TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE DNA foraneo dentro de una célula animal, “se observa la mieroauja ultieada para ks iiyoocidn, jt, Le micropipeta que mantiene ata cla sujeta. (a eas, Ideas fundamentales | DNA recombinante se construye mediante la incorporacién de un fragmento de DNA foriinco en una mokécula pequetia sapaz de replicarse (por ejemplo, un plésmide bacteriano) # y de ampliticar el fragmento incorporado en ellt, dando £ Se pueden det lugar a.un clon molecular del DNA insertado, de restriccion cortan el DNA en sitios diana { espeeificos: tras el corte, se generan fraginentos concretos con extemos cohesivos apropiados para su insereién en un vector que haya sido cortado eon Ia misma enzima, Una coleccién de clones de DNA que sea representativa de todo el genoma de un organismo se denomina genotoea genémica tar clones individuales de una genoteco utilizando sondas que reconozcan especificamente un DNA (© su producto proteico, o mediante transformaci6n de un ‘mutante nulo, Fs posible Separar los diferentes fragmentos producidos tras dligestién con una enzima de restriveién porque funeidn de su tamatio cuando se someten a electroforess en gel. Una ver que las moléculas de DNA digetido con enzimas de restnccién o las moléeulax de RNA se han separado por electroforesis en zel, se pueden detevtar moléculas expectficas mediante la utilizacién de sondas. Los sitios diana para las enaimas de restriceién pueden situarse en un mapa y constituyen mareadores que son muy stiles para la maniputacién del DNA. Un gen puede aislarse mediante el unélisis secuencial de clones contiguos parcialmente solapados, partiendo de un ‘mureader ligado, ‘Tras la clonacién de un gen, puede determtinarse su secucncia nucleotidica, y esta secuencia puede utilizarse para estudiar su funcién y su evolucién. Una secuencia concreta puede amplificarse utilizando un par de cebadores que delimiten la secuencia de interés.Capitulo 12 Tecnologia del DNA recombinante +366 | objetivo global dela Genética es el andisis de Ta es- trucura y funeign de os genes y de tos gonomas Desde imediante el andisi de segregaciones fenotipias en cruzamien los ontrulados. Las primeras evidencias sobre la funcin de les genes surgieron de [a observaviGn de correlaciones entre dete- minadas nitaciones y kt defcieneta de una enzima 0 de otto tipo de proteina, Nuestra comprensidn sobre la estructura y fun cis de tos genes experimentd un avanee notable cuando se esta- blecid la relacign entre la presencia de mutaciones en un gen y Ia presencia de cambios aminoacidicos espectticos en la proteina correspondiente. Fstos conccimientos, sumados. al. descubri- riiento dela nanuraleza del DNA y del e6digo genético, pusieron de manifesto la naturaleza bisica del zen, No obstante, el con- cepto de gon se hahis fraguaio vinicamente a partir de inferen- cas indivectas, pues nunca se habta aislade un gen y analizado directamente su secuencia, De hecho, parecfa imposible gue tl Nazaha pudicra Mevarse a cabo. Aunqueel aislamiento de DNA a partir de un tejido vivo es un roceso relativamete facil, en el tubo de ensayoe! DNA tine la consistencia de una masa muy viscosa, ;Como poddia aslarse un sen expecifico entre esta «masa de hilos enredados»? La tecno- Jogia del DNA recombinante lo ha hecho Fuctibl, y en la actua- lidad se aislan genes y owas partes del genoma rutinariamente {Por que es tan importante que podamos aislar genes indivi- civales? En primer ligar, porque el aislamiento de un gen permi- {ela determinacién de su secuencia nucleotidica. A partir de esta informacién pueden estublecerse los rasgos caracteristicos de un en, por ejemplo, el nero de intrones y su posivién. La com- paracin entre las secuencias de DNA de diferentes genes puede proporeionar informaci6n sobre su evelucién, Mediante la con- ‘erin dela secuensia de mucledtidos ala secuencia de aminos: cidos dictadu por el eédigo genético, puede determinarse direc: famente laestructura del producto proteico de un gen; y, wpa de estos datos, a menudo puede inferiwse la funcién del gen, También puede esttiarse la funcidn mediante modificacisn di- recta de ura parte de la secuencia del DNA del gen, seguida de su teinserci6n en el zenoma. Ademiis, podemos trasladar un gen ds un organismo a otro y generar ast crganismos transgénicos, que se uiizan tanto en investigacion basiea como aplicads, Una de sus aplicaciones ha sido la produceidn de sustancias de inte ry puta la humanidad tales como la insulina, a partir de bacte- pas portadoras del gen humano adecuado, Esta breve revision ilustra Ia importancia del aislamiento de genes como herramien- 1a indispensible del nalisis genético moderno. Qué genes podria ser interesante aislar? La reapuesta depen de en gran medica del proceso biologico que se esté estudiando, Analicemes unos cuantos casos. Un genetista que investigue so tve la ruta de sintess dl triptsfano en hongos esa interesado ct aquellos genes que, cuando se mutan, confieren auxctrofia pura triptsano, ya que cada uno de estos genes seria responsable de un paso conereto de Ia ruta biosinética (véase el Cap. 10) tstos genes podrian identificarse mediante mutacién, segrega- cin y andlisis de ligamiente, denominarse top! 172, 13, eroétera. Fl genetisia en cuesin estara muy interesado en el aislamiente y la caracterizacion de uno o més de estos genes. Asimiymo, por motivos médicos y biokégicos, los genes huma- hos cuyas mutaciones conlieren alain tipo de desordes fa hal suscitan interes. Ya vimos que estos genes pueden ide ccarse mediante e! andlisis de genealogias. En los Cx sanalizamos dos ejemplos de enfermedades sastosémicas vas: el albinisine y Ie aleapronuria, Aunque en ambos cconoce desde hace tiempo la naturaleza general del def dos son defectos enzimticos), seria bastante itil poder genes implicados. Mediants ol anélisis de genealogts identificado otros genes humanos cuya funcién bioguii desconoce. Fn este caso, el aislamiento del gen corres podria resultar particularmente wil, ya que Ta caracterizi su estructura podria contribuir a determinar sv funcién y raleza de la enfermedad. La fibrosis quistica es un buen ge del andlisis de genealogtas, se habia concluida que se tuna enfermedad autosmica tecesiva, pero ka funciGn implicado no se desvel6 hasta que se aisl6 y secuenti zgen. Existen ejemplos similares en pricticamente todos hs hismos que se usan en investigacion, En nuestro tratamiento de los métodos dle aislamiealo de nes, abordaremos en primer lugar Ii maturaleza del DNA\ binante y como esta tecnologia permite el aislamiento de Posteriormente, analizaremos diferentes métedos para ties especificos, como los que acabamos de discuti. Construccién de DNA recombinante {Cusles son tos principios de In tecnologia del DNA. ante? Fl organisa en estudio, donate del DNA qu analizar, se denomina organismo donante, El procedi bnisico consiste ea extraer el DNA del organismo don tarlo en fragmenios que contengan entre uno y varios x insertar cada uno de estos fragmentos en una moléeu replique autGnomamente, por ejemplo, un plismido bade Estas pequefias moléculas circulares funcionan a modo de portadores o veetores de estos fragnsentos de DNA. Las las de vector con sus insertos se denorninan DNA. fe, porque constituyen eombinaciones nuevas de DNA w parte de genoma donante (que puede proceder de cua nismo) y otra parte de DNA veetor cuyo origen es comp te diferente (normalmente, un plismido bacteriano 0 Ut La mezcla de DNA recomblnante se utiliza paca transfom lulas bacterianas, que suelen incorporar una dniea mols becterisnas 66 slembran en medio slido pura que colonias individules. Uni cSlula hacterianatranson una sole moléculs de DNA recombirante se vii dl ‘una colonia con millones de ful, todas elas port mismo vector recombinante. Asi. una colonia individual om ne una poblacién numerosa de insertos de DNA idénticos, denomina clon de DNA. Una parte considerable del a un fragmento clonado puede reliarse mientras een la bacteria hospedadora,sungue un abjetivo posterior su reinteducciéncnclorgenismo donante original part lar la estructura y funeién del genoma, Por ello, el sue constar de los siguientes pasos:Identificaci6n del gen donante de interés mediante eruzamientos J Clonacién del gen de interés en uns bucteria 1 Caracterizacién del gen donante en el sistema bacteriano 1 Modificacién det gen donane 1 iduccidn del gen en las c&lulas donantes originales, lO Propiedad A de | Bresophilaen estudio Identfcacidn de mutants) | que carezcan de A. Cruzamiento silvestre x mutante | | 1 sive rmutante Relacionar el gon de interés A |S con clolelo mutonte a, Construccién de DNA recombinante 367 Puesio que cl DNA danante se corté en inuchos fragments diferentes, la mayorfa de las colonias serdn portadoras de uma ‘molécola diferente de DNA recombinante (es decir, un inserto diferente), Por tanto, et siguiente paso consiste en encontrar Is ‘manera de seleccionar el clon portador del iaserto que nos inte= resa, Una ver que se obtiene este clon, se aisla el DNA en masa ¥ el gen de interés clonado puede someterse a una serie de anitisis, que consideraremios mis adelante en este capitulo. Advierta que el método de clonacién funciona debido a que en cada cétula bacteriana transformada entra una dnica molécula recombinante {yA que estas edlulas se encargan de amplificarlas en poblaciones onstituidas por un mimero clevado de moléculas susceptibles de Ser tratadas como si fueran compuestos quimicos. La Figura 12-1 rmuesiru un esquema general de esta estrategia E] término DNA recombinante no debe contundirse con los, DNA recombinantes naturales que se originan por recombina- Figura 12-1. 1s wcrolonia del DNA recombinants nos permite inserar Fragmeniosinvidsales de euaigier genonsa en nous de DNA vector tales come pls y arpllcaras tatividulmenta bate Cada uno de os Fsprictos soplifiados 6 un clone BWA, ) ce Ce CB)ae cin entre cromosomas homélogos tante en eucariotas como en procariotas. | DNA recombmante al que nos referimos en este capitulo se genera mediante ta unién anificial de moléculas de DNA no homélogas que suelen proceder de organismos diferen- tes. Aluunos genetisias prefieren utilizar el término DNA qui- mérico, en honor al monstruo de 1a mitologia griega denomi do Quimers. Una Quimera siempre ha simbolizado una unién bioldgica imposible, es decir, una usoeiaciGn de partes proce- dentes de diferentes animales. Por ello, podemos considerar el DNA recombinante como una quimera de DNA, que no seria pesible sin la manipulacién experimental que conocemos enmo tecnologia del DNA recombinonte. Capitulo 12 Tecnologia det DNA recombinante Aislamiento del DNA Liprimer paso en la construceién de un DNA recombinante &s el aislamiento de fos DNA donante y vector, Décaclas antes del desa- Clularasistente a tetraciina Plasmido que confiare resistencia a tetracclina Cromosoma’ | Extraveidn de DNA fea e DNA celular Cloruro de cesia total ybromuro de cidio | CCentetugacion a 3g — ov rmoxinn DNA plasmidico sag | Fraccionamionto > S| Célula sensible ‘a tetracilina DNA sromasemice —399, orfiio loruro eilcico Cetula permeable Cromosoma Fidsmido que confiore resistencia a totraciclina Célula transformed, rosistonta aterracclina rrollo de la tecnologia del DNA recombinante ya exist tocolos generates para el aislamiento de DNA. Cuando: ~zan estos métodos, la mayor parte del DNA exiraido del te es DNA nuclear gendmico en eucsriotas o el principal genOmica en procariolas; normalmente, son est0s DNA los que se someren a andlisis. El procedimieno sigue para obtener el DNA vector éepende ée su n Los phismides bacterianos son unos vectores quc s© rutinariamente y que deben separarse del DNA gens bacteria. La Figur 12-2 resume el protocolo de extrac DNA plasmidico por ultracentrifugacién. EI DNA plas forma tna banda ritida después de Ia ultracentrifugacis sgradiente de densidad de cloruro de cesio en presencia muro de etidio, Para recuperar la banda, se perfors lip tubo de centrifuga de plastica. Existe otro proiocolo h Ja observacién de que, a un pH alcalino espe raliza el DNA genémico bacteriano pero no el pla Cuando Inego se neutraliza la muestra, et DNA gen6r Cipita, mientras que el plasmidico se mantiene en solu fayos tales como 4 también pueden utilizarse como para la clonacién de DNA ea sistemas bacterianos, ELD fago se alsla a partir de una suspensién pura de fagos po te de un lisado, Digestién del DNA El descubrimiento que hizo posible el desarrollo de la teem del DNA recombinante fue la identificaciGn y caracteri las enzimas de restriceién, Las bacterias producen enzin restrieciGa como mecanisme de defensa frente a los fags cenzimas funcionan a modo de tijeras, cortando el DNA é para producir st inactivacisa, Lo importante es que las de restriccidn no cortan aleatoriamente, pulacién del DNA. Por azar, cualquier moléeula de DNA, de virus 6 de cualquier ofro organismo hasta los seres fu ontiene sitios de restriceién, de modo que puede vote fragmentos definidos de tamafio adecuado para su com Los sitios de restriceién no desempefian ningtin papel cionamiento de un organismo, y tumpoco serian ‘como tales in vive, ya que la mayoria de los organismos ducen encimas de restriceién, xaminemos un ejemplo. La enzima de restriceién Fox E, coli) reconoce la siguiente secuencia de seis pares de tidos en el DNA de cualquier organismo: Figura 12-2. Los piamidos,en este caso un plsmis porta, sen de resisencia al anbiicoteraiclna (aria), pueder sepean somos hacer Dene sin i a wns las dow especies de DNA hacen que el psi sea mus dens que 61 DNA eromosimieo forme una banda separa ta enue, tn grant de chon de esi (ajo ta egalenda). i vex pia ‘eden esos om le elas bstoranan par ranslrmin (ae (Moditiado de 8. N-Coheo, «The Manipulation of Genes.» Copia 6 1975 de Sviemtie American, In. Reserves tos Tos ech)N23, 1 encima de resriocin Hout conta una mokéeua lirde DNA que lene un sitio de ecanociento para dicha encima, ior sa mou liza! eam extrennos exes. tipo de secuencia se denounina palindrome de DNA, para Ea qu? las clos eadenas tienen fa misma secuencia nucleott- Fo una orientaci6n antiparalels, La mayorfa de li en- is de testriecion reconocen y cortan palindromes especiti Taewima EcoRI corta de forma escalonads entre los nus dos G y A de smbas cadenas is Sedice ue los extremos son cohesivas porque pueden tes de hidjgena (unirse) con una secuencia comple. {a Figura 12-3 muesira la digestion con EcoRI de una Grvular, como puede ser un plasmido, que contione ssouencia dana: el verte produce la apertura delete jltmokcula linea! resultane tiene dos extremas cohesivos, mlucein de estes extremes cohesivos es ota propiedad de de restrccién que tiene aplicacisn en la teenolegia Arecombinante. La ideas la siguiente: si dos moléculas se ortan con la misma enzama de restriccién, ambas in fragments con los mismos extremes. cohesivos, nenurios, Lo que permite la formacin de quimeras de ise cortanel DNA vector y eldonante eon EcoR, i. los extremos cohesivos del vector Podrén unirse con » cahesivos de los Fagmentos donantes ite, xe comoeen docenas de enzimas de restriceién ‘especiticidad de secuencia, algunas de las cuales se el Curadro 12-1, Advertira que todas las secuencias apulindromes, pero quc hay enzimas, como EcoRI, que ares escalonados, mientras que otras producen cor- gue generan extremos romos. Inchuso los extremos 0 utilizarse para construie DNA recombinante, lumbién puede fragmentarse mecénicamente. Por IDNA se agita en una batidora, los eromosomas de Construccién de DNA recombinante 360 gin tamato se romperin en fragmentos con extremos romos ue pueden clonarse. Ligacion del DNA Lo mas comiin es que el DNA vector y.el DNA donante se digie- Fan con una enzima de restriccidn que genere extremos cohesi- ‘Yos y luego se mezclen en un tubo de ensayo para permitir que los extremos cohesivos de ambos DNA se unan y formen molé- culas recombinantes. La Figura 12a muestra un plésmido vec tor portador de un inico sitio de restriceién para EeoRL, de ma- nncra que la digestién con la enzima EcoRI convierte la molécula circular en una molécula de DNA lineal con extremes eohesives DNA de cualquier otro origen (p. ej.. de Drosuphila) se trata Organismo Biana de restriecion Enzima productor _enei DNAde cadena doble FooRL Escherichia coli FoR Een sPlismido Vector Sitio de corte ) {| corte con ta || endonucleasa EcoR! v A I: ) Figura 124, Molo fs a const de on Pismo quineic potar de DONA frien Toma SiN, Cahn le Maniplation of Genes Copyeiht © ISIS de See Amon, In: Reserva ao dacchon) también con la enzima EcoRI para producir una poblacién de fragmentos con lox mismos extremos cohesivos, Cando se tmezclan las dos poblaciones, las moléculas de DNA vector pue- den unitse con fragmentos de DNA donante mediante la forma cion de segmentos de doble hélice entre sus exiremos cohesi- vos. Debido a que hay muchas moléculas lineales de vector en 4 solucién, y muchos fragmentos EcoRI diferentes de DNA dlonante, se producira una diversidad de moléeulay recombi> nantes. En esta etapa, aunque los extremos cohesivos han hibri- ado y generado una poblacién de moléculas quiméricas, tos cequeletos azdear fosfato presentan discontinuidad en cada uno de los puntos de unin, No abstante, es posible sellar los extre- mos mediante la adicién de la enzinia DNA Higasa, que crea enlaces fosfodiésteres en los pantos de unién (Fig. 12-46). Algu- nas ligasas pueden ligar incluso fragmento de DNA con extre> Capitulo 12 Tecnologia del DNA recombinante Alinoarnionto DNA foraneo Corte con la { endonucleasa EcoR! aurr arr TTAA THAR TIAA ‘Amplificacion del DNA recombinante ELDNA recombinante, una ver ligado, se introduce ent a bacteriana mediante transformacién, Desitro de fa ceptora, et vector plasmidico se replica, ya que los pil suelen tener un origen de replicaciin. Ademés, abort DNA denante se encuentra integrado en el plasmid, sa replica sutométicamente cuando se replica el DNA xeeiny ppkismido recombinante que penette en una eélula dard imiltiples copias de sf misino en esa célula, Posteriormes rririn muchos cicios de divisién celular y los vectores nantes experimentariin més rondas de replicacién. La bacteriana resultante contendré millones de copias de un teonereto de DNA donante. El conjunta de copias ampli de-un fragmento de DNA donante se conoce como clon dO (Fig, 125).Construccién de DNA recombinante om Sitios ue resinccion Con det agmento donate 2 Figura 12-5. Asi ccure la ampliicaciin. Et ratanienio dl DNA dans y vector con enemas ds rss Derm a inserin de tragmenos infividuales en! vector. Ths la ented de un sola molecula reombinsnte ex Incdula astern, fa epicacion y tis clue pmalucen un nso clea de coi del fremento donut,> Clonacién de un gen especifico ‘apitulo 12 Tecnologia del DNA recombinante [En los apartados precedentes hemos descritu aproximaciones genérivas para la construcci6n de DNA recombinante, Sin em- bargo, en la préctica, lox genetistas esta interesados en aislar y ccaracterizar genes ceneretos, por lo que los provedimientos de- ‘ben de adaptarse para permitir la clonacién de un fragmento de DNA que contenga el gen de interés, Los detalles det proceso, Vector pBR322 Ecofly 185 Nel 228, Seal 3946, Banlil375 Pus 3735. Spl 562 Px 3609, ‘Ser 651 Se Pata Digestign de! DNA forénea ‘Con, por ejemplo, Sal | “Transtormacion bacteriana | ‘Siembra en placas con ampicilina ape Sin Con Figura 126. po la nacivaion ela fineion lato syoficial X-Ga en un enmpuesto de clor azul agi 938 NAN S72 Bett 1063 Exqucma de fa estuctrs general y ls sitios do esrecion de ds plismidos dsenados para ser ‘sipledos coma vsctnes de lonacign de DNA. La nsercion ea pbR22 se detects pla inactivaion de un gon de (at, ve prownoasFenetipa de sonsiblidad "Tet- La smersb on pUCIB se detects dal feb 7 que Seduce om a incagucida para gonvenire usta differen de un organismo a otro y de un gen a otro. Ui ‘nicial importante es la eleceion ie un vector adecuado proyecto que uno se proponga realizar. Eleccién del vector de clonacién Los veotores deben ser moléculas relativamente peque {que sen faeiles de manipular, También deben ser Digestién del DNA foréneo an, por ejemplo, Xba! amp" sin insert conaren una célula viva y permitir asf la amplificucién del agmento donante insertado, Otro requerimient importante es contenga sitios de restricvi6n convenientes para la insereién }DNA que se desea clonar. Los sitios de restriccién inicos los mas atiles porque permiten ditigir kt inserciGn de DNA ane un sitio especifico del vector. También es importante ofrea un mecanismo pura la identificacién y la recupera- pide ls moléculas recombinantes, Actualumente, bay miichos ates de clonacién disponibles, y la eleccidn entre ellos suele nde del tamaiio del segmento de DNA que se desea clonar, lenremos algunos de uso muy comin, Como describimos anteriormente, los phismidos eeramos son moléculas circulates pequetas, separadas del umosom acteriano principal. Replican su DNA eon inde~ cit del cromosoma bacteriano. Se hart encontrado mut sips dstinios de plésmidos en bacteria. La distribucidn de uit plésmido dentro de una especie suele ser esporidicas ants clulas son portadoras del plésmido y otras no, Lin el nlp 7, consideramos el plismido F, que confiere ciertas les comjugativas a les céhulas de E. coli EI phismido F de tlizarse como vector de frugmentos grandes de DNA, note, como versinos en cl Capitulo 14, Sin embargo, los mids que se utilizan rutinariamente como vectores son jos que son portadores de genes de resistencia a antibii Las 2enes de resistencia a antibisicos son muy tiles por- | feaouipo Ue resistencia sirve para selecctonar no solo las trnsformadss. con plismido, sino también los yectores tienen DNA recombinante, Ademis, los plésmides. son Temedic cficaz paca amplilicar DNA clonado, ya que existen 8 copias por vélula, hasta varios centenages para algunos tilizado anipliamente en los estuins genética, Estos vec- esa de plsmidos naturales, pero ambos han sido modi enclicamente para faciltar sv uso como vectores de {MAncombinante EI plésmido pBR322 presenta una estructu- & sila y contiene dos yenes de resistercia a antbieti- ie" y amp*. Ambos genes contienen sitios de restriccién inves que resultan muy titiles para 1a clonacida. Por ejemplo, fia clegirse el gen ¢et* para insertar cl DNA donante. Una inen el gen tet” produvira su inactivacién y la pérdida de ssecia a tetracelina, de manera que ls céluks se volve~ ersibles a la droga, Por ello, ef precedimiento de elomacisn ranpicilina, que deben haber sido transformadas con una sila de plismido. De las colonias Amp", sélo aquellas que wean sensibles a tettacivlina portardn inserto, en ouas, las colouias Amp® Tet serdn las que contengan DNA inunte, Para averiguar qué clon es portador de un inserto hay que realizar experimentos adicionales. iplsmido pUCes un vector més avanzado, cuya estructura teh visualizacién directa de las colonias portadoras de MAncombinante. El elemento clave es una peu ue determina la f-palactosidasa de E. coli. En esta regicn, isetado un fragmento de DNA denominada sitia de clo- parte dsl ‘Clonacién de un gen especifico 373 nnacién miltiple, yue contiene muchos sitios de restriceién tni- cos para facilitar lt clonacién, Bl sitio de clonaeién maliple no aller Ia fase de lectura del fragmento de f-yalactosidasa y tam ‘poco interfiere con su traduecién. El protocola de transforma- ‘in utiliza células portadoras de un gen para la f-galactosidasa ‘que carece del fragmento presente en el plismido, Ovurre un lipo de complementacién poco habitual en el que las protefnas pareiales determinadas por ambos fragmentos se unen y dan Iu far a una enzima f-yalactosidasa funcional. Cuando se atade al medio el sustrato incolora de Ia f-galactositass denominado X Gal, la enzima funcional convierte al sustrato on un compuesto azul. que da una tonalidad azul a la colonia, $i se inserta DNA donante en el sitio de mutticlonaje, se interrumpe el fragmento de la enzima determinado por el vector, no se forms f dasa funcional y lis golonias son blancas, Asf, las. colonias Amp® bianeas son candidaias claras a ser ponadoras de DNA ecombinante, y son este tipo de colanias las que se aislaréan para su estudio posterior. Los plismidos que contienen insertos de gran tamaiio tienden & perderlos espontineamente; por ell, los plismidas no som tit Jes pare clonar fragmentos de DNA mayores de 20 kb Jactost Vectores virales. Los vectores virales, hasados en la lilize én del genoma de un virus para la insercign del gen o genes de interés, ofrecen muchas ventajas en li clonacién de genes y su ‘manipulacién posterior. Debido a que los virus infectan a sus las hospedadoras con una eficacia elevacla, el gen clonado se introduce dentro de fas célvlas con mucha mils frecuencia que por el método de fa transfonmaciGn, Algunos vectores virales se han disefiado especialmente para permitir la sintesis de niveles clevaulox de los productos proteicos de los genes clonados, como cel easo de los baculovirus de insectas, cuyo uso pura li expre sidn de genes fordneos en un sistema celular eucaridtica se deta- Uaen ef Capitulo 13. Otros vectores virales, como los basados en cl bucterisfago MI, han sido disefiados para facilitar la secuen ciacidn de los genes clonados y la introduccin de mutaciones en dichos genes. Los vectores derivadns de los retrovirus perm ten Ia integraci6n estable del DNA clonado en los eromusunias de mamiferos, permitiendo la expresién estuble del gen. Los vectores virales son también Tos vehtculos clegidas en las estra- tegias de terapia génica. A continuacién, se deseriben algunos ejemplos de vectores virales utilizades en hacterias, Fago lambda. Por varies motivos, el fago jes un vector de clonaciéa bastante Gtil. En primer lugar, las eSpsidas del fago cempaquetan selectivamente cromosomas de unas 50 kb de longi lud y, como veremns, esta propiedad resulta muy ttl para selec- ccionar las moléculas de . que han insertado el DNA donante, La parte central del genoma del fago no se requiere para la replica- ccidn @ el empaqueamiento de las molsculas de DNA de Zen E. coli, asi que esta parte puede cortarse con enzimas de restricciéin y descartarse. Los dos «brazos» se ligan con DNA donarte cor= tado con enzimas de restriccidn, Las molécnlas quiméricas puc- den intreducirse en F. coli por transtormacién 0 tras Ser empa quetadas en capsidas de fago in vitro, En el sisema in vitro, se mezela el DNA y los componentes de la eépsida, ylas particulas Virales infectivas se forman espontaneanente, En cualyuiera de Jos dos métodos, son las moléculas con insertos de 10.2 15 kb asam que se empauctan mas eficazmente en las capsidas virales, ya ue este amano de inserto sustituye a la parte central deleviona- tia del_genoma del fago y genera una molécula cuyo tamaio ronda las SO kb, Por ello, la mera presencia de un halo en un essped bacteriano indica aulomiticamente Ia presencia de un ‘ago recombinante portador de un inserto (Fig. |2-7), Otta pro- Piedad titi del fago como vector es que lus molgeulas recombi- antes se empaquetan de forma uutomética en purticulas infeeti vas, que pueden almacenare convenientemente y manejarse experimentalmente, Fayos de cadena sencilla Algunos fagos contienen slo moléculus de DNA de cadena sencilla. Cuando infectan una buc- DNA aendmica <7 to Aislamiento de Iragmentos de 15 kb ——= Digestion de algunos fe los sities Sava sida DNA [cectaes Joe 4) de E. colt = Jura 12-7. Choad en el fags 4 Se descr un resin cone se curso del fago que no es eserwaly los ees se Higa lca con fragmentos de DNA cmane de 15 Mh Se formas ulin nel ‘onetime, que luego ulin pr feller a pis del ago con owinw mefiante ak ster de erpacutanines in vitro, Toman dB: ‘Wason, M. Gilnan, J. Witkowski ¥ M. Zoller, Revbuant DNA, 3. ed (Copmght 1992 de Scestitic Anertan Books. Capitulo 12. ‘Tecnologia del DNA recombinante Bacteriofaga 2 (vector! [escartar los fragmertos tte tamano superior a inferior feria, la cadena infectiva se conviewte en ung forma de cadena doble, que puede aislarse y utilizarse para ventaja de utilizar estos Fagos womo vectores de clo el DNA de cadena sencilla es el susirato que se requiee secuenciacion del DNA por la técnica de Sanger, El fuga el que se utiliza mis frecuentemente con este propésit Césmidos. Los odsinidos son vectores hvbridos entre ¥ tun plismido, de modo que su DNA puede replic la como un phismido oempaquetarse como un fago, burgo. en los cdsmidos pueden clonarse insextos de tres veves mis prandes queen 2 (tanto como unas 45 kb fo), El fundamento es que se ha delecionado la mayor p <+—______ 5b Bami ' Bam 4 Digestion con | Alslamianta de tos brazoe derecho e izquierdo | | : Escrutinio de la genoteca utilizando ln deido nucleieo come sonda1a de 2, dejando las secuencias que actin como sefiales ‘npaquetamiento (Sitios cos). Esta estructura modificada ue la cpsida viral se rellene casi exciusivamente con (Ardoante. El DNA del eésmido se puede empaquetaren las spsidas del fago mediante el sistema in vitro. La Figura 12-8, vel método de clonacksn utilizando eésmidos. de expresién, Una forma de identificar un gen elo- eunereto es detectar el producto proteico que se expresa a ‘del mismo en una célula bacteriana, Para ello, es necesatio l.gen se exprese, es decir, que se transeriba y que el mRNA. oa aprotcina, La mayorfa de los vectores de clonacisn 00 la expresion de lox genes clonados, y se requiere el uso Clonacién de un gen especitico 3s. dle veetres especitles, Sin embargo, debido a que las bacterias no procesaa los intrones,previamente dehen de haherse eliminado los intrones de las secuencias clonadas. El gen clonado se inset aguas bajo de las settles necesarias para la transeripeiin y la traduccion cen bacterias, Se han diseriado algunos vectores de expresion que contienen sitios de restricién adyacentes a una regi regulado- fa lac, Estos sitios de restriccién permiten la clonacion de DNA. Tordneo en el vector bajo el control del sistema regulador fac. Construccién de una genoteca de DNA Hemos visto que el principal objetivo de la tecnologia del DNA recombinante cs la clonacion de un gen particular o de cualquier Concatémera de DNA del fago 2 = Pe ee = Eros cheatos (oe) [oe DNA gensimico | en un plasmido Sitio cos =~ Ball {eompatibe con Sau3A Digestion pais Cosmida |S, Rotura enel sitio Bail con SauSA, Aislamiento de tragmentos de 36-85 Kb int: ons hh ——————— ————— Sitios cos ———s — Ligadion tet? DNA vector Sites cos DNA genomico Ie ‘empaquetamienta io vitro recanoce dos sitios cos ey mncuentren soparados unas 35-45 kD tris 1 essmide recambinanta ‘8 replica como un plasmid Figura 12- Infoccién de €. cof, Seteccion dela resistencia a Tet. Célula de. cot! DNA genémico ‘Cinacion en eis. Se vor el efsido en un sto Bell adjacent a sve cus. ELINA genimico dopants se coma con SiA, que produce extreme cohesive somppatibles von Bgl, Cuando se mezelu, se tiene uns dissosii6n en tdem de moléculas de DNA denn ‘ect fg s empl itn eotando fen el sito om Los cries que cotienen inset, una Yer dentro sels eels hacer, se creularzan ‘Towa de J.D. Watsen, M, Gime, J. Witkowski y M. Zaller, Rcombinane DNA, 2° ed. Copyright) 1992 de Seieniie American Hooks+> cara fragmento genGmico de interés pars el invesigador, La es: tvategia a uilizar para la clonacién de un gen especifico depende en gran medida del gen en cuestiny de lo que satennos sobre é, Genetalmente, se suele comenzar con una muestra de DNA camo, por elemplo, DNA genomico cucariotice, Hl siguiente peso consiste en obtener una vasta coleceién de clones a partir 4d lu muesira original, Esta coleccién de clones se denomina genoteca de DNA. A veces, nos referimon a este paso coim0 «clonacién por perdigonada» porque el experimentador clona un muestra amplia Je fragmentos y espera que con uno de los Clones se haya dado en cl eblaneo» y contenga e! gen deseade, 1a tarea enionces es encontrar ese clon particular, Hay diferentes tipas de genotecas, clssticadas, en primer Ii- sar, seziin el vector que se utilce y, en segund higar. segsn el tigen del DNA. Puesto que veciores de clonacién diferentes pueden transportar longitudes de DNA distintas, it eleocida del ‘cctor para la construcei6n de la penoteca dependers del tamafto del genomia (0 de cualquier otra muestra de DNA) con el que se ‘8.4 consnur la genoteca. Los vectores plasmidicos ¥ los fagos pueden transportarcantidudes pequefias de DNA, por lo que som lules para clonar genes a partir de organismos cuyes genomas son Pequelios, Los edsmidos pueden transportar cantidades de DNA inayores y clos vectores, como lox YAC y los BAC (xéanse los Caps. 13 y 14), som lbs que offeoen la maxima expacidad. Otro factor importante en ls elecci6n del vectors la facilidad de mane= jo, Una genoteca viral es una stspension de fagos. Una genute oastruida con plismidos © e6saides es una suspension de bie terias¢ um conjunto de cultivas bacterianos Uefinides que se al macenaut en tubos de ensayo 0 en cajus con miles pocllos La segunda decisién importante eonsiste en optar por cons ‘wuir una genoteca genémica o una genoteca de cDNA. El eDNA, 0 DNA complementario, es DNA sintstico obtenido @ partir de mRNA por lsaccién ce una enzima especial cenominada ‘wanscriptasa inversa y aislada originalmente de retovirus. Util zando mRNA como mold, la tanscriptssa inverss sintetiza una rmulécula de DNA de cadena sencilla que luego puede utlizarse ‘como molde para la sfntesis de DNA de cadena doble (Fig. 12-9). Debido a que procede de copiar mRNA, el cDNA carece tanto de Secuencias reguladoras como de intrones, Esto significa que el CDNA de eucariotus sf puede traducirse & protefna funcional en bacterias, un factor a considerar cuando se expresan genes euca- righicos en hacterias, Lt eleccisn entne DNA gencmica y eDNA depende de Is si- luucivn, Si se busca un yen conereto, que sea activi en un deter ‘minado fefido de una planta 0 un animal, entonces tiene sentido ilizar ese tejido para prepara mRNA, convertilo a DNA. y prepurar una genoteca de cDNA a panic de esa muestra, Una zonoteca obtend de esta manera deberia estar enriquecida en el gen en cuestidn. Una genoteca de cDNA esta hasada en las ro- fines del gonoma que se transriben, por lo que inevitablemen- te ser mas pequedla que una genoteca genémica completa, que dleherfa eontener todo el zenoma. Aungue lus genoteeas genémi- cas incluyen un mayor mémero de clones, tienen la ventaja de contener los genes en su forma nativa, incluyendo los intzones y Jas secuencigs reguladoras. Si el objetivo de constuir una geno- teci es el preludio de Ia clonacidn de un genoma completo, en- tonces se necesitard una genoteca genéimica en alin moment. Capitulo 12 Teenologia del DNA. recombinante En algunas casos, es posible reducir la fraceién genéimi se utiliza en la construccién de una genoteca con el obj facilitar la deteccién del gen deseado. Esta aproximacién: de realizar si el investigador ya conoce qué cromosomac el gen, Lina técnica que se utiliza en el anilisis genético lar de mamiferos consiste en separar los cromosomas instrumento denominado citcmetro de flujo. Se hace pas suspension de cromosomas por este sparato, que track cromosomas sega su tamaiio (esta técnica se discute ow: etalle en el Cap, 14), La fraccisn cromosémica adeet utiliza para consteair la genoteca, tra konica uplicable a los onganismos con eromoso queiios consiste en fraccionarlos mediante eleetroforeie campo palsante (PEGE: del inglés, pulse field yel ele Seeeinenreeinanene) # ee ain nya | AAR IBA me en horquilla a Folimeragal de DNA TTT 1 | | Nucleasa $1 lespesifica de cadena sencilla | DNA dle doble cadena Figura 12-9. eu ligne (ooo parn gh Sivesis de eDNA de Uoble eden pir de WRN, ide con cola de ol mRNA y tuncinne come cebador de la wawscripasa inves qu wine InN conn molde pars a sintesis de una cidkna de DNA complementie EYeDNA reultante termina en wns estrucure ot haga Cuando 12 degrada den de lA. con NOH, la ‘etd pare le pomerss I de DNA, que genett DNA de dle cadena La estructura en Rorquil seeming com la micas S| gu lo akin le repn de cena sencilla dela hocqula, prac asi ens moles DNA oe cate dole. (Fomsao de'l. DB. Watson, 4, Tze DT Kutz, Recombinant BNA: A Short Course, Copyright ©) 198 de WI. Freeman ané Compan.)“fais La electvoforesis es um tGeniea general que permite sepa “at fvidos nucleicas o proteinas de acuerdo con su tamafio cuan- Be cick ox peleseampetidds nun cane edewien intend. Maline este procedimiento se separan los fragmentos de DNA. ones, La PEGE es un tipo expecializado de electroforesis erute la separacién de moléculas de DNA muy largas. Se I cc chos cc nets roles Jatasditeeciones. Eso permite que mokiculus de DNA de gan amaio migren a posiciones diferentes del gel segtin su ta- El cromosoma de interés pede idewificarse vilizando sonda especifica de dicho cremosuina (véaxe el siguiente ‘atypatado). Una vez identificado, se corta I banda del ge! que ‘Stine el cromosoma deseado, se eluye del gel y se utiliza para. Tnsnir una genoteca especifica de un cromosoma, sentemente amplia para contener una secuencia tinica de in- con un grado razonable de certeza’ Existen formulas que puede obtenerse una idea upronimada de ki magnitud exigi pra una zenoteca simplemente considerand el tamafo total ‘eons y dvidigndolo por el tamafio medio de los insertos nspontados por el vector. Generalmente, ef niimero real seri jpmenos el doble, pero proporciona una estima de la magni- (el trabajo a invertir en la construceiGn de una genoteca entificacin de clones especificos adiante la utilizacion de sondas sgmeca, que podria contener tanto como cientos de miles de pints clonados, debe caaminarse pura encontrar la molé- lnleDNA recombinamie que costenga el gen de interés, Este io se reliza mediante la utlizacin de una sonda espect- fee reconccers expecificaments el clon, permnitiend asi que esigndor Io detece. En trminos amplios,existen dos tipos Jas que reconocen DNA y las que reconocen proefna. para la deteccion de DNA. El uso de estas sondas se en la tendencia natural a la complementariedad entre cade- Gt eailas de dcidos nucleicos. Asi, una sonda de DNA que sido desnaturalizada (cuyas Uos cadenas se hayan separa sont y Se unin a otras secuencias de la genoteca simi- us que hayan sido desraturalizadas, [0 AGOUENICTICGNTAAATACCCUETTACGTACTATTGGAAGG...-¥ tlicacidn de un clon especifico de una genoteca consta “pasos (Fig. 12-10). Primero, colonias 9 halos de la geno- sinedos en una placa de Petri se transfieren a una membra- jtorbente (en general, nitrocelalosa), simplemente deposi- Clonacién de un gen especifico 3am tando la membrana sobre la superficie del medio. A continuacin, se levanta la membrana, y las colonias © halos que se hayan adhe rido a la Supericie se lisan in situ y se desnaturaliza el DNA. El siguiente paso consiste en sumergir la membrana en una solu: cidn con una sonda especitica pari el DNA de interés. La sonda debe estar marcada con radiactividad © con un compuesto fluo- scente, En general, la propia sonda es un fragmento de DNA clonado que contiene una secnencia hamologa al gen deseads, La sonda de DNA debe desnaturalizarse, para que se una exclu Sivamente al DNA del clon que se persigue. La posicién del clon positivo serd revelada por la posicigin de la sonda eoncentrada, 3 menudo una mancha en un autorridiogran. {De dinde provede el DNA que se utiliza para obtener una sonda? Puede tener diversos origenes. Una posibilidad es que sea cDNA obtenido de an tejida que exprese el gen de interés La idea es que, debido a que el mRNA de un gen abundard en se tejido, es muy probable que muchos de los CDNA sitet dos a partir de ese tejido e insertados individualmente en las mokéculas de vector comespondan al gen deseado. Por ejemplo, en reticulocitos de mamiferos, el 90 4 del mRNA provede de lt ‘ranseripeidn del gen de la f-globina, por lo que los reticulocitos serdin una fuerte adecuada de mRNA para sintetizar una sonda de eDNA que permita «cazar» el gen gendmico de la globina. Ea este caso, habifa que rastrear Una genoteca gen6mica, La elec- in depende del tipo de preguntas que nos interes resolver acerca del gen. Si s6lo estamos interesados en la regién que se transcribe, un clon de cDNA seri tan inforntativo como uno ge- ‘nomico, Si, por el contratio, estamos interesados en el zen com pleto, con sus intrones y secuencias reguladoras, entonces es ne esario que busquemos un elon zendimico, ‘Otra fuente de DNA para la obtencién de una sonda puede ser ‘un gen homélogo de un organismy relacionado, Por ejemplo, si dlisponemos de un clon de un gen del hongo ascomiceto Newros ora, es bastante probable que se pueda utilizar este zen como sonda para encontrar él gen homélogo en el hongo relacionado Podespora. Li efieacin de este método depende del grado de conservacidn evolutiva de las secuencias de DNA. Aun cuando las secuencias de DNA de la sonda y del gen de interés puede ‘ue no sean idénticas, el grado de simnilitud suele ser suliciente para permitir la hibridacién. En teno jocose, solemos referirnos odo con Ja expresién «clonacién por teléfono» porque, si telefoneas a un colega que haya obtenido un clon del gen de interés a partir de uit organisio relacionads, la tarea de clona- cidn suele convertirse en un proceso relativamente ficil ‘También puede sintetizarse una sonda de DNA cuando se co- rnoce el producto proteico del gen de interés y su Secuencia de aminodcidos, Se diseftan oligonuctestidos sinéticos teniendo e cuenta ¢l edidigo genético. de modo que bastaria con traducir ex sentido inyerso la secuencia de aminodcidos para deducir la se cuencia de muclestidos correspondiente. Sin embargo, debido a {a redundancia del eédigo —en otras palabras, a que la mayorit de los aminodsidos estin determinados por mas de un eodGin— hay més de una secuencia de DNA posible que podria determi- nar fa proteinaen cuestidn, Para subsanar este problema, se elige tin tramo de aminoseidos corto y con una redundaneie minima. Utilizando el diccionario de codones se dedacen las posibles se- ccuencias. La sintesis quimica de oligonuclestidos es un procesolo 12 Tecnologia del DNA recombinante om taeeie iv if \ Feiss = / | wacom don Digestién con una enzima 4 od deveerieson 5 gE . Incubaciin | Bein eee =e ok ween ee Fito, spill. Seeihion Fagos hibridos FFirenenneeeeny Bacteria > oe “! be st Césped bacteriano. Auerraaiograte para ocalizar ‘8 clon deseeda Pelicula Clon del face en ta placa ‘etrFreneerene Sintosie de! gen fordneo i ‘que se realiza paso a paso; esto permite la sintesis simalténea de tocas las secuencias posibles mediante el suministro. de una inezcla de les nuclestidos alternativos en aquellos pasos que co- rrespondan 2 posiciones de la secuencia donde existe ambigtic- dad, Ia Figura 12-11 contempla un ejemplo con cineo posicio- fnes que presentan redundancia: 2, 3,2.2.y 2 alternativas, Livamente. La reaceidn sintetizarfa 2x 4x 2x 2x 2=4K ucledtidos simultineamente. Esta mezcla de oligonucl se utilizaria como sonda y lt cadena con Is secuencia os permitiria detectar el gen de interés, Veinte nuclestiFigura 12-10. (3) Se oe onsinic una zeotecagennca meine Bhi sc sicy cnc tmcerign & Candy se ia csp Esco cn nero eleva de gos bdo ferent, aa a ab tel espe esque un co ch de fags descendent del go es riptalmene, Cade cln conten w ramen diferente do Batu ponina anes xmas ex taenitear qv chon Sle esa gv deine enc) meine ic dnde DNA RNA relacionadas co eh deseo.) Se ace us pis rset de incl, se dog la etlaas ‘jon slo DNA recombi, se desis pura tar sao ir, ir ecb cn Un sonda mada radar, on ua ops eh DNA il RNA corespondent al oe mes, bri con evar DNA reciente que ya incorpo Pes cmplrentat: I porlon declan postin ne dtc, fsatingrai To ches de er ps selcims de aly oy urferice de nev awa cella cena, pr eer wt ze en fe, CToniad de R.A. Weinberg, A Molstlr Bas of Cans Het. The Gencics Asin Divery» Copycat 1 1983, Bl Scie Auer Ine, Revers kos lox deh) la especificidad necesaria para hx ideniificacién de una efvia nica de DNA a partir de una genoieca “Ads, ambign puede utilizarse RNA marcado radiactiva- como sonda, Esta posibilidad existe cuando se dispone de laciin relativamerte pura de moléculas idénticas de fnles como RNA 0 IRINA en distinias fracciones. para la deteccién de proteinas. Si se conoce el pro- joteico de un gen y se puriticaa homogeneidad, la proter- fe ilizarse para detsctar el clon de! gen correspondiente faigenoteca El proceso se describe en la Figura 12-12. Se je anticuerpo que reconozea especificamente la protefna za para rastrear una genoteca de expresion, Este tipo de eas Se contuye utlizando vectores de expresién que per veloselovados de expresién de una determinada protei- aaterina, Para construir la genoveca, los cDNA se insertan eciorde manera que su fase de traduceién eoineida con la na bacteriana y lus céluas sinteticen proteinas. do 5 6 7 8 ¥ 10 11 12 HE TE Wa THIS I ABH (SBF LOL GIA opeicico Eee ees Regién de 20 bases menos degenerada Sintesis ce | Otiganuctestida Sigonuclesidor | dela mercla 20 bases | degenereds que es dogenerados para | perfectimente fastrear una | complementario TAK ATG TAG GIG GIT 'OPATCOAATGTC.. Sesuencia ielgen 241. se atin wn scene co eons pen pr ttjntn de ligonuclectidosreduntes para uso como nda en legen sue determina esa protein, Una de les sondas gue ain coincided co ls secuencia del yen (Toad de PBnwre, A. Berk, 8. Zipurky.F: Masucasa J. Darel i ie. 3208 Copyright 105 de Scenic American Books, Clonacién de un gen especitico a fusidn, Se deposita una membrana sobre la superficie del medio para obtener una réplica de las colonias, se seza y se sumerge en tuna solucisn con el anticuerpo, Los ctones positives se detectan utilizando un anticuerpo secundario, que reconoce al primer an ticuerpo y esta mareado con un isotepo radiactivo, um compuesto Fluorescente 0 un compuesto coloreado, Al detectar la proteina cortecta, ef anticuerpo desvela el clon portador del gen que de- Acriing la sintesis de dicha proteins Al principio del capitulo, se plantes la cuestidn de e6mo po «ira identificarse el gen responsable del albinismo en el hombre, Pues se clons previsamente ulilizando un anticuerpo que reeono ce Ia enzima tirosinasa, cuya deficiencia es la que proyoca este ‘rastorno, En primer lugar se purifies la enzinta, como cualquier ‘tra protefna, ullizando métoxlos bioquimiicos establecidos, Unt vex purificada, se obtuvieron anticuerpos especificas de conejo. Se aislé ef mRNA total a partir de oéulas productoras de tirosi- nasa y se utilizs para sintetizar CDNA. Con eleDNA se constru- ‘v6 una genoteca de expresion, Se rastre6 la genoteca con el nti: ‘cuerpo anti-tirosinasa y s© obtuvieron varios clones positivos. ‘Tras secuenciar el CDNA de los cloves positivos, se identifies un gen cuyos exones sumaban 1590 pares de bases, Este CDNA se utiliz6 para rastrear una genoteca gendmica humana y, en este proceso, se identificé el gen de la tirasinasa, con cineo exones y cuatro intrones, COROLARIO « \dentificacién de clones especificos mediante complementacién funcional ‘También pueden idemtificarse clones espectfisns de una genote- a conaruida en bacteriaso en fagos haciendo uso de si capaci- dad para complementarelfenetipa de una fea nustantedel ya nismo donante tansformada con la genoteca, Este procedimiento se denomina complementacién funcional y cl protocolo a se sir seria: Construccidn de una genoteca en bacterias o en fagos utiizando DNA silvestre como donante J Transformacién de una linea mutante a cen la genoteca 1 Seleccidn del fenotipo a” entre las eélulas del organismo donante t Recuperacisn del gen a a partir del clon bacteriano 6 viral adecuado 0 de las células donantes transformadas Este método exige que el organisme donante, con frecuencia un eucariota, sea susceptible de ser transformado. En un capitulo previo se trat6 la transformacién en procariotas (Cap. 7), pero Jos eucariotas también pucden set objeto de transfermacién Aunque hay diferencias entre el procedimiento que se utiliza con diferentes eucariotas, es habitual que haya que someter a las cé-> batt ‘ mal an Sr mw | ' Placa original $ La proteina de fusion Unida ala ritroceluiosa ~ Capitulo 12 Tecnologia del DNA. recombinante Ecort P-Golostosidasa ' Protaina de field || Empaguatamiento in vitro | Siombra sobre un césped | poston he cet Y ol ees | Se dopasita un ftro de nitrocolulosa | por encima Las protefnas se unen al filtro de nitrocelulosa | Ineubacién del filtro ean el anticuerpo primario | Lavado del titra | Incubaciin del filtro con wl anticuerpo secundaria marcad ratlisctiverents Autorrediogratia ecundaria mareade Fl onticuerpa detects ( / moon Patou de ayos X ae = primaria Figura 12-12, wings el corde interes mediante clus de aniverpos, Un genoa de expen Consiga en el fago derivado gt eae con n ais. Despus elimina de finn kos anceps gue sw sthayan uid, Ios aniewips reenios se detecan mee avin dem icuern scan aici Fv de J.D. Watson, M Gilman J. Witkowski y M. Zoler. Recondinan! DNA, 2 ed. Copyright 1992 de Scenic ‘American ook)recipientes a un tratamiento especial. Por ejemplo, para ar homgos, suele ser necesaria la eliminacidn enzindti- as paredes celutares. Supongamos que hemos aislado un ielacionady con algun proceso de interés pura nosotros, volo, un mutante atixStrofo de un hongo. Urilizariamos NA de la gencteca para transformar la estirpe auxstrofa y ‘enbrarfamies las células recipientes en medio minimo, ibjado de ser auxétrefas y creeeran en medio minimo. ‘explicacin pura que este método de transformacigin fun- onsiste en que el fragmento transformante complement nlmente la deticiencia provocada por el alelo mutate en recipiente. A simple vista podria parecer que este con- i decomplementaci6n difiere del desurrollado en el Capitu- gs decir, la producciGn de un fenotipo silvestre cuando se dos genomas mutantes. Sin embargo, el vector trans- He aporta algo de lo que carece el genom recipiente (el GENOTECA DE COSMIDOS Clonacién de un gen especifico 381 alelo silvestre que se persigue), y el genoma recipiente apona algo de lo que carece el vector (el resto del genoma), de modo que si que podemos hablar de un tipo de complementacion, Si el recipiente de Ia transformacién es un organismo en el {que los vectores plasmidicos se replican auténomamente | princi palmente bacterias y levaduras), entonces el inserto transfor- ‘mante puede recuperarse simplemente por aislamiento del phis- mido. Sin embargo, como veremes, en la mayoria de los ‘organisms el vector no se replica y es necesario que se inserte en el genoma pars conseguir una transformacidn estable. En es- tos casos, fragmento ransformante es Telativamente iraccesi- ble y su recuperacién debe walizarse a partir del clon de la geno- teca que dé un resultado positive, Para ello, se utiliza una genoteca en la que Tos clones estén numerados y dispuestos en lorma de una colecci6n de cultivos bacterianas en bos 0 cajas con multiples pocillos. Se afsla DNA en masa a partir de todas Jas estirpes agrupadas en un subconjunta determinade de Ia ge fhoteca y con este DNA se transforms, El proceso consiste en ir To OE belecleeelenidas vl | Prasunto clon ‘con trp? Figura 12-13. Localzacién de un sen lonado mediante uliacion de mestas ‘ke DNA progesivamente menos comple. Jase eemple, la basquede se He cabo para el pen ip de Neurospors (Tora de JR. S. Finca, Genet Anolis Copy © 1995 de Blaskvell)ae reduciende el tama de los subconjuntos de ta yenoteca que Genoteea de | Clonacién de un gen especifico Ee EE om ewrcarionco Digestion con EcoRt s0rcién entre. Brazos de, ST co Bsvenceisnseunteiiinicsaiuans Prvirc sooner yonsten EE con acyacome2 4 SE ee Paseo cromosnico, Un fga eum oblenido partir de una penotees consi eine gestion parcial con Feo ean genomes eantco puede alizarse pa sista ot fg recombinant que comtengs sono se deseite ot el texts, (Toma de JD, Watan, 3. Too y D. 7. Kuntz, Recombinant LNA: A Short Course. Copyright «1983 de W. Il aeeman and Company) DNA atcueie — > A-vocus, el DNA otiquots oe Innveduee on alalelo A Y genera linfenotino & FIDNA det gen A adyaconto ais etiquets puede utliarse somo sonda para buscar selon A' en una genatoca Figura 12-16, isicacin de uni inserciin de DNA como esque pra marcer y asl ur gea dl genom, Ls etiueta de DA pwede ser DNA. transformant o un temspason endigena element mai) *ae Clonacién mediante la utilizacién de etiquetas ‘apitulo 12 Tecnologia del DNA recombinante La clonacicin mediante Ia utilizacién de etiquetas es un método, que permite la identificacién directa de un gen mediante la in: duccidin de mutaciones en el mismo por insercisn de fragmentos de DNA especificos, ’slas secuencias incorporan una «etiqueta» en el gen, que puede utilizarse como sonda para aislarlo, La Fi gura 12-16 resume esta estrategia, Un tipo de etiqueta sera un DNA transformante concreto, Cuando se afiade DNA exdgeno por transtormicién © por otros métodos tales como la inyee- cidn, éste puede integrarse en el genoma y convertirse en parte del cromosoma. La integracién eetOpiva ocurre al azar portodo el yenoma: parece que no existe segmentos cromosémicos «que sean inmiunes at la integracién. Cuando la integracién ocu: re dentro » cerea de un gen, el fragmento integrante como un mutigeno, eliminundo la funcién del gen. Esta pro- piedad puede utilizarse para clonarlo, Suponga que ulilizamos, cttta tun alelo del organis mo donante en x ‘especifico para transformar células « Muchos de los transiormantes x" serdn mu- tantes para los genes en los que el DNA transformante se hit invertado eetépicamente lames para el gen de interés a, y ser surio entonces que identifiquemus las células a de entre todos Algunas de lis eélulas.x* seria mu: de fenotipo a”. Bs rece. Ios transformantes x transformantes para determinsr si el fenotipo a segrega con el 2°, Siey asi, ey muy probable que la mutaciGn se haya origina do por la integraci6n del fragmento portador del alelo x". Con el DNA de esta Ifnea mutante se construye una genoteca que se analiza con el alclo a para identificar el clon portador del gen a interrumpido. Para recuperat el segunda ronda de eserutini, en esta ocasion de w EI siguiente paso consiste en cruzar los silvestre, utilizando como sorda un segmento del gene inte- trumpido, Siguiendo una estrategia similar, los genes pueden marcarse leon transposones. Los transpasones sen fragmentos de DNA, moviles que se encuentran en muchos organismas. Cuando se Inovilizan, pueden inserturse en cualquier parte del genom. Si se inserlan dentro o cerca de un gen, pueden provecar una muti Gn nula. (En el Cap. 20, se deseriben lus trunsposones con ma yor detalle). Kn una linea que contenga un transposén aetivo, se seleccionan mutantes para el gen de interés, Muchos de estos Imuutantes surgirén por insercién uel trunsposdn. Tras construir luns genoteca a partir de una de estas Iinews mutantes, puede utilizarse un segmeenty del transpossn como sonda para recupe- fat el gen, siguiendo un procedimiento similar al ilustrad en l Figura 12-16 COROLARIO Aplicaciones del DNA clonado. EIDNA clonado tiene diversas aplicaciones que vienen dictadas por las necesidades del experimento, En este apariado, conside: raremos alguns aplicaciones hasicas que tienen utilidad en sh amplia gama de circunstancias experimentales, EI DNA clonaco como sonda Ya hemes abordada varios ejemplos de este tipo de aplicaitg como el uso de un gen clonado a partir de un organismo pu ‘Wentificar el clon correspondiente en otro organismo, 4 oink \dn, analizaremos ejemplos adicionales. Utilizacin como sonda para identificar un acido nucleico especifico en una mezcla En el curso de la manipulacion de genes y genomes, es probibl que fengamos que detectar y aislar moléculas especifcas db DNA que se encuentran formando parte de una mezda, Bt ejemplo, recuerde que cuando se utiliza el [ago / como veetor lonacidn es necexario sepacar fos dos brazos cromosdnits nada, Aunque existen varias métaii 1 que se utiliza mas frecuentemeneg ctroforesis (véase el esquema de un aparico electrfon cul nel rosa y el pollo secolas la regién central np des para fraccionar el DNA. a en la Fig. 4-5), Sise deposita una mezela de mol de DNAe el pocillo de un gel de Clones M M Vector Figura 12-17. ios pre som cinco vectores recombine os de DNA trsos 2a Foo. Las nel ‘te deposit en pocillos studs en la parte superior del ge oe se mcven hj Ta influ de un camp eléeeice 8 poses di bandas de DNA se han visualizado medisre tic com bromo de « iuniaaic del yl ea Iu ultraviolet, (Los cals marcos coo Me rmareadores de tao ara estima a longa de os fragmento. Tm eH. Ladi D Balimone, A, Bet, 5, Le Zipurshy. P. Masuda Dare Mole American Books, Ie. ogre, Copyright © 1995 de SseRNA ONA, 12-18, Electrons ew wel, astern « hibckn pt gee clonalos concrete, Se carga RNA o fagmentos de erin stn um gel de apacossy se sone decor Las etn migra 4 posiiones diferentes sein stag, Se elo eninpin,y secre con ut files de aizocello yaa i de 1 Ue opel ape scene) Ls ramen se desaturalizan pra ye valerie a a uvelulosd casa son aah st He po ese musye por capri cia et pap scans, A te flow despeys ye ine cm a sod de cade ‘adiatvamiente, qu es contplementaa a a secueneis dan sms yee ha beak pot ava, ero sexe jul sensible fas sais XD ie he sob tne edo sn co los fragments de testesidn congeners, ky “ims nieument ls poses que srtespoatan es Por compracifn cow lx ysis de marines de aan sta el tantato de ios tragsnetns gue come is a, Hs iluxmacén puede uolizse para sia las wees de resicsion_ ET pstmt» denominated oo ques tani es DNA, 5 tn de Nor ew (usTarudy ds 1. Watson: M. Gilman. Witkowski y M. Zale n DN, 22d. Caos tips 1 1H de Sete Aner Books | edroxtode un campo elgetnico, las mokéculas se move- del gel hacia ol snodo, «una xelocidad que depende 10 (Fig. 12-17). Sila mezcla est compuesta Ue nl tiferente amiatio, estas moiéculas se separarin en ef lugar a bandas definidas, Lax bandas se vissalizan DNA con bromurn de etitio, que huce que el DNA seencia cuano se irradia con lus vitraviolet, Si kas bien separadus, se puede cortar una banda indvi- ¥ luew purificar el DNA de la ayarosa, Por lo Gnto, foresis de DNA puede utlizarse con fines dinginsticos inar Ios fragmentos presemes en Ui MUMESEA) 0 {para uislur fragmentos especitivos). igen de DNA gendmico eon envimas de resticeidn als fragments que cuando se Someten a electrotoresis cen com un mnancha amplia y difusa de DNA. de os fragmentos de DNA, se deposit uns membra- bene soe el gel y se transfieren kas hands Ue DNA a rana por capiluridad. Una ver transferidas a la membea de DNA ocupan las miss posiciones relatives gel. La membrana se sumerge en una solucién con un cal hiego se expone a ura pelicula sensible a rayos i presencia de banclas en el gel que sean homlo- Si procede, las bandas pueden cortarse del gel y atdecuadamente, El tamano de lasbandas en cl gel se curriendo en el misipo gel una mezcla de frag tatnaio conocido, De este modo pademos interir el Aplicaciones del DNA clonado 85 La solucién pasa # avis del gely doittro nacia las serviletas de papel ag Servilletas de panel Esponja —— Gai Tamnwén Fityo ue con'salos nivoeluto cel rit DNA transterido alfiteo ibridaisn oon tn oan Filtra on na bolsasellaga 2 iL Sonia unids a Lovade de las secuncie jasonda gomplerantarias ‘ire A } ‘ane pelicula Exposicidn det tra sensisie'arayos X Auorradiograms386 Capitulo 12 Figura 12-19. Souter EI BSA ni losaizaciin asoudtica derail se ha smetid a electors» ol ge se i. La hates bilanies son piss lisse; algunas de fs poisons de sos pldsmides estin areas Flea arcade como L cmtene na venclers c Tragmestos ls BNA ie tans conaeidns. Los tas de los spekaions visible en sigur son fe asaya iba 1.8 hy 2 Kb, y Higa una Kline ‘Micinal por eada pela. asta 12 kb Ul plismide Ue la esti 1 se eli y seutlia6 como sonda pare of anlisis por a wen de Souihem El arradiogrims eves que varios des ous plismiss ‘mise scouoneias ome lis dl plist 1. De Heche. l estrpe 7 enn on mii de to psi tks ogo a de beste 11, (De Sinan Yang emo de andiss mente Ly Kei de coaal de 1 estrpes de Neurospora cco una Ja tis oon snk _* 1.8 Kb o7k =< 2.eb Hoa! se H Polipprido 7008 DNA DNA feendmizo genomico igende“lgena va Proveina cont “con teal ‘otal Paco t co. a ra SO kh as protenal ia poe Dako de “ yodes | 070 e Loe] Sonda: COVA ‘dol gon X. ‘dol gon X. Figura 12-20. Comyarocisn de is anise det gen X meine bis tecsias de Souter, Norther y Weston. By H rqresenan sits Hart as bis fay de resiceton I y 1 (Now hay poses de Is Danes ol “aint meant lo tcten de Southerr no son stmmparables com las posiciones| {4 bs hands en os oto is ps esis (eenologia del DNA recombinante Pedi Plasmids ‘Sondi: eDNA Sanda: antisverpo enntra la preteina X 12a4@Mse7sgii234@sersso Gel sometido a electroferasis 'ytenido con bromura ‘de etidio Autorradiograma utiliza td plismide de ls este “camo sonda famano de cualquier fragmento de inerés en nuestra ue experimental, La Figura 1218 ilustra ef proceso genes iransterencia por la éenica de Southem. La Figura 1 ‘ra una aplicucién en la que un fragmento clonado a partirds plésmido tipico de honges se utilizé para identificar phism homologos en una diversidad de estirpes, La téenica de Souther puede hacerse extensiva a la det de una molécula de RNA especifica que se haya separady tras moléculas de RNA por fraccionamiento en gel. En caso se denomina téenica Northern, para distinguirla de i nica desarrollada por Southem para el andlisis de DA. E:R} fraceionado se transfiere a una membrana y se somete al tratamiento de deteccién descrito para la técni Una aplicacién de la técnica Norther consiste en la detemis cidn de la expresiin de un gen en un tejido determinado ¢ nas condiciones anbientales determinadas. Primero, se & RNA de la muestra celular apropiada, y luego se somete 1h ‘toforesis, transferencia e hibridaciGn eon una sonda espec del gen de interés, Una seftal positiva indica la presencia iranserito en cuestion Hemios visto que un DNA clonado presta un amplio sem ‘como sonda, ya sea para detectar un clon detetminado, un mento de DNA coaereto 0 un RNA especifico. En todos 0s, se hace uso de la capacidad de los deidos nucleic encontrar sus secueneias complementarias ¥ unirse a ells solucidn, Se ha desarrollado una téenica paralela denominada té Western, que consiste en la transferencia electroforética Ue teinay fraccionadas en un gel y la visuslizaciéa de protefnss’ tretas mediante el uso de anticuerpos. Sin embargo, adview la sonda, en esta ocasitin, no es un fragmento de DNA sipo marcado. Estas tres téenicas son herramientas mole- es findamentales en la deteccitin y clasificacién de macro- las. En la Figura 12-20 se comparan las ies técnica, iinacién de la secuencia de DNA icin de un gen de interes no es mds que el principio de uncla ronda de andlisis cuyo objetivo es la curacteriza: aide la estructura y funcidn de dicho yen. Lu secuencia nu- flea de un gon supone Ia carwelerizacién maxima de su ira genética, Uno de los requisitos para la secuenciacién un DNA es que podumos obtener fragmentos definidos de ese iqiera de tox métodos de secuenciacién comienzs con Heblicién compuesta por un fragmento conereto de DNA tras ser convertidas en moléculas de DNA de cade: {.a movilidad de una cadenaes inversamente propor: logaritmo de su longitud, Esta téenica es tan sensible ‘aseparacion de fragmentos cuya longitud difiere en enuclestido, Para establecer la secuencia de nuclestidos, enrina la base que ocupa la tiltima posicién en el extrema de las moléeulas feavcionadas, de secuenciacin que se utiliza mas frecuentemen- ollado por Fred Sanger. Fste método se basa en Ia ik DNA en presencia de didesoxinucledsidos, que a di- sit los desoxinucledtidos normales carecen de un grupo milo (Fig. 12-21), Los didesoxinucledsides trifosfatados pueden incorporarse a la cadena creciente: pero, una porados, provocan la terminacién de la sintesis porque ‘grupo 3-hidroxilo necesario para que se establezca ris : Ay ‘ ( 4 H un enlace fasfodisier con el NTP entrante H. Estuctura de Jo 3 didesniniclesidn, gue se modo de scuenciaci6n desarlis por Sanger Aplicaciones del DNA clonado 387 el enlace con el siguiente ructedsido tritusfatedo, Se preparan ‘cuatro reacciones, cada una de ellas con DNA mole de la se- ‘cuencia de interés en forma de cadena sencilla, DNA polimerasa y un cebador mareado. A cala reaccidn se le afi una pequetia Cantidad de un dNTP diferente (WATP, déTTP, ddCTP o 990 O=P-P-P—0, Base 11 ye 3 0.0. — \ J Ruclectidos tdidesexi \/ rerminadores de la sintesis No puede establecer un ‘nlace fosfodister son 5! Cadenade DNA _eldNTP entrance TTAGACCCGATAAGCCEGER eG Polimerasa | de DNA, +4 dNTP Cebacor agar Cabana TTAGACECGATAAGCEEGCA atTesesceT 4 H wi OLED ee eer srr eregeey " nm AATETSOGCTATI CSG GEST " mn Polimerasa ide DNA ===" Cobador dNTP 7 AATP dTTP ddCTP daGTP Gel de serilamida f ik NY Secuencia de la cadena original de DNA Figura 12-22. _F: métao de secuenciasien com didesoxinuslesds, (a) Para nici la snes se uti un eehador mead (comespendient une secueneia del vector pics uno de lo palor de unin eon st insen) Le adicién de cada uno de les cuts didesoxinuleidos (en exe 280 se sa el proceso son ddATP) deine Is snes letoriamente. (6 Los fragments resutanss se sepasn por eecituoresey se ometen 4 autrradiogntia. (Tom de J, D. Watson, M. Cima, J, WiGowshiy M. Zoller Recombinant DNA, 2° el. Copyright 1 1992 de Scientific American Books.)ae Figura 12-23. Gel de secueneicon por ef metodo de Sanges te Adrecha se muir pane se a seouencia de DNA inferida. (Fetograta de Lowa Fscte Carson Capitulo 12 Tecnologia del DNA recombinante UGTP), sdemiis de los cuatro desoxinucledsidos tt normales (NTP). La incorporacién de un desoxinuckest rre al azar, en diferentes posiciones de las diferentes sintetizadas en un tubo de reaccién. De este mod en de los tubos, se produciran toda una serie de procictos e diferente tamaho, coincidiendo la posicién de la tem con a incorporacion del didesoxinuclestido comespond su vee, las Hongitudes de las cadenas ponen de manifest calizaci6n de las bases complementarias a los ddNTP eal tn todos lox productos truncados poses, comespe todas las posiciones en las que aparece exa base cone fagmentes pueden visualizarse mediante electroforess cuatro musstras en cuatro camiles diferentes lean gel de mida, donde los fragmentos aparecen como bandas, Ex ‘do Tos cuatro caries del gel e idemtificando qué base o& extremo de cada una de las bandas consecutivas puede arse Ia secuencia. Las Figuras 12-22 y 12-23 iustran lp [El marcaje radiactivo puede susttuirse por el marae echaulores con compuestos flyorescentes. En cada unt cuatro reaveiones se emplea un coloraate Mluorescent ifs de manera que lis cuatro reacciones pueden depositane mismo carl y someterse conjuntamente « electoforesis cuenciacion automitica se basa en Ia detecciva ineyula esta fluorescencia, permitiendo la lectura de hasta 1000 ta tnica reaceién, La Figura 12-24 iustra la eet de an matograma obtenido por secuenciacicn automética, COROLARIO -. La secuencia mucleotidica de un fragmento de DNA utlizarse para determinar qué gen 0 genes clonados com Para ello, se introdace la secucneia de nucledtices en uno dot, que la analiza en las seis pautas de lectora (tes et direccién en busca de un tama de DNA suficientemente que comience con un cod6a iniciador ATG y finalce an codén teminador. Los trams de DNA. que cumplen ests diciones se denominan tramos de Ketura abierta (Ot inglés Open Reading Frames) y representan Secuencias ca tus a ser genes, La Figura 12-25 muestra este tipo de andl el que se identifican dos ORF y. por consiguiente, dos p genes. Merece la pena rescltar que lu deteccién de ORT 4 andlisis mendeliano de segregaciones fenotipicas son des dos igualmente validos para la identificacion de genes, +p de las diferencias inherentes a cada estrategia. Deteccion y amplificacion de secuencias por el método de amplificacion en cadena de la polimerasa Si una tegién de DNA ya se ha clonado y secuenciado, in ccuencia puede wlilizarse para obtener tramos de dichaAplicaciones del DNA clonado > FART GERAT ROR REE CACY AT AGGGUG AAT TOGAGET CHT AUG UGGGATOCTOT WO NET SURES SOAGOTAL OER ACCT ASTAT SET ‘ ea e ie e SF ‘be 8 Figura 12-24. iia compuesto leetura 1000 Figura 12-25. Haydon ORF ey te individuos coneretos de eso de otra especie, sin nece ge clonars. La técnica de basa en un peocedimicnta de- reaccion en cadena de la polimerasa (PCR. del in- Hs Foimerase Chain Reaction), La Figura 12-26 ilustea as de esta (Gerica. Para catalizar la extensidn de Tos cebudo- lize una polimerasa de DNA termoestable, kt Pag poli= obtenida a partir de ta bacteria Thermas aguaticus je muestra en la Figura 12-26, la polimerasa extiende en soavergente a partir de dos eebudlores que hibridan con epuestas. Una vez completada [a replicacién del sep- liitado por los dos cebadores (primer ciclo), fas dos ls nuevas de cadens doble se desnaturslizan por calor y ‘un segundo ciclo de replicaciGn, tras bajar latempe- presencia de todos los componentes necesarios para la nacGn, La repeticidn dle los ciclos de Sintesis y- desma sin leva a un aumento exponencial del ndmero de seg- iephcados, Resulta Ficil conseguir niveles de amplifies Copia nro del enomnograma y fe secucncis tend eon un send uutomaieo qu furescentes cus mize rents uma tse sin asst 4000 5000 6900 7000 e000 Panes ce ruclectios Cualguie wegen de DNA tiene sn putas de ctu pies, re en cade dies, leon one analizadn uni serene de 4h un plane de hongosen busca de ORE genes patel). 2-que port muy samo pan enepnder Benes ‘idm de hasta un millén, La utilzacin de la técnica de PCR per inite fe amplifieacién de un gen de copia tiniew a partir de una ‘muestra genémica, siempre que podamus sintetizar eebadares ‘complementaris a secueneias conocidas del gen, Debid a a a piificacidn exporencial, la PCR es una téenies muy sensible, que permite detectar secuencias que se encuentran mninimamente re- presentadas en uns muest, Por ejemplo, se pueden ampliticar seamentos de DNA humane a partir de las pocas cetulasFolicula- Fes que rodeun 1 un solo pelo. La PCK resoita inuy stil en el diyendstico del DNA en ous palabra, en la comprobstsicn de la presencia de un gen o de una mutacin en un gen espectico 0 a nivel preparativo, en fa amplficacion de un segevento deverminad, Advierta que la técnica de PCR no requiere lx digestion del sustrato can enzimas de restriccién, ya que los eebadores se en- eargan de encontrar la secuencia aleouuda en el INA native. Adem. powtemos prescindir de experimentos de clonaciin te- diosos, porque se sinteiza DNA siiciente para producir unaCapitulo 12 ‘Ampliicaci6n de la secuencia diana La muestra diana original fs DNA de dable cadena ia oo | Separacion de las sadenas y | unidn te fos cebacores oes oS Cobador 1 7S | Extonsin de los cebadores, « * RAR WE nese Campana saan —a_arwrr.,, iby Cobador 2 | Separacion de las cadonas y Union delos tebadores BDI es ‘8 cuit 5 OC ARRn | Extension de los cebadores aaenes de ‘Cadenas de longitud variable tamario unidad | Separacion de las cadena y | tnidn de ios cabadares i % SNA Complementari. ae aleebador2 an aeeeteneniee SONS ai caemar} o ee os le be he : a ‘Yesisueesivamente Tecnologia del DNA recombinante Figura 12-26. 1a resign en cadena de a potimerss. a) DNA ob cadeua gue Cntiene Ia seeuenia diana secveneis on eomplementarss bs entero. de la secuenia se desea amplifcar. Las caeas se searan po clenumienin,permitend ‘ne los cebidores se an x sus seevencis emmplementii. De ese ‘do os eeadores dlimitan a sesvencia dant. (e La poimers Tg las primers ene complements de ia ean. Estas dos primes ‘denis heten un tanato variable bide a que eanecen de una sel de cerminacéin comin, se extenden missle la secuersia dian etimitada por os cebores. Las moguls de dbl cade se des ‘de neve, exponiendo cay sitios Jenin dens eehadoes. (Par in solo se mura ls dos cadenas de nuova sitesi), Los dos esas ‘uch 3 unise a ls steueneas cempleinetars eos exon de Fexidn dans (e} La polierasa Tay sinlelia dos cadenas cmplemerat ‘Nurgue as ears mulls este pss ton de git arable, as le 5 sina a partido elas yutiensn exacamente la ongiud ela secuercia dana, Tso se dee aque cada cadena mvs comin Se-ume el char, en wn errand lr secuenit dan,» emtin base leancat eal del mote, eet a extreme de fa secoenvia dina ‘Ahura ea cadena vomienza co la seeentie de ut de ks ead termina can fs secwensia de n,n la sprain de os eae, hp sshadoreswieiven a unisey, ahora la actin de exten produce m te ble cena que voresponden x secaencia din, tLaseadenss ve lomgin variable del paso e tang extn prlciendo moleuls del fama adcondo). (5) prowens pce epee seamen, «adn er don molecule duble eadona idéntcns fs scumncia dane ‘mado de. DB. Watsen, M. Cin, J. Witkowski y M, Zoller, Brea VA, 2 ed. Copyright 1 1992 e Scientific American Bock, banda nitida en un gel. Ain mas, se requieren cantidades ii del DNA sustrato, Localizacién de genes en mapas de restriccion Hemos visto ya ta importancia de lus enzimas de restriceilu | digestisn del DNA para su clonaciéa, Otra caracteristica de las enzimas de restricci6n es que las posiciones de sus sil diana a Jo largo de una moléeala ve DNA (es decir, ato Ia lun cromosoma) pueden utilizarse como matcadores de 0! ‘Aun cuando las dianas ocusren por azar, suelen ocupar pest ‘es equivalentes en cromosomas homdloges. Por Io tant, Posiciones de los sitios diana tienen ung utilidad comparable de los mojones a fo largo de una carretera, que aunque put tismos carecen de importancia, sirven para localizar otros fos a Lo largo del camino que sé son importantes, Por ello, ‘mapa de las posicioues de las dianas de resti herramienta valiosa en el andl las ocasiones, se constraye un mapa de terminada regisn cromosémica de interés 0 paca vin erom telativamente pequeiio como el de un plismiide 9 un orgie ‘Un métodlo para laelaboraciin de mapas de restriceién cons en comparer las digestiones con una sola enzima con las diges nes dobles, Las dos enzimas se afuaclen por separade a dos res res independientes, y juntas a una tercera reaccién. Después digestion, se separan los tragmentos por clectraforesis ¥ se detioiere con [ * Enamat Enima 1 Enzima? vyenzima 2 oD REIRE? RET Flaunaci de mapas de entriccén msdn comparacion obser ts a sepaacielotorrtti de digesiones fn sxe sjerpin srpliical, la eigestion con Ta enzimia xine ds ston de eet pu ess enzma, pero no el fagninto eS kb esto la parte coral «tea igs, su mide 17M Ls geste em na oa fs cmzimas 1 Is agen de por cor el fragmento de 3 Kb li no pan de oe em one Fagen ja 3 kb emuvsrs keaton un evento de la secuenia ged co sSo a ezia 2 wena un frgiveto de 1 92D, ie de tes agents pci por Leavin 1 de fats cae wets Que ot paso de sents se encra ns sere del semen de 6M qu del 8 je dl ano 7 10 kh) de Les fragmento ebinidos con eh Aplicaciones del DNA clonado ~ Sitio EcoRt “cen Econ Sitios Haelll Digestion parcial Digestién parcial \ Etectroforesis en get swonsaogat \" =“ Sitios Mapa Sitios. ‘Alu Hell Figura 12-28. tdenutcacin det orden de os sco de restesin en tina moka de DN itu Ene ejemplo, a destin con HzoRt de i toléula circular (eo un ico sitio de ome para ests encima proves sane Esta mefcula nel se waa en ss extremes con "P ye pene pile on Ala (nzima de reicen de Artabarer tikes, {ve igvdmente pry ser Hor una ens de rescind Harv ‘egyptian para produ frames de ngitades varies, Cad taginento stars wsitaa shawn cha solo extern. Sehge el fagmenin mas srande {tes compar ls omits en eng) 3 ide et me Una ucts se die parce co Ale le oa parame eon Hoel 1 nuevo conjunto defragment e para pot electors em gel. La losin de for fapmontonmizcadoe poste Jeterninirs pov atneadingrala ‘do ges. Compan elon de os agpemos ot. sds gles poe Heese Ta serves de os sitios de rests,Capitulo 12 Tecnologia del DNA. recombinante Evimas So an ‘ xo ' : 1 7 | Hindi! ; 1 ayAl H ree Xba i og [es = Hiri i Pt } Figura 12-29, Mju de resrosiin de un pksid line de un hong, nits de erceio par seis ens iene, mina su tamefto, La digestién doble permite inferir si un fragmen- (o de restriccisn producido por una enzima contiene sitios de res Uricei6n para la otra evzimna: si es asf, el fragmento desaparece y. | aparecen dus © mds frazmentos de menar tamano, La ‘comparacién de lox tamafis de los lragmentos producidos en las diferentes digestiones permite Iuealizar de forma aproximadds los sitios de restriceién, La Figura 12-27 ilusra el procedimient En la Figura 12-28 se muestra otro método para construir ma pas de restrieei6n. Este método parte de un fragmento de DNA rmarcado en Tos dos exiremos 5 con ©P, que se corta para gene- rar fragmentos mareados en un solo extremo. El fragmento mis largo se afsla y se digiere con una segunda enzima de restricei6n, sin dejar que la reaccién se complete; de este modo, se obtione uns poblacitn de fragmentos marcados y de tamaio variable, ida uno de ellos indicativo de la presencia en el extremo no mateado de uno de los varios sitios de restriceién para la segun: dda enzima, La separacién eleetroforética de estos fragmentos permite deducie la distancia entre el extremo marcado ¥ la posi- cidn del sitio de restriccién. En Ia Figura 12-29 se muestea unr ejemplo de mapa de restricei6a, correspondiente al mapa del DNA de un plismido lineal de hongos. Después de que se bays elaborado un mapa de restriccién, los, zens pucden colocarse en el mapa mediante analisis por la teen cade Souther, Por ejemplo. si un gen clonado hibrida con un frag ‘mento A producido porla enzimade restricci6n 1 y can el fragmen- ( B producids por la enzima de osteiceisn 2, entonces ol gen debe estar situado en la regién donde los dos sragmentos solapan. En este capitulo, hemos presentado las tSenicas fundamentales ‘que han revnlucionado li Genética, En el siguiente apartade se des- serina en la posicién 230 de la protefn (mutacin P2305), correspondiente a una mutacién en el exén 10. El otro progenitor results ser hetereigiitin para cl cambio valina ~ glicina en la posicién 300 de la proteina (mut cin V300G), comespondiente a un mutacién en el exén 12. Los tres hijos con alcaptonuria presentaron 1a constitucién genética P230S/V300G, como cabris esperar si fueran éstas las posicio- nies mutadas responsables de la inactvidad de la enzima 8. Utilizando et cDNA, se encuentra et gen en una ‘genoteca genomics construide en i ———== et ‘Gen HGO (14 @xdnes, 13 intrones! 9, elon HGO hibrida con 342 Casos de hibridacion aon | } 10, Mediante PCR de los exones 10 y 12 e encuentran los sitios mutantes 10 —eCobador 12 = === —~ FT —=_ == paws == vso06 11. Herencia de las mutaciones P2308} v3006 2308! v006 230s! v3006 +1'V3006 L ndisis de le leapronur (enfermedad de a rina neg,os RESUMEN La Geni ica se centraen el andlisis de ta navuraleza de los penes, ¥y uno de los principales objelivos es la curacterizacion de su festructura y funcion. La teenologfa del DNA recombinante ha permitido aislar genes individuales en un tubo de ensayo para s ceacterizacién molecular, Esta tecnologia se bast en el uso de lus enzimay de restrizei6n, que cortan el DNA en fragmentos especificos. Los sitios diana de las enzinias de restriccién pue- den situarse en un mapa y servir de marcadores del DNA, A. menudo, os fragmentos de resiriceidn presentan extremos eohe sivos que facilitan su insereidn en un vector eapar de replicarse cen una eétula bacteriana, Estas moléculas hibridas se denominan DNA recombinante, Las bacterias amplifican una motéeula re combinante individual y asfdan lugar a un clon, Batre los vecto- res mas comuunes se encuentran los plismidos, los Lagos y los césmidos, Se puede clonar todo el genoma en una poblaciGn de clones denoatinada genoteca, Un clon determinado de una geno teca puede identificarse utilizando una sonda que se una especi ficamente al DNA 0 a la proteina del clon de interés, Tamnbié MAPA DE CONCEPTOS ‘Trace un mapa de conceptos, estableciendo tanlas relaciones ‘como le sea posible entre Ios tésminos siguientes. Observe que la liv de términos no sigue un orden concreto, PROBLEMA DE Encl Capitulo 10, estudiamos ta estractica de las moléculas de FRNA, Suponga que esti interesady en clonar un gen de hongos que determine un (RNA conereto, Dispone de una muestra de (RNA puri do un plismido de £. coli que contiens ua gen que confiere resistencia a tetraciclina (te#"), con un inieo punto de conte para EcoRI, y un gen que confiere resistencia a lampicilina (amp®). ¢Cémo elonaria el gen de interés? ide +Solucion + Paadria utilizar et propio (RNA, 0 una copia del mismo en cDNA, ‘como sonda para buscar cl gen vorrespondiente, Un métodocon- sistiria en digerir el DNA genémico con KcoRIy luego mezelar- locon el plesmido, también cortado con £coRI. La uparicien de PROBLEMAS RESUELTOS 1, Laenzima de restriceidn HindI1T corta ef DNA en la secuen cia AAGCTT, y Hpall corta en Ia secuencia CCGG. Por \érmino medio, jcon qué frecuencia vortard cada una de es- las enzimas en un DNA Ge doble cadena? (En otras pala bras, cual seria la separacién media entre 10s sitios de res: triveion?) Capitulo 12 Tecnologia del DNA recombinante TEGRACION DE CAP{TULOS pueden aislarse clones espeeificos por su capacidad det ‘mar mutates nulos. La adicién de etiquetas también resis fi para clonar an gen: se provocan mutaciones por insenséad DNA transformant o de un transposén y Iego se clonae! DN aadyacente a la etigueta. La técnica de paseo cromosémi mite aislar un gen mediante el aislamiento secuencial deck solapads, partiendo de un marcador ligado al gen de DNA clonado puede secuenciarse por varios métodos, {que se incluye la terminacisn del erecimiento de a cadena pal insereién de un didesoxinuciedtido. La reaccién en caden polimerasa utiliza cebadores para amplificar una secuencs método permite aistar eépidamente un DNA cuya este hha secuenciado parcialmente y detectar pequeias cant un tipo de DNA espeerfico. Una mezcla de moléculas de DN RNA de diferentes tamafios puede separarse por electrof en gel. La utilizacién de sondas permite deteciar molé pecificus de DNA 0 RNA en el gel, mediante las téenis Southern y Norther, respectivamente cenzima de restriceién / DNA recombinante / clon de DN sonua /transiormaci6n / vector / complementavidn secucneiacién / genoteca colons Anup! tray transformar una estinpe recipient am e indicativa de que la transformaciéin ha si eficaz, De colonias Amp", habria que seleccionar aquellas que sean Estas colonias Tet? contended vectores con insert, pl construceién de la genoteca necesitarfamos un nimers eb de ellos. La genoteca habria que analizarla utiizando el como sorda. Las eolonias que hbriden eon Ta sonda se ex rian para averiguar cudnta secuencia correspondiente ali contienen. Alternativamente, podria someter« clectroferesis DNAd organism X digerido con EcoRI e identificar 1a banda cr utilizando el (RNA como sonda. La regisn del gel que bi enriquecida en el DNA de interés, podria cortrse y ult para clonar en el plismido digerido won EcoRI. + Solucion + Debemos tener en cuenta una sola cadena, ya que ambas 8 clas estarin presertes en la misma posicidn en la cadena plementaria, dado el cardcter simétrien de las secuencias, ccencia de seis pares de bases reconocida por Hindlllms frecvencian de (1/4)* = 1/4096, ya que existen cuatro sldades en cada una de Tas seis posiciones. Por consiguier ledistncia media entre fos sitios Hindlll seria apeoximada- 4k. Para pall, a frecuencia de aparicida de su secueneia nu decuato pares de bases serfa (1/4)*, 0 1/256, Li eparackin tare los sitios Hpall serfa aproximadamente 0.25 kb. Gon os datos del Cuadr 12-1, derermine si seria mis iil Ia ‘nvima EcoRI o la enzinia Smal para clonar. Explique su respuesta OBLEMAS a Up pismido bucteriano circular (pBPL) contione un sitio de “raticcién HirdIll en medio del gen de resistencia a tetraci lima (1et"). Sedigiere DNA genomico de la mosea del vina- ‘secon Hindlll y se construye una genoteca en pRPI. Poe hibidacién con una sonda se ucteeta que el clon 15 contien ungen de Drosophila en el que estamos interesads. Se es “tuia el clon 15 por andlisis de restriceién con Hiralll _FeoRV- El diagrama muestra las bandas tefidas con bromu: ‘ik etidio tras Ia electroforesis (el control correspunde al _plémido pBPI sin inser). Al lado de cada banda se indica uw hmaio en kilobases. (Nota: las molécults circulares: no _-danbandsintensas en este tipo de gel, asf que puede asuumir Hint Beok 1 Comal as Aes Dibuje los mapas de restriecitin del pkismido pBPI con tinsero, indicando lus sitios de las Secuencias diana y la én aproximada lel yen ter" Siel gen ‘e1®, clonado en un yector completamente ho- ¢ mafea radiactivamente y se utiliza coma sonda ma tinsferencia de este gel por lu técnica de Southern, andas esperaria que apareciesen raliactivas en el dograma? _ Si ve clon en un vector no homéloge el mismo gen rds a partir de na miusea estrechamente relucionada ieDrosoplulo, v se utiliza este clon como sonda para ana iar el mismo gel, .qué bandas esperaria ver en ef auto- i tipo de pismnidy de Tos descritos ent este cuprtule Se apBPI? Problemas al ¢Solucion¢ Ambas enzimas de restriecién reconocen una secuencia de seis pares de bases, asi que esperfamos que la frecuencia de aparicién dle sus stios diana fuera apioximiadamente la misma, La principal diferencia entre les dos enzimas es que KeoRI deja extremos co~ hesivos, mientras que Smal genera exiremns romos. La manipula cidn de los extremos cohesivos durante kt clanacién es mucho mas facil, dada su capacidad inherente para establever erupureja~ mientos entre bases. (Solueidn propuesta por Diane K, Lavett). 2. {Qué importancia tiene el dnice sitio de vestriveion Hin ane 3. @Por qué esimportante que el silo tinico se encuentte loca lizado en un gen de resistencia? {Seria ttl si no lo estuviera!? 4, ,Qué clecto tiene fa insercién de DNA donante en el gen de resistencia? ;Tiene importancia este efecto en el contexta del problema? 5. {Qué es una genoteca?” {Qué tipo de genoteca se utili76 cn este experimento? a. Deduzea lasecuencia de la cadena de DNA sintetizada a partir del cebador, indique los extremos 5° y 3 b. Deduzca le secuencia nucleoi(dica de la cadens de DNA utilizada vomo molde, indique los extremos 5° y ¥ €. Bscriba la secuencia nucleotidiea de la cadena doble de DNA (marque los extremos 5 y 3), dd. {Cuntas de las seis posibles pautas de (ectura darian lugar a tramos

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