Universidad Industrial de Santander

Facultad de Salud
Escuela de microbiologa
Fisiologa microbiana 2015

INTEGRANTES:

Mara Kamila Prieto Monsalve

Viviana Marcela Vaca Celis
Karen Natalia Villamizar Ojeda

2140321
2140321
2140327

27-07-2015
IDENTIFICACIN DE COLIFORMES EN AGUAS RESIDUALES
PROTOCOLO DE LABORATORIO
Pruebas bioqumicas para identificacin de Coliformes.
Bacilos Gram negativos.
Pruebas
bioqumicas

TSI

LIA

citrato
de
Simmo
ns

Klebsiella

A/A
Gas: +
H2S: -

k/k

Citrobacter

K/A o
A/A
gas + y
HS +

K/A H S
+

A/A
Gas: +
H2S: -

k/k

SIM

fenilal
a-nina
(PPA)

Motilidad

rojo
de
metilo

Voges
Proskau
er

Enterobact
er

malona
to

caldo
nitrato

Fundamentos y siembra.

LIA (Lisina hierro agar)

Tocar el centro de una colonia pura, realizar puncin del medio
hasta el fondo dos veces y estriar en el pico de flauta, dejar sin
asegurar la tapa del tubo. Incubar a 351C por 18-24 horas.

Fundamento: Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos,

especialmente Salmonella spp., basado en la decarboxilacin / desaminacin de la
lisina y en la produccin de cido sulfhdrico.
Sirve para demostrar la produccin de dos enzimas: la lisina descarboxila y la lisina
desaminasa, adems la presencia de sales de hierro sirve para detectar la produccin
de H2S por algunos microorganismos.
El indicador del PH del medio es PRPURA DE BROMOCRESOL, el cual en acidez
vira
al color amarillo y en alcalinidad al color prpura. Por contener pequea cantidad de
Glucosa (1 g/ L) al ser fermentada al fondo del tubo es amarillo y la superficie alcalina.
RESULTADOS

1- Decarboxilacin de la lisina:
-Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta.
-Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo.
2-Desaminacin de la lisina:
Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del gnero Proteus, Providencia y
alguna cepas de Morganella spp.
3-Produccin de cido sulfhdrico:
-Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el lmite del pico y
fondo)

SIM:

A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio slido,

sembrar por puncin profunda con aguja de inoculacin
recta (no usar ansa con anillo). Se debe inocular el centro
del tubo, y la puncin debe abarcar 2 tercios de profundidad
del medio de cultivo desde la superficie. Es importante que
la siembra se realice en lnea recta.
Es un medio semislido destinado a verificar la
movilidad, produccin de indol y de sulfuro de
hidrgeno en un mismo tubo.
Es til para diferenciar miembros de la familia
Enterobacteriaceae.
Es un medio que se usa para determinar la formacin de sulfuro de hidrgeno, la
produccin de indol y la movilidad en el diagnstico de Enterobacterias.
INDOL
Para identificar el Indol, el medio tiene peptonas, y el aminocido triptfano el cual si
las bacterias tienen la enzima triptofanasa hace que se libere el indol (Grupo funcional
del triptfano). Si se libera el indol, ste reacciona con Paradimetil Benzaldehdo
(Kovac)
RESULTADOS
Cepas mviles: producen turbidez del medio, que se extiende mas all de la lnea de
siembra.
Cepas inmviles: el crecimiento se observa solamente en la lnea de siembra.
Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la lnea de siembra o en todo el
medio.
Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color.
Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovac
s o de Erlich.
Cepas indol negativas: sin cambio de color.

Color Rojo: positivo

Color Amarillo: Negativo
(No se liber indol porque la bacteria no tiene triptofanasa)
CIDO SULFHDRICO H2S
El medio tiene tiosulfato, el cual libera cido sulfhdrico que es un gas. ste reacciona
con la Sal de Hierro y forma un precipitado negro que es sulfuro ferroso
Color Negro: Positivo (debido al precipitado)
Sin precipitado Negro: Negativo
MOVILIDAD
Movilidad Negativa: Si la cepa crece solo en la picadura es inmvil

 Movilidad Positiva: Si crece en todo el medio, es mvil.

Siembra: Por picadura. Sembrar el caldo triptfano con el microorganismo por probar e
incubar a 35 C durante 18 a 24 horas. Una vez transcurrido este tiempo, agregar 15
gotas del reactivo haciendo que se deslicen por la pared del tubo. Si se utiliza el
reactivo de Ehrlich, este paso debe ser precedido por el agregado de 1 mL de xilol.
Esto no es necesario con el reactivo de Kovac.

FENILALANINA (PPA)
Medio de cultivo utilizado para diferenciar Morganella morganii
biogrupo 1 y 2, Proteus spp. y Providencia spp., de la mayora de
otros miembros de la familia Enterobacteriaceae, en base a la
presencia de la enzima fenilalanina deaminasa.
Siembra: A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar un
inculo denso estriando la superficie del medio.
Incubacin: Incubar de 18 a 24 horas a 35-37 C, en aerobiosis.
Luego, se debe realizar el revelado: agregar unas gotas de una
solucin acuosa de cloruro frrico al 10%
Determina la capacidad e la bacteria para desaminar el aminocido fenilalanina en
cido fenilpirvico por accin de la enzima Fenilalanina desaminasa, esto va a
producir una acidificacin del medio, que se va a poner de manifiesto mediante la
aplicacin de 0,2 - 0,3 mL de Cloruro frrico al 10 %, si hay en el medio c.
fenilpirvico aparece una coloracin verde-azulada.
RESULTADOS
- Agregar 4 a 5 gotas de Fenilalanina Reactivo (REF B1550461).
- Rotar el reactivo con suavidad sobre el pico de flauta.
- Observar el color dentro de los primeros 5 minutos.
Positivo: desarrollo de color verde plido a intenso en el pico de flauta y en el lquido
de condensacin.
Negativo: sin cambios de color. El medio permanece amarillo debido al color del
reactivo.

CALDO NITRATO: REDUCCIN DE NITRATO A NITRITO.

Con esta prueba se investiga la capacidad de las bacterias para reducir los nitratos
convirtindolos en nitritos o en nitrgeno, es decir se estudia la presencia de nitrato
reductasa y nitrito reductasa.
Se utiliza el medio de cultivo caldo nitrato. Para revelar la presencia de nitritos en el
medio se emplearn dos reactivos:
reactivo A (cido sulfamnico al 0.8% en cido actico glacial 5N)
reactivo B (-naftilamina al 0.5% en cido actico glacial 5N)
se aadirn tras la incubacin.
procedimiento: El medio de cultivo lquido se inocula
introduciendo en l una carga de bacterias de la cepa en
estudio mediante el asa bacteriolgica. Se incuba a 37C
durante 24 horas y tras la incubacin se aaden dos gotas
de los reactivos A y B de nitratos que revelarn la
presencia de nitritos en el medio.
Si los nitratos han sido reducidos, el caldo de cultivo virar
a un color rojo intenso por la presencia de nitritos. Si todo
el nitrato ha sido reducido hasta nitrgeno, no se revelar
la presencia de nitritos, pero se observar la aparicin de
burbujas de nitrgeno que se desprenden dentro del tubo
(similar a burbujas de cava).

MOTILIDAD
A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio slido, sembrar por
puncin profunda con aguja de inoculacin recta (no usar ansa con
anillo). Se debe inocular el centro del tubo, y la puncin debe abarcar 2
tercios de profundidad del medio de cultivo desde la superficie. Es
importante que la siembra se realice en lnea recta.

En el medio de cultivo, la triptena, que es un digesto pancretico de

casena, constituye la fuente de nitrgeno, aminocidos y carbono necesarios para
favorecer el crecimiento bacteriano. Adems es una fuente importante de triptfano, lo
cual permite la deteccin de la enzima triptofanasa. Esta enzima, actua sobre el
triptofano y se libera indol, el cual se combina con el aldehido presente en el reactivo
revelador (reactivo de Kovacs o de Erlich), originando un compuesto de color rojo. El
cloruro de sodio permite mantener el balance osmtico del medio. El agar es el agente
solidificante, el cual se encuentra en una concentracin que le da la caractersticas de
medio semislido, util para evidenciar la motilidad bacteriana.
Resultados

Cepas mviles: producen turbidez del medio, que se

extiende ms all de la lnea de siembra.
Cepas inmviles: el crecimiento se observa solamente en la
lnea de siembra.
Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de
agregar el reactivo de Kovacs o de Erlich.
Cepas indol negativas: sin cambio de color.