Sitotoksik , pro - apoptosis , pro - oksidan , dan kegiatan non genotoksik ofa tembaga baru ( II ) kompleks terhadap kanker

serviks manusia
Susana E. Frias memangku Gonzleza , Enrique Angeles Anguianob , Alberto
Mendoza Herrerac , Daniel Escutia Calzadaa , Cynthia Ordaz Pichardoa , *
aLaboratorio de Biologa Celular y Productos Naturales , Escuela Nacional de
Medicina y Homeopata - IPN , Guillermo Massieu Helguera 239 , Fracc .
LaEscalera , Ticoman , D.F. 07.320 , MexicobLaboratorio de Qumica Obat ,
Facultad de Estudios Superiores Cuautitln - UNAM , Av . 1ode Mayo s / n ,
Kolonel Sta . Mara Las Torres , Cuautitln Izcalli , Estado de Mxico 54.740 ,
MexicocLaboratorio de Interaccin Planta - Microorganismo , Centro de
Biotecnologa Genmica - IPN , Blvd . del Maestro s / n Esq . Elas Pi ~ na ,
Reynosa , Tamaulipas88710 , Meksiko
sejarah Artikel : Diterima 19 April 2013 diterima dalam bentuk revisi 8
Agustus 2013 diterima 28 Agustus 2013 tersedia secara online 5 September
2013
Kata kunci : Tembaga ( II ) sel-sel kanker serviks yang kompleks
Sitotoksisitas Genotoksisitas Apoptosisa
abstrak :Cisplatin tetap menjadi salah satu agen kemoterapi yang paling
efektif saat ini ; Namun , complexessynthesis logam telah meningkat dalam
rangka untuk memproduksi obat anti - neoplastik baru dengan DNA
mengikat dan apoptoticactivities dalam sel tumor dan toksisitas kurang
untuk pasien . Dalam studi ini , kami mengevaluasi sitotoksik activ - ity dari
tembaga baru ( II ) kompleks ( LQM402 ) terhadap jalur sel kanker serviks
dan menemukan bahwa LQM402exhibited sitotoksisitas selektif terhadap
HeLa dan Ca Ski sel . Assay FITC - annexin dan DNA fragmenta - tion
menunjukkan bahwa apoptosis dapat terlibat dalam kematian sel HeLa .
Caspase 3/7 dan sitokrom c Hasil analisis menggunakan imunoblotting
menunjukkan jalur intrinsik . LQM402 adalah induktor peroksidasi lipid
Menurut produksi toTBARS . Selain itu , tes Ames dan mikronukleus
menunjukkan non - genotoksik activityfor senyawa ini dalam Salmonella
typhimurium dan tikus CD1 , masing-masing. Oleh karena itu , LQM402
mungkin apromising dan aman senyawa anti-kanker serviks .
Kanker serviks Pendahuluan ( CECA ) adalah keganasan umum di sekitar
theworld . Penyakit ini merupakan masalah kesehatan masyarakat di Latin
Amer - ica , dimana hal itu menyebabkan sekitar 32.000 kematian pada
wanita pertahun ( Almonte et al . , 2010). Karena saat ini digunakan anti tumordrugs menimbulkan efek samping beracun dan resistensi , perlu
toresearch dan mensintesis baru , produk yang efektif untuk treatmentof
tumor canggih yang menyebabkan efek negatif yang lebih sedikit ( Zou et
al . , 2005). Sejak penemuan standar cisplatin obat anti -proliferasi , derivatif
seperti carboplatin , oxaliplatin , dan kompleks othermetal telah disintesis

dan diuji untuk kegiatan anti tumor in vitro ( Chitambar dan Purpi , 2010;
Laine dan Passirani , 2012) dan in vivo ( Chen et al , 2007; . . Milacic et al ,
2006) . Partisipasi tembaga dalam reaksi transfer elektron dari banyak
proses seluler dan fungsinya sebagai komponen metallopro - teinases dan
enzim telah dipertimbangkan selama pengembangan obat kemoterapi
( Marzano et al , 2009; . Wang dan Guo , 2006; Ruiz - Azuara dan Bravo Gomez , 2010). Tembaga , seperti jejak logam lain , adalah penting untuk
protein thatare terlibat dalam beberapa proses biologis , termasuk respirasi ,
metabolisme , sintesis DNA , dan reaksi oksidasi-reduksi ( Marzano et al . ,
2009). Defisiensi tembaga atau ketidakseimbangan adalah asosiasidiasosiasikan dengan gangguan neurologis yang parah , termasuk
Alzheimer , Parkinson ( Donnelly et al . , 2008) , Wilson , dan penyakit
Menkes ' ( Wang dan Guo , 2006) . Karakteristik kimia transitionmetals
memberikan kesempatan untuk mengembangkan obat anti - kanker yang
berbasis logam baru dengan mekanisme yang berbeda dari tindakan;
dengan demikian , complexesthat mengandung tembaga atau logam lainnya
mewakili baru agen antitumor alternatif generationof ( Ruiz - Azuara dan
Bravo - Gomez , 2010). Casiopenas adalah kompleks tembaga yang
designedon dasar dari kegiatan antitumor dari cisplatin dan otherseries
senyawa logam . Senyawa ini ditemukan beseveral kali lebih sitotoksik
daripada cisplatin terhadap beberapa baris sel kanker servikal ( Gracia Mora et al . , 2001) . Berbagai coppercomplexes juga sitotoksik terhadap
jenis sel bisa- cer manusia . A terner tembaga ( II ) kompleks amino - kumarin
dengan phenanthroline menghambat pertumbuhan sel prostat manusia PC3
bisa- cer dan HL - 60 sel kanker leukemia myeloid manusia ( Jiaet al . , 2010).
Benzene - 1 ,2 - dithiol - dimodifikasi , berbasis cisplatin polisi - per ( II ) dan
seng ( II ) kompleks juga terbukti sitotoksik . terhadap lini sel kanker manusia
, termasuk HeLa ( kanker servikal manusia ) , Hep2 (kanker epitel laring
manusia ) , HepG2 ( kanker hati manusia ) , dan MCF - 7 ( sel kanker
payudara manusia ) ( Raman et al . , 2010). Pengobatan with10 - Deacetyl
Baccatin thiosemi - carbazone saja hanya menangkap pertumbuhan sel MCF
- 7 kanker payudara yang layak , sedangkan penambahan tembaga untuk
senyawa yang sama diinduksi mematikan sel terkenal ( Murugkar et al . ,
1999) . Dalam recentyears , laporan kompleks tembaga sitotoksik telah
menunjukkan bahwa themechanism tindakan didasarkan pada interkalasi
DNA dan cleavageactivity ( Krishnamoorthy et al , 2011; . . Lakshmipraba et
al , 2011) atau kegiatan induksi apoptosis ( Boulsourani et al , 2011; .
Tarditoet al . , 2009). Dalam tulisan ini , kami mengevaluasi in vitro sitotoksik
abili - ikatan tembaga ( II ) LQM402 kompleks terhadap empat baris sel
cervicalcancer manusia , yang HeLa dan Ca Ski sel adalah yang paling yang
sensitif . Tangga DNA dan TUNEL tes menunjukkan fragmentasi thatLQM402
pembelahan
DNA
diinduksi
dalam
sel
HeLa
dalam
waktu
dependentmanner . Kami berhipotesis bahwa efek sitotoksik terkait tothe
aktivitas pro - apoptosis LQM402 , seperti yang terdeteksi oleh annexin FITCstaining dan ekspresi berkurang dari pro - caspases 3 dan 7 , juga

sebagai kehadiran sitokrom c dalam ekstrak sitosol . Lebih - lebih , LQM402

tidak menginduksi mutasi pada Salmonella typhimuriumand CD1 tikus .

kimia
Kompleks 4 - acetate { 4 - hydroxi - 3 ,5 -bis ( morpholinomethyl ) } tetra
tembaga ( II ) ( LQM402 . ; Gambar 1 ) ( 4 - Oxo ? ) Tetra - ? Disiapkan
inethanol dengan 1.602 g ligan 2 ,6 - Bis ( morpholinomethyl ) fenol
( Velazquezet al . , 2008) , 1,081 g Cu ( II ) asetat dan 0,1 ml NH4OH .
Solusinya adalah stirredfor 18 jam pada suhu kamar . Pelarut dibuang dan
endapan wascollected dan mengkristal (hasil : 86 % ) . Kristal hijau yang
dihasilkan ditampilkan karakteristik thefollowing : rumus , C44H72Cu4O14N4
; berat molekul , 1132 g / mol , dan titik leleh , 198-200 C ( data tidak
dipublikasikan , dalam pengolahan paten ) .

Budaya garis sel

Empat karsinoma serviks manusia ( CECA ) baris sel , HeLa , Siha , Ca Ski ,
dan C - 33 A , dan fibroblast manusia non - tumoral primer ( FB ) yang
digunakan . Sel HeLa kindlydonated oleh Teresa Ramrez - Apan , M.Sc. dari
Instituto de Qumica di Universidad Nacional Autonoma de Mxico ( UNAM ) .
Siha , Ca Ski , dan C - 33 baris sel yang ramah disumbangkan oleh Juan
Carlos Gomora , Ph.D. dari Instituto de Fisiologa di UNAM.The sel
dipertahankan dalam modifikasi media Eagle Dulbecco yang disuplementasi
dengan 10 % serum janin sapi ( HyClone , Thermo Scientific , Logan , UT ,
USA ) dan 1 % antibiotik antimycotic solusi ( Gibco , Carlsbad , CA , USA )
dalam labu kultur pada 37 C ina 5 % CO2 inkubator dilembabkan . Sel Semi
- konfluen ( 70-80 % ) telah dihapus with0.1with0.1 % tripsin ( Sigma Aldrich , St Louis , MO , USA ) , dicuci dua kali dengan larutan garam fosfatbuffer ( PBS ) yang mengandung 0,2 g KCl , 0,2 g KH2PO4 , 8 g NaCl ,
and2.16 g Na2HPO4 7H2O per liter , pH 7,4 , disentrifugasi , dan
diresuspensi dalam media . September - arately , 5 103FB , HeLa , atau
Siha sel dan 8 103Ca Ski atau C - 33 A sel per wellwere disimpan ke dalam
96 -well microplates . Sel diinkubasi semalam sebelum perawatan
tambahan .

Pengobatan sel dan MTT assay

Sitotoksisitas ditentukan dengan MTT assay standar sebagai describedby
Mosmann ( 1983) . Uji ini didasarkan pada pengurangan MTT kuning ( 3 ( 4,5- dimethythiazol - 2 - il) -2,5 - diphenyltetrazolium bromide ) untuk
formazan bymitochondrial suksinat dehidrogenase dalam sel hidup . Kristal

forma - zan ungu yang dihasilkan dilarutkan dalam DMSO dan kemudian
absorbansi yang measuredand terkait dengan nilai absorbansi formazan
yang diproduksi oleh sel-sel yang tidak diobati . Nilai Theabsorbance dari
formazan berbanding lurus dengan jumlah viablecells ( Cory et al . , 1991) .
Secara singkat , sel-sel CECA yang telah unggulan ke - 96 wellmicroplates
dirawat selama 24 jam dengan konsentrasi yang berbeda LQM402 com pound ( 12,5-100 ? M ) . Cisplatin ( Sigma - Aldrich , St Louis , MO , USA )
pada sameconcentrations digunakan sebagai kontrol positif , dan media
ditambah 1 % DMSO adalah usedas kontrol negatif . Selain itu , sel-sel HeLa
diobati selama 48 dan 72 jam . Aftertreatment , media itu disedot dari sumur
dan diganti dengan media yang memuat MTT ( 1 mg / ml ) , dan sel-sel
diinkubasi untuk tambahan 4 jam pada 37 C.After inkubasi dan
penghapusan media MTT , yang kristal formazan yang dis - diselesaikan
dengan DMSO dan piring yang dibaca pembaca lempeng ( ELx808 , Bio Tek , Winooski , VT , USA ) pada 570 nm. Semua perawatan dilakukan
setidaknya tiga rangkap tiga timesin . Nilai rata-rata yang diperoleh dan
digunakan untuk menghitung persen viabil - ity dengan rumus : % viabilitas
= ( berarti OD sel diperlakukan 100 ) / nilai mean konsentrasi ODcontrol
cells.The yang menyebabkan penghambatan pertumbuhan sel 50 % ( IC50 )
werecalculated dari hubungan dosis - efek setiap baris sel dengan non linear regresi dengan Prism 5.0 software ( GraphPad , La Jolla , CA , USA )
Deteksi phosphatidylserine dengan sitometri assay
Aktivitas apoptosis LQM402 dinilai dengan FITC-label annexin Vbinding dan
serapan PI dengan Annexin-V FITC kit (Biovision, Milpitas, CA, USA). Menurut
instruksi dari pabriknya, 5 sel 104HeLa yang diunggulkan inDMEM Media
dengan 10% FBS dan diizinkan untuk mematuhi selama 24 jam. Pada hari
berikutnya, themedia digantikan dengan media yang berisi LQM402 at
74.74? M dan cellswere diinkubasi untuk tambahan 6, 12, atau 24 jam.
Setelah pengobatan, sel-sel wereharvested, dicuci dua kali dengan PBS,
disuspensi dalam 500? Penyangga l mengikat ditambah 5? Lannexin V-FITC
dan 5? L PI (disediakan dalam kit). Tabung lembut diaduk, disimpan dalam
gelap pada es selama 10 menit, dan dianalisis pada aliran FACScan
cytometer (BDBiosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) (Vermes et al., 1995).

Kematian sel deteksi oleh TUNEL assay

The HeLa diprogram kematian sel dideteksi dengan menggunakan In Situ
Cell Kematian deteksi kit, AP versi 11.0 dari Roche sesuai dengan petunjuk
produsen withminimal modifikasi. Secara singkat, sel-sel HeLa yang
diunggulkan di coverslips dalam 6 wellplates dan diperlakukan dengan
74.74? M LQM402 selama 24, 48, dan 72 jam. 1% DMSO dan 20? Sel
Mcisplatin-diobati (48 jam) adalah kendaraan dan kontrol positif, masingmasing. Aftertreatments, sel dicuci dua kali dengan PBS dan tetap dengan

4% paraformaldehydein PBS pH7.4 dan permeabilized dengan 0,1% Triton X100 dalam 0,1% sodium sitrat selama 20 menit pada 2-8 C. Setelah
permeabilization, sel dicuci dua kali dengan PBS dan cov ditutup dengan 50?
L campuran reaksi TUNEL dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 60 menit
di atmosfer ahumidified dalam gelap. Akhirnya, coverslips dengan sel dibilas
dengan PBS threetimes dan ditempatkan pada slide menggunakan
Vectashield Mounting Media forfluorescence (Vector Labs) untuk observasi
mereka di bawah mikroskop fluoresensi inthe kisaran 515-565 nm (lampu
hijau).

Assay Tangga
(Deteksi fragmentasi DNA) isolasi DNA dari sel HeLa diobati dengan 74.74? M
untuk 24, 48, dan 72 jam wasperformed menggunakan metode DMSO-SDSTE baru sesuai dengan Suman et al., 2012.Floating dan sel-sel yang melekat
seeded dan diperlakukan 100 mm cawan petri yang col-lected dan dicuci
dengan PBS. 100? L DMSO ditambahkan langsung ke sel pelletand dicampur
dengan baik diikuti oleh vortexing. 100? L dari SDS (2% sodium dodesil
sulfat)-TE (Tris-EDTA) (pH 7,4) ditambahkan diikuti dengan mencampur dan
vortexing. Theresulting solusi disentrifugasi pada 13.000 rpm pada 4 C dan
supernatan col-lected dalam tabung baru. 25? L dari supernatan untuk setiap
perlakuan dimuat pada 1,5% agarose gel dan berjalan selama 60 menit pada
100 V. 1% DMSO dan 20? M cisplatin-treatedcells (48 jam) yang kontrol
negatif dan positif, masing-masing.

Analisis Western blotting

Tingkat ekspresi caspases 3, 7, dan 9 dan sitokrom c yang immunoassays
determinedby. Pengendalian dan 74.74? M LQM402-diperlakukan sel HeLa
dari berbeda-ent titik waktu (3, 6, 12, 18, dan 24 jam) dicuci dua kali dengan
PBS dan jumlah atau sitoplasma ekstrak diperoleh dengan RIPA penyangga
(0,5 M Tris-HCl , 1,5 M NaCl, 2,5% asam deoxycholic, 10% NP-40, 10 mM
EDTA) atau digitonin, masing-masing (semua fromSigma-Aldrich) pada pH
7,4, di hadapan Lengkap Protease Inhibitor CocktailTablet (Roche
Diagnostics, Mannheim, Jerman ). Semua reaksi lisis yang performedon
penangas es. Jumlah konsentrasi protein ditentukan menurut metode Bradford (BioRad, Hercules, CA, USA). Jumlah yang sama protein dari masingmasing lisat (30? G) dimuat dan berjalan pada 12% SDS-poliakrilamida gel.
Protein werethen ditransfer ke membran nitroselulosa yang diblokir dengan
5% non-fatmilk di 0,1% Tween 20-Tris buffer saline pada pH 7,5. Setelah
mencuci, hybridiza-tion dilakukan semalam dengan antibodi primer terhadap
caspases 3, 7, and9 dan sitokrom c (1:200; Santa Cruz Biotechnology, Santa
Cruz, CA, USA) pada 4 C.Horseradish peroksidase-conjugated antibodi
sekunder IgG juga digunakan (SantaCruz Bioteknologi), diikuti oleh deteksi

dengan chemiluminescencekit ditingkatkan (Pierce, Rockford, IL, USA) dan

pengembang autoradiografi Film (Kodak, Rochester, NY, USA). Anti-?-Aktin
(1:500) digunakan untuk memastikan pemuatan sama protein pada thegel
(Montes-Sanchez et al., 2009).

Uji Ames
Tes Mutagenisitas adalah tes biologi yang digunakan untuk menilai
mutagenik potensi terjadinya senyawa kimia (Hong et al., 2011). Kami
melakukan tes Ames onthe berikut set histidin auksotrofik S. typhimurium
strain: TA100 (hisG46, rfauvrB pKm101), yang dapat mendeteksi mutasi
substitusi pasangan basa; TA98 (hisD3502, rfa UvrB pKm101), yang dapat
mendeteksi mutasi frameshift; dan TA102 (hisG428, rfa, pQ1, pKm101), yang
dapat mendeteksi kerusakan DNA ROS-diinduksi reaktif. The mutasi genicity
dari LQM402 dievaluasi dalam tiga strain, dengan atau tanpa Arochlor1254
diinduksi tikus homogenat hati (S9 campuran), dengan metode
penggabungan asdescribed oleh Maron dan Ames (1983). Tiga konsentrasi
LQM402 (50, 100, dan 200? M / plate) yang digunakan dalam tidaknya 500?
L dari S9 mix-mendatang. LQM402 dilarutkan dalam DMSO pada konsentrasi
yang ditunjukkan dan mixedwith 100? L kultur bakteri (1-2 109CFU/ml)
dalam 2 ml agar cair yang ditambahkan ke wassubsequently agar minimal
piring Vogel Bonner dengan 0,5 mM histi-dine/biotin. Pelat diinkubasi selama
48 jam pada 37 C dan histidin (+-Nya) koloni reversi dibentuk dihitung
dengan Fisher koloni-counter. Untuk hasil tes Ames yang positif, bahan kimia
yang diuji harus mendorong dua kali lebih banyak + revertantsas Nya
diperoleh dengan pengembalian spontan (Ames et al, 1975;.. Szyba et al,
1992). Kontrol yang positif yang digunakan dalam pengujian ini adalah
picrolonic acid (PA) di 50? g / piring, N-metil-N?-nitro-N-nitrosoguanidin
(NMNG) pada 10? g / piring, mitomycin C (Mit C) AT10 ng / piring, 2Aminoanthracene (2AA) pada 10? g / piring, dan cyclophosphamide (CP)
pada 500? g / piring.

Dalam uji mikronukleus vivo

Tes mikronukleus mendeteksi kromosom rusak yang tidak ditarik ke
theappropriate tiang penggulung karena hilang sentromer kromosom dan
fragmen-fragmen yang tidak dimasukkan ke dalam inti sel anak pada mitosis
(Schmid, 1975). Untuk tes ini, kami menggunakan CD1 tikus jantan (25-30 g)
yang diperoleh dari Rismart, Meksiko. Mencit dipelihara sesuai dengan kantor
Meksiko peraturan forthe produksi, perawatan, dan penggunaan hewan
laboratorium (NOM-062-ZOO-1999) dan theprotocol disetujui oleh Komite
Etika dari Sekolah Nasional Kedokteran andHomeopathy Meksiko
(Pendaftaran No ENMH -CB-010-2011). Tikus-tikus tersebut keptin ruang
hewan pada 25 2 C, 50 5% kelembaban, dan di bawah 12 jam: 12 jam

cahaya darkcycle. Tikus diberi diet standar (Purina, Cuautitlan, Meksiko) dan
adlibitum air. Kelompok perlakuan terdiri dari lima tikus yang masing-masing
mengalami injeksi oneintraperitoneal. Tikus pada kelompok kontrol
(kendaraan) menerima air steril, tikus pada kelompok kontrol positif
menerima 60 mg / kg Mit C, dan tikus dalam kelompok mengobatipemerintah menerima 5, 10, atau 15 mg / kg LQM402 dilarutkan dalam air
steril. Thesame dosis LQM402 juga diberikan kepada tikus yang telah
menerima 60 mg / kgMit C 30 menit sebelumnya dengan tujuan menentukan
potentialof LQM402 anti-mutagenik. Noda darah perifer dari ekor tikus
diperoleh sebelum thetreatments dan pada 24, 48, dan 72 jam setelah
perawatan. Para smear diwarnai dengan larutan Giemsa (Sigma-Aldrich)
dalam larutan dapar fosfat (0,6 M, pH 6,8). Toestimate jumlah eritrosit
polikromatik micronucleated (MNPCE), 1000 eritrosit polikromatik (PCE)
diberi skor per smear (Diaz Barriga et al., 1999) dan rasio PCE diperkirakan
dari tahun 2000 eritrosit. Nilai-nilai yang diperoleh fromLQM402 atau Mit C
hewan yang dirawat dibandingkan dengan yang diperoleh dari
controlanimals.

Lipid peroksidasi inductionEvaluation pembentukan spesies reaktif sering

digunakan untuk mengukur aktivitas theantioxidant atau pro-oksidan dalam
beberapa jenis sampel. Karena malon-dialdehyde dan senyawa sejenis yang
dihasilkan oleh reaksi peroksidasi lipid asam withthiobarbituric, tes ini
bernama asam spesies reaktif thiobarbituric (TBARS) (Cathcart et al., 1991).
Untuk pengujian ini, kami menggunakan tikus Wistar jantan dewasa (200
50 g) yang disediakan oleh Institut of Cellular Physiology-UNAM dan
dipelihara AT25 2 C dan 50 5% kelembaban di bawah 12 h: 12 h
terang-gelap siklus. Tikus-tikus yang fedwith diet dan air baku ad libitum.
Untuk persiapan homogenat otak tikus, hewan-hewan itu dikorbankan
dengan CO2according ke protokol resmi previouslymentioned untuk
menghindari rasa sakit yang tidak perlu. Seluruh otak dengan cepat dibedah
andhomogenized di PBS untuk menghasilkan 1/10 (b / v) homogenat.
Homogenat wassubsequently disentrifugasi selama 10 menit pada 3400 rpm.
Kandungan protein di otak solusi super-natant diukur dengan Folin dan
Ciocalteu yang fenol reagen dan thesolutions disesuaikan dengan larutan
PBS menjadi 2,66 mg / protein ml (Dominguez et al., 2005). Semua
percobaan peroksidasi lipid dilakukan dalam penangas es. Secara singkat,
375? Solusi supernatan otak lof dan 50? L dari 20? M EDTA ditambahkan 1,5
ml tubes.Next, 25? L dari LQM402 pengenceran di DMSO ke konsentrasi yang
berbeda (1-100? M) atau DMSO hanya untuk kontrol ditambahkan ke tabung.
Sampel diinkubasi at37 C selama 3 jam dengan gemetar konstan. Setelah
inkubasi, 500? L larutan TBA (0,5% TBA di 0,05 N NaOH dan 30% asam
trikloroasetat pada rasio 1:1) ditambahkan ke eachmixture dan sampel
didinginkan pada es selama 10 menit, disentrifugasi pada 10.000 rpmfor 5
min, dan diinkubasi pada 90 C selama 30 menit. Setelah pendinginan pada

suhu kamar, absorbansi sampel diukur pada 540 nm dalam pembaca

lempeng (ELx808, Bio-Tek, Winooski, VT). Selain itu, eksperimen kontrol
untuk menguji induksi oflipid peroksidasi dilakukan di hadapan tikus
homogenat otak untuk memberikan pemasukan yang membaca basal atau
20 mM 2,2?-Azobis (2-metil-propionamidine) dihidroklorida (AAPH) atau 10?
M ferrous sulfate ( FeSO4) untuk memberikan pembacaan kontrol positif;
lattercondition diinkubasi selama 1 h.2.11. Aktivitas scavenging assayThe
antioksidan LQM402 diukur dengan 2,2-diphenyl-1-pikrilhidrazil metode
(DPPH). DPPH adalah stabil radikal bebas yang dapat reducedin keberadaan
pemulung radikal bebas, yang di atasnya itu mengkonversi dari warna ungu
aslinya kuning (Waffo Teguo et al., 1998). Secara terpisah, tiga konsentrasi
ofLQM402 (1, 10, dan 100? M) yang telah dilarutkan dalam etanol dari
larutan 20 mM stockDMSO diizinkan untuk bereaksi dengan stabil DPPH
radikal bebas (100? M) for30 menit pada suhu kamar dalam gelap . Setiap
pengenceran diuji dalam rangkap tiga. Thereaction absorbansi diukur pada
515 nm dengan pembaca lempeng (ELx808, Bio-Tek, Winooski, VT).
Persentase aktivitas radikal (% RSA) untuk masing-masing sam-ple dihitung
dibandingkan dengan kelompok kontrol DMSO-diperlakukan accordingto
persamaan berikut: %RSA =
analisis statistik
Data disajikan sebagai mean standard error. Untuk perbandingan
treatedgroups terhadap kelompok kontrol, dua arah ANOVA dan Bonferroni
pasca-tes wereconducted untuk analisis data ketika berlaku. Signifikansi
ditetapkan pada p <0,05, p <0,01, atau p <0.001, tergantung pada
percobaan.

Hasil dan diskusi

3.1. LQM402 adalah sitotoksik terhadap sel CECA di mannerThe obat antineoplastik tergantung aconcentration yang umumnya digunakan untuk
treatCeCa menyebabkan efek samping yang serius dan menghasilkan
resistensi, indi-cating kebutuhan untuk alternatif yang aman untuk
mengobati ini disease.Cis-diaminedichloroplatinum (II) (Cisplatin ) masih
salah satu agen anti-tumor kemoterapi saat mosteffective. Sebagai
tanggapan, beberapa kompleks logam telah disintesis dengan intentto
menghasilkan senyawa anti-neoplastik baru yang mencakup metalssuch
galium, emas, nikel, tembaga, dan seng (Frezza et al, 2010;. Laine dan
Passirani, 2012). Di sinilah kita diuji tembaga baru (II) LQM402 kompleks
terhadap HeLa, Ca Ski, Siha, dan baris sel kanker C-33 A servikal untuk
menentukan data effects.Our anti-tumor potensial pada Gambar. Kegiatan
cyto-toxic tergantung konsentrasi 2 acara diferensial dalam baris sel pada 24
jam. Pada konsentrasi tertinggi (? 100 M), viabilitas menurun sebagai fungsi
dari lineas sel tumor berikut: Siha (57,75%), C-33 A (51.44%), Ca Ski

(36.62%), andHeLa (19,45%); Data ini menunjukkan bahwa sel-sel HeLa

adalah mostsensitive ke LQM402. Di semua lini sel, aktivitas sitotoksik
wasnot diamati pada konsentrasi LQM402 bawah 25 M; ? Namun, pada
konsentrasi mulai dari 50 hingga 100 M, hal ini menyebabkan kerugian
dramatis dalam kelangsungan hidup semua lini sel CECA kecuali untuk Siha
line.The LQM402 IC50 values secara signifikan lebih rendah untuk HeLa dan
sel CaSki (<100 M;? p <0,05) dibandingkan dengan jalur lain sel (> 100 M;?
Tabel 1), menunjukkan kemungkinan perbedaan dalam membran
permeabilityor metabolisme tembaga (II) kompleks antara baris sel.

PICTURE
The Fig. 2. LQM402 menghambat kelangsungan hidup jalur sel kanker
serviks. Garis cancercell serviks HeLa, Siha, Ca Ski, dan C-33 A diobati
dengan berbagai concentrationsof LQM402 selama 24 jam dan dianalisis
dengan MTT assay. Sel viabilitas CECA menurun secara tergantung
aconcentration sementara fibroblas normal (FB) kurang grafik affected.The
menunjukkan
sarana
dan
kesalahan
standar
setidaknya
tiga
independentexperiments, dilakukan dalam rangkap tiga. * P <0,05 dan p ***
<0,001 mewakili significantdifferences dibandingkan dengan kontrol (sel
kendaraan-diobati).

aktivitas sitotoksik senyawa kami adalah sesuai dengan reportsdescribing

kegiatan sitotoksik kompleks tembaga introducedinto sel HeLa oleh vektor
pengiriman nanopartikel (Harris et al., 2011), serta Casiopenas dievaluasi
oleh sulforhodamine b assayin baris sel yang sama yang digunakan dalam
CECA kami studi (Gracia-Mora et al, 2001;.. Krishnamoorthy et al, 2011,
2012). Lain diuji tembaga com-plexes telah menunjukkan menjadi sitotoksik
untuk jalur sel dari differenttypes kanker seperti prostat, hati, dan leukemia
myeloid (Jiaet al, 2010;. Lakshmipraba et al, 2011;. Hammud et al, 2008.).
Inthis studi, fibroblas digunakan sebagai sel non-ganas kendali manusia dan
ditemukan kurang dipengaruhi oleh LQM402 dari tumorcells, menunjukkan
keuntungan untuk kompleks ini sebagai obat antikanker selektif potensial.
Hasil ini sebanding dengan obtainedin studi lain tembaga makrosiklik (II)
kompleks yang wereevaluated pada konsentrasi yang sama (1-100 M?) Dan
oleh samemethod di V79 hamster Cina fibroblas paru-paru normal; bahwa
tingkat kelangsungan hidup sel studyreported di atas 80% pada 50? M dalam
24 jam inkubasi (Fernandes et al., 2007), sementara kompleks kami diinduksi
95,14% bertahan hidup pada saat yang sama konsentrasi dan waktu
inkubasi. Di sisi theother, dibandingkan dengan obat cisplatin antitumor,

LQM402was kurang sitotoksik terhadap sel HeLa; Namun, IC50value

ofLQM402 untuk fibroblas non-tumoral adalah lebih tinggi dari cis-platin,
yang menunjukkan bahwa LQM402 kurang toksik terhadap sel thesenormal
(Tabel 1). Karena selektivitas sel LQM402 forHeLa, kami menguji
sitotoksisitas kompleks tembaga dalam cellline ini pada 48 dan 72 jam dan
dibandingkan dengan pengobatan cisplatin pada thesame kali. IC50values
yang diperoleh menunjukkan pada Tabel 2.3.2. LQM402 menginduksi
phosphatidylserine residu externalizationon obat antikanker HeLa cellsMost
mengerahkan efek mereka dengan induksi apoptosis, yang merupakan
mekanisme aksi dianjurkan karena kurangnya
TABEL
Setiap data yang diberikan sebagai mean dan standard error (SE) dari
setidaknya tiga independen
eksperimen dalam rangkap tiga. Cisplatin IC50: HeLa 18.9

0.99? M, Ca Ski 66,6

8.5? M,
Siha 69,92

1.25? M, C-33 A 64.98

6.88? M, FB 185,23

28,6? M.

TABEL 2
respon inflamasi (Mizutani, 2007; Kerr et al, 1994.). Apo-ptosis merupakan
mekanisme penting dari kematian sel yang terlibat inmany proses fisiologis
yang berkaitan dengan homeostasis dan merupakan centralregulator kondisi
patofisiologi. Sel-sel kanker telah beenreported untuk mengembangkan
beberapa mekanisme yang dapat digunakan untuk melawan kematian selapop Totic, dan ketahanan terhadap apoptosis dianggap kanker hallmarkof
(Hanahan dan Weinberg, 2000, 2011; Ocker dan Hopfner, 2012). Untuk

menentukan apakah efek penghambatan sel viabilitas LQM402 onHeLa

akibat apoptosis, kami mengukur proses apop-Totic oleh annexin V-FITC
pewarnaan dan propidium iodida (PI) akumulasi, berdasarkan awal sandal
phosphatidylserineresidue apoptosis dari dalam ke permukaan luar
sitoplasma membran, dan dianalisis sel pewarnaan oleh aliran cytometry
(van Engelandet al, 1998;.. Vermes et al, 1995). Gambar. 3 menunjukkan
bahwa concentrationof 74.74? M LQM402 mampu menginduksi tergantung
waktu apoptosis pada sel HeLa, dengan frekuensi 10,96% dan 51,44%
apoptoticcells pada 6 dan 24 jam, masing-masing, dibandingkan dengan
5,86% pada 24 jam apoptoticcells dalam sel diobati dengan 0,1% DMSOdiperlakukan; ini findingwas konsisten dengan IC50data kami sebelumnya.
Pada 12 jam, hampir setengah ofthe LQM402-diperlakukan sel HeLa
apoptosis berada di awal apoptosis, dengan sisanya pada akhir apoptosis.
Pada 24 jam, 3,77% dari treatedcells diberi label hanya dengan propidium
iodida (nekrosis) dan sel-sel restof diwarnai oleh kedua annexin V dan PI
(akhir apoptosis), yang menunjukkan bahwa sel-sel telah kehilangan
integritas membran (Caiet al, 2002. ). Karena sebagian besar sel
diperlakukan berada di awal apo-ptosis, kita dapat mengatakan bahwa
LQM402 memiliki potensi yang sama seperti othercopper kompleks untuk
menginduksi apoptosis pada sel HeLa pada titik waktu awal. Sebagai contoh,
karsinoma ovarium manusia (CH1) dan murineleukemia (L1210) sel
dipamerkan perubahan morfologi khas inthe sitoplasma (penyusutan),
kromatin (kondensasi), dan inti (fragmentasi DNA) setelah pengobatan
dengan Casiopena II selama 24 jam (De Vizcaya-Ruiz et al., 2000).
Sebuah dasar tembaga Schiff (II) juga inducedapoptosis di MCF-7 sel pada
konsentrasi 20? M atau kurang dalam 48 hincubation, sebagaimana
ditentukan dengan aliran cytometry (Ma et al., 2012), dan sebuah studi dari
siklus
sel
di
HCT116
sel
menunjukkan
bahwa
polisi-per
bis
(thiosemicarbazone) kompleks induksi apoptosis baik andDNA pembelahan
dalam sel-sel (Palanimuthu et al., 2013). Ini andmany penelitian lain yang
diterbitkan dalam dekade terakhir confirmthat kompleks tembaga potensi
sitotoksik compounds.3.3. LQM402 menginduksi fragmentasi DNA di HeLa
cellsIt diketahui bahwa kematian sel terprogram atau apoptosis adalah
bentuk mostcommon kematian sel dan bahwa proses ini dikaitkan withDNA
pembelahan (Kroemer et al., 2009). Oleh karena itu, untuk mengevaluasi
apakah thecopper LQM402 kompleks mampu menginduksi pembelahan DNA,
kita per-bentuk TUNEL dan tes DNA-tangga dengan HeLacells LQM402dirawat di IC50value diperoleh dalam sel-sel ini pada 24 jam (74.74? M)
selama 24, 48 dan 72 kali jam inkubasi. Dalam uji TUNEL, kami foundDNA
label pembelahan dengan cara tergantung waktu (Gambar 4). Theamount sel
memperlihatkan belahan DNA yang diinduksi oleh LQM402 at72 h adalah
serupa bahwa disebabkan oleh kontrol cisplatin positif, namun, tampaknya
bahwa morfologi atau fragmentationpattern DNA diamati pada beberapa sel
LQM402-diperlakukan berbeda dari dana sel cisplatin-diobati. The TUNEL
Reaksi istimewa labelsDNA istirahat untai yang dihasilkan selama apoptosis;
Namun demikian, DNA GAMBAR HAL 159

Gambar. 3. LQM402 mempromosikan apoptosis. Sel HeLa diobati dengan 1%

DMSO selama 24 jam atau 74,74? M LQM402 selama 6, 12, dan 24 jam
dianalisis dengan aliran cytometry untuk mendeteksi annexinV-FITC
pewarnaan. Persentase sel apoptosis meningkat dengan cara yang
tergantung-waktu di LQM402-diperlakukan sel sel HeLa bila dibandingkan
dengan sel-sel DMSO-diobati. Graphsare wakil dari tiga percobaan
independen, masing-masing dengan 10.000 peristiwa dianalisis.

Gambar. 4. LQM402 menginduksi fragmentasi DNA dengan cara yang

tergantung waktu. Sel HeLa diobati dengan 74.74? M LQM402 untuk (A) 24,
(B) 48, dan (C) 72 h dan DNA strandbreaks diberi label dengan fluorescein
oleh TUNEL assay menunjukkan peningkatan tergantung waktu sel dalam
apoptosis. (D) 1% DMSO dan (E) 20? M cisplatin selama 48 jam digunakan
kontrol asnegative dan positif, masing-masing

Gambar 5. LQM402 perawatan di sel-sel HeLa menginduksi kerusakan DNA.

Sel HeLa weretreated dengan 74.74 M LQM402 pada waktu yang berbeda
poin dan DNA diperoleh withDMSO-SDS-TE metode. Semua perawatan
LQM402 dihasilkan DNA fragmentsof kira-kira 600 bp seperti 20 M cisplatin
lakukan di 24 h. Hanya cisplatin treatmentgenerated beberapa ukuran DNA
fragments.cleavage dapat tidak lengkap dalam beberapa bentuk bentuk sel
kematian atau Mei occurin acak dalam tahap akhir nekrosis (Zong dan
Thompson, 2006). Dalam assay DNA-tangga, kami mengamati degradasi
DNA sel-sel inLQM402-diperlakukan sama sekali waktu diuji (aprox. 600 bp)
com-dikupas dengan sel-sel kontrol. Cisplatin perawatan di 24 h diinduksi
serupa fragmen DNA (600 bp) sebagai pengobatan LQM402, berarti
whileapproximately 1000, 600, dan 400 bp fragmen yang generatedat 48
jam (GB. 5). Beberapa komplek tembaga dengan fitur struktural yang
berbeda telah ditunjukkan untuk mengikat heliks ganda DNA dan Pro mote
double-untai DNA kerusakan, kegiatan ini adalah terutama associatedto
kemampuan mereka untuk menginduksi atau untuk menghasilkan radikal
(Liu et al., 1999).3.4. BlottingApoptosis Barat dan nekrosis adalah jenis
utama dari kematian sel. Setiap ischaracterized oleh fitur morfologi dan
biokimia dan skr-kini sedang, genetika berkontribusi secara khusus
menetapkan proses-proses tersebut (Kroemer et al., 2009; Ouyang et al.,
2012). Namun, ada arealso kurang mekanisme kematian sel belajar seperti
anoikis, cornifica-tion, entosis, mitosis bencana, necroptosis, netosis,
parthanatos, dan pyroptosis (Galluzzi et al., 2012) yang kurang
commonlyobserved.Proses apoptosis tergantung pada aktivasi Yangyang
caspases terlibat dalam kedua jalur ekstrinsik dan intrinsik. Untuk mencegah
tambang jika LQM402 diinduksi aktivasi caspase, kami memperoleh

lysatesfrom HeLa budaya yang diperlakukan dengan kompleks di

differenttime poin dan memeriksa ekspresi caspase-3, caspase-7, dan
caspase-9.
Immunoblotting
percobaan
menunjukkan
thedepletion
procaspase-3 dalam sel-sel HeLa diperlakukan dengan 74.74 MLQM402
untuk 18 dan 24 h, dibandingkan dengan kontrol sel (p < 0.01and p < 0.001,
masing-masing), dan hasil yang sama setelah treatmentwith 20 M cisplatin
untuk 24 h (p < 0.05). Meskipun analisis densitomet-ric tidak menunjukkan
perbedaan yang signifikan antara thetreatments, procaspase-7 dan
procaspase-9 menunjukkan tren ara

tren gambar 6. LQM402 menginduksi perubahan dalam ekspresi protein

terkait apoptosis.Sel HeLa diperlakukan dengan 74.74 M LQM402 pada titik
waktu yang berbeda dan thelysates dianalisis oleh immunoblotting. Ekspresi
dari wasdiminished pro-caspases 3 dan 7 cara tergantung pada waktu.
Denganrasio sitokrom c tingkat meningkat inan inkubasi bergantung pada
waktu cara. Perwakilan bercak dari exper-iments berulang yang ditampilkan.

menuju berkurang ekspresi, yang disarankan pembentukan ofactive bentuk

zymogens ini; Namun, bentuk-bentuk aktif ofthese caspases tidak terdeteksi
di tes kami. Cwas sitokrom dideteksi dalam sitoplasma lisat dari withLQM402
sel-sel yang diperlakukan HeLa untuk 6, 12, 18 dan 24 h atau dengan
cisplatin untuk 24 h, tetapi notin lisat dari kontrol (diobati) dan 1%
diperlakukan DMSO sel (gambar 6). Pada awalnya, data kami menunjukkan
bahwa dariucup jalur intrinsik terlibat dalam LQM402-induced apoptosis,
tetapi kemungkinan ofother rute atau jenis kematian sel tidak boleh
kematian sel diberhentikan becauseother proses telah diamati dalam respon
todifferent Cu(II) kompleks. Sebagai contoh, cop-per(II) thioxotriazole
kompleks (A0) yang dipelajari oleh Tardito dan co pekerja inducedcell
kematian setelah aktivasi caspase-3, tapi sel melakukan displaythe dikenal
karakteristik klasik bergantung pada caspase apopto-SIS. Para penulis
melaporkan bahwa kematian A0-induced sel terlibat endoplasma stres dan
paraptotic kematian (Tardito et al., 2009). Selanjutnya, apoptosis kematian
sel dilaporkan dalam sel-sel glioma C6 yang terkena selama 24 jam untuk
konsentrasi [(dimetil 4,4--2,2 bipiridine)(acetylacetonate) Copper(II) nitrat]
(CasIII-ia) mulai dari 11.23 22.4 m. Namun, pengobatan with33.7 44.9 M
findingsthat ultra disebabkan bahwa senyawa menyarankan kematian sel
autophagic (Trejo-Solis et al., 2012). Theseresults dibuka pendekatan
berbeda mekanisme aksi fornew tembaga atau lainnya berbasis logam
senyawa dirancang untuk terapi anti-kanker.Di sisi lain, sementara 74.74 M
LQM402 dimin-ished ekspresi procaspase-3 dan procaspase-9at 24 h, 50 M
Isatin-diimine copper(II) kompleks bis-[(2-ox-indol-3-yl-imino) - 1,3 diaminopropane-N, N, O, O] tembaga (II) perklorat ([Cu(isapn)](ClO4)2)
and[bis-(2-oxindol-3-yl-imino)-2-(2-aminoethyl)pyridine-N,N]
copper(II)

perchlorate([Cu(isaepy)2](ClO4)2), juga knownas Cu(isapn) dan Cu(isaepy),

disebabkan ekspresi bentuk theactive caspases ini setelah h 24 dan 48
memperlakukan-ment di baris sel neuroblastoma SH-SY5Y (Filomeni et al.,
2007). Selain itu, 11.23 22.4 M dari Cas III-ia disebabkan mito-chondrial
sitokrom c pembebasan, yang ditemukan di dalam sitoplasma (Trejo-Solis et
al., 2012). Hasil ini adalah simi-lar untuk temuan kami di sel-sel HeLa
diperlakukan-LQM402; Namun, data ini mewakili awal penyelidikan jalan
jalan LQM402-induced sel HeLa kematian dan lebih lanjut studi diperlukan.

table 3
LQM402 adalah agen bebas-mutagenik di Ames testBecause potensi obat
anti neoplastic harus sel-sel ganas tonon beracun, kami mengukur efek
genotoksik LQM402on histidine mutan S. typhimurium strain TA 98, TA100
dan TA 102. Senyawa diuji dengan atau tanpa theaddition aktivator S9
karena banyak agen karsinogenik mustbe diaktifkan (Ames et al., 1973).
Tabel 3 menunjukkan jumlah nya + revertants S. typhimurium setelah 48 jam
inkubasi dengan kontrol DMSOvehicle atau konsentrasi berbeda LQM402.
LQM402 wasnot mutagenik dalam salah satu strain diuji tiga di 50, 100,
and200 M bila dibandingkan dengan semua kontrol positif bekerja (PA,
NMNG, Mit C, 2AA dan CP) dengan atau tanpa campuran S9, allof yang
diinduksi mutasi tarif yang telah higher(364) beberapa kali daripada kontrol
spontan pengembalian (DMSO; Tabel 2).Hasil kami menunjukkan bahwa dosis
ini LQM402 tidak genic muta ke galur diuji oleh tes Ames dan toresults
serupa yang diperoleh dalam studi Ames novel copper(II) quinolin satu Schiff
kompleks dasar yang sitotoksik terhadap manusia dapat-karsinoma sel (HepG2) dan non-mutagenik di S. typhimuriumstrains TA98 dan TA100 (Duff et al.,
2012). Lain tembaga complexesevaluated oleh tes Ames itu [Cu (phendione)
3] (ClO4) 24H2O and[Cu(phen)2(mal)] 2H2O, yang juga sitotoksik terhadap
Hep-G2and garis sel adenokarsinoma (A-498) ginjal manusia tetapi bebasmutagenik di S. typhimurium strain TA98 dan TA102 (Deeganet al., 2006,
2007). Hasil ini menunjukkan bahwa beberapa tembaga com-plexes dapat
secara efektif membunuh sel-sel kanker tanpa mutagenik activity.3.6.
LQM402 tidak menginduksi pembentukan micronucleus di miceperipheral
bloodTo menilai aktivitas genotoksik LQM402 di vivomodel di, jumlah
micronucleated polychromatic erythrocytes(MNPCE) mencetak dalam
eritrosit polychromatic 1000 (PCE), menurut sebelumnya diterbitkan kriteria
(Fenech, 2000). Abil-ity dari LQM402 untuk menginduksi MNPCE ditampilkan
dalam Fig. 7, dimana itu isobserved yang hanya tikus diobati dengan kontrol
positif hadstatistically Mit C signifikan meningkatkan jumlah MNPCE di 48and
72 h sehubungan dengan tikus diobati dengan kendaraan (distilledwater).
Biasanya mungkin untuk mengamati efek mutagenik awal dari micronucleusmerangsang agen di 24 h; ofMN jumlah tertinggi diamati 48 h, dan tingkat
menurun di 72 h. Ini wasobserved dengan kami pengendalian positif Mit C,
tapi tidak dengan LQM402.Fig. 7 juga menunjukkan efek penghambatan

LQM402 di Mit C-inducedMNPCE ketika kompleks tembaga diberikan selain

toMit C. Semua kelompok diperlakukan LQM402 telah sama jumlah
MNPCEboth
sebelum (0 h) dan setelah pengobatan (24, 48, dan 72 h), dengan
meanvalues mulai dari 2 sampai 3,6, dan tidak signifikan wereobserved
perbedaan antara kelompok-kelompok atau berkaitan dengan kontrol.
Theseresults
menyarankan
bahwa
LQM402
memiliki
sifat
antimutagenik.Dalam tes micronucleus, peningkatan rasio Poli-kromatik eritrosit
(PCE) sehubungan dengan normal chromaticerythrocytes (NCE) berarti
bahwa aktivitas proliferatif identitas-laranangan dan saksi, mungkin karena
fase awal dari penipisan sel (Ecobichon, 1997). LQM402-induced PCE/NCE
Ratios dinyatakan inTable 4. Tidak ada konsentrasi dan waktu poin untuk
LQM402showed peningkatan PCE/NCE, dibandingkan dengan rasio exhib-ited
untuk kelompok kontrol. Di 24 dan 48 jam setelah administrasi ofMit C, rasio
untuk PCE NCE adalah sangat berbeda (p < 0.05) dari rasio kontrol pada
waktu yang sama dan di h 72, ratiodecreased hampir dengan nilai awal (0 h).
Ketika LQM402 at5 mg/kg (C1), 10 mg/kg (C2) dan 15 mg/kg (C3)
concentrationswas diberikan 30 menit setelah pemberian 60 mg/kgMit C, itu
menghambat peningkatan rasio PCE NCE, efek anti sitotoksik indicatingan
LQM402 di concentrationsagainst diuji Mit C-induced toksisitas dalam sel-sel
darah mencit. Ada studi arefew genotoxicity kompleks tembaga yang
evaluatedby micronuclei assay. Evaluasi micronuclei coppercomplexes CuL
(ClO4) 2and CuL(NO3) untuk macrocyclic ligand1, 1 - bis (bis-(6,6 2,2 oxymethylenyl - bipyridine) binaphthyl (L) incultured manusia limfosit
ditunjukkan genotoxicity oleh induc-tion micronucleated sel pada dosis 0.15
mg/kg untuk 24 h andcytotoxicity oleh penurunan jumlah sel di sama dosis
andtime (Beynek et al., 2007); efek ini tidak diamati unsur tembaga
kompleks bahkan pada 33 untuk 100-fold dosis yang lebih tinggi. Dalam
reportsof
kegiatan
genotoksik
lainnya
tembaga
kompleks,
researcherscommonly digunakan tes DNA fragmentasi. Kebanyakan dari
laporan-laporan ini
TABEL 4
Gambar 7. LQM402 tidak menginduksi pembentukan micronuclei.
Konsentrasi tiga LQM402 diberikan intraperitoneally dalam dosis tunggal
untuk tikus CD1. Nomor ofmicronucleated polychromatic eritrosit (MNPCE) di
1000 dihitung polychromatic eritrosit dianalisis pada 0, 24, 48, dan 72 h di
ekor Giemsa-bernoda darah smear.Konsentrasi sama LQM402 juga diberikan
30 menit setelah pemberian 60 mg/kg Mit C. Efek genotoksik Mit C diamati
hanya ketika itu wasadministered sendirian. Grafik menunjukkan berarti dan
kesalahan standar 5 tikus per kelompok eksperimental. Perbedaan yang
signifikan dari kontrol ditunjukkan oleh ** p < 0.01and * p < 0,05

menyarankan mungkin clastogenic efek atau oksigen reaktif speciesas

mekanisme efek mutagenik kompleks tembaga (Beynek et al., 2007; Szyba
et al., 1992; Serment-Guerrero et al., 2011).3.7. LQM402 menginduksi lipid
peroxidation dari tikus otak homogenateCytotoxicity dan apoptosis terjadi
sebagai respon terhadap beberapa penyebab, termasuk ekses radikal bebas
atau lain lipid peroxidation prod-ucts (Barrera, 2012). Untuk sebagian besar
unsur-unsur penting, animbalance tembaga endogen dapat mengubah
sistem redoks di acell dan menyebabkan kerusakan sistemik dan patologi
(Wang dan Guo, 2006). Di sisi lain, sementara chelation tembaga dapat
digunakan asan anti-angiogenik terapi (Hancock et al., 2011; AndHarris
Lowndes, 2004; Lowndes et al., 2008), tembaga kompleks seperti
ascasiopenas dapat menginduksi berlebih ROS dan mengarah toksisitas
tomitochondrial (Serment-Guerrero et al., 2011). Di Amestest kami TA102
ketegangan, jumlah nya + revertants diinduksi byincubation dengan LQM402
sudah hampir menggandakan jumlah sponta-neous nya + revertants, yang
dapat mengindikasikan stres oksidatif dalam diperburuk genotoxicity. Oleh
karena itu, untuk menguji effectsof Pro-oksidan LQM402, kita mengevaluasi
kemampuan untuk menginduksi lipid peroxidation ina tikus otak
homogenate. Kami menemukan bahwa dalam berbagai konsentrasi of5.62
17,7 M, LQM402 disebabkan peningkatan lipid per-oksidasi (p < 0.01) di atas
tingkat basal; ini meningkatkan werenot diamati pada konsentrasi di bawah
5.62 M atau di kisaran of31.62-100 M (gambar 8). LQM402 10 M diinduksi
maksimum levelof lipid peroxidation (6.7 menegaskan nmol TBARS mg
protein), yang washigher dari tingkat yang disebabkan oleh 20 mM AAPH
positif kontrol (3,7 menegaskan nmol protein TBARS mg) dan mirip dengan
yang disebabkan oleh the10 M FeSO4positive kontrol (7.4 menegaskan nmol
protein TBARS mg). Thesedata menyarankan bahwa LQM402 mampu
peroxidize lipid dan thereforeto mendorong proses-proses biologis yang
terkait. Dengan demikian, LQM402-induced celldeath dan apoptosis pada selsel HeLa dapat karena lipid peroxida-tion dan/atau lipid peroxidation produk.
Logam Cu(II), Cr(II),Co(II), Pb(II), dan Fe(II) memainkan peran penting dalam
proses redoks sistem inbiological dan beberapa dari mereka adalah induktor
lipid perox-idation oleh fitur oksidatif Fenton reaksi (Benedetand Shibamoto,
2008); dengan demikian, hal ini tidak biasa bahwa senyawa berbasis logam
yang mencakup logam ini memiliki aktivitas tersebut. Beberapa casiopenas
dan kompleks tembaga lainnya dapat menghasilkan oksigen reaktif
spesies (Trejo-Solis et al., 2012; Serment-Guerrero et al., 2011) dan kegiatan
ini telah diasumsikan menjadi ofaction modus utama di balik cytotoxicity
kompleks tembaga (Kowol et al., 2012).Cu(II) dan lain logam transisi seperti
(Mn(II), Mn(III), andFe(III)) tampilan antioksidan properti. Scavengeractivities
superoksida macrocyclic copper(II) kompleks yang ditentukan bya xantinaxantina oksidase sistem (Fernandes et al., 2007). Dengan demikian, kita diuji
kemampuan LQM402 untuk menghambat FeSO4-inducedlipid peroxidation
dalam upaya untuk menentukan apakah aktivitas antioksidan LQM402had.
LQM402 ditemukan memiliki efek PA-tive pada produksi FeSO4-induced
TBARS di concentrationsfrom 5.62 M untuk M 13.34 tikus otak homogenate;

Namun, LQM402 ditampilkan penghambatan aktivitas konsentrasi berkisar

of23.71-56.23 M (GB. 9). Bersama-sama, hasil kami menunjukkan bahwa
LQM402has induktif dan penghambatan kegiatan di lipid peroxidation.3.8.
LQM402 bukanlah seorang agen pemulungan untuk radicalThe DPPH DPPH
radikal assay pemulungan digunakan sebagai tes PA-mem untuk mengukur
aktivitas antioksidan dari LQM402. Wetested LQM402 pada tiga konsentrasi,
1, 10, dan 100 M, ina 100 M DPPH solusi. Konsentrasi tertinggi
LQM402achieved nilai maksimum 5.18% pengurangan DPPHsolution, yang
kita tidak bisa menentukan efektif con-centration diperlukan untuk
mengurangi 50% larutan DPPH (EC50).Kegiatan ini adalah sangat rendah
dibandingkan dengan kegiatan knownantioxidants seperti - tokoferol (85.79%
DPPH pengurangan at74.13 M) atau quercetin (85.53% 23.71 m). LQM402
bisa inhibitthe Pro-oksidan kegiatan FeSO4but tidak dapat bertindak sebagai
scav-Crissi dari DPPH radikal bebas. Temuan ini tersirat mekanisme
differentpotential dari aktivitas pemulung superoksida pra-sented oleh
macrocyclic copper(II) kompleks, yang ditampilkan EC50values kegiatan
pemulungan pada konsentrasi di bawah 30.82 M (Fernandes et al., 2007).
Namun demikian, dalam penelitian lain, asam mefenamat obat inflammatory
dan
senyawa
azo
ligand(E)-4-((1H-1,2,4-triazol-3yl)diazenyl)benzene-1,3-diol
dan
(E)-4-((5-mercapto-1,3,4-thiadiazol-2yl)diazenyl)benzene-1,3-diol Apakah tidak mengerahkan sifat antioksidan
ketika dikomplekskan dengan Cu(II) (Kovala-Demertzi et al., 2009; GABER et
al., 2013), yang revealsroles untuk ligan selain logam terikat.

8 GB. LQM402 adalah sebuah induktor peroksidasi lipid. Tikus otak

homogenate (2 mg/ml protein) diinkubasi dengan LQM402 di beberapa
konsentrasi (1-100 M) di 37C for3 h. TBARS produksi diukur di 540 nm.
Signifikan TBARS produksi, ditandai dengan * p < 0,01, hanya diamati pada
konsentrasi dari 5.62 M 17.78 M. At10 m LQM402 lemak peroxidation
induktor lebih kuat daripada AAPH (20 mM) dan mirip dengan FeSO4(10 M).
Grafik menunjukkan berarti dan kesalahan standar threeindependent
percobaan.
Gambar 9. LQM402 meningkatkan dan menghambat produksi FeSO4-induced
TBARS. Lipid peroxidation diinduksi dalam otak tikus homogenate oleh 10 M
FeSO4alone atau simultaneouslyadding LQM402 pada konsentrasi berbeda
(5,62 56.23 M). TBARS produksi diukur di 540 nm. TBARS yang disebabkan
oleh FeSO4was ditingkatkan dengan 5,62 13.34 M LQM402and adalah
dihambat secara konsentrasi tergantung pada konsentrasi 23.71 m dan
tinggi.
Grafik
menunjukkan mean dan kesalahan standar tiga
independentexperiments. ##p < 0,01 menunjukkan perbedaan yang
signifikan dari kelompok-kelompok diperlakukan LQM402 dibandingkan
dengan tingkat basal dan ** p < 0,01 mewakili perbedaan yang signifikan
dibandingkan dengan FeSO4.

Kesimpulan studi ini menunjukkan bahwa iscytotoxic LQM402 kompleks

tembaga melawan Republik Ceko jalur sel, dengan selektivitas untuk sel-sel
HeLa dan CaSki, dan itu menampilkan kurang cytotoxicity terhadap fibroledakan
normal.
Senyawa
ini
disebabkan
translokasi
membranephosphatidylserine sel-sel HeLa fitur apoptosis kematian,
asdetected oleh annexin V-FITC noda. Pada awalnya, LQM402-inducedcell
kematian menunjukkan aktivasi intrinsik apoptosis jalan-jalan yang
ditentukan oleh kehadiran sitokrom c di diperlakukan HeLacell sitoplasma
ekstrak dan penurunan ekspresi pro-caspases 3 dan 7. Dimungkinkan bahwa
aktivitas sitotoksik bahwa ledto kematian apoptosis pada sel-sel HeLa adalah
karena aktivitas LQM402as lemak peroxidation induktor dan itu juga mungkin
terkait degradasi DNA yang diamati dalam tes tangga TUNEL dan
DNA.Meskipun ada laporan dari tembaga kompleks dengan antioxidantor
oksigen reaktif spesies induktor kegiatan, novel tembaga (II) kompleks
LQM402 ditampilkan peroxidation kedua lipid penghambatan dan induktif
effectson. Oleh karena itu, karena LQM402 memiliki genotoxicactivity tidak,
mungkin digunakan sebagai agen terapeutik againstcervical kanker
potensial. Saat ini, penelitian kami berfokus pada efek ofthis copper(II)
kompleks pada pertumbuhan tumor pada tikus telanjang modelof kanker
serviks, serta ekspresi gen terkait tocancer kemajuan.Konflik interestThe
penulis menyatakan bahwa ada konflik tidak keprihatinan-ing manuskrip
ini.AcknowledgementsWe terima Antonio Nieto Camacho, M. Sc. dan Ivn
AriasGonzlez, M. Sc. atas bantuan teknis dengan TBARS andDPPH, dan tes
DNA tangga, masing-masing. Proyek ini finan-manusia menjadi sangat
didukung oleh Instituto Politcnico Nacional (IPN), Meksiko (SIP proyek
20101395, 20110808 dan 20121122). SEFG adalah siswa saat ini terdaftar
dalam Program Doktor ilmu di bidang bioteknologi di ENMH-IPN dan
Penerima mahasiswa sesama-kapal dari CONACyT (40069) dan PIFI-IPN..