 70 puta
2. Atenuacijom preko formiranja sekundarne strukture (ukosnice) u
molekulu iRNK indukovane atenuatorskim regionom trp-operona
Strukturni geni

eoni niz

6720n

LL
L
Prerana terminacija transkripcije trp operona
140n

Regulacija transkripcije Trp operona

Regulacija transkripcije Trp operona

Sadri 2 uzastopna
kodona za Trp