FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS

CINTICA ENZIMTICA DE LA FOSFATASA ALCALINA

.
Casas Hernndez Mara Fernanda; Hernndez Pando Daniel Alejandro; Lagar
Quinto Frida; Lpez Huerta Eric.
Departamento de Bioqumica Experimental; Grupo 3; Equipo: 3, 8 de abril de
2016.

Resumen
En esta prctica se determinaron las
constantes cinticas, Km y Vmax, de la
enzima fosfatasa alcalina, para la reaccin de
desfosforilacin, manteniendo constante la
concentracin de enzima, el pH y la
temperatura previamente determinados para

tener condiciones ptimas de reaccin.

Tambin se aadi un inhibidor (Molibdato de
Sodio) y se determinaron las constantes
cinticas
aparentes
para
as
poder
determinar el tipo de inhibicin.

1. Introduccin

catalizada por una enzima, slo a

concentraciones bajas del o los sustratos se
obtiene una reaccin de segundo orden. A
concentraciones altas de sustrato la
velocidad
es
independiente
de
la
concentracin de sustrato, debido a que no
hay ms enzima que lleve a cabo la reaccin.
La reaccin a concentraciones altas de
sustrato se llama reaccin de orden cero y
tambin se representa como una lnea recta,
pero con pendiente casi igual a cero.

El trmino cintica enzimtica implica el

estudio de la velocidad de una reaccin
catalizada por una enzima y los efectos que
pueden tener varios factores como los
inhibidores. Uno de los principales estudios
que se realizan en una enzima es medir el
efecto en la velocidad de la reaccin cuando
se modifican las concentraciones del sustrato
de la enzima y se mantienen constantes la
concentracin de enzima, el pH, la fuerza
inica del medio, la temperatura, entre otros.
Tanto en una reaccin catalizada por una
enzima como en una reaccin qumica, se
espera que la velocidad de la reaccin de
conversin de sustratos a productos, sea
directamente proporcional a la concentracin
de los reactantes que participan en la
reaccin, es decir si se duplica la
concentracin de cualquiera de los sustratos
la velocidad de la reaccin tambin se
duplica.
A una reaccin as se denomina reaccin de
segundo orden y se representa como una
lnea recta con pendiente positiva y diferente
de cero. Pero en una reaccin que es

En resumen, en una reaccin catalizada por

una enzima la variacin en la concentracin
del o los sustratos presenta diferentes
rdenes de reaccin. Para un gran nmero
de enzimas la grfica que se produce se
puede describir mediante la expresin
matemtica de una hiprbola rectangular.
Como en cualquier expresin matemtica se
expresan en ella la relacin entre las
variables junto a 1 o ms constantes. El
trabajo pionero de Michaelis y Menten y
Bringgs y Haldane llev a describir la
ecuacin de la hiprbola rectangular, ahora
conocida como ecuacin de MichaelisMenten, con ella es posible predecir el
comportamiento de la enzima en condiciones

experimentales diferentes. Entonces, la

ecuacin se describe as, las dos variables
de la ecuacin son la velocidad (v) y la
concentracin de sustrato (s). Mientras que
las dos constantes son la Km y la Vmax. La
Km es llamada la constante de MichaelisMenten. El valor de Km de una enzima para
un sustrato especfico es la concentracin del
sustrato a la cual la velocidad de la reaccin
es la mitad de la velocidad mxima. La Vmax
es la velocidad terica mxima de una
reaccin. A concentraciones muy altas de
sustrato el valor de la velocidad se aproxima
al de la velocidad mxima de la reaccin,
pero nunca se llega a sta. Los valores de
Km y Vmax son caractersticos de una
enzima,
aunque
dependen
de
las
condiciones en las que se llev a cabo la
reaccin, ya que hay que recordar que la
enzima es una protena que responde
modificando su estructura y carga elctrica
cuando los componentes de la solucin
cambian.
Una manera para obtener los valores de Km
y Vmax de una enzima tambin llamados
parmetros cinticos de una enzima, es
graficando los valores de velocidad contra la
concentracin de sustrato. Este mtodo tiene
la desventaja de que se grafica una curva y
no una lnea recta por lo que la interpolacin
es difcil. Otra manera, es la de utilizar alguna
de las expresiones matemticas que
producen una lnea recta como son la de
Eadie-Hosftie, la de Hanes o la ms popular
la de Lineaweaver-Burk. Las formas lineales
de la ecuacin de Michaelis-Menten son
expresiones matemticas simples y aunque
cada una tiene sus problemas de
interpretacin son tiles para obtener los
valores de Km y Vmax.
Una de las formas de regulacin de la
actividad de una enzima es a travs de
molculas que disminuyen su velocidad de
reaccin, inhibidores. Los inhibidores pueden
encontrarse de manera natural en las clulas
para controlar la velocidad de una reaccin
metablica, o bien pueden ser compuestos
sintticos que se utilizan como herramientas
experimentales para el estudio de las
reacciones enzimticas. Muchos compuestos
txicos como antibiticos, pesticidas o

herbicidas son inhibidores de enzimas que

son responsables de reacciones vitales para
la clula.
La interaccin de un inhibidor y la enzima no
es siempre la misma, ya que depende de la
naturaleza qumica del inhibidor, as como de
la reaccin qumica que cataliza la enzima.
Para dilucidar el tipo de interaccin entre
ambas molculas se recurre a determinar el
efecto del inhibidor en las constantes
cinticas de la enzima.
Inhibidores competitivos. Son molculas que
tienen una similitud estructural y qumica al
sustrato de la enzima. Debido a lo anterior el
inhibidor se puede unir al sitio activo de la
enzima. Pero como el inhibidor no es idntico
al sustrato, la enzima no es capaz de
convertir el inhibidor a producto. El inhibidor
simplemente bloquea el sitio activo, por regla
no es posible que tanto el inhibidor como el
sustrato se encuentren al mismo tiempo en el
sitio activo. Si se adiciona ms sustrato y el
inhibidor es reversible, el aumento en la
concentracin de sustrato reduce la
inhibicin. El inhibidor afecta exclusivamente
el valor de la Km de la reaccin catalizada
por la enzima.
Inhibidor no competitivo. El inhibidor no se
une al sitio activo de la enzima sino a un sitio
alejado del sitio activo y ocasiona un cambio
conformacional en el sitio activo de la
enzima. Un inhibidor no competitivo puro es
aquel en el que slo se altera la capacidad
de unir al sustrato. La mayor parte de los
inhibidores son inhibidores mixtos es decir no
slo se afecta la unin del sustrato sino
tambin la conversin del sustrato a
producto. Debido a lo anterior, los inhibidores
mixtos alteran tanto el valor de la Vmax como
el de la Km de la enzima.
Inhibidor acompetitivo. Es un inhibidor que no
es capaz de unirse a la enzima libre, es decir
slo se une al complejo Enzima-Sustrato. Lo
anterior puede deberse a que la unin del
sustrato expone o crea sitios de acceso o
unin para el inhibidor, en el o fuera del sitio
activo. Una vez que el inhibidor se une la
enzima se previene la formacin de producto.

El inhibidor acompetitivo altera tanto la Km

como la Vmax de la enzima. Sin embargo, a
diferencia de la grfica que se produce con
un inhibidor de tipo no competitivo mixto, las
curvas a diferentes concentraciones de
inhibidor son paralelas en este ltimo.
El Molibdato de Sodio (Na2MoO4*2H2O). El
in Molibdato junto con el vanadato son

potentes
inhibidores
frecuentemente
utilizados en la caracterizacin de Fosfatasas
(Gellatly et al. 1994; Bozzo et al , 2002.)
Generalmente,
los
metales
pesados
disminuyen
la
actividad
porque
desestabilizan la conformacin nativa o
desactivan los residuos del centro activo.Sin
embargo pocos metales se han identificado
como activadores enzimticos.

2. Materiales y Mtodos

Preparar
curva
patrn

Leer a 415
nm

Graficar

Preparar
segn tabla

Leer a 415
nm

Obtener el
tiempo ptimo

Una vez fijado el

tiempo, probar con
distintos pH

Medir a 415 nm

Obtener el pH
ptimo en el que
opera la enzima

Prepara ensayos
para encontrar la
temperatura ptima

Con los parmetros

ptimos de pH, tiempo
y temperatura prepara
ensayo para ver el
efecto del sustrato

Por tlimo adicionar

inhibidor a
diferentes
concentraciones de
sustrato

leer a 415 nm

leer a 415 nm

leer a 415 nm

Obtener temperatura
ptima a un timepo
y pH especficos

Graficr efecto del

sustrato

Obtener constantes
y tipo de inhibicin

Resultados:

Determinacin de t, T y pH
Grafica 1: Curva patrn del producto que se
formar en las pruebas posteriores

Grafica 3: Determinacin de pH ptimo para

la enzima con diferentes amortiguadores.

Curva patrn de p-nitrofenol

0.8

Efecto de pH sobre la velocidad

0

0.6

Abssorbencia

0.4

f(x) = 6981.43x + 0.01

R = 1

0
0

0.2

Velocidad (M/min)

0
0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Concentracin p-nitrofenol (M)

10

11

pH
Los amortiguadores usados fueron TRIS pH 7-9;
Glicina pH 9-10.4; carbonatos pH 10.4-11.5. El pH
ptimo result ser el correspondiente a glicina pH:
10.4

Grafica 2: Determinacin del tiempo

apropiado para realizar pruebas posteriores.
Progreso de la reaccion enzimatica
0.4
f(x) = 0.01x + 0.01
R = 0.97

0.3

Absorbencia

Grafica 4: Determinacin de la temperatura

ptima de la enzima.

0.2
0.1
0
0

10 15 20 25 30 35

Tiempo (min)
Se tomaron 20 min como tiempo adecuado ya que despus de
dicho tiempo se empieza a observar la tendencia de la absorbencia
a volverse constante.

12

Efecto de la temperatura
0
0

Velocidad (M/min)

0
0
0
270 280 290 300 310 320 330

Temperatura (K)
La velocidad disminuye despus al superar los
37C (310K), por lo cual se decidi que sta es la
temperatura ptima.

Determinacin de Km y Vmax
Graficando la velocidad contra la
concentracin de sustrato se obtiene una
grfica de tipo Michaeliana cuya funcin
se describe mediante la ecuacin:

V=

VmaxS
S+ Km

Grafica 5: Efecto de la concentracin de

sustrato sobre la velocidad.
Representacion de Michaelis-Menten
0
0
0

Velocidad (M/min)

0
0
0
0

Sustrato (M)
La velocidad aumenta conforme aumenta la
concentracin de sustrato pero hasta cierto punto
cuando la velocidad se empieza a mantener
constante, indicando el lmite de capacidad de la
enzima, es decir la Vmax.

Con la grfica 5 es difcil y poco exacto

determinar tanto la Vmax como Km, por
esta
razn
se
recurrir
a
la
representacin de Lineweaver Burk que
sirve para linealizar la
ecuacin de
Michaelis-Menten, quedando de la
siguiente manera:

Km
1
1 Vmax
1
=
+
V
S
Vmax

Posteriormente podrn calcularse los

parmetros Vmax y Km con las
siguientes ecuaciones:

Vmax=

1
b

Km=bm=

Km
b
Vmax

Para calcular km y Vmax aparentes se

usar el modelo de lineweaver burk y
para determinar el tipo de inhibidor del
que se trata.
Grafica 6: Representacin lineal de la
ecuacin de Michaelis-Menten
Grafica 8: Evaluacin del tipo de inhibidor
utilizado

Representacin de Lineweaver Burk

12

Efecto de inhibidor

10
8

1/V (min/M)

700000

600000

f(x) = 26.13x + 407604.47

500000
R
= 0.8

2
0

f(x)
=
2000
4000
6000
R = 0
1/S (1/M)

400000

8000

1/V (min/M)

300000
200000

Usando los valores obtenidos de la regresin se obtuvo que

Vmax= 2.14 x 10

M/min;

Km=9.28 x 103 M

Despus de evaluar el inhibidor se

obtuvo lo siguiente:
Grafica 7: Comparacin de la velocidad con
y sin inhibidor
Efecto de inhibidor molibdato de sodio
0
0
0

Velocidad (M/min)

0
0
0
0

0 0 0 0 0 0 0 0
S (M)
Lnea naranja: sustrato sin inhibidor. Lnea azul:
sustrato + inhibidor, se omiti una medicin que
sala de la tendencia.
Se observa clara disminucin de la velocidad de
reaccin enzimtica, sin embargo es difcil
determinar si se trata de inhibidor competitivo o

100000
0

-5000

f(x)
0 =
R = 0
1/S (1/M)

5000

Se eliminaron puntos de ambas graficas que

afectaban la correlacin lineal de los datos asi como
la pendiente con la cual resultaban valores de
1/Vmax negativos.

Sustrato
+inhibido
r
m

423.01

455748

Vmax
(M/min)
km (M)

Sustrato
sin
inhibidor
m

b
Temperatura(K
2.1942x10^Vmax
ap
)
06
(M/min)
277.15
0.00092816
km ap (M)
293.15
6

Tabla 1: Evaluacin y comparacin de Km y

Vmax al agregar inhibidor

42,367
400716
velocidad
2,49553x10^
(M/seg)
-06
8.51465E-10
0.00010573
2.16209E-08

303.15

2.3292E-08

310.15

3.04538E-08

318.15

1.9711E-08

323.15

4.55176E-09

No hubo variacin significativa de la

Vmax, sin embargo, parece que Km tuvo
LNTabla
K
1/T usados
una
mayor de Arrhenius.
3: Valores
para la Ecuacin
modificacin, lo
-20.884062 0.003608154
cual indica que
-17.649608 0.003411223 podra tratarse
una
-17.575158 0.003298697 de
inhibicin
de
-17.307055 0.003224246
tipo competitiva.
-17.742088

0.003143171

-19.207752

0.003094538

Para el clculo
de la Energa de
activacin (Ea)
se
utilizaron
los
resultados
correspondientes a la evaluacin del
efecto de la temperatura y la ecuacin de
Arrhenius, la cual se presenta a
continuacin:

ln K=

Ea 1
+ ln A
R T

Donde:
k: constante de velocidad de la reaccin.
A: factor de frecuencia o factor
preexponencial. Es un ndice relacionado
con la frecuencia de las colisiones entre
las molculas de reactivos y sus
unidades dependern de las de k.
Ea: energa de activacin de la reaccin,
normalmente dada en kJmol-1
R: constante de los gases ideales. Si Ea
viene dada en kJmol-1, su valor es
8,3110-3 kJmol-1K
T: temperatura, en kelvin

Se calcul primero la concentracin y la

cantidad
de
producto
por
cada
temperatura evaluada, utilizando la curva
de calibracin:
Tabla 2:
producto.

Concentracin

cantidad

de

Se calcul la velocidad dividiendo la

concentracin entre 20 minutos (1200

Absorbanc Concentrac Cantidad

ia
in (M)
(mol)
0.013
1.02176E-06 2.5544E10
0.187
2.5945E-05 6.48626E09
0.201
2.79503E-05 6.98759E09
0.261
3.65446E-05 9.13614E09
0.171
2.36532E-05 5.91331E09
0.044
5.46211E-06 1.36553E09
segundos), se calcul el logaritmo natural
de esta velocidad y se grafic contra el
inverso de la temperatura.
Ecuacion de Arrhenius
0
-5

Ln K

-10
-15
-20

f(x) = - 9330.33x + 13.23

R = 0.85

-25

1/T

Grafica 9: Ecuacin de Arrhenius

A partir de la ecuacin obtenida con el grfico de
las temperaturas en las que es activa la enzima se
calcul la Ea, que result ser de 77.8 kJ/mol.

Tabla 4: Resultados grupales

Eq
.

t(mi
n)

20

15

20

20

15

15

p
H

T(
C)

Ea
(KJ/mo
l)

Vmax
(M/min
)

Km
(M)

10,
4
10,
4
10,
4
10,
4
10,
4
10,
4

45

15.59

45

45

34603.
7
7,78E+
01
0.46

37

17,74

0.0004
8
1,60E03
9,28E03
1,06E04
0,33

45

29,079
69

2,33E03
5,77E06
2,19E04
1,54E06
1,67E06
7,20E03

37

7,30E03

Vmax
ap
(M/min
)
3,97E03
1,56E06
2,50E+
06
4,59E06
1,77E03
5,40E02

Para todos los equipos result ser una

inhibicin competitiva.
ANALISIS DE RESULTADOS:
Las condiciones ideales de temperatura y
pH que se determinaron desde el inicio
eran
fundamentales
para
obtener
resultados confiables en los parmetros
Km y Vmax y que de esa forma
asegurbamos un ptimo rendimiento de
la enzima. Las temperatura ideal a las
que se llev a cabo el experimento
coincide con la del cuerpo humano
(37C) que es donde se encuentra
presente esta enzima y como su nombre
lo dice, funciona mejor a un pH alcalino
(10.4) sin embargo el medio no puede
ser demasiado bsico ya que su
actividad disminuye como se observa en
la grfica 3.
El molibdato de sodio desde un principio
se sospechaba que fuera un inhibidor
competitivo ya que su estructura tiene
parecido con el sustrato de la enzima el
cual
es
el
ion
fosfato,
independientemente de la molcula que
est desfosforlandose. Ambos tienen 4
oxgenos con estructura tetradrica y un
tomo central.

km ap
(M)

1,25E03
3,40E04
1,06E04
2,47E03
0,52
5,40E02

Los inhibidores competitivos tienen la

caracterstica
de
ser
parecidos
estructuralmente al sustrato de la
enzima, a diferencia de los no
competitivos, los cuales se unen de
manera covalente al sitio activo de la
enzima, sin necesidad de competir por
ste; un inhibidor de este tipo provocara
una disminucin en la velocidad mxima
de la enzima ya que seran menos la
enzimas disponibles para catalizar la
reaccin.

ANALISIS
GRUPALES

DE

RESULTADOS

A partir de los datos grupales es posible

observar que hubo coincidencia entre los
parmetros escogidos por los equipos en
cuando a tiempo, temperatura y pH, lo
cual es indicativo de que los resultados
deban variar poco. En efecto, si bien los
valores numricos no son los mismos
debido a la variacin que el mismo
experimentador causa, los valores de la
Vmax, la Vmax ap, la Km y la Km ap
estn dentro del mismo orden de
magnitud por lo que no hay tanta
variacin. E el clculo de la Ea, los valore
obtenidos varan ms, sin embargo, esto
puede venir del mismo proceso

experimental o de la forma en que se

calcul este parmetro. Al final de la
prctica, todos los equipos concluyeron
en que no hay diferencia significativa
entre las Vmax y Vmax ap y si la hay
entre Km y Km ap, por lo que se trata de
una inhibicin competitiva.

CONCLUSIONES:
A pesar de pequeas variaciones
obtenidas por otros equipos, podemos
concluir que el inhibidor molibdato de
sodio es un inhibidor de tipo competitivo.

REFERENCIAS:

Mdhealth.com(2015)
Lactate
Dehydrogenase (LDH) Revisado
el 3 de octubre de 2015 [URL:
http://www.mdhealth.com/LDH.html]
Stuart Ira, Fox (2011) Fisiologa
Humana, 12 Edicin Mxico:
McGraw-Hill, p.111
Kinga Duczmal, Magorzata
Darowska, Ewa D. Raczynska,
Spectral (DFT-IR, FT-IR and
UV)
similarities
and
differences
between
substrate
(pyruvate)
and
inhibitor (oxamate) of lactic
dehydrogenase (LDH), 2004.