Universidad Andrs Bello

Facultad de Ciencias Biolgicas

Laboratorio de Biologa Celular
Profesores:Fraccionamiento
Vernica NochesSubcelular

Organizacin
subcelular

Integrantes: Josefina Castillo

Javiera Olivares
Marcia Suarez
Seccin: 6
Bio131

Introduccin
Las clulas que existen hace muchos aos. Antiguamente, existan clulas parecidas a las
que hoy conocemos como eucariontes, pero con los aos han ido evolucionando, siendo la
eucarionte la presente en todos los seres vivos. (2)
Las clulas eucariontes presentan diversos organelos, los cuales cumplen funcionen
especificas dentro de ella. Los principales organelos son: Ncleo, que contiene toda la
informacin gentica. La membrana plasmtica, que envuelve a toda la clula con una
bicapa de fosfolpidos, en los cuales se encuentras protenas, para la comunicacin celular,
Mitocondrias, las cuales realizan la sntesis de ATP y llevan a cabo la respiracin celular.
Retculo endoplsmico rugoso, el cual presenta ribosomas en su estructura, donde las
protenas, terminan su proceso de traduccin y el retculo endoplsmico liso, en el cual se
realiza la sntesis de lpidos. Aparato de Golgi, en el cual las protenas terminan su
maduracin, siendo modificadas en el A. de Golgi, y son exportadas a los lugares en donde
deben realizar su funcin. Lisosomas, que mantienen aislados componentes txicos para las
clulas. Los peroxisomas, en el cual se produce el perxido de hidrogeno durante la
oxidacin de molculas, los peroxisomas mantienen aislado esta molcula, que es toxica
para la clula. Y el citoesqueleto, que le da la forma a la clula, adems de ser el sostn que
posee la clula. (2)
Todos estos componentes pueden ser separados mediante el proceso de fraccionamiento
sub-celular, que posee dos etapas: Homogenizacin y centrifugacin. (3A)
La homogenizacin corresponde a utilizando un homogeneizador, se rompen las clulas,
siendo filtrado, obteniendo un Homogenizado crudo (HC). Este HC debe permanecer a baja
temperatura, y en un ambiente similar al de la clula, luego es sometido a diversas
centrifugaciones, a distintas velocidades, que hacen sedimentar los componentes ms
pesados al fondo de un tubo de ensayo, separando los distintos organelos de esta forma,
obteniendo un pellet, que es el sedimento, y el sobrenadante que se vuelve a someter a
centrifugacin. (3B)
Sin embargo, el proceso de fraccionamiento, no entrega un 100% de pureza, por lo que no
se sabe con certeza lo que se obtiene en los tubos, para esto se utilizan los marcadores
moleculares, los cuales revelan la presencia de organelos al unirse a algo propio de ese
organelo.
Hiptesis
A travs del fraccionamiento celular se puede diferenciar los componentes dentro de cada
fraccin, y a travs de reactivos, reconocer los organelos.
Objetivos:
Realizar, paso a paso, las diferentes etapas de la tcnica de fraccionamiento celular.
Utilizar marcadores moleculares para identificar los componentes de las distintas fracciones
celulares.
Visualizar mediante microscopia los componentes de una de las fracciones.

Materiales y Mtodos
Actividad I: Se cort un trozo de hgado de Pollo, y con un bistur se trozo en partes ms
pequeas dentro de un vaso precipitado, con 100 ml de Solucin salina al 0,9% para
mantener a los organelos en ptimas condiciones, y luego se utiliz un homogeneizador
mecnico ULTRA TURAX, para triturar y homogenizar la muestra, siendo filtrada a travs
de una gasa, para que la muestra no estuviera contaminada con restos ms grandes de
Hgado, obteniendo un Homogenizado crudo (HC)
Con 10 ml de HC, siempre a 4C, para que no se activen proteasas, y fosfolipasas, del cual
se guard 1ml del homogenizado crudo en un tubo eppendorf, para utilizarlo despus.
Los otros 9 ml restantes de HC del vaso precipitado se colocaron en un tubo Falcon, para
centrifugarlos a 2.500 rpm durante 5 min, de donde se obtuvo un Pellet 1 (P1) y un
sobrenadante (SN1). Luego del centrifugado se traspas el SN1 a un nuevo tubo Falcon,
aadindole 1 ml de suero al P1 para resuspenderlo con una pipeta pasteur. Este P1 se
guard en hielo para ser analizado despus.
Del pellet 1, que se encontraba en hielo, se extrajeron dos gotas, que se colocaron en
portaobjetos, aadindole a una de las muestras una gota azul de tripn, se le coloc un
cubreobjetos siendo observada al microscopio a 4x, 10x y finalmente en 40x, la cual
finalmente se dibuj. La segunda gota, se coloc en un portaobjetos, y se le adiciono un
cubreobjetos, se observ al microscopio en 4x, 10x, y 40x, siendo finalmente dibujada en
40x.
A dos tubos eppendorf de 2ml se le agreg 2 ml del sobrenadante 1, para ser centrifugados
a 13.000 rpm por 20 min, Luego se traspas el sobrenadante 2 utilizando una micropipeta
de 1 ml y fue traspasada a un tubo eppendorf de 1,5 ml. El Pellet 2 fue resuspendido en
500 l de suero fisiolgico, dejndolo en hielo.
Para reconocer las estructuras que se encontraban en las distintas fracciones, mediante los
marcadores moleculares, se marcaron 6 tubos eppendorf de 2 ml, aadiendo homogenizado
crudo, Pellet 1, sobrenadante 1, pellet 2, sobrenadante 2 y agua destilada, en un volumen de
400l de cada uno, y aadindoles 400l de Succinato 0,1 M y 100 l de Azul de Metileno.
Luego se agit cada tubo, y se le agregaron 200 l de vaselina lquida, para que no haga
contacto con el aire, sin ser agitados. Finalmente se colocaron a un bao termorregulador a
37C por 10 minutos. Se observ y se anotaron los resultados.

Resultados

A.2.1. Tabla 1) Detectar mitocondrias a travs de reaccin de SDH en las fracciones

TUBO

MUESTRA

Succinato
0,1 M

Azul de
Metileno

Agua
Destilada

Reaccin
(-) o (+)

400 l de
Agua
Control

400 L

100 L

400 L

(-)

400l de
HC

400 L

100 L

400 L

(+)

400 l de
P1

400 L

100 L

400 L

(+)

400 l de
SN1

400 L

100 L

400 L

(+)

400 l de
P2

400 L

100 L

400 L

(+)

400l de
SN2

400 L

100 L

400 L

(-)

Observaciones
La reaccin es negativa y
de color azul intenso dado
que es una muestra
control.
Se aprecia un color verde
dado que, en el
homogenizado hay clulas
enteras con ADN y
poseen mitocondrias.
La reaccin es positiva con
un color verde, porque
existe una alta presencias
de clulas enteras que
contienen mitocondrias y
ADN.
La muestra tiene una
coloracin verdosa porque
se mantiene la presencia
constante de mitocondrias
Se observa un color verde
con aspecto ms denso,
ya que, decantan los
componentes ms
pesados de la clula como
lo son las mitocondrias.
La muestra es de
coloracin azul, porque
contienen componentes
ms pequeas , sin un
nivel energtico tan alto
como lo son mitocondrias

En la tabla 1: Se concluy que las muestras que no hubo reaccin fueron las (-) siendo el control y
SN2, que casi no posee ADN, ni mitocondrias , sin embargo las muestras que si reaccionaron a los
distintos componentes de las fracciones subcelulares son las (+), lo que nos da como resultados
que si haba presencia de mitocondrias dando un color mas verdoso.

A.2.Figura I. Observacin microscpica de las fracciones

Fraccin Nuclear de Hgado de pollo

Microscopia ptica de campo claro
Aumento ocular: 10X
Aumento objetivo: 40X
Aumento Total: 400X
Tipo de muestra: Fresca, temporal
Tincin: Sin tincin
Observaciones: En la muestra de Hgado de pollo no
se aprecian los componentes de la fraccin, dado que
no posee tincin y no hay nada que marque las
estructuras presentes.

Figura 2: Observacin microscpica de la fracciones

Fraccin Nuclear de Hgado de pollo
Microscopia ptica de campo claro
Aumento ocular: 10X
Aumento objetivo: 40X
Aumento Total: 400X
Tipo de muestra: Temporal y fresca
Tipo de tincin: Azul de tripn
Observaciones: En la muestra, gracias a la
tincin de Azul de Tripn, se logran
identificar concretamente los ncleos de la
clula, dado que la tincin azul de tripn
marca el ADN dentro de esta.

Discusin

En la observacin microscpica de las fracciones del fraccionamiento celular, se sac una

gota suspendida de Pellet 1 (P1) y luego, se observ en el microscopio, usando para ello el
objetivo 40X. Al observar esta muestra no se logr identificar ningn componente dentro
de ella solo se observ un color piel, debido al hgado de pollo. Luego se tom otra gota de
P1, y se le agreg una gota de azul de tripn, se observ en el microscopio usando para ello
el objetivo de 40X. Se logr observar un fondo azul claro con puntos pequeos de color
azul intenso.
Esto resultados se obtuvieron debido al azul de tripn, que se le conoce como un colorante
bsico, que se une al ADN localizado dentro de los ncleos, y que los colorantes bsicos se
unen a ella cuando se encuentra ionizada. En el primer caso, al no tener azul de tripn, nada
marcaba al ADN, por lo que, no se podan ver los ncleos con claridad, que al no estar
marcados con el microscopio ptico no se logra identificar. En cambio en el segundo caso,
los puntos azules, si correspondan a los ncleos, ya que, en esta muestra si contena azul de
tripn, por lo que, su ADN fue marcado logrando ver los ncleos.(1)
Para poder evaluar el fraccionamiento subcelular mediante marcadores moleculares,
primero se colocaron en distintos tubos de ensayo muestras obtenidas, a travs, de una
centrifugacin diferencial, la cual separa la muestra dependiendo del tamao de cada
componente celular del hgado de pollo, el cual fue tratado con un buffer de suero salino
0,9% cloruro de sodio, para evitar que las clulas se reventaran, adems se homogeneizo
con el Ultra-Turax, para obtener un homogeneizado total, que es filtrado para que este no
este contaminado, obtenindose el homogeneizado crudo (HC). Parte de este HC es
guardado, y la otra parte centrifugada 2 veces a distintas velocidades y distintos tiempos
para obtener el fraccionamiento celular.(1)
Luego de este proceso las muestras de 1ml que fueron guardadas para evaluar, que eran
Homogeneizado crudo de hgado de pollo (HC), Pellet 1 (P1), sobrenadante 1 (SN1), pellet
2 (P2), sobrenadante 2 (SN2) y por ltimo, un control de agua oxigenada.
A cada uno de esos tubos se les agreg la misma cantidad de 400 l de succinato 0,1M,
100l de azul de metileno, 400l de agua oxigenada y 200l de vaselina, la cual evita que
la muestra sea afectada por el oxgeno que se encuentra en el ambiente. Todas las muestras
tenan un azul intenso debido al azul de metileno aplicado, luego fueron sometidas a un
bao termorregulado de 37C durante 10 minutos.(1)
Se pudo observar, que despus del proceso anterior las muestras HC, P1, SN1 y P2 pasaron
del color azul intenso a un color verde, y las muestras de agua oxigenada y SN2 se
mantuvieron su color azul intenso.
La separacin de los distintos componentes celulares se permiten diferencian por los
distintos tipos de organelos, que contienen distintas enzimas o molculas que lo
caracterizan ya que no se encuentran en las distintas separaciones y que con colorantes
bsicos se pueden identificar.(5)
El azul de metileno, es uno de los tipos de colorantes que sirven para definir qu tipo de
componentes existen dentro de la muestra, ya que, al estar en un estado oxidado tiene un
color azul pero al ser reducido este se transforma a un color incoloro, es decir, se destie.
Adems que al estar reducido, se puede fcilmente volver a oxidar, debido al oxigeno que
se encuentra en el aire, por eso se recomienda cubrirlo con algn aceite mineral o vaselina
liquida.(4)

Por otra parte, el Succinato al momento de entrar en contacto con la enzima Succinato
deshidrogenada (SDH), cataliza la deshidrogenacin, especifica de Succinato
transformndolo a Fumarato, junto con la liberacin de dos protones y dos electrones
durante el ciclo de krebs.(5)
Las mitocondrias, se identifican por SDH complejo proteico ligado a la membrana interna
mitocondrial que interviene en el Ciclo de Krebs.(6)
Dado a esto, los resultados que cambiaron de color azul a verde fue debido a que al
agregarle Succinato y azul de metileno, las muestras que contenan mitocondrias
produjeron la reaccin de que del Succinato, fuera catalizado por SDH formando Fumarato
junto con la liberacin de dos protones y dos electrones, que provocan una reduccin del
azul de metilo el cual fue desteido formando el color verde. Esto quiere decir que dentro
de HC, P1,SN1 y P2 contenan mitocondrias.(1)
Por otra parte, las dos muestras que no reaccionaron se debieron que primero, el agua
oxigenada, es solo una muestra blanca que sirve como control, para poder compararla con
las otras muestras y ver si reaccionaron o no. La otra muestra que no reacciono fue el SN2,
que por lo mencionado anteriormente no contena mitocondrias. Esto se debe a que al
momento de la centrifugacin diferencial, se separan las molculas por su peso, por lo cual
las mitocondrias al tener un coeficiente de sedimentacin alto, (es uno de los ms pesados)
y no es hasta centrifugar el SN1 a 13000rpm, durante 20 minutos, que se separa en un pellet
2 que contiene las mitocondrias y un SN2 el cual al ser separado de la sedimentacin P2
quedando libre de mitocondrias.(1)

Conclusin

Se pudo concluir, que los objetivos de este laboratorio si fueron logrados, ya que, el
fraccionamiento celular obtenido, a travs, de los distintos pasos como la homogeneizacin
y la centrifugacin del hgado de pollo fueron exitosos, ya que, se logr poder seguir todos
estos pasos para la obtencin del fraccionamiento celular. Al momento de identificar las
distintas fracciones todas dieron concordes con lo que previamente fue visto en la literatura.
Al momento de ver una de las fracciones en el microscopio que fue el pellet 1 se logr
visualizar sus componentes al ser marcados con una tincin, que en este caso eran los
ncleos.

Bibliografa
Acceso a pginas de internet a travs de: https://www.google.cl
1) Universidad Andrs Bello, Gua de Laboratorio N5 organizacin subcelular,
Laboratorio de Biologa Celular, BIO131, 2015.
2) Alberts, Bray, Hopkin, Johnson, Lewis, Raff,Roberts,Walter, Introduccin a la Biologa
Celular.(2011). Panamericana, 3 edicin. Espaa. Pg 26-27
3) Lodish, Berk, Matsudaria, Kiser, Morigerarse, Scooter, Zipursky, Darnell, Biologa
Celular y Molecular.(1986). Editorial Panamericana, 5 Edicin,United States of America.
Pg. 145
3B) Lodish, Berk, Matsudaria, Kiser, Morigerarse, Scooter, Zipursky, Darnell, Biologa
Celular y Molecular.(1986). Editorial Panamericana, 5 Edicin,United States of America.
Pg. 207
4) http://quimica.laguia2000.com/conceptos-basicos/indicador-redox
5)http://es.scribd.com/doc/177564133/Bioquimica-Final#scribd
6)http://es.swewe.net/word_show.htm/?261814_2&Succinato_deshidrogenasa