BIOKIMIA

KARBOHIDRAT

Disusun oleh :
Misbahul Munir 201439013
Roy K. Raturoma 201439008
Siti Nur Halimah 201460
Aprilia Heni 201460

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS PAPUA

MANOKWARI
2016

BAB I
PENDAHULUAN
1.1

Latar Belakang

Istilah kromatografi diturunkan dari fakta bahwa teknik ini mula-mula

digunakan untuk memisahkan pigmen-pigmen (Greek, chroma= warna,
graphein = menggambar), tetapi dengan berbagai modifikasi maka teknik ini
digunakan dalam pemisahan zat-zat kimia, dan tidak lagi selalu dihubungkan
dengan senyawa-senyawa berwarna.
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas
distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase,
yaitu fase diam (padat atau cair) dan fasa gerak (cair atau gas).
Ketepatan dalam memilih

prosedur

semuanya

tergantung

pada

perbendaan distribusi berbagai komponen-komponen campuran di antara

dua fasa, yakni fasa bergerak dan fasa diam. Fasa bergerak dapat berupa
cairan atau gas, dan fasa diam dapat berupa padatan atau cairan. Melalui
kombinasi komponen-komponen tersebut maka diperoleh beberapa macam
teknik kromatografi seperti pada Tabel 7.1.

Fasa diam
Padat

Fasa
bergerak
Cairan

Teknik (pemisahan zat-zat)

Kromatografi serapan (meliputi molekulmolekul alifatik dan aromatik
Kromatografi

fasa

terbalik

(molekul

organik polar)

Kromatografi penyerapan gel

Kromatografi

penukaran

ion

(molekul-

molekul bermuatan, asam-asam amino)

Kromatografi
Cair

Cair

Cair

Gas

partisi

(molekul-molekul

organik yang labil terhadap panas dan

asam)
Kromatografi

fasa

uap

atau

gas-cair

(molekul-molekul organik volatil)

Dalam makalah ini akan dibicarakan komponen-komponen prinsip

pemisahan yang sering digunakan dalam percobaan kimia, dan dapat
digolongkan

ke

dalam

kromatografi

adsorbsi,

kromatografi

partisi,

kromatografi ekslusi dan kromatografi pertukaran ion.

1.2

Rumusan Masalah

Masalah yang dibahas pada makalah ini adalah mengenai komponenkomponen

prinsip

pemisahan.

Mengapa

perlu

dipelajari

komponen-

komponen prinsip pemisahan, apa kelebihan dan apa kegunaan dari

komponen-komponen prinsip pemisahan.
1.3

Tujuan

1. Menjelaskan komponen-komponen prinsip pemisahan.

2. Mengetahui kelebihan dari komponen-komponen prinsip pemisahan.
3. Mengetahui kegunaan dari komponen-komponen prinsip pemisahan.

BAB II
PEMBAHASAN
2.1

Pengertian

Kromatografi merupakan suatu proses pemisahan yang mana analitanalit dalam sampel terdistribusi antara 2 fase, yaitu fase diam dan fase
gerak. Fase diam dapat berupa bahan padat atau porus dalam bentuk
molekul kecil, atau dalam bentuk cairan yang dilapiskan pada pendukung
padat atau dilapiskan pada dinding kolom. Fase gerak dapat berupa gas atau
cairan. Jika gas digunakan sebagai fase gerak, maka prosesnya dikenal
sebagai kromatografi gas. Dalam

kromatografi cair dan jiga kromatografi

lapis tipis, fase gerak yang digunakan selalu cair.

Kromatografi dapat dibedakan atas berbagai macam tergantung pada
pengelompokannya.

Berdasarkan

pada

mekanisme

pemisahannya,

kromatografi dibedakan menjadi :

a) Kromatografi adsorbsi
b) Kromatografi partisi
c) Kromatografi penukaran ion
d) Kromatografi eksklusi
2.2

Prinsip Kromatograf

a. Kromatograf penukaran ion

Kromatografi Pertukaran ion adalah proses

pemurnian senyawa

spesifik di dalam larutan campuran atau proses substitusi satu jenis senyawa
ionik dengan yang lain terjadi pada permukaan fase stasioner. Fase stasioner

tersebut merupakan suatu matriks yang kuat (rigid), yang permukaannya

mempunyai

muatan,

dapat

berupa

muatan

positif

maupun

negatif.

Mekanisme pemisahan berdasarkan pada daya tarik elektrostatik.

Bila matriks padat tersebut mempunyai gugus fungsional yang
bermuatan negatif seperti gugus sulfonat (-SO 3-), maka akan dapat berfungsi
sebagai penukar kation. Sebaliknya, bila bermuatan positif, misalnya
mempunyai gugus amin kuaterner (-N(CH) 3+), maka akan dapat berfungsi
sebagai

penukar

anion.

Kromatografi

ini

sangat

bermanfaat

untuk

memisahkan molekul-molekul bermuatan terutama ion ion baik anion

maupun kation. Metode ini pertama kali dikembangkan oleh seorang
ilmuwan bernama Thompson pada tahun 1850. Secara umum, teradapat dua
jenis kromatografi pertukaran ion, yaitu:

Kromatografi pertukaran kation, bila molekul spesifik yang diinginkan

bermuatan positif dan kolom kromatografi yang digunakan bermuatan
negatif. Kolom yang digunakan biasanya berupa matriks dekstran yang
mengandung

gugus

karboksil

(-CH2-CH2-CH2SO3-

dan

-O-CH2COO-).

Larutan penyangga (buffer) yang digunakan dalam sistem ini adalah asam
sitrat, asam laktat, asam asetat, asam malonat, buffer MES dan fosfat.

Kromatografi pertukaran anion, bila molekul spesifik yang diinginkan

bermuatan negatif dan kolom kromatografi yang digunakan bermuatan
positif. Kolom yang digunakan biasanya berupa matriks dekstran yang
mengandung gugus -N+(CH3)3, -N+(C2H5)2H, dan N+(CH3)3. Larutan
penyangga (buffer) yang digunakan dalam sistem ini adalah N-metil
piperazin, bis-Tris, Tris, dan etanolamin.

Metode ini banyak digunakan dalam memisahkan molekul protein (terutama

enzim). Molekul lain yang umumnya dapat dimurnikan dengan menggunakan
kromatografi pertukaran ion ini antara lain senyawa alkohol, alkaloid, asam
amino, dan nikotin.

Kromatografi

penukar

ion

dilakukan

dengan

fasa

diam

yang

mempunyai gugus fungsi bermuatan. Kebanyakan mekanisme penukaran ion

sederhana:
a) X- + R+Y-Y- + R+X- (penukar anion)
Dimana X adalah ion cuplikan
Y adalah ion fasa gerak
R adalah bagian Inc. Pada resina

Pada kromatografi penukar anion ion cuplikan X- bersaing dengan ion

fasa gerak Y- terhadap bagian ionik pada penukar ion R. Pemisahan ion
sederhana berdasarkan pada perbedaan kekuatan interaksi ion terlarut
dengan resina. Jika senyawa terlarut berinteraksi lemah dengan adanya ion
fasa gerak, ion terlarut keluar awal pada kromatogram, sedangkan senyawa
terlarut yang berinteraksi kuat dengan resina, berarti lebih kuat terikat dan
keluar belakangan.
Berdasarkan pada keberadaan gugusan labilnya; resin penukar ion
dapat secara luas diklasifikasikan dalam empat golongan, yakni :
a. Resin penukar kation bersifat asam kuat (mengandung gugusan HSO3).

b. Resin penukar kation bersifat asam lemah (mengandung gugusan

COOH).
c. Resin penukar anion bersifat basa kuat (mengandung gugusan amina
tersier atau kuartener).
d. Resin penukar anion bersifat basa lemah (mengandung OH sebagai
gugusan labil).
1. Komponen Dasar Kromatografi Pertukaran Ion
a. Eluent, yang berfungsi sebagai fase gerak yang akan membawa sampel tersebut masuk ke
dalam kolom pemisah.
b. Pompa, yang berfungsi untuk mendorong eluent dan sampel tersebut masuk ke dalam
kolom. Kecepatan alir ini dapat dikontrol dan perbedaan kecepatan bisa mengakibatkan
perbedaan hasil
c. Injektor, tempat memasukkan sampel dan kemudian sampel dapat didistribusikan masuk
ke dalam kolom.
d. Kolom pemisah ion, berfungsi untuk memisahkan ion-ion yang ada dalam sampel.
Keterpaduan antara kolom dan eluent bisa memberikan hasil/puncak yang maksimal,
begitu pun sebaliknya, jika tidak ada kesesuaian, maka tidak akan memunculkan puncak.
e. Detektor, yang berfungsi membaca ion yang lewat ke dalam detektor.
f. Rekorder data, berfungsi untuk merekam dan mengolah data yang masuk.
2. Perhatian dalam preparasi kolom
a. Pemilihan dan preparasi resin
Sifat-sifat yang perlu diperhatikan dalam membeli resin dalam perdagangan ialah
ukuran partikel (mesh), tingkat ikatan silang, dan kualitasnya (analitycal grade; AG).
b. Pembengkakan (swelling)
Bila penukar ion, misalnya resin yang tersulfonasi diberi air, gugus SO 3- dan H+
seolah-olah terlarut dalam konsentrasi yang tinggi dalam matriks. Karenanya air bertendensi
untuk mendifusi kedalam matriks.

c. Kapasitas kolom
Kapasitas penukar ion akan mempengaruhi banyaknya sampel maksimum yang dapat
dianalisis dan dipakai untuk mengetahui stabilitas resin.
d. Cara deteksi
Untuk hal-hal khusus digunakan : adsorbsi sinar, indeks refraksi, pH, radioaktivitas
dan pengukuran polarografik.
3.

Kelebihan Kromatografi Pertukaran Ion

Beberapa kelebihan yang dimiliki kromatografi ion sehingga menjadikan the best
choice dalam dunia pemisahan ion-ion di antaranya :
a.

Kecepatan (speed)
Kecepatan dalam analisis suatu sampel menjadi aspek yang sangat penting dalam hal

analisis ion. Salah satu yang menyebabkannya adalah masalah klasik yaitu untuk mengurangi
biaya dan bisa menghasilkan data-data analisis yang akurat dan cepat. Namun, sebenarnya yang
lebih penting adalah memberikan andil dengan maksimal dalam perhatian kepada kondisi
lingkungan (environmental efforts) yang dari hari ke hari jumlah sampel yang mau dianalisis
(untuk diketahui kandungan apa saja di dalamnya) semakin bertambah. Itulah sebabnya, teknik
ini terus dikembangkan orang untuk mendapatkan teknik pemisahan/pendeteksian yang lebih
praktis dengan biaya yang relatif murah. Sebagai tambahan pula bahwa limbah (waste) yang
dihasilkan dari penggunaan eluen dapat dikurangi.
b.

Sensitivitas (sensitivity)
Dengan

berkembangnnya

teknologi

mikroprosessor,

mulailah

orang

mengkombinasikannya dengan efisiensi kolom pemisah, mulai skala konvensional (ukuran

diameter dalam milimeter) sampai skala mikro yang biasa juga disebut microcolumn. Sehingga
walaupun hanya dengan jumlah sampel yang sangat sedikit, misal 10l yang diinjetkan ke dalam
sistem kromatografi, ion-ion yang ada dalam sampel tersebut dapat terdeteksi dengan baik.
c.

Selektivitas (selectivity)
Dengan sistem ini, bisa dilakukan pemisahan berdasarkan keinginan, misalnya

kation/anion organik saja atau kation/anion anorganik yang ingin dipisahkan. Itu dapat dilakukan

dengan memilih kolom pemisah yang tepat. Ataupun hanya ion tertentu yang ingin diukur
walaupun banyak ion lain yang ada dalam sampel.
d.

Pendeteksian yang serempak (simultaneous detection)

Secara umum, anion dan kation dipisahkan/dideteksi terpisah dengan menggunakan

sistem analisis yang terpisah (different systems). Padahal sangat penting dilakukan pendeteksian
secara serempak (simultaneous) antara anion dan kation dalam dalam sekali injek untuk sebuah
sampel. Tentunya, pendekatan yang terakhir ini punya sejumlah kelebihan dibanding pemisahan
terpisah. Sebagaimana telah dijelaskan di atas, beberapa kelebihan di antaranya dapat menekan
biaya operasional, memperkecil jumlah limbah saat analisis berlangsung, memperpendek waktu
analisis (short time analysis) serta dapat memaksimalkan hasil yang diinginkan.
e.

Kestabilan pada kolom pemisah (stability of the separator column)

Walaupun sebenarnya, ketahanan kolom ini berdasarkan pada paking (packing) material

yang diisikan ke dalam kolom pemisah. Namun, kebanyakan kolom pemisah bisa bertahan pada
perubahan yang terjadi pada sampel, misalnya konsentrasi suatu ion terlalu tinggi, tidak akan
mempengaruhi kestabilan material penyusun kolom. Walapun diakui bahwa ada juga kolom
pemisah yang mempunyai waktu penggunaan yang tidak terlalu lama, dikarenakan paking kolom
yang kurang baik atau karena faktor internal lainnya.
4.

Penggunaan kromatografi Pertukaran ion

Sampel cair yang mengandung ion atau logam ini bisa diketahui atau dianalisis dengan
menggunakan teknik kromatografi ion (ion chromatography). Dengan menggunakan teknik
kromatografi ion, anda bisa memastikan ion-ion atau logam secara kualitatif ataupun kuantitatif
dari sampel. Dalam waktu yang singkat, ion-ion positif (kation) seperti : Na +, NH4+, K+, Mg2+,
Ca2+, Ag+, Cu2+, Fe2+ dan sejumlah kation lainnya atau ion-ion negatif (anion) seperti : F -, PO43-,
Cl-, NO2-, Br-, SO42-, CN-, I-, IO3-, dan sejumlah jenis anion lainnya dapat diketahui secara pasti
kepekatan perjumlahnya. Bahkan lebih dari itu, berbagai jenis ion (anion atau kation) dalam
sampel, dapat ditentukan secara serentak (simultaneous) dalam satu kromatogram (one
chromatogram run).
Pada umumnya, anion dan kation dapat diketahui dan dipisahkan dengan menggunakan
teknik pemisahan. Atau dengan kata lain, untuk sekali injek sampel saja ke dalam sistem

kromatografi ion, berbagai-bagai puncak kromatogram (chromatogram peaks) dari anion atau
kation akan muncul. Inilah salah satu yang menjadikan teknik ini lebih populer, bukan saja
sensitivitas dan selektivitasnya, tetapi juga waktu analisisnya yang relatif singkat dan juga
hasilnya yang maksimal.
Teknik kromatografi ion merupakan salah satu subset dari kromatografi, khususnya
kromatografi cair (LC = liquid chromatography). Teknik ini dapat menentukan kepekatan spesies
ion-ion (anion atau kation) dengan memisahkannya berdasarkan pada interaksinya dengan Resin
yang ada dalam kolom pemisah dan mobile phase yang digunakan. Spesies ion-ion ini kemudian
dapat dipisahkan (separated) dalam kolom tersebut berdasarkan pada jenis, ukuran dan afiniti
elektronnya.
Campuran anion dan kation dalam suatu sampel dapat diketahui dan jumlah ion-ion
tersebut dapat ditentukan dalam waktu yang relatif singkat (relatively short time). Suatu ion
dalam sampel dengan kepekatan yang sangat rendah, masih bisa diukur dengan teknik ini.
Disebabkan itulah, teknik kromatografi ion menjadi pilihan bagi peneliti dalam mengetahui ion
yang ada dalam sampel cair, karena teknik ini mempunyai kemampuan menentukan kepekatan
ion atau logam pada level ppt (parts per trillion). Ia juga mudah digunakan serta tidak rumit
dalam pengendalian peralatan ini.
Pada umumnya, aplikasi teknik ini lebih menjurus kepada teknik mengetahui ion-ion non
organik serta ion-ion organik di mana berat molekul relatif kecil, dan/atau ion-ion organik
dengan berat molekul yang besar dapat diketahui dengan baik dengan didahului persiapan
sampel yang baik.
Beberapa kegunaan Kromatografi Pertukaran Ion lainnya :
a. Untuk menghilangkan ion
Untuk menghilangkan ion-ion keseluruhannya, air tersebut dapat dialirkan melalui
penukar kation, kemudian dialirkan melalui penukar anion, yang akan menghilangkan semua
anion dan diganti dengan ion hidroksida. Bila kedua resin tersebut (kation dan anion) dijadikan
satu, penghilangan kedua jenis ion tersebut sekaligus dapat dikerjakan.
b. Mengkonsentrasikan komponen berkadar kecil

10

Ion-ion yang jumlahnya kecil (trace element) dapat dikonsentrasikan dengan

penukar ion. Setelah ion solut terikat dalam kolom, kemudian dielusi dengan jumlah
eluen yang kecil.
c. Pemisahan asam-asam amino
Pada suatu pH, Asam-asam amino dapat dipisahkan menjadi tiga golongan
berdasarkan titik isoelektrisnya. Dengan demikian campuran asam-asam amino dapat
dipisahkan dalam suatu aliran fase mobil dengan secara gradual dengan merubah pH
untuk elusi (gradient elution). Perubahan pH sering dikombinasikan dengan perubahan
suhu.

11

b. Adsorpsi
Adsorpsi ialah gejala timbulnya konsentrasi zat yang lebih besar pada
bidang perbatasan antara dua fasa daripada dalam masing-masing fasa.
Terjadinya pemisahan ialah akibat gaya tarik fasa stasioner yang kuat
terhadap komponen komponen yang harus dipisahkan.
Gaya tarik yang kuat ini disebabkan oleh interaksi kimiawi dan atau
interaksi Van Der Walls.Kromatografi adsorpsi adalah teknik kromatografi
tertua dioperasikan berdasarkan retensi terlarut pada permukaan adsorben.
Adsorben yang umum digunakan adalah silika gel dan alumina karena
mereka dimiliki daerah yang besar permukaan dan banyak situs aktif.
Terlarut dan pelarut dalam cairan dapat bersaing satu sama lain untuk
mendapatkan situs yang aktif. Karena ini, memilih pelarut yang tepat sangat
penting untuk mendapatkanadsorpsi yang maksimum zat terlarut pada situs
aktif permukaan.Pada kromatografi adsorpsi, fasa stasionernya terdiri atas
zat padat dan fasa mobilnya terdiri atas zat gas atau zat cair.

Fasa diam ( absorben atau lapisan penyerap )

Betindak sebagai pemisah campuran tersebut.Contoh pelarut
yang digunakan adalah slika gel, aluminium oksida, selulosa. Namun

12

yang paling banyak digunakan adalah slika gel dan alumunium oksida
karena kadar air yang digunakan berpengaruh terhadap daya.

Fasa gerak ( Eluen )

Bertindak

sebagai

pembawa

campuran

tersebut

.komponenkomponen campuran akan bergerak dengan kecepatan

yang berbeda-beda akibat hambatan dari fase diam sehingga terjadi
pemisahaan.
Kromatografi didasarkan pada retensi suatu zat terlarut oleh adsorpsi
permukaan. Kromatografi adsorpsi banyak digunakan dalam pemisahan
senyawa-senyawa organik, senyawa-senyawa nonpolar dan konsistuenkonstituen yang sulit untuk menguap.
Sebagai Adsorben dapat digunakan adsorben anorganik maupun
adsorben organik. Adsorben anorganik yang bisa digunakan antara lain
kalsium karbonat, alumina, magnesium silikat, kalsium hidroksida, silika gel
dan tanah diatom. Adsorben organik bisa digunakan antara lain karbon aktif
dan arang gula.
Adsorben sebaiknya mempunyai ukuran yang seragam. Adanya Zat
pengotor yang menyebabkan terjadinya adsorpsi yang tidak reversibel.
Pemisahan yang lebih baik dapat diperoleh dengan terlebih dahulu mengolah
adsorbennya dengan suatu senyawa yang dapat teradsorpsi dengan kuat.
Hal ini dapat dilakukan pada adsorpsi dengan langkah yang bertingkat .Pada
kolom diisi dengan segmen-segmen dengan adsorben yang mempunyai
tingkat kejenuhan lebih berbeda. Hal ini dapat menghasilkan pemisahan
komponen yang lebih baik dan efisiensi ynag tinggi. Pemilihan fase mobil
ditentukan oleh kompetesi anatara komponen solut dan molekul eluen pada
setiap titik adsorben.

13

Makin tinggi Kandungan ikatan Rangkap dan gugus hidroksil suatu

molekul maka akan lebih kuat teradsorpsi. Misalnya alkohol teradsorpsi suatu
molekul ,maka akan semakin kuat jika dibandingkan dengan aldehid. Hal ini
dapat disebabkan karena alkohol mempunyai gugus OH ,yang
menyebabkan adsorpsi lebih kuat. Senyawa-senyawa akan mudah
Teradsorpsi lebih cepat ketika memiliki konsentrasi yang tinggi daripada
konsentrasi rendah. Naiknya konsentrasi akan mempengaruhi laju
pergerakan komponen dan perubahan posisi wilayah adsorpsi.
Pemisahan kromatografi kolom adsorpsi didasarkan pada adsorpsi
komponen-komponen

campuran dengan afinitas berbeda-beda terhadap

permukaan fase diam. Kromatografi kolom adsorpsi termasuk pada cara

pemisahan cair-padat. Kromatografi cair-padat juga disebut Kromatografi
Adsorpsi,

metode jenis ini diketemukan oleh Tswett dan diperkenalkan

kembali oleh Kuhn dan Ledere pada tahun 1931. Metode ini banyak
digunakan untuk analisis biokimia dan organik. Teknik pelaksanaannya
dilakukan dengan kolom. Sebagai fasa diam di dalam kolom dapat dipilih
silika gel atau alumina.
Substrat padat (adsorben) bertindak sebagai fase diam yang sifatnya
tidak larut dalam fase cair. Fase bergeraknya adalah cairan (pelarut) yang
mengalir membawa komponen campuran sepanjang kolom. Pemisahan
tergantung pada kesetimbangan yang terbentuk pada bidang antarmuka di
antara butiran-butiran adsorben dan fase bergerak serta kelarutan relatif
komponen pada fase bergeraknya. Antara molekul-molekul komponen dan
pelarut terjadi kompetisi untuk teradsorpsi pada permukaan adsorben
sehingga

menimbulkan

proses

dinamis.

Keduanya

secara

bergantian

tertahan beberapa saat di permukaan adsorben dan masuk kembali pada

fase bergerak. Pada saat teradsorpsi komponen dipaksa untuk berpindah
oleh aliran fase bergerak yang ditambahkan secara kontinyu. Akibatnya
hanya komponen yang mempunyai afinitas lebih besar terhadap adsorben

14

akan secara selektif tertahan. Komponen dengan afinitas paling kecil akan
bergerak lebih cepat mengikuti aliran pelarut.
Contoh yang termasuk Kromatografi Adsorpsi
1. Khromatografi Kolom Adsorpsi :
a. Prinsip
Prinsip yang mendasari kromatografi kolom adsorpsi ialah bahwa
komponen komponen dalam zat contoh yang harus diperiksa
mempunyai afinitas yang berbeda-beda terhadap adsorben dalam
kolom. Apabila kita mengalirkan cairan ( elutor ) secara kontinyu
melalui kolom yang berisi zat contoh yang telah diadsorpsikan oleh
penyarat kolom, maka yang pertama tama dihanyutkan elutor
ialah komponen yang paling lemah terikat kepada adsorben.
Komponen komponen lainnya akan dihanyutkan menurut urutan
afinitasnya

terhadap

adsorben,

sehingga

terjadi

pemisahan

daripada komponen komponen tersebut.

b. Penyarat Kolom
Pola kecepatan arus elutor pada tiap irisan kolom yang dipilih di
sembarang tempat sudah tentu sedapat mungkin harus sama.
Keseragaman ini dapat dicapai dengan memilih adsorben yang
ukuran butir-butirnya sama ( diayak ) dan dengan cara penyaratan
yang baik. Makin kecil ukuran butir adsorben, makin cepat
keseimbangan adsorpsi akan tercapai, dan makin besar pula
kecepatan elusi yang boleh dipergunakan. Tetapi dilain pihak, makin
kecil butir adsorben, makin besar hambatan bagi cairan yang harus
mengalir melalui kolom.Apabila kecepatan lintas bagi cairan elutor
terlalu kecil, dapat dipergunakan pompa vakum yang menimbulkan
tekanan rendah dalam ruang di bawah kolom sehingga cairan dapat
mengalir lebih cepat melalui kolom.

15

c. Bentuk Kolom
Penempatan adsorben dalam kolom secara uniform betul sangat
sukar dilaksanakan. Sebagai akibatnya, zona zona komponen yang
dipisahkan menjadi kurang teratur bentuknya.Bagi kolom yang lebar
hal ini dapat menyebabkan pembauran.Tetapi bagi kolom kecil
bahaya ini seberapa besar. Namun di lain pihak, kolom yang lebar
dan pendek itu lebih memudahkan dalam pemakaiannya
Oleh karena itu, tinggi kebanyakan kolom ialah 20 kali
diameternya.Di bawah tabung yang umumnya terbuat dari gelas
terdapat lempengan meduk yang terbuat dari porselen atau dari
serbuk

gelas

yang

dipanaskan

hingga

melengket

jadi

satu.Lempengan yang berbentuk cakram ini bergawai sebagai

penahan fasa yang stasioner.Di bagian tabung yang paling bawah
terdapat kapiler penyulur dilengkapi dengan pancur.Kapiler beserta
pancur dirakitkan dengan kolom memakai suku asah sehingga
mudah dilepaskan guna membersihkan kolom dan untuk meniup
kolom sehingga menjadi bersih dari cairan.Ruang antara pancur dan
cakram penyaring harus sekecil mungkin supaya tidak terjadi
pembauran antara cairan cairan yang keluar dari kolom.
d. Kecepatan Arus
Semakin rendah kecepatan arus cairan, semakin baik akibatnya
bagi tercapainya keseimbangan adsorpsi dan akan semakin baik
pula pemisahannya. Bentuk zona pun menjadi lebih teratur.Tetapi
kecepatan arus yang terlalu rendah dapat menimbulkan efek difusi
axial dalam fasa mobil yang harus dihindarkan sejauh mungkin.
Jadi dapat dikatakan bahwa pemisahan yang terbaik dapat
dicapai dengan mempergunakan kolom yang panjang dan sempit,
diisi dengan adsorben yang berbutir halus, dan arus yang lambat.
Elusi dapat dimulai apabila campuran yang harus dipisahkan sudah

16

dimasukan dalam kolom. Elusi ini dilakukan dengan memasukan

cairan elutor berenyai renyai melalui kolom dan harus dijaga
supaya arusnya tidak berhenti. Komponen komponen yang telah
diadsorpsikan oleh adsorben akan bergerak dalam bentuk gelang
gelang atau zona dengan kecepatan yang berbeda beda melalui
kolom dan ditampung di bawah kolom secara terpisah memakai
beberapa tabung yang dibubuhi tanda tanda. Tabung tabung ini
ditempatkan dalam sebuah fraksikolektor.Setelah itu fraksi fraksi
yang diperoleh mulai dapat diselidiki.
Ditinjau dari mekanismenya kromatografi kolom merupakan
khromatografi

serapan

atau

adsorpsi.

Khromatografi

kolom

digolongkan kedalam khromatografi cair-padat (KCP) kolom terbuka.

Alat kromatografi kolom sederhana, terdiri dari kolom dari kaca
yang ada kranya. Umumnya panjang kolom minimum 10x diameter
pipa kaca yang digunakan dan labu Erlenmeyer sebagai penampung
eluen. Fasa diam berupa adsorben yang tidak larut dalam fasa
gerak, ukuran partikel fasa diam harus seragam. Adanya pengotor
dalam fasa diam dapat menyebabkan adsorpsi tidak reversible.
Sebagai fasa diam digunakan alumina , silica gel, arang, bauksit,
kalsium karbonant, bauksit, magnesium, karbonat, talk, selulosa,
dan gula.
Pengisian fasa diam ke dalam kolom dapat dilakukan dengan
cara kering dan cara basah. Pada cara basah fasa diam dibuat
bubur dulu dengan pelarut yang akan digunakan untuk fasa gerak,
baru kemudian dimasukkan kedalam kolom. Fasa gerak dalam
kromatografi kolom dapat berupa pelarut tunggal atau campuran
beberapa pelarut dengan komposisi tertentu. Pelarut dapat polar
atau non polar dengan berat molekul kecil lebih cepatmeninggalkan
fasa diam .

17

Kromatografi
merupakan

cair

metode

yang

dilakukan

kromatografi

di

dalam

terbaik

kolom

untuk

besar

pemisahan

campuran dalam jumlah besar. Pada kromatografi kolom, campuran

yang akan dipisahkan diletakkan berupa pita bagian atas kolom
penyerap yang berada dalam tabung kaca, tabung logam atau
bahkan tabung plastic. Pelarut (fase gerak) dibiarkan mengalir
melalui kolom karena aliran ini disebabkan oleh gaya berat atau di
dorong dengan tekanan .
Zat penyerap (misalnya aluminium oksida yang telah diaktifkan,
silica gel, kilsegur terkalsinaasi, dan kilsegur kromatografi murni)
dalam keadaan kering atau sebagai bubur, dimampatkan ke dalam
tabung kaca atau tabung kuwarsa dengan ukuran tertentu dan
mempunyai lubang mengalir keluar dengan ukuran tertentu.Sediaan
yang diuji dan dilarutkan dalam sedikit pelarut ditambahkan pada
puncak kolom dan dibiarkan mengalir ke dalam zat penyerap. Zat
berkhasiat diserap dari larutan secara sempurna oleh bahan
penyerap berupa pita sempit pada puncak kolom.
Dengan mengalirkan pelarut lebih lanjut, dengan atau tanpa
tekanan

udara,

masing-masing

zat

bergerak

turun

dengan

kecepatan khas hingga terjadi pemisahan dalam kolom yang

disebut kromatogram. Kecepatan bergerak zat dipengaruhi oleh
beberapa faktor misalnya daya serap zat penyerap, sifat pelarut
dan suhu dari system kromatografi. Jika dikehendaki pemisahan
beberapa

zat

khasiat

dapat

dilakukan

dengan

mengalirkan

selanjutnya pelarut yang sama atau pelarut lain yang mempunya

daya elusi yang kuat.
2. Sifat Adsorban dan Sifat Pelarut
Harus memiliki luas permukaan besar internal. Kecepatan adsorbs
akan semakin bertambah denagan semakin kecilnya ukuran diameter

18

adsorben.Daerah tersebut harus dapat diakses melalui pori-pori cukup besar

untuk mengakui molekul untuk teradsorpsi. Ini adalah bonus jika pori-pori
juga cukup kecil untuk mengecualikan molekul yang tidak diinginkan untuk
menyerap.Adsorben seharusnya tidak mengalami penuaan yang cepat, yang
kehilangan kapasitas serap melalui daur ulang terus-menerus.
Daya Adsorpsi dari bahan tergantung dari sifat kimia permukaanya,
luas relatif permukaan dan perlakuan pendahuluan terhadapnya.Sifat-Sifat
ini mudah berubah dan sulit di kontrol sehinggatidak selalu pasti.Dalam
kromatografi

Adsorpsi,

perubahan-perubahan

pada

setiap

permukaan

berbeda dari titik ke titik partikel yang sama dan juga dari bagian-ke bagian.
Perlakuan pendahuluan terhadap adsorben termasuk

pencucian yang

terkontrol dan pengeringan selalu dianjurkan.

Adsorben yang digunakan pada kromatografi tersebut adalah Silica
Gel. Silica Gel mempunyai luas relatif yang lebih besar dari alaumina (kurang
lebih 500 m2 /g), Silica gel kurang aktif dibandingka dengan alaumina. Silica
Gel dianjurkan penggunaan untuk senyawa-senyawa organik yang sensitif
terhadap sifat mengkatalis dari permukaan aktif. Pada Silica Gel terdapat
gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solute. Gugus silanol pada
silica mempunyai reaktivitas yang berbeda karenanya solut dapat terikat
kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor. Fase gerak yang
digunakan untuk fase diam silica gel berupa pelarut non polar yang
ditambah dengan pelarut polar seperti air aatau alkohol rantai pendek untuk
meningkatkan kemampuan elusinya sehingga tidak timbul pengekoran
puncak yaitu n-heksana ditambah dengan metanol.Penambahan air atau
pelarut polar harus diperhitungakna secara matang. Jika terlalu sedikit, maka
akan menyebabkan kemungkinan belum mampu untuk mengelusi solut. Jika
terlalu banyak akan menyebabkan kolom menjadi kurang aktif.
Bahan yang dapat dipakai sebagai adsorben dalam kromatografi
adsorpsi tidak begitu banyak dan yang paling dikenal adalah silica gel dan

19

alumina.Daya adsorpsi dari bahan tergantung dari sifat kimia permukaannya,

luas relative permukaan, dan perlakuan pendahuluan terhadapnya.

No
1
2
3
4
5
6
7
8

Nama adsorben
Alumina
Charcoal
Silica Gel
Magnesia
Kalsium Karbonat
Sukrosa
Pati
Selulosa Serbuk

Dalam kromatografi adsorpsi, perubahan-perubahan pada sifat

permukaan selalu menjadi masalah. Keaktifan permukaan berbeda sari titik
ke titik dari partikel yang sama dan juga dari bagian ke bagian.
Syarat fase diam dalam kromatografi adsorpsi adalah :
1. Tidak larut dalam fase gerak
2. Inert
3. Cukup aktif
4. Sebaiknya tidak berwarna
5. Memungkinkan aliran baik dan teratur fase gerak. Missal : sukrosa,
pati, CaCO3, MgCO3, Mg Silikat aktif, alumina aktif, arang aktif, florisil.
Pemilihan pelarut tergantung dari sifat kelarutannya, akan tetapi lebih
baik untuk memilih suatu pelarut yang tidak tergantung pada kekuatan elusi
sehingga zat-zat elusi yang lebih kuat dapat dicoba kekuatan dari zat elusi
adalah daya penyerapan pada penyerap dalam kolom.
c. Kromatograf Eksklusi ( Exclusion Chromatography )

20

Prinsip kerja cara ini adalah penyaringan molekul sehingga disebut

juga moleculersieve. Dalam cara ini kolom diisi dengan fasa diam dengan
ukuran tertentu, berpoti-pori seragam dan akurat. Pemisahan terjadi karena
perbedaan besar molekul cuplikan, yang berukuran besar tidak dapat masuk
ke dalam pori-pori fasa diam sehingga lebih dahulu dieksklusi keluar dari
kolom sedangkan partikel yang molekulnya lebih kecil akan tertahan lebih
lama oleh fasa diam. Cara ini biasa disebut gel per-meation, tau gel filtration
(seolah-olah penyaringan oleh gel atau gel chromatography karena pada
awalnya digunakan fasa diam yang berupa gel. Kolom mula-mula diisi
dengan bahan yang akan membentuk gel jika diairi, kemudian dialiri eluen
berupa cairan organik. Fasa diam berupa gel tidak boleh larut dalam eluen
organik tersebut. Jenis ini misalnya digunakan untuk menguji kualitas
polimer apakah suatu polimer masih mangandung monomer-monomer yang
masih bebas yang tidak terikat pada polimer.
Pemisahan berbagai konstituen dengan meninjau perbedaann ukuran
dan geometri molekul adalah dasar Kromatografi eksklusi. Peredaan ukuran
menyebabkan beberapa partikel bergerak lebih cepat ddaari yang lainya
sehingga menimbulkaan perbedan permukaan migrasi. Kromatografi eksklusi
dapat dikelompokkan menjadi tiga kategori yaitu :
1. Teknik Permeasi atau Filtrasi Gel
Teknik permeasi atau Filtrasi adalah suatu teknik yang menguraikan
campuran zat-zat sesuai dengan ukuran molekulnya. Teknik ini didasari atas
inklusi dan eksklusi suatu zat terlarut melalui suatu fase diam yang terbuat
dari gel polimer yang terikat silang ddan berpori heterogen. Dalam
kromatografi eksklusi cair-padat pemisahan teradi antara vase cair di dalam
partike gel dan cairan di luar mengelilingi partikel gel.
Sebagai

penunjang

fase

diam

dalam

pemisahan

ini

biasanya

digunakan xerogel-xerogel. Xerogel adalah suatu gel organik yang dapat

bersifat hidrofilik (yaitu : agar dan dekstran yang terikat silang pada

21

poliakrilamida) ataupun hidrofobik (poistirena). Xerogel-xerogel ini tersedia di

pasaran dengan nama dagang biogel p-2 (poliakrilamida),sepadex G-10-200
(dekstran) juga styrogel (gel polistirena yang dimodifikasi) dan agarose.
Kolom yang digunakan adalah kolom biaya pengelusi (luent) dibiarkan
mengalir

karena

grafitasinya.

Laju

aliran

akan

bertambah

dengan

bertambahnya ukuran partikel seperti kromatografi pertukaran ion, laju

aliran juga dapat dipengaruhi oleh variasi porositas gel. Untuk suatu gel yang
tidak padat, volume interstisi dapat diturukan dengan pemberian tekanan,
volume eluent berkisar antara 25 100 ml. sepertii juga metode
kromatografi lainnya, konsekwensi efluaennya diukur melalui sifat-sifat fisik
yang sesuai.. seperti indeks refraksi, absorbansi,, intensitaas pendar flour
atau sifat-sifat listriknya.
Parameter-parameter kolom dapat dihubungkan secar matematik
dengan
Vb = Vo + Vi + Vr = Vo Vs
Vi = m Sr/ Ps
Vi =Vo + Kd Vi
Dimana :
- Vi = volume bagiana dalam gel,
- Vr= volume matriks gel,
- Vs= volume total face diam gel,
- m = berat gel,
- Sr = volume pelarut yang dipakai,
- Ps = kerapatan pelarut,
- Kd = koefisien distribusi,
- Pr = kerapatan gel,
- Vb= volume bed,
- Vo= volume di luar gel,

22

Pemisahann suatu tipe gel bergantung pada ukurran molekul dan sifat
kimia dari zat yang akan dipisahkan. Misalkan biogel 0 10 digunakan untuk
zat-zat dengan berat molekul berkisar antara 500-17000 satuan. Molekul
dengan besar molekul diatas batas ini yaitu limit eksklusif, akan lewat saja
tanpa rintangan dari gel. Di bawah limit eksklusi, zat tersebut akan terelusi
pada volume elusi yang sesuai dengan volume bed total. Untuk bekerja
dalam medium tidak berai, gel yang tepat digunakan adalah sephadex LH20.
Pemakain

Kromatografi

permeasi

gel

digunakan

untuk

analisis

campran molekul dengan berat molkul yang berbeda seperti pemisahaan

rafinosa, maltose, dengan menggunakan sephadex pada pH 7,0, laju aliran 5
ml/jam ddan H2O sebagai eluent. Pemisahan molekul- molekul dengan berat
molekul sama dapat juga dilakukan dengan pemilihan yang tepat tipe gel
dan tinggi kolomnya. Pengeluaran garam (desalting) adalah salah satu
pemisahan yang meliputi pembebasan garam dan senyawa berberat dengan
molekul makro.
2. Eksklusi dan reterdarsi ion
Eksklusi ion adalah suatu proses untuk memisahkan materi ionic dari
materi nonionic didasari pada perbedaan distribusi pada ke dua tipe zat
pelarut ini di antara vase resin penukar ion dan larutan air. Jika suatu resin
penukar ion diletakkan dalam larutan elektrolit encer atau dalam air,
konsentrasi elektrolit pada kesetimbangan dalam fase resin akan lebih kecil
dari pada larutan sekelilingnya yaitu fase luarnya, tetapi bila resin diletakkan
dalam suatu larutan nondielektrolit (dalam air), maka nonelektrolit ini akan
berubah

untuk

terdistribbusi

secara

merata

pada

kedua

fase.

Jadi

sebenarnya tidak terjadi penukaran ion dalam peristiwa absobsi elektrolit

dan elektrolit tersebut. Karena ke dua tipe zat terlarut ini dapat diekstraksi
dari resin dengan hanya mengencerkan larutan laurnya (sekelilingnya)
dengan air. Jika suatu latutan yang mengandung baik materi-materi ionic dan

23

nonionic diletakkan pada bagian atas kolom berisi resin dan dicuci dengan
air, materi ionic akan mengalir mengelilingi partikel resin sedang materi
nonionic berdifusi kedalam pertikel-partikel resin dan masuk kedalam
rongga-rongga kosong antara partikel resin. Laju perpindahan materi
nonionic akiabatnya akan lebih rendah dari pada komponen ionicnya dan
akan teramati komponen ionic muncul terlebih dahulu sebagai efluen.
Jelasbahwa resin penukaran ion digunakan sebagai fase diam, dank arena
tidak

terjadi

penukaran

ion,

resindapat

dipakai

terus-menerustanpa

regenerasi.
a)

Mekanisme Eksklusi Ion

Suatu resin penukaran ion tidaklah sama dengan absobsi biasa.

Dengan mengatur jaringan muatan suatu resin, dapat diperoleh

keadaan dimana hanya satu macam ion elektrolit yang dieksklusikan.
Jumlah total elektrolit yang berdifusi kedalam resin dibatasi eloh
prinsip elektronetralitas. Makin kuat terionisasi suatu resin penukaran
makin efesien untuk eksklusi ion. Banyaknya garam yang erdifusi
kedalam resin berkurang dengan bertamnbahnya kapasitas penukar
ion suatu resin. Sebagian besar ion elektrolit berberat elektrolit rendah
yang mudah larut dalam air, bebas berdifusi kedalam dan keluar resin
tidak

peduli

besarnya

kapasitas

resin,

sehingga

cenderung

berkonsentrasi sama dengan ke dua fase saat kesetimbangan tercapai.

b)

Aplikasi Metode Ion Eksklusi

Gula dan garam tidak dapat dipisahkan dengan metode ini

karena ukuran dan ketidakmampuanya relative dari molekul sukrosa

dan glukosa untuk berdifusi secara cepat kedalam fase resin.
Pemisahan elektrolit kuat dan molekul netral paling baik dicapai
dengan metode eksklusi ion, misalnya pemisahan NaCl dan etilen
glikol, HCl dan HC3COOH, CH3COOH; NaCl dan etano. Riechenberg
telah menggunakan teknik ini untuk pemisahan anggota deret

24

Homolog, misalkan pemisahan asam asetat dan asam n- butirat.

Gugusan sulfanat yang bersiafat asam pada resin penukaran ion, dapat
menghasilkan efek garam pada materi organic dan cenderung untuk
menehan efek absorbsi matriks resin. Oleh karena itu rieman
menggunakan larutan garam sebagai pengganti larutan H2O untuk
eluen dalam memisahkan methanol, etanol dan propanol. Efek yang
menguntungkan adanya garam dalam eluen adalah efek garam
selektif terhadap komponen nonionic dari fase larutannya.
d. Kromatograf partisi
Prinsip kromatografi partisi dapat dijelaskan dengan hukum partisi
yang dapat diterapkan pada sistem multikomponen yang dibahas di bagian
sebelumnya. Dalam kromatografi partisi, ekstraksi terjadi berulang dalam
satu kali proses. Dalam percobaan, zat terlarut didistribusikan antara fasa
stationer dan fasa mobil. Fasa stationer dalam banyak kasus pelarut
diadsorbsi pada adsorben dan fasa mobil adalah molekul pelarut yang
mengisi ruang antar partikel yang ter adsorbsi.
Kolomnya (tabung gelas) diisi dengan bahan seperti alumina, silika gel
atau pati yang dicampur dengan adsorben, dan pastanya diisikan kedalam
kolom. Larutan sampel kemudian diisikan kedalam kolom dari atas sehingga
sammpel diasorbsi oleh adsorben. Kemudian pelarut (fasa mobil; pembawa)
ditambahkan tetes demi tetes dari atas kolom.
Partisi zat terlarut berlangsung di pelarut yang turun ke bawah (fasa
mobil) dan pelarut yang teradsorbsi oleh adsorben (fasa stationer). Selama
perjalanan turun, zat terlarut akan mengalami proses adsorpsi dan partisi
berulang-ulang. Laju penurunan berbeda untuk masing-masing zat terlarut
dan bergantung pada koefisien partisi masing-masing zat terlarut. Akhirnya,
zat terlarut akan terpisahkan membentuk beberapa lapisan.
Pada kromatografi partisi fasa diam cairan yang melapisi partikel
penyangga (kieselguhr, selulosa, silika gel , alumina C8, C18 ) dan fasa gerak

25

cairan yang tidak dapat campur dengan fasa diam tidak dapat teradsorpsi
pada penyangga fasa diam sehingga sampel berbeda kelarutannya dalam
fasa diam. Komponen yang lebih besar kelarutannya dalam fasa diam
tertahan lebih lama.
Koefisien partisi( Kd)=

[X] A
[ X ]B

Berubah bila suhu berubah

Nisbah konsentrasi zat terlarut dalam dua pelarut yang tidak saling
campur, pada saat kesetimbangan

26

Fasa

Kromatograf partisi fasa normal

Fasa diam: hidrofilik

Fasa gerak : hidrofobik
Pasangan fasa diam dan fasa gerak: daya saling melarutkan
kecil

Kromatograf partisi fasa terbalik

Fasa diam: hidrofobik

Fasa gerak : hidrofilik
Pemisahan ion-ion logam

27

1. Kolom partisi

Fase diam dan fase gerak merupakan zat cair.

Pada kolom partisi umumnya suatu pelarut tidak campur air diadsorpsi
pada suatu padatan inert, sebagai cairan fasa diam.

Larutan analit ditempatkan pada bagian atas kolom, kemudian dicuci

dengan pelarut kedua hingga analit keluar dari kolom.

Pelarut kedua = fase gerak = eluen =bias berupa campuran pelarut

mungkin juga yang mengandung buffer.

28

29

BAB III
PENUTUP
3.1

Kesimpulan

30

DAFTAR PUSTAKA
http://materi-kimia-lengkap.blogspot.co.id/2014/05/makalah-kromatografiadsorpsi.html
http://tyafaithful.blogspot.co.id/2012/04/kromatografi.html
http://kruiqito.blogspot.com/2012/11/kromatografi-ion.html
http://klephone-file.blogspot.com/2012/03/kromatografi-penukar-ion.html
http://prof-chem.blogspot.com/2012/04/kromatografi-penukar-ion.html
http://id.wikipedia.org

31