TUGAS UJIAN TENGAH SEMESTER

PEMISAHAN & PEMURNIAN

OLEH
MOH. RIZAL PAKAYA
NIM : 14/373232/PFA/1429

DOSEN
Prof. Dr. Phil-nat. SUDARSONO, Apt.

PROGRAM PASCASARJANA FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS GADJAH MADA
2016

Soal : KODE 34
Senyawa target

: Asam meta digalat

Senyawa impurities 1

: Pektin

Senyawa impurities 2

: Asperulosid

Senyawa impurities dominan

: Klorofil

Senyawa target

COOH

O
C
HO

OH

O
OH
OH

Asam Meta digalat

OH

Asam metadigalat larut dalam air dan metanol, sedikit larut dalam etil
asetat dan tidak larut dalam pelarut organik. Deteksi asam metadigalat dapat
dilakukan dengan penambahan FeCl3 terjadi endapan biru/ hitam pada ph 3-5 dan
endapan akan hilang jika ditambah asam kuat serta uji pengendapan protein. Asam
metadigalat mengendapkan protein dan dapat dihidrolisis (tannin terhidrolisis).

Impuritis 1

-OOC

OH

OH
HO

COOCH3
O

O
O

H3COOC

OH

Potongan molekul pektin

Pektin adalah senyawa heteropolisakarida kompleks polimer dengan

struktur utama homogalakturonat, rhamnogalakturonat I dan rhamnogalakturonat
II yang terdapat dalam dinding sel tumbuhan darat. Larut dalam asam air dan
asam oksalat tergantung kadar metoksil didalamnya, sedikit larut dalam air dingin,
tidak larut dalam alkohol dan pelarut organik kecuali dicampur dengan air.
Identifikasi dapat dilakukan dengan metode fenol-asam sulfat, metode karbazoleasam sulfat.

Impuritis 2

Asperulosida

Merupakan glikosida iridoid, larut dalam air, metanol, etanol, aseton, etil
asetat, dioxane, piridin, asam asetat, tidak larut dalam eter, kloroform, benzene.
Dideteksi asperulosida dilakukan dengan menggunakan KLT FD : silika gel GF
254, tidak meredan pada 254 nm dan meredam 366, disempot dengan pereaksi
Trim Hill (1 bagian volume 2%, larutan CuSO4, 10 bagian volume asam sulfat
pekat).

Senyawa dominan :

Klorofil
Klorofil adalah pigmen hijau yang ada dalam kloroplastida. Pada
umumnya klorofil terdapat pada kloroplas sel-sel mesofil daun, yaitu pada sel-sel
parenkim palisade dan atau parenkim bunga karang. Pada tumbuhan tingkat tinggi
terdapat dua jenis klorofil yaitu klorofil-a dan klorofil-b. Pada keadaan normal,
proporsi klorofil-a jauh lebih banyak daripada klorofil-b.
Selain klorofil, pada membran thylakoid juga terdapat pigmen-pigmen
lain, baik yang berupa turunan-turunan klorofil-a maupun pigmen lainnya.
Kumpulan bermacam-macam pigmen fotosintesis disebut fotosintem, berperan
menjerap energi cahaya (foton, kuantum) pada reaksi terang untuk menghasilkan

energi kimia berupa ATP dan NADPH2. Contoh turunan klorofil-a yang berperan
penting pada fotosintesis adalah feofitin(kloforil-a yang kehilangan inti Mg,
menjadi salah satu komponen fotosintem II), pigmen yang peka terhadap 680 nm
(P680= sebagai pusat reaksi fotosistem II) , dan P700(menjadi pusat reaksi
fotosintem I). Pigmen yang lain antara lain carotenoidadan Xantofil.
Molekul klorofil tersusun atas 4 cincin pirol dengan Mg sebagai inti.
Pada klorofil terdapat rangkaian yang disebut fitil (C20H39O) yang jika terkena
air dengan pengaruh enzim klorofilase akan berubah menjadi fitol (C20H39OH).
Fitol adalah alkohol primer jenuh yang mempunyai daya afinitas yang kuat
terhadap O2 dalam proses reduksi klorofil. Sifat fisik klorofil adalah menerima dan
atau memantulkannya dalam gelombang yang berlainan (berpendar =
berfluorescens). Klorofil banyak menyerap sinar dengan panjang gelombang
antara 400-700 nm, terutama sinar merah dan biru. Sifat kimia klorofil menurut
antara lain (1) tidak larut dalam air, melainkan larut dalam pelarut organik yang
lebih polar, seperti etanol dan kloroform, (2) inti Mg akan tergeser oleh 2 atom H
bila dalam suasana asam, sehingga membentuk suatu persenyawaan yang disebut
feofitinyang berwarna coklat.
Deteksi klorofil dengan melihat profil spektrum, yaitu adanya serapan
pada 465 nm dan 650 nm (klorofil B) dan 675 nm (klrorofil A). TLC dengan fase
diam silika 60, fase gerak 50% hexane, 45% chloroform and 5% ethanol, Klorofil
A : 0,5, biru/ hijau; klorofil B : 0,63, kuning/hijau.

Proses Pemisahan
1. Daun yang sudah dideterminasi kebenaran dan dikeringkan, diekstraksi
menggunakan MeOH 90% secara maserasi dan dipisahkan ampas dan sarinya
2. Sari diuapkan sampai menjadi ekstrak kental menggunakan rotari evaporator
suhu maksimal 40 C agar tidak terbentuk gumpalan pektin
3. Ekstrak kental ditambah air dan n-heksane dan dipisahkan menggunakan
Liquid Liquid Continous Extraction (LLCE). Klorofil akan lebih banyak pada
fase n heksan dan senyawa asam metadigalat, asperulosid dan pektin ada di
fase air. Pada fase air dicek apakah masih ada klorofil atau tidak
menggunakan pola spektrum yang dilihat menggunakan spektrofotometri UV

pada panjang gelombang sekitar 400-700nm atau dengan TLC fase diam
silika 60, fase gerak 50% heksan : 45% kloroform : 5% metanol, lihat bercak
dan Rfmya untuk Klorofil A : 0,5, biru/ hijau; klorofil B : 0,63, kuning/hijau.
4. Fase air diekstraksi menggunakan etil asetat dengan menggunakan dengan
LLCE, sehingga terbentuk dua fase, yaitu fase etil asetat yang berisi
asperulosit dan fase air yang berisi sisa asperulosit, asam meta digalat dan
pektin. Untuk mendeteksi asperulosit digunakan KLT dengan fase diam silika
GF 254 dan dilihat meredam di 366 atau tidak dan emnggunakan pereaksi
semprot Trim Hill. Jika masih ada ada aseperulosit, tambahkan n butanol dan
diekstraksi menggunakan LLCE dan terbentuk dua fase yaitu fase n butanol
yang berisi asperulosit dan fase air yang berisi asam meta digalat dan pektin.
5. Fase air diekstraksi menggunakan air asam panas sehingga terbentuk
gumpalan Daun/
pektinbahan
dan laruran. Gumpalan pektin dan larutan dipisahkan
menggunakan penyaring.
Larutan berisi
asam metaMetanol
digalat. 90%
Diekstraksi
menggunakan
6. Untuk memurnikan asam metadigalat digunakan kromatografi kolom
Ekstrak
kental
Diekstraksi
n-heksandan
dandilanjutkan
air
menggunakan
fase
diam poliamida
danmenggunakan
fase gerak Metanol
HPLC preparatif dengan fase gerak 16% MeCN dalam 0,1% asam format
7. Untuk mendeteksi kemurnian asam metadigalat
menggunakan uji
Fase n-heksan
Fase air
pengendapan protein. Jika mengendapkanDiekstraksi
protein menunjukkan
positif
asam
menggunakan
Etil Asetat
metadigalat.
KLOROFIL
Fase EtoAc
Fase airDiekstraksi menggunakan n-Butanol
ASPERULOSID
Fase n-Butanol

Fase air
Ditambah Etanol panas, saring

Fase larutan
Kromatografi kolom
Fase diam poliamida, fase gerak Metanol,

Kromatografi kolom
Fase diam Diaione HP 20, fase gerak H2O
Gumpalan

ASPERULOSID

Beberapa
REVIEW PRESENTASI
harifraksi
JUMAT TANGGAL 01 APRIL 2016
PEKTIN
Kromatografi kolom
Fase diam poliamida, fase gerak 16% MeCN dalam 0,1% asam format

ASAM METADIGALAT

Komentar terhadap presentasi :

1. Mengapa menggunakan sampel daun?
Karena pada impurity terdapat klorofil. Dan diketahui bahwa klorofil paling
banyak terdapat pada bagian daun.
2. Mengapa sampel harus dikeringkan?
Karena apabila sampel masih segar masih terjadi reaksi enzimatik dan akan
terjadi dekomposisi kandungan aktif dan kontaminasi mokroba.
3. Bagaimana proses pengeringan simplisia menjadi simplisia kering?
Sampel daun segar dikeringkan dengan cara diangin-anginkan, atau dijemur
dibawah sinar matahari yang ditutupi dengan kain hitam, atau melalui oven
dengan suhu dibawah 50oC.
4. Mengapa simplisia dibuat dalam bentuk serbuk?
Karena simplisia dalam bentuk serbuk memudahkan penetrasi penyari untuk
mencapat zat aktif di dalam bahan. Sehingga proses penyarian semakin
efektif.
5. Dalam mengestraksi serbuk simplisia, mengapa menggunakan methanol 90%?
Karena metanol merupakan pelarut universal yang dapat menarik senyawa
polar dan senyawa non polar.
Selain itu dapat juga menggunakan etanol karena sama-sama pelarut universal.
6. Mengapa metode ekstraksi menggunakan metode maserasi?
Karena metode maserasi merupakan metode sederhana,
7. Bagaimana cara memperoleh ekstrak kental?
Hasil ekstraksi yang diperoleh diuapkan dengan menggunakan Rotary
Evaporator, sampai kadar airnya berkurang dan konsistensi ekstraksnya
menjadi kental.
8. Mengapa pelarut diawal tidak menggunakan n-hexan langsung? Mengapa
harus dimaserasi dengan methanol?
Karena penggunaan n-hexan jika digunakan dari awal asumsinya kurang
efektif, karena dikhawatirkan n-hexan tidak optimal dalam menarik senyawa
klorofil yang ada dalam sel tanaman.
9. Mengapa tidak mengekstraksi langsung dengan menggunakan n-hexan tetapi
berkali-kali?
Karena kemampuan n-hexan untuk berpenetrasi lebih rendah dibandingkan
dengan methanol maupun etanol.
10. Sampai kapan penambahan n-heksan : air pada ekstrak kental?
Sampai warna hasil penyarinya tidak berwarna hijau yang menandakan bahwa
klorofil diasumsikan sudah tidak terdapat pada ekstrak tersebut.
11. Bagaimana cara mengetahui klorofil diasumsikan sudah tidak terdapat pada
ekstrak?

Sisa ekstraksi diidentifikasi dengan dengan menggunakan spektrofotometri,

apakah masih ada pada serapan di 465 dan 650 nm (klorofil B) dan 675 nm
(klorofil A).
12. Apakah pemisahan klorofil dapat dilakukan dengan senttrifugasi?
Sentrifugasi adalah proses pemisahan berdasarkan bobot molekul (BM). Oleh
karena itu susah untuk di sentrifugasi.
Contoh pemisahan senyawa dengan sentrifugasi adalah pemisahan protein,
sehingga memungkinkan untuk terjadi pengendapan secara bertahap.
13. Mengapa pemisahan asperulosida dilakukan liquid-liquid extraction 2 tahap
yaitu dengan etil asetat dilanjutkan dengan n-butanol?
Karena untuk mengoptimalisasi mengambil/ memisahkan asperulosid. Pada
pemisahan dengan etil asetat, kemungkinan asperulosid masih ada di fase air.
Makanya dilanjutkan dengan pemisahan n-butanol. Agar pada fase air
diasumsikan tidak terdapat lagi asperulosida.
Menurut saya, dalam mengeliminasi asperulosida pada fase air tidak
perlu dilakukan pemisahan dengan n-Butanol lagi. Cukup pemisahannya
dilakukan berkali-kali dengan etil asetat.
14. Asperulosida merupakan glikosida terikat (bukan gula bebas) sehingga lebih
larut dalam etil asetat/ n-butanol. Mengapa glukosa tidak tidak dihidrolisis
saja lalu dipisahkan dengan air?
Karena senyawa target asam metadigalat juga dapat dihidrolisis, jadi justru
dikhawatirkan akan merusak senyawa target yang diinginkan.
15. Bagaimana cara membuktikan bahwa pada fase air sudah tidak terdapat
asperulosida?
Dengan cara spektroskopi, asperulosid tidak meredam di 254 nm, namun
berfluorosensi di 366 nm dan disemprot dengan pereaksi Trim Hill (1 bagian
volume 2%, larutan CuSO4, 10 bagian volume asam sulfat pekat).
16. Kenapa fase air pada fraksi etil asetat ditambahkan dengan etanol panas?
Ini dikarenakan untuk mengeliminasi pectin dengan metode presipitasi
(endapan).
17. Bagaimana cara memisahkan pektin dengan presipitasi?
Ada banyak cara mempresipitasi pectin salah satunya dengan pemanasan dan
penambahan etanol lalu dipanaskan.
Pektin dapat dipresipitasi dengan penambahan etanol maupun aseton. Pektin
akan membentuk endapan.
18. d