Secionare a blocului de parafin Clarificare (solveni organici) Hidratare (alcool n concentraie descresctoare) Splare n ap Blocarea enzimelor endogene Splare n sol. salin Blocarea situsurilor antigenice nespecifice Blocarea biotinei endogene Incubare cu primul anticorp Splare n sol. salin Incubare cu anticorpul secundar i sistemul de detecie Detecia semnalului Deshidratarea, clarificarea i acoperirea cu lamela
Blocarea enzimelor endogene
-Peroxidaza Peroxidazele contin gruparea HEM ce utilizeaza H2O2 ca acceptor de electroni pentru a cataliza oxidarea substratului (DAB, AEC). Peroxidaza exogene extrasa din hrean. Peroxidazele endogene:
-PeroxidazaBlocarea peroxidazei endogene se face prin suprasaturare cu H2O2 1-3% in apa distila sau metanol.
Blocarea enzimelor endogene
-Peroxidaza-
Blocarea enzimelor endogene
-Peroxidaza-
Blocarea enzimelor endogene
-Peroxidaza-
Blocarea enzimelor endogene
-Fosfataza alcalina PA (intestin de vitel) muta o grupare P de pe un donor pe un acceptor (ambele componente ale substratului). PA endogena se gaseste in maduva hematogena, vezica urinara si intestin. Blocarea PA se face cu o solutie 5 mM de levamisol.
Blocarea enzimelor endogene
-Fosfataza alcalina-
Blocarea biotinei endogene
Biotina abunda in ficat, rinichi si tesutul limfoid. Vizualizarea biotinei endogene se acentueaza pe sectiunile tratate cu EDTA pH=9.
Blocarea biotinei endogene
Blocarea biotinei endogene
Blocarea biotinei endogene
Blocarea biotinei endogene
Blocarea biotinei endogene
Blocarea biotinei endogene
Blocarea biotinei endogene
Blocarea biotinei endogene
Blocarea biotinei endogene
Blocarea biotinei endogene
Biotina poate lega o singura data Avidina sau Streptavidina !!!
Blocarea biotinei endogene
Incubare cu streptavidina Spalare PBS Incubare cu biotina Spalare PBS
Blocarea situsurilor antigenice nespecifice
Se realizeaz pentru mpiedicarea legrii nespecifice a anticorpului primar care ar conduce la obinerea unui semnal fals. Inainte de anticorpul primar, se incubeaz lamele 30 min la temperatura camerei cu ser normal al aceleiai specii cu anticorpul secundar, sau cu lapte degresat 1-3%. Nu se spala in PBS inainte de adaugarea anticorpului primar.
Blocarea situsurilor antigenice nespecifice
Blocarea situsurilor antigenice nespecifice
Blocarea situsurilor antigenice nespecifice
Blocarea situsurilor antigenice nespecifice
Secvena tipic a IHC
Secionare a blocului de parafin Clarificare (solveni organici) Hidratare (alcool n concentraie descresctoare) Splare n ap Blocarea enzimelor endogene Splare n sol. salin Blocarea situsurilor antigenice nespecifice Blocarea biotinei endogene Incubare cu primul anticorp Splare n sol. salin Incubare cu anticorpul secundar i sistemul de detecie Detecia semnalului Deshidratarea, clarificarea i acoperirea cu lamela
PLANUL PREZENTRII
Metode de blocare a surselor de semnal fals in
IHC
Detectia fluorescenta a semnalului
Detectia fluorescenta a semnalului
Anticorpii se conjuga cu fluorofori (cromofori) care excitati cu o lumina UV de o lungime de unda, pot emite o lumina UV cu energie mai joasa (cu o lungime de unda mai mare).
Detectia fluorescenta a semnalului
(in lumina reflectata!!!)
Detectia fluorescenta a semnalului
Fluoroforii sunt de obicei compusi fenolici: Cei mai folositi: FITC (verde), Texas Red, CY3 (rosu), DAPI (albastru)
In ultimii ani au aparut nanocrostale care emit lumina pe
frecvente ce depind de dimensiunile lor (nanocristale- Qdots)
Detectia fluorescenta a semnalului
Detectia fluorescenta a semnalului
Detectia fluorescenta a semnalului
Avantajele IHC in fluorescenta: 1. Studiile de colocalizare sunt posibile numai prin fluorescenta. 2. Microscopia confocala si deconvolutia permit colocalizarea si reconstructia 3D reale. 3. Detectia nu interfera cu structurile normale (semnal pur). 4. Markerii fluorescenti se pot urmari si in vivo. Dezavantaje: 1. Microscop special dotat cu filtre pentru fiecare cromogen. 2. Vizualizarea nespecifica a unor compusi fluorescenti (lipofuscina).