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Determinación Espectrofométrica de hemoglobina en una

muestra de sangre

OBJETIVOS

1- Manejar correctamente pipetas automáticas.


2- Determinar la concentración de hemoglobina en una muestra de sangre
utilizando el método espectrofométrico.

FUNDAMENTO TEORICO
La hemoglobina es una proteína conjugada contenida en el interior de los
eritrocitos a razón de 300000000 moléculas de hemoglobina por cada
eritrocito en los humanos. Sirve como vehículo para el transporte de oxigeno
de los pulmones, donde la tensión de O2 es elevada, hacia los tejidos, donde
es baja.
Una molécula de hemoglobina es un tetrámero que consta de dos pares de
cadena de polipéptidos, dos subonidades alfa y dod beta que está enfrentadas
entre sí en torno a una cavidad en el centro de la molécula. Cada subunidad
contiene un grupo hemo (región ligante de oxigeno, que contiene un átomo de
hierro ferroso), por lo cual una molécula de hemoglobina puede unir 4
moléculas de oxigeno.
La hemoglobina reducida es hemoglobina con hierro no asociado al oxigeno.
Cuando cada grupo hem se asocia con una molécula de oxigeno, la
hemoglobina toma la forma de oxihemoglobina.
Tanto en la hemoglobina reducida como en la oxihemoglobina, el hierro
permanece en estado ferroso (Fe ++. Con el hierro oxidado al estado ferrico se
forma Meta hemoglobina y la molécula pierde su capacidad para transportar
oxigeno y dióxido de carbono.
El método que se utilizara para realizar esta determinación se denomina
Método de la Cianometahemoglobina y se fundamenta en que al combinar un
volumen determinado de sangre con una solución que contiene k3fe (CN)6 y
KCN (solución de Drabkin), el ferrocianuro convierte el hierro ferroso de las
hemoglobinas en ferrico, para formar metahemoglobina y la molécula pierde
su capacidad para transportar O2. Luego la meta hemoglobina se combina con
el cianuro de potasio para formar cianometahemoglobina de color rojo
anaranjado brillante, apto para la determinación calorimétrica.

MATERIALES

- 10 tubos de ensayo
- 1 gradilla
- alcohol rectificado
- algodón
- jeringas desechables
- torniquete
- pipeta automática (20 ul)
- pipetas graduadas de 5 a 10 ml
- puntas amarillas adaptables para pipeta automática
- guantes
- tubos de espectrofotómetro
- espectrofotómetro spectronic 20
REACTIVOS

A) Solución de Drabkin:
Bicarbonato de sodio---- 1g
Cianuro de potasio-------0,05g
Ferrocianuro de potasio---0,2g
H20 deshilada-------------1000 ml
Esta solución tiene un pH de 8,6. Debe ser de color amarillo y transparente
y al medir su densidad óptica contra agua como blanco, esta debe ser cero.
La solución debe guardarse en frasco oscuro y debe descartarse si esta
turbia o decolorada. El reactivo es un poco toxico pero debe manejarse con
cuidado.
B) Muestra de sangre total con anticoagulante (EDTA)
C) Anticoabulante (EDTA)
D) Patrón de hemoglobina

PROCEDIMIENTO

Parte 1: realización de la curva patrón o curva de calibración


A) Realizar un espectro de absorción abs. vs. longitud de onda para una
muestra de sangre de concentración conocida (12 a 14 mg %) Para ello
se toma con la pipeta automática 20 ul de la sangre y se diluye en ml de
la solución de Drabkin. Se lee luego a diferentes longitudes de onda
(400 a 600) y se grafica en papel milimetrado.
B) Realizar 6 disoluciones de la sangre de concentración conocida
utilizando siempre un volumen constante de sangre de 20 ul con pipeta
automática variando solo el volumen de solución de Drabkin en cada
tubo. Podrían ser volúmenes de 4, 5,7,10 y 12 ml. Luego, para graficar
la curva patrón, medir las absorbancias de cada una de las diluciones y
realizar un gráfico de abs. Vs. Concentración de hemoglobina.

Parte 2: determinación de una concentración de hemoglobina desconocida


- Encender el espectrofotómetro
- Chocar 5 ml de solución de Drabkin en un tubo
- Mezclar suavemente la mezcla de sangre (agitar el frasco 20 veces)
- Con la pipeta automática tomar 20 ul de la sangre, limpiando
cuidadosamente la parte exterior de las puntas de las pipetas
- Introducir la pipeta y mezclar la sangre con el reactivo de Drabkin
contenido con el tubo
- Mezclar bien y esperar 5 minutos
- Leer la absorbancia utilizado como blanco un tubo con solución de
Drabkin
- Para el cálculo de los resultados (concentración de Hb) extrapolar en la
curva patrón
- Sacar conclusiones

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