Pirgenos

Las preparaciones de uso parenteral deben elaborarse por procedimiento que

eviten la presencia de pirgenos; es decir, de sustancias que, una vez inyectadas
por va parenteral, sean capaces de provocar un proceso febril en el paciente.
La presencia de pirgenos en un preparado inyectable puede dar reacciones
febriles, acompaadas de escalofros, aceleracin del pulso, disnea, cefaleas y
mialgias. Estos cuadros pueden ser ms o menos intensos y puede llegarse incluso
a la muerte. Hay que tener presente que, ocasiones, las preparaciones inyectables
se administran a enfermos con equilibro fisiolgicos muy precarios.
No fue hasta 1876 que burdon-sanderson utilizo por primera vez el trmino
pirgeno para designar toda sustancia productora de fiebre. Unos 90 aos ms
tarde, Seibert estableci la relacin entre fiebre y las sustancias de origen
bacteriano.
A) Origen y naturaleza de los pirgenos
Entre los pirgenos se encuentran sustancias tanto endgenas como exgenas, de
naturaleza mineral, biolgica y qumica. Entre las sustancias pirgenas endgenas
estn las hormonas tiroideas, las citoquinas y la adrenalina. Como sustancias
pirgenas exgenas se han descrito principios activos (tales como anfotericina B, la
atropina, la vancomicina y el azul de metileno), adyuvantes (EDTA), partculas de
slice y los procedentes de microorganismos, como bacterias gram (-) y gram (+),
levaduras y virus. Sin embargo, se ha visto que la mayor parte de los accidentes
pirognicos debidos al tratamiento por va intravenosa eran causados por
endotoxinas de bacterias gram (-). Estas sustancias son las responsables de la
fiebre en el curso de muchas infecciones bacterianas y se trata de los
lipopolisacaridos (LPS) de la pared de las bacterias gram (-).
Las endotoxinas bacterianas actan a dos niveles: directamente como pirgeno
endgeno, ejerciendo a su accin sobre el hipotlamo, y por induccin de la sntesis
de interleuquinas por clulas del paciente.
Los pirgenos son a menudo termoestables y resisten la esterilizacin en autoclave;
pasan a travs de la mayora de los filtros, aunque pueden ser retenidos por filtros
de profundidad y por sustancias adsorbentes. Los pirgenos actan a dosis muy
bajas, del orden del microgramo. Todos los animales no tienen la misma
sensibilidad. El conejo es grande, aunque inferior al hombre. En el ser humano, al
inyectar una solucin con pirgenos, hay un tiempo de latencia de una hora ( 15
minutos) antes de que aparezca un pico febril. En el conejo el tiempo de latencia es
ms corto y pueden aparecer dos o ms picos febriles.

B) Precauciones para prevenir los pirgeno

Durante la preparacin de inyectables, los pirgenos pueden ser incorporados a la
formulacin por el disolvente (generalmente agua), por las sustancias disueltas
(principio activo y adyuvante) y por el material.
Para evitar la incorporacin de pirgenos a travs del agua que se va a utilizar en
el inyectable, se aconseja seguir las siguientes pautas:
-

No almacenar el agua innecesariamente.

Conservarla en condiciones que eviten el desarrollo de microorganismos.
Evitar en el diseo de canalizaciones y depsitos los puntos en que puedan
producirse estancamientos.
Limpiar regular y vigorosamente todas las canalizaciones con soluciones
antispticas o vapor sobrecalentado.

Por otro lado, resulta relativamente fcil conseguir productos qumicos de sntesis
libres de pirgenos, pero esto es mucho ms difcil en el caso de los de origen
biolgico. En estos ltimos, as como para la glucosa y los aminocidos, se
recomiendan ensayos para comprobar la ausencia de pirgenos. Finalmente, en lo
que se refiere al material, se recomienda lavar los recipientes de vidrio con cidos
o bases y seguidamente enjuagarlos con agua apirognica. Para mayor seguridad
se puede realizar un calentamiento durante un tiempo prolongado, a temperaturas
superiores a 200 C.
C) Procedimientos para eliminar los pirgenos
Los mtodos utilizados para despirogenar preparaciones inyectables son muchos y
variados, aunque no hay uno que sea universal. Todos los procedimientos tienen
un inters limitado, ya que no son aplicables a preparaciones ya dosificadas en sus
recipientes definitivos. Tras el acondicionamiento y esterilizacin, un lote declarado
pirgeno no es recuperable. A continuacin se describen brevemente algunos de
los mtodos ms utilizados.
1) absorcin sobre carbn activado
Se basa en la capacidad del carbn activo de absorver fsicamente la endotoxina.
El carbn se aade a la solucin, se agita y, finalmente, se elimina por filtracin o
sedimentacin. Uno de los mayores inconvenientes de esta tcnica es la gran
afinidad del carbn activo por las molculas no ionizadas de compuesto con alto
peso molecular.
2) tratamientos con agentes oxidantes
Se utiliza H2O2 e hipoclorito de sodio NaOCl, agentes fciles de manipular y eliminar.
No son adecuados para tratar sustancias y materiales sensibles a la oxidacin.
3) filtracin

Los pirgenos pueden ser retenidos por filtros de profundidad, aunque es mejor
utilizar membranas de ultrafiltracin, que se separan las grandes molculas
orgnicas. Para ello se utilizan membranas que se clasifican por el lmite de peso
molecular nominal excluido (LPMNE) y de porosidad comprendida entre 0.2 y 0.002
m. La unidad bsica es el LPS, que tiene un peso molecular de aproximadamente
144 daltons, pero sin embargo, cuando se utilizan soluciones acuosas con
cantidades normales de endotoxinas (10-6 a 10-5 gr/ml) se prefieren las membranas
de LPMNE 100000. La presencia de tensioactivos o agentes quelantes en la
solucin reduce mucho la agregacin de LPS, con lo que se hace necesario utilizar
membranas de LPMNE mucho ms pequeo.
4) calentamiento en medio acido o alcalino
El tratamiento con soluciones de HCl 0.1 N, durante 30 min a 100C, inactiva los
LPS por un proceso hidroltico. En medio bsico se produce la saponificacin del
cido graso del lipopolisacrido y puede utilizarse solucin de NaOH 0.1 N en etanol
al 95% o en dimetilsulfoxido al 80%.
5) calor seco
Es el procedimiento de eleccin para la inactivacin de los pirgenos en caso de
ampollas y envases de vidrio, equipos metlicos y productos qumicos
termoestables. Se aplica a temperaturas superiores a 250 C durante media hora.
6) otros mtodos
Entre ellos cabe citar la destilacin, la smosis inversa y algunas tcnicas
cromatogrficas.
D) Control de pirgenos
Existen diversos mtodos para determinar la existencia de pirgenos en preparados
parenterales. Segn las farmacopeas europea y francesa, la bsqueda de
sustancias con actividad pirogena se puede hacer por dos tcnicas distintas:
-

La medida del aumento de la temperatura en el conejo, tras administracin

intravenosa de la solucin que se desea controlar.
El mtodo de la coagulacin de lisado de amebocitos de Limulus poliphenus
(mtodo LAL) por las endotoxinas.

1) mtodo de la medida del aumento de temperatura en conejos

Es el mtodo universalmente reconocido para el control de pirgenos. En este
ensayo se mide la respuesta febril al administrar al animal por via intravenosa una
cantidad del preparado inyectable. El animal utilizado es el conejo, puesto que es
muy sensible a los pirgenos; sin embargo, tiene el inconveniente de ser un animal
muy sensible tambin a cualquier variacin de temperatura, lo que hace que el
ensayo resulte delicado.

Para el mismo, se eligen animales machos o hembras que pesen al menos 1.5 kg y
que hayan sido previamente mantenidos y controlados al menos una semana en
cajas individuales. Se comprueba que los animales los animales presenten una
sensibilidad normal frente a los pirgenos al inyectarles una cantidad conocida de
solucin pirognica adecuada, y los que no hayan reaccionado no sern aptos para
el ensayo.
Para medir la temperatura las farmacopeas termmetros adaptados a la anatoma
de animal o sondas termoelctricas de alta precisin. Adems, el material (jeringas
y agujas) utilizado en el ensayo debe lavarse cuidadosamente con agua y
esterilizarse por calor seco a 250 C durante 20 min.
Durante las cuatro horas que preceden al ensayo, y a lo largo de este, los conejos
(3 por grupo) se mantienen en una sala de condiciones ambientales constantes.
Para el ensayo, los preparados se calientan de antemano a fin de administrarlos a
la temperatura interna del animal (entre 38.5 y 39 C) y se inyectan muy lentamente
en la vena de la oreja. La temperatura se anota cada 30 min y se obtiene la
diferencia entre la temperatura mxima y la inicial. Si el ensayo es dudoso se repite
en un segundo grupo de 3 animales y, eventualmente, en un tercero y cuarto grupo.
El preparado satisface el ensayo si la suma de las respuestas del primer grupo es
inferior al valor indicado en la segunda columna de dicho cuadro. Si la suma de las
respuestas est comprendida entre los valores indicados en la segunda y la tercera
columna de dicho cuadro, se repite el ensayo con un segundo grupo de 3 conejos.
Finalmente, el preparado inyectable ser pirognico cuando la suma de las
respuestas sea superior al valor dado en la tercera columna.
Nmero de conejos

El preparado satisface
el ensayo si la suma de
respuestas no excede
de

El
preparado
no
satisface el ensayo si
loa suma de respuestas
es superior a

1.15 C

2.65 C

2.80 C

4.30 C

4.45 C

5.90 C

12

6.60 C

6.60 C

2) mtodo de la coagulacin de lisado de amebocitos (mtodo LAL)

Este mtodo se llama tambin ensayo de endotoxinas bacterianas. El mtodo LAL
(Limulus Amebocyten Lysate) se basa en la utilizacin del lisado del amebocito del
cangrejo americano Limulus polyphemus, debidamente tratado y conservado, que
posee una proenzima capaz de transformarse en una enzima en presencia de
endotoxinas bacterianas. En ese momento se establece una serie de reacciones

hasta llegar a una sustancia llamada coagulina que provoca una turbidez o
gelificacin y que permite visualizar la presencia de pirgenos en el preparado
inyectable.
Las ventajas de este mtodo estn en que es un ensayo in vitro de fcil puesta a
punto y de utilizacin puntual. Adems, es ms rpido y no hace falta disponer de
un animalario. El nico inconveniente est en que solo es especfico para
endotoxinas de bacterias gram (-).
Suele estar destinado a preparaciones donde el ensayo en conejos no es
prcticamente. As, por ejemplo, se suele utilizar para la determinacin de pirgenos
en productos radiofarmacuticos, vacunas y preparados con productos derivados
de la biotecnologa, preparaciones de gran volumen para administracin parenteral
y preparados inyectables destinados a la va intravenosa e intrarraqudea de al
menos 15 mL.
El ensayo es muy simple y basta con poner sobre una lmina de vidrio un poco del
reactivo y del preparado que se va a controlar. La reaccin es positiva si se produce
un aumento de la viscosidad o una coagulacin de la mezcla, utilizndose como
control un patrn de endotoxina. Los estudios muestran que casi siempre hay
concordancia entre el ensayo en conejos y el mtodo LAL.

Bibliografa:
-

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