26.

METODE DE STUDIU I DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC

Diagnosticul infeciilor virale trebuie s fie rapid i s identifice noile virusuri, multe necultivabile sau greu
cultivabile.
Metodele de studiu i de diagnostic sunt directe i indirecte.
26.1. Metode directe
1. Examenul la microscopul electronic: metoda coloraiei negative, microscopia electronic n transmisie, imunoelectrono-microscopia, pentru studiul morfologiei virale i al etapelor ciclului de multiplicare.
2. Examenul histo-citologic la microscopul optic: observarea efectului citopatic (liz celular, vacuolizare,
sinciii, incluzii).
3. Izolarea virusului n culturi de celule, n oul embrionat de gin sau prin inocularea animalelor de laborator.
26.1.1. Metode microscopice
Microscopia electronic (ME) este singura metod direct de studiu care vizualizeaz virusurile i antigenele
virale. Metoda este folosit pentru diagnosticul gastroenteritei virale, ai crei ageni etiologici se multiplic lent sau
nu se multiplic in vitro, pentru analiza leziunilor tegumentare produse de virusurile herpetice, pox i papiloma i
pentru studiul virusurilor care produc focare epidemice. Metoda a avut succes, n special pentru examinarea
materiilor fecale, a leziunilor tegumentare, a concentratelor de urin, n care s-au evideniat virusuri care se cultiv
cu dificultate: rota-, astro- i alte virusuri mici sferice. Se poate folosi, de asemenea, pentru identificarea virusurilor
izolate n cultur.
Pentru examinarea preparatelor la ME se folosesc dou metode :
- metoda coloraiei negative: suspensia viral se adsoarbe pe gril de Cu i se coloreaz cu un colorant electronodens (acid fosfotungstic sau acetat de uranil). Colorantul coloreaz fondul grilei, dar nu ptrunde n particulele
virale intacte, care se pot astfel observa prin colorare negativ;
- examinarea seciunilor tisulare sau a depozitului celular la microscopul electronic cu transmisie (TEM).
Celulele sau esutul se fixeaz cu glutaraldehid, se coloreaz cu tetraoxid de osmiu i se includ n rin Epoxy.
Seciunile ultrafine obinute la microtom se examineaz la TEM. Metoda are avantajul c detecteaz infecii mixte
(comune n celulele epiteliului intestinal), ofer un diagnostic rapid pentru pentru gastroenterita cu rotavirusuri i
pentru infeciile herpetice ale tegumentului.
Dezavantaje: metoda este laborioas i nu permite prepararea unui numr mare de probe pentru ME; frecvent
apar artefacte i necesit expertiz pentru interpretarea imaginilor; este mai puin sensibil dect testele serologice
pentru evidenierea antigenelor virale sau dect metoda izolrii virusului. Pentru detectarea virusului prin metoda
ME sunt necesare 103 106 particule virale/ml.
Sensibilitatea metodei crete prin centrifugarea suspensiei virale pe grilele de Cu, prin concentrarea virusului
prin metoda ultrafiltrrii* sau prin metoda imuno-electrono-microscopiei (IEM). In metoda IEM, grila de Cu se
tapeteaz cu anticorpi specifici antivirali, cu rolul de a concentra virusul pe gril.
*
Ultrafiltrarea este o metod ce utilizeaz membrane semipermeabile pentru separarea materialelor dizolvate i suspendate pe baza
dimensiunilor. Procesul se desfoar sub aciunea presiunii negative care se aplic probei. Metoda se folosete pentru separarea
macromoleculelor (proteine, polizaharide, lipide, polimeri sintetici) cu dimensiuni mai mici dect dimensiunile porilor membranei,
virusurilor, coloizilor sau pentru concentrarea probelor diluate de acizi nucleici (1-10 nm). Membranele au pori cu diametrul cuprins ntre
0,01-10 m. Ultrafiltrarea nu discrimineaz ntre macromoleculele cu dimensiuni asemntoare i nu se folosete pentru separarea
moleculelor care difer cu mai puin de un factor de 6. Pentru separarea unor astfel de molecule se folosesc tehnicile de cromatografie sau de
electroforez.

Metode histo-citologice. Examenul microscopic direct al probelor colorate histologic sau citologic poate s
ofere indiciul c procesul patologic este determinat de un virus: de exemplu, incluziile nucleare evideniate n
biopsiile de rinichi transplantat de la pacienii cu nefrit interstiial se datoreaz virusului polioma BK;
schimbrile citologice ale epiteliului cervixului uterin asociate infeciei cu HPV; incluziile nucleare n celulele
precursoare eritroide infectate cu parvovirusul B19.
26.1.2. Metode de cultivare a virusurilor
Izolarea virusurilor prin cultivare a stat la baza progresului n virologia clinic.
Condiii de recoltare i transport al probelor. Unele virusuri sunt labile, fiind inactivate n cteva ore. Probele
trebuie pstrate n mediu tamponat i transportate la laborator n cel mai scurt timp, preferabil n aceiai zi. Pentru
perioade mai lungi, probele trebuie s fie pstrate la 4 o. Mediul de transport este mediul pentru culturile celulare,

tamponat, cu adaus 5% ser fetal de viel, antibiotice i ageni antifungici. Probele de urin pot fi plasate n mediu
de transport cu 35% sorbitol.
Prezena virusului n probele clinice se poate demonstra prin inocularea animalelor de laborator, a oulor
embrionate de gin sau n culturi de celule.
Culturile de celule. O varietate de celule pot fi cultivate pe suportul solid de material plastic sau sticl. Este cea
mai folosit metod pentru diagnosticul virologic.
Tipuri de culturi celulare. Cultura primar se obine prin dispersia celulelor din esut, sub aciunea enzimelor
proteolitice (tripsina i colagenaza). Culturile primare sunt diploide i se folosesc pentru producerea vaccinurilor
virale. Culturile de celule n monostrat se desprind cu enzime proteolitice i cu ageni chelatori (EDTA = versen) i
apoi se subcultiv n 2-3 recipiente. Durata de via a celulelor difereniate este limitat i variaz n funcie de
tipul de celule i de originea lor: celulele epiteliale umane pot fi subcultivate de circa 10 ori, iar fibroblastele de 4060 de ori. Aceste culturi se numesc linii celulare.
Culturile celulare pot s derive din esuturile maligne, dar au complement cromosomal heteroploid. Astfel de
culturi au o durat de via nelimitat i se numesc linii celulare continui. Liniile continui au pierdut inhibiia de
contact.
Inocularea probelor adecvate n linii celulare sensibile la virusul din prob, completat cu analiza microscopic
a efectului citopatic (ECP) confer metodei un grad superior de specificitate, care poate fi confirmat prin tehnica
imunofluorescenei.
Cele mai utilizate linii celulare sunt cele de rinichi de maimu, liniile celulare epiteliale umane n cultur
continu i o linie de fibroblaste umane. Inocularea acestor linii permite detectarea majoritii virusurilor
cultivabile de importan clinic: HSV, VZV, CMV, enterovirusuri, virusul respirator sinciial (RSV),
adenovirusuri, parainfluenza, influenza i rinovirusuri.
Cultivarea virusului dintr-o prob clinic aduce dovada prezenei virusului infecios, dar antigenele virale pot
persista perioade lungi de timp, dup iniierea terapiei antivirale. De exemplu, antigenele HSV-2 se detecteaz n
tampoanele genitale un interval relativ mare, dup iniierea terapiei, cnd virusul nu se mai izoleaz.
Metoda izolrii virusurilor n cultur are cteva avantaje:
- ofer posibilitatea examinrii ulterioare, cu privire la sensibilitatea la agenii antivirali sau tipizare;
- ofer informaii epidemiologice, importante pentru sntatea public;
- cultivarea ofer posibilitatea identificrii unor virusuri noi (de exemplu, SARS).
Majoritatea virusurilor umane cunoscute pot fi izolate i cultivate n culturi sau prin inocularea animalelor de
laborator. Izolatele de HSV se multiplic n 3 zile pe fibroblastele umane, dar pentru cele mai multe izolate clinice
timpul necesar exprimrii ECP sau pentru hemadsorbie este de 7-21 zile.
Metoda cultivrii nu se aplic virusurilor gastroenteritei (rotavirusuri etc.), virusurilor hepatitice, EBV, HH6,
7 i 8, HIV, VHB i papiloma.
Coronavirusurile se multiplic puin n culturi celulare i se pot izola n cultur de organe, dei metoda nu se
folosete n mod obinuit.
Perfecionarea continu a tehnicilor de cultivare a celulelor a sporit numrul virusurilor care pot fi cultivate.
Descoperirea IL-2, un factor stimulator al diviziunii limfocitelor, a uurat cultivarea celulelor limfoide, ceea ce a
dus la descoperirea retravirusurilor umane.
Izolarea virusurilor n cultur este metoda cu cea mai larg utilizare pentru diagnosticul virologic.
ECP. Modificrile morfologice ale celulelor infectate se observ fr colorarea celulelor, dar pentru detalii
suplimentare este necesar colorarea histochimic. Coloraia hematoxilin-eozin este cea mai adecvat.
Modificri produse de ECP :
- rotunjirea celulelor: multiplicarea viral induce modificri ale citoscheletului, care duc la rotunjire i eventual
la liza celulei;
- formarea sinciiilor: membranele celulelor adiacente fuzioneaz i rezult celule gigante cu civa nuclei
(virusul rujeolei, VRS, HIV). Celulele sunt unite prin puni citoplasmatice (virusul herpes simplex);
- rotunjirea i agregarea celulelor n aglomerri ciorchine, care se detaeaz de support (adenovirusuri);
- formarea incluziilor: incluziile sunt agregate nucleare sau citoplasmatice de componente ale multiplicrii
virale (fabrici de virus), ce se pot vedea pe preparatele colorate, la microscopul optic. Pot fi incluzii bazofile
sau acidofile.
Pentru identificarea prezumtiv a izolatului, de obicei ECP este suficient. Tipul de celule n care se multiplic
i produce ECP este un indiciu pentru identificarea virusului. De exemplu, HSV se multiplic n numeroase tipuri
de celule, iar CMV, numai n culturi de fibroblaste umane. De aceea, pentru izolare este necesar inocularea probei
n cteva tipuri de culturi celulare.

De obicei, culturile inoculate sunt cele primare de rinichi de maimu, de rinichi uman sau fibroblaste de
embrion uman. Culturile renale pot fi nlocuite cu o linie celular continu (HeLa, Hep-2).
Pentru izolarea virusurilor tractului respirator, culturile inoculate se incubeaz la 32 o sau la 37o. Unele virusuri
orthomyxo- i parainfluenza nu produc ECP evident, dei se multiplic intens. Multiplicarea lor se evideniaz prin
metoda hemadsorbiei: hematiile adugate pe suprafaa monostratului, ader de celulele infectate. Aderena este
mediat de spiculele de HA inserate n membrana citoplasmatic.
Inconvenientul major al izolrii virusurilor n cultur de celule este durata multiplicrii: virusurile se pot
multiplica n 1-2 zile, dar CMV necesit circa 2 sptmni, prea mult pentru utilizare clinic.
Alt inconvenient al metodei izolrii virusurilor const n faptul c succesul depinde de obinerea probei la
momentul optim. Cu ct infecia este ntr-o faz mai timpurie, cu att cantitatea de virus excretat este mai mare i
ansa izolrii virusului crete. Excreia virusului, n general, scade rapid dup ce efectorii RI neutralizeaz virusul.
Alteori (de exemplu, virusurile enterice i CMV), pot fi excretate perioade lungi - sptmni sau luni - dar n aceste
cazuri raportul etiologic cu maladia este greu de stabilit.
Pacienii imunocompromii i copiii infectai congenital elimin virusul pentru perioade lungi sau eliminarea
devine cronic: de exemplu, o mare proporie a acestor copii excret CMV sau virusul rubeolei n urin, prin
secreia faringian sau pe ambele ci, pentru un an. Virusul rubeolei poate fi izolat civa ani dup natere din
cataracte sau din urechea intern a copiilor infectai congenital.
Rolul culturilor celulare convenionale pentru diagnosticul de rutin al infeciilor virale diminueaz, deoarece
multe laboratoare prefer diagnosticul prin detectarea antigenului viral cu anticorpi specifici marcai cu
fluorocromi sau prin detectarea genomului virusurilor de importan clinic (CMV, VZV).
S-au elaborat metode pentru detectarea celulelor infectate cu virus, nainte ca ECP s devin aparent.
Metodologia utilizrii AMC marcai cu fluorocromi combin specificitatea cu posibilitatea detectrii timpurii a Ag
virale. AMC sunt reactivi cu specificitate nalt i au avantajul c pot fi folosii pentru evidenierea antigenelor
specific-virale. AMC au fost utilizai pentru diagnosticul infeciei cu CMV. CMV produce ECP vizibil dup 7-10
zile, dar Ag virale imediat- timpurii (IE) i timpurii (E) pot fi detectate n celulele infectate n 3-6 ore dup infecie,
cu mult nainte de producerea ECP.
Embrionul de gin de 8-11 zile este inoculat i incubat pentru 2-9 zile, durata variind n funcie de virus, de
calea de inoculare. Virusurile se identific prin leziunile pustulare ale membranei corioalantoice, iar pentru testele
de hemaglutinare (HA) se folosete lichidul amniotic sau alantoic.
Multe virusuri se cultiv n oul embrionat, dar metoda este rareori folosit: pentru evidenierea poxvirusurilor i
pentru propagarea ortho- i paramixovirusurilor.
Inocularea animalelor de laborator se folosete numai pentru arbo- i coxsackievirusuri. Unele coxsackievirusuri
de grup A se multiplic greu n cultur de celule, dar se multiplic prin inocularea intracerebral la puii nou nscui
de oarece. Tipul de paralizie poate fi folosit pentru identificarea grupului de coxsackievirusuri.
26.2. Metode indirecte
1. Metode imunologice: detectarea antigenelor virale (utiliznd AMC) sau a anticorpilor specifici (virusurile sunt
imunogene i stimuleaz RI intens) printr-o metod adecvat.
2. Metode moleculare pentru detectarea genomului viral:
- reacia de polimerizare n lan (Polymerase Chain Reaction - PCR);
- hibridizarea cu sonde moleculare specifice pentru o secven int unic, pe preparate citologice/ histologice.
26.2.1. Metode imunologice (serologice)

Metodele imunologice sunt folosite n virologie, cu cteva scopuri:

- pentru a identifica un virus izolat;
- pentru demonstrarea Ag virale ntr-o suspensie sau n celule;
- pentru diagnosticul serologic;
- pentru testarea capacitii imunogene a unui virus.
Proteinele structurale virale, ca i cele sintetizate n celula infectat sunt foarte imunogene i stimuleaz sinteza
anticorpilor. n cursul rspunsului imun primar se sintetizeaz predominant IgM.
26.2.1.1. Evidenierea anticorpilor
Toate infeciile virale sunt nsoite de sinteza Ac, a cror evideniere n infecia primar (IgM) i n
convalescen se face prin urmtoarele metode:

reacia de fixare a complementului (RFC);

hemaglutinoinhibarea;
imunofluorescena;
testul IPI (imunoperoxidazei indirecte);
seroneutralizarea;
contra-imunoelectroforeza (CIEF);
EIA (Enzyme linked immunosorbent assay);
latex-aglutinarea;
western blot (WB);
RIA.

Determinarea IgM specific. IgM este produs timpuriu n rspunsul imun i persist 3-4 luni, iar IgG persist tot
restul vieii. Detectarea IgM este dovada direct a infeciei recente cu un anumit virus. Testele de prim generaie
ale determinrii IgM au fost laborioase pentru c necesit separarea fizic a IgM de celelalte izotipuri. Avnd gr.
mol. mai mare, IgM se poate separa de IgG prin gel-filtrare sau prin centrifugare n gradient de densitate de
sucroz. Fraciile care conin IgM se colecteaz i se testeaz pentru prezena Ac specifici antivirali, prin metodele
IFA sau HAI.
Anticorpii specifici clasei IgM pot fi detectai prin teste imunologice, fr fracionare prealabil, folosind Ac
anti-IgM. Anticorpii anti-IgM sunt imobilizai pe o suprafa solid i se pun n contact cu serul. IgM seric este
captat pe suportul solid. Metoda este mai sensibil i mai simpl, deoarece elimin etapa fracionrii.
Toate metodele de separare a IgM, dar mai ales metoda captrii pe suportul solid, nu fac distincia ntre IgM i
FR (IgM anti-Ig). FR se gsete n serul unui procent mare de persoane adulte i la toi cei cu infecii acute sau
cronice. De aceea, FR se adsoarbe cu IgG agregat, pentru c altfel, rezultatele determinrii IgM vor fi fals pozitive.
Alte tehnici serologice: hemaglutino-inhibarea (HAI), latex-aglutinarea i IF (n special pentru diagnosticul
(EBV). Serul este proba pentru cele mai multe metode serologice, dar secreia salivar se poate folosi pentru
detectarea Ac, n special n studiile de monitorizare la copii. De la pacienii cu infecii ale SNC, se poate testa
lichidul cefalorahidian (LCR) pentru prezena Ac antivirali, iar raportul titrului Ac fa de titrul seric ofer indicii
cu privire la situsul sintezei Ac.
Pentru diagnosticul imunologic sunt necesare 2 probe de ser: una recoltat n faza acut (nainte de ziua a 7-a
dup infecie) i o prob recoltat n convalescen (recoltat la 1-2 sptmni dup faza acut). Cele 2 probe se
testeaz concomitent. Creterea de cel puin 4 ori a titrului de Ac arat c infecia s-a produs cu acel virus.
Metodele imunologice sunt eseniale pentru diagnosticul i monitorizarea aciunii tratamentului asupra evoluiei
infeciilor persistente: anticorpii se detecteaz n infeciile persistente n condiiile multiplicrii virale (VHB, HIV,
VHC).
Metodele serologice au o valoare limitat n diagnosticul infeciilor virale la pacienii imunocompromii, unde
virusul trebuie identificat.
Uneori Ac sunt neutralizani (poliovirus). Multe infecii sunt controlate mai eficient de celulele T, iar detectarea
Ac este o metod cu importan secundar.
Metodele de determinare a Ac nu disting ntre IgG i IgM. Diagnosticul unor infecii virale se bazeaz pe
seroconversie, adic pe creterea semnificativ a titrului Ac ntre proba din faza acut i cea din convalescen (la
interval de 10-14 zile). RFC a fost folosit pe scar larg, dar lipsa de sensibilitate i reactivitatea ncruciat a
multor Ag utilizate n test a limitat utilizarea metodei n laboratorul clinic.
Diagnosticul se poate pune numai dup faza acut a infeciei.
Pentru primele 2 obiective (identificarea unui virus izolat i demonstrarea antigenelor virale n suspensie sau
n celule), se folosete serul specific standard. Pentru obiectivele 3 i 4 (diagnosticul serologic i testarea capacitii
imunogene a unui virus), probele de ser de la pacieni se testeaz pentru prezena Ac, folosind Ag virale cunoscute.
Testele de neutralizare msoar titrul de Ac care neutralizeaz infeciozitatea virusului. Testul const n
diluarea serului i incubarea diluiilor cu o doz fix de virus (de obicei 50% doze infecioase) pentru 1 or la 37 o
sau peste noapte la 4o. Amestecul este inoculat n culturi sensibile. Diluia de ser care inhib multiplicarea virusului
n 50% din culturi este considerat ca fiind titrul neutralizant.
Evidenierea antigenelor virale. Antigenele virale n suspensie (snge, urin, fecale, suspensii tisulare) se pot
demonstra prin testul imuno-enzimatic (EIA), testul latex-aglutinrii sau RIA. In aceste teste, Ac specifici sunt
adsorbii pe un suport solid (granule de plastic, godeuri, particule de latex) i au rolul de a lega Ag din prob. Ag
legat se detecteaz adugnd un Ac specific marcat cu o enzim sau cu un izotop.

Metoda latex-aglutinrii pentru detectarea Ag n faz solid se folosete pe scar larg. Particulele mici de
latex tapetate cu Ac specifici aglutineaz n prezena Ag. Reacia se observ cu ochiul liber. Metoda latex
aglutinrii se folosete pentru diagnosticul infeciei cu rotavirusuri.
Metodele ELISA, EIA.
Principiu. Anticorpul indicator sau Ag este conjugat cu o enzim. Prezena lor se detecteaz prin adugarea unui
substrat care este convertit la un produs colorat, sub aciunea enzimei. Reacia de culoare poate fi nregistrat
vizual sau se msoar spectrofotometric. Enzimele cele mai folosite sunt peroxidaza i fosfataza alcalin, care
utilizeaz substraturi incolore.
Metoda este larg utilizat pentru detectarea Ag de suprafa a HBV i mai recent pentru detectarea proteinei C
(a regiunii centrale) a virusului hepatitei C (VHC) n laboratorul de analiz a donorilor de snge.
ELISA n faza solid se folosete pe scar tot mai mare n laboratorul de diagnostic. Se folosesc Ag peptidice
sintetice sau Ag recombinante, n locul lizatului viral brut. Formatul testului ELISA este foarte versatil. n esen
sunt comercializate 3 tipuri de teste automatizate:
1) Testul indirect: antigenul viral este imobilizat pe faz solid. Anticorpii din ser se leag cu antigenul i dup
splare, anticorpii sunt detectai cu Ig antiuman marcat. Se detecteaz IgG i IgM n funcie de Ig indicatoare.
Dac proba este pozitiv pentru FR, rezultatul poate fi fals pozitiv pentru IgM.
2) Captarea anticorpilor: Ig antiuman este fixat pe faza solid, cu rolul de a capta IgG sau IgM din prob. Se
adaug antigenul, iar n final anticorpul marcat.
3) Testul competiiei antigenelor: n sistemul ELISA, Ag este imobilizat, iar un Ac marcat intr n competiie
pentru legarea Ag, cu anticorpii din proba clinic.
Diagnosticul serologic al infeciei acute (fig. 450) este indicat n cazul n care detectarea virusului este dificil,
necesit prea mult timp sau n cazurile n care producerea virusului a ncetat (virusul hepatitei A, virusul rubeolei
sau parvovirusul B19).
Ac marcat
anti- IgM

Ac mar cat
anti- IgM

Ac mar cat
Ac ser ic

Factor
reumatoid

IgGseric

Ag

IgMseric

Ag

IgGser ic

Ag

Ac competitiv
marcat

Ag

IgM ser ic

Ag

Ac
anti-IgM

Fig. 450. Ilustrarea schematic a variantelor serologice de diagnostic viral. a. Testul indirect al detectrii IgG n varianta EIA. b. Testul
indirect al detectrii IgM. c. Interferena FR n testul indirect al IgM. d. Testul captrii IgM seric cu anticorpi anti-IgM. e. Testul legrii
competitive a Ac serici i a Ac marcai. Liniile din partea de jos a schemei reprezint suportul solid de care se leag unul dintre reactani
(dup K. Jeffery and Emma Aarons, 2004).

Tehnicile care utilizeaz anticorpi marcai sunt imunofluorescena (IFA =Ac imunofluoresceni) i
imunoperoxidazei indirecte (IPI), care utilizeaz Ac marcai cu peroxidaz. Utilizarea IPI este uurat de faptul c
substraturile enzimei sunt etil-carbazolul i 5-cloronaftolul, care precipit la situsul enzimei, crescnd sensibilitatea
metodei. Avantajul IPI este c preparatul este permanent. Pentru creterea sensibilitii, poate fi adugat marcajul
cu biotin, care apoi se leag cu avidina, conjugat cu peroxidaza.
Probele (raclaj, frotiu, seciuni fine, aspirat) pentru demonstrarea direct a antigenelor virale prin metodele IFA
sau IPA se depun pe lam de microscop i se fixeaz cu aceton rece. Virusul sau antigenul viral se detecteaz cu

Ac marcai (monoclonali sau policlonali). De cele mai multe ori, Ac sunt nemarcai i se detecteaz cu al II-lea Ac
marcat (metoda indirect) anti-caten H.
26.1.2.2. Evidenierea antigenelor
Detectarea antigenului prin metoda IF este o variant rapid de diagnostic. Iniial s-au folosit seruri policlonale,
iar ulterior AMC.
Metoda direct folosete ca indicator, Ac marcat, iar cea indirect, un Ac anti-specie marcat, pentru a evidenia
Ag viral. Markerul este fluoresceina.
Metoda IF indirecte (IFI) este mai sensibil, deoarece pe celula infectat se fixeaz o cantitate mai mare de
marker. Rezultatele pot fi disponibile n 1-2 ore dup primirea probei. Metoda se folosete pentru diagnosticul
infeciilor tractului respirator (cu VRS, cu parainfluenza, cu influenza A i B), pielii, ochiului i creierului
(herpesvirusuri, adenovirusuri) i ofer un diagnostic rapid, n cteva ore, dac frotiul cu celule infectate se obine
repede (spltur bronic, sediment urinar, raclaj tegumentar sau material din biopsie). Este mai sensibil
comparativ cu metoda ME sau cu metoda inoculrii n cultura de celule, n special pentru detectarea VRS. Proba
ideal este aspiratul nazofaringian de la copiii cu broniolit, pentru care rezultatul rapid este esenial, iar
antigenele virusurilor respiratorii se exprim n celulele epiteliale.
Metoda IF directe permite detectarea semi-cantitativ a celulelor sanguine infectate cu CMV. Tehnica
presupune separarea leucocitelor mononucleare din snge, fixarea pe lam i colorarea cu AMC anti-proteina
matriceal pp65 uman. Frecvena celulelor pozitive este indiciul infeciei cu CMV la pacienii imunocompromii.
Metoda este laborioas i necesit prelucrarea rapid a probelor. Din aceste motive, antigenemia se determin prin
metoda PCR.
Testul imunoperoxidazei indirecte (IPI), asemntor cu IFI, folosete complexul format din peroxidaza de hrean
cuplat cu IgG de iepure anti-IgG uman, n locul colorantului fluorescent. Peroxidaza de hrean hidrolizeaz
substratul specific adugat n reacie i formeaz un precipitat la locul legrii complexului.
Fa de IFI, metoda IPI are avantajul c preparatul se observ la microscopul cu fond clar, lama se pstreaz
indefinit, dar are dezavantajul c peroxidaza endogen poate s produc rezultate fals pozitive.
Metodele imunoblot se folosesc pentru confirmarea infeciei cu HIV (Western blot) i cu HCV. Metoda se
bazeaz pe detectarea Ac n proba de ser fa de epitopii multipli n preparatul blot pe o membran.
26.2.2. Metode moleculare. Detectarea acizilor nucleici
Demonstrarea direct a prezenei virusurilor n probele clinice, pn recent, s-a fcut prin metoda ME, IFA
(Indirect Fluorescent Antibody), metoda histologic i citologic. Diagnosticul histologic este postmortem. Aceste
metode au fost nlocuite de cele care folosesc AMC i tehnologia ADN recombinant.
Infecia, asimptomatic sau simptomatic, este definit de prezena virusului ntr-o prob clinic. Pentru
diagnostic este esenial sensibilitatea testului i are ca scop detectarea genomului viral. Un test calitativ sensibil
este relevant pentru diagnosticul HIV la copii, sub forma ADN proviral n leucocitele periferice sau al infeciei cu
HCV, sub forma ARN seric.
Diagnosticul rapid al infeciilor virale se realizeaz prin metodele care utilizeaz ADN recombinant i de
amplificare molecular, care ofer rezultate calitative i cantitative, cu o sensibilitate superioar celorlalte metode.
Tehnicile ADN recombinant permit demonstrarea acidului nucleic viral n probele analizate, ca o alternativ la
detectarea Ag virale. Tehnica este adecvat virusurilor al cror genom se integreaz n ADN celular sau persist
sub forma genomului viral episomal. Expresia genelor papiloma este foarte limitat i infecia nu poate fi
diagnosticat prin metodele de detectare a Ag. ADN viral se evideniaz prin hibridizarea dot-blot sau hibridizare
in situ.
Principiu. Metoda hibridizrii dot-blot i in situ se bazeaz pe principiul conform cruia AN monocatenar se
va renatura cu catenele complementare obinute prin tehnologia ADN recombinant.
In metoda hibridizrii dot-blot, AN este extras din celule (esut) i imobilizat pe filtru de nitroceluloz sau
nylon. ADN este foarte stabil i rezistent la tratamente dure cu 0,3 M NaOH la 60 o, folosite pentru eliberarea ADN
de proteine, de ARN i de membranele celulare, n probele clinice. Se adaug proba, selectat pentru o regiune
specific a AN viral, care se va alinia cu catenele complementare, timp de circa 6 ore. Proba poate fi marcat cu
un radioizotop, cu biotin sau cu colorani fluoresceni (DAPI = 4,6-diamidino-2-phenylindole), care se coloreaz
albastru sau cu acetyl aminofluorene (AAF), ce se coloreaz rou la lumina uv. Legarea probei marcate de AN se
evideniaz ca o pat neagr pe membran. Metoda detecteaz pn la circa 10 000 copii de AN viral.
Hibridizarea in situ se folosete pentru evidenierea AN viral, direct n seciunea tisular.

Pn acum, metoda a fost folosit n special pentru virusurile cu genom ADN. ARN este denaturat prin
metodele de extracie i este mai sensibil la atacul nucleazei dect ADN. Tehnica se folosete pentru diagnosticarea
infeciilor cu HPV, ce nu pot fi cultivate, iar expresia Ag n esutul infectat este foarte limitat i pentru
diagnosticul infeciilor cu herpesvirusuri, mult mai rapid dect metoda izolrii n cultura de celule.
Metoda hibridizrii AN nu este la fel de sensibil ca metoda detectrii Ag, deoarece n ciclul multiplicrii se
sintetizeaz mai puine molecule de AN dect proteine. Acest neajuns a fost eliminat prin metoda PCR. Avantajul
major al metodei este c Taq ADN-polimeraza izolat de la bacteria Thermus aquaticus este rezistent la
temperatur, ceea ce permite succesiunea ciclurilor de denaturare a ADN i alungirea primerilor, ceea ce produce o
amplificare de pn la 1 million de ori a segmentelor de ADN. PCR poate s detecteze un singur genom viral ntr-o
suspensie celular sau n seciune tisular.
PCR (Reacia de polimerizare n lan) este o metod simpl i rapid de a copia i a amplifica secvenele
specifice de ADN cu lungimea de pn la 1 kb. Este o tehnic preparativ i analitic folosit n toate domeniile
biologiei moleculare.
Pentru utilizarea metodei este necesar cunoaterea secvenei unei scurte regiuni de ADN de la fiecare capt al
secvenei mai mari care trebuie copiat i amplificat. Secvenele scurte se folosesc pentru sinteza primerilor
oligonucleotidici specifici.
Principiu (fig. 451). Metoda const din cicluri repetate ale denaturrii ADN, reasocierii catenelor ADN i
sintezei ADN.
PCR implic 3 etape: 1) ADN dublu catenar este denaturat i convertit la ADN monocatenar; 2) primerii se
asociaz cu ADN int; 3) ADN se sintetizeaz prin adugarea nucleotidelor la primeri sub aciunea catalitic a
ADN-polimerazei. Primerii oligonucleotidici au o secven care le permite s hibrideze cu capetele 3 i 5 ale unei
gene int. Primerii se extind pe secvena int, reacia de sintez fiind catalizat de ADN-polimeraz n prezena
deoxinucleotid-trifosfailor. Rezultatul este duplicarea secvenei int de origine. Denaturarea ADN dublu catenar
rezultat dup primul ciclu i repetarea procesului de multe ori au ca rezultat creterea exponenial a cantitii de
ADN int.
ADN dublu catenar care conine secvena ce urmeaz a fi copiat i amplificat, se amestec cu un mare exces
molar a dou oligonucleotide de ADN monocatenare - primerii.
Primul primer este identic cu secvena captului 5 al catenei sens al ADN ce va fi copiat, iar al II-lea primer
este identic cu secvena de la captul 3 al catenei opuse. Pentru c ADN dc este antiparalel, al II-lea primer este
complementul inversat al catenei sens.
Reacia de polimerizare n lan este iniiat prin denaturarea (topirea) ADN la temperatur nalt i rcirea
amestecului pentru a permite reasocierea i formarea dublei catene. In timpul reasocierii, primul primer, prezent n
mare exces molar, va hibrida la captul 5 al catenei sens, iar al II-lea primer, de asemenea prezent n mare exces
molar, va hibrida cu captul 3 al catenei antisens.
Amestecul reasociat pe baza complementaritii bazelor se incubeaz cu ADN polimeraza I i cu toate cele 4
deoxinucleotid-trifosfai (A, T, G i C). Se sintetizeaz ADN nou: ADN polimeraza I va extinde captul 3 al
fiecrui primer legat i se sintetizeaz complementul matriei de ADN monocatenar.
Catena sens original are rolul de matri pentru sinteza unei noi catene antisens, iar catena antisens original are
rolul de matri pentru sinteza unei noi catene sens. Cu aceasta se ncheie ciclul I al reaciei de polimerizare.
Ciclul II al reaciei este iniiat dup ce amestecul de reacie este denaturat din nou i catenele, att cele originale
ct i cele sintetizate n ciclul I, se aliniaz cu primerii. In treapta de sintez a ADN din ciclul II, fiecare lan
sintetizat n primul ciclu, dar i catenele originale au rol de matri dup ce au hibridat cu primerii adecvai.
Numrul matrielor n reacie se dubleaz la fiecare ciclu i de aici deriv numele de reacie n lan.
Ciclul al II-lea al reaciei se ncheie cnd ADN-polimeraza I extinde primerii i sintetizeaz catene
complementare matrielor.
Reacia de polimerizare poate fi condus pentru 20 sau un numr mai mare de cicluri.
Teoretic, fiecare rund de replicare dubleaz numrul moleculelor de ADN, dar procesul rareori are eficien de
100% datorit prezenei inhibitorilor ADN-polimerazei, care n rundurile ulterioare limiteaz randamentul reaciei.

Fig. 451. Ilustrarea schematic a principiului i etapele tehnicii PCR (dup K. Jeffery and Emma Aarons, 2004).

Aceste reacii sunt automatizate, folosind termocicluri cu temperatur controlat pentru reglarea denaturrii,
reasocierii i sintezei ADN. Se utilizeaz Taq-polimeraza (o ADN polimeraz I) care suport temperatura de
denaturare a ADN, izolat de la bacteriile termofile.
Reacia de polimerizare n lan are multe utilizri. De exemplu, folosind primerii adecvai poate fi amplificat
orice secven de ADN. Dup amplificare, ADN poate fi legat ntr-un vector adecvat i astfel secvena ADN se
determin fr s necesite izolarea genei ADN. Acesta a fost principalul obiectiv al introducerii acestei metode.
PCR poate fi folosit pentru clonarea genelor cunoscute sau a genelor nrudite cu genele cunoscute; pentru
detectarea i chiar cuantificarea unei secvene particulare de ADN ntr-o prob (de exemplu, detectarea prezenei
secvenelor virale ntr-o prob clinic).
Nivelul ARNm poate fi de asemenea cuantificat dup transcrierea invers i obinerea unei copii de ADNc a
moleculei de ARNm.
PCR poate amplifica ADN numai cnd cei doi primeri sunt apropiai unul de cellalt (adic sunt situai n
interiorul unei unei secvene de 1 kb).
Componentele eseniale ale PCR sunt: Taq ADN-polimeraza, primerii oligomerici, deoxinucleotidele (dNTPs),
matria de ADN i ionii de Mg.
Condiiile PCR. Variaia recomandat a concentraiei Taq ADN-polimerazei este 1,0-2,5 uniti/100 l. O
concentraie prea mare a enzimei favorizeaz formarea produselor nespecifice, iar o concentraie prea mic a
enzimei determin formarea unei cantiti insuficiente de produs.
Taq ADN-polimeraza are activitate optim la 700 i nu este inactivat la temperatura de 90-950, la care amestecul
de reacie se incubeaz pentru scurte intervale de timp pentru denaturarea fragmentelor de ADN generate n PCR.
Se recomand concentraiile de 0,1-0,5 M ale primerilor. Concentraiile mai mari de primer pot favoriza
formarea produselor nespecifice i n special pot crete rata asocierii primer-dimer. Produsele nespecifice i
artefactele primer-dimer sunt substraturi pentru PCR i rezultatul este scderea cantitii de produs specific.
Primerii tipici au o lungime de 18-28 nucleotide, cu o proporie de G+C de 50-60%. Primerii trebuie s aib
temperaturi asemntoare de denaturare (Tm).
Concentraiile dNTP care dau specificiate i fidelitate optim sunt de 20-200 M, iar a ionilor de Mg, de 0,5-2,5
mM.
PCR presupune un ciclu repetitiv ntre o temperatur nalt necesar denaturrii ADN, o temperatur relativ
sczut pentru a permite primerilor s se hibrideze cu regiunea complementar a ADN i o temperatur
intermediar pentru extensia primerilor. Reglarea temperaturii i durata de timp a fiecrui interval depind de
compoziia n baze, lungimea i concentraia primerilor. Temperatura de hibridare de 55-72 0 d cele mai bune
rezultate. La o concentraie de 0,2 M, hibridarea necesit numai cteva secunde.
Activitatea enzimei variaz cu dou ordine de mrime ntre 20 i 85 0 C. Extensia primerilor are loc la 72 0, optim
pentru Taq ADN-polimeraz.
Condiiile tipice pentru denaturare sunt la 94-95 0, pentru 30-60 secunde. Temperaturile inferioare pot da o
denaturare incomplet a matriei i/sau a produsului de reacie. O denaturare la o temperatur prea nalt sau

prelungit prea mult, duce la pierderea activitii enzimei. Timpul de njumtire a activitii Taq ADNpolimerazei este de 40 min. la 95 0. Un numr prea mare de cicluri de reacie poate crete cantitatea i
complexitatea produselor nespecifice, iar un numr prea mic de cicluri furnizeaz o cantitate prea mic de produs
final.
Alegerea corect a primerilor este foarte important. Trebuie cunoscut secvena genomului cel puin a unei
regiuni, iar primerii trebuie s inteasc o regiune bine conservat.
Produsul reaciei de amplificare are dimensiuni cunoscute i poate fi detectat pe gel de agaroz, n comparaie cu
o scar de greuti moleculare cunoscute. In produsul de amplificare se poate evidenia mai mult dect o band sau
banda nu are localizare corect.
26.3. Cuantificarea multiplicrii virale
Metode fizice. PCR (metod bazat pe detectarea acizilor nucleici) poate s determine numrul copiilor
genomice ale virionilor infecioi i neinfecioi ntr-o prob.
Testele serologice RIA i ELISA - pot s determine cantitatea de virus dintr-o prob. Aceste metode nu
disting ntre particulele infecioase i neinfecioase i uneori detecteaz proteinele virale neasamblate.
Unele virusuri posed o protein cu funcie aglutinant pentru hematiile umane i animale. Testele de HA sunt
metode uoare i rapide pentru cuatificarea acestor virusuri. Hemaglutinarea este produs de virionii infecioi i
neinfecioi.
Numrul de virioni poate fi evaluat direct prin metoda microscopiei electronice, prin comparaie cu o
suspensie standard de particule de latex de dimensiuni asemntoare.
Metodele biologice se bazeaz pe inocularea animalelor sau culturilor celulare sensibile:
- determinarea dozei letale 50 (DL50) (doza de virus care produce moartea a 50% din numrul total de animale
infectate) sau determinarea dozei infecioase 50 (DI50);
- determinarea ECP n culturi de celule la o serie de diluii ale virusului. Titrul este exprimat n DI 50;
- metoda plajelor este cea mai folosit. Monostratul de celule este inoculat cu diluii adecvate de virus. Dup
adsorbia virusului, stratul de celule este acoperit cu mediu agarizat sau cu carboxi-metilceluloz (CMC)
pentru a mpiedica diseminarea virusului pe suprafaa monostratului. Dup cteva zile, celulele infectate
iniial produc virus ce infecteaz numai celulele nvecinate. Ciclurile succesive de multiplicare urmate de
moartea celulelor produc o plaj de liz. Durata de timp pn la apariia plajelor depinde de durata ciclului de
multiplicare a virusului i variaz de la cteva zile (poliovirus), pn la dou sptmni sau mai mult (SV 40).
n condiii controlate, o plaj de liz poate s rezulte prin multiplicarea unei singure particule virale, denumit
UFP. Plajele pot fi numrate macroscopic. Raportul numrului de particule infecioase fa de numrul total
de particule virale variaz de la 1 la mai mult de 1/1000, cu o medie de 1/cteva sute;
- unele virusuri (herpes, vaccinia) formeaz pustule pe membrana corioalantoic a embrionului de gin. Ele
pot fi quatificate prin raportarea numrului de pustule calculat la diluia virusului inoculat.
26.4. Purificarea i identificarea virusurilor
n vederea purificrii, virusul se cultiv ntr-un substrat celular permisiv sau se inoculeaz la gazde sensibile
pentru obinerea unei cantiti mari de virus.
Prima treapt a purificrii este concentrarea particulelor virale. Concentrarea se face prin metoda precipitrii
cu sulfat de amoniu, etanol sau PEG sau prin metoda ultrafiltrrii.
Pentru concentrarea virusurilor hemaglutinante se folosete metoda hemaglutinrii, urmat de eluia virusului.
Odat concentrat, virusul poate fi separat de materialele probei prin centrifugare diferenial, centrifugare n
gradient de densitate, cromatografie n coloan i electroforez.
Pentru o purificare adecvat este necesar mai mult dect o etap. Purificarea preliminar are scopul de a
ndeprta cel mai mult material neviral, prin centrifugare. Treapta final include totdeauna centrifugarea n gradient
de densitate.
Virusurile pot s fie purificate prin centrifugare la vitez nalt n gradiente de densitate de clorur de cesiu,
tartrat de potasiu, citrat de potasiu sau sucroz.
Cantiti mici de material celular tind s se adsoarb pe particulele virale i s co-purifice. Criteriul minim de
puritate este aspectul omogen la microscopul electronic.
Identificarea unei particule ca virus se face pe baza urmtoarelor principii:
- particula poate fi obinut numai din celule sau din esuturi infectate;
- particulele obinute din diferite surse sunt identice, indiferent de substratul n care se cultiv;

inactivarea infeciozitii sub aciunea factorilor fizici sau chimici este asociat pierderea activitii virale;
serul imun anti-virus infecios reacioneaz cu particulele virale;
pasajul particulelor n cultura celular permisiv duce la producerea virusului progen.
26.5. Aciunea factorilor fizici i chimici asupra virusurilor

Reacia la temperatur este foarte diferit: virusurile icozaedrice nude tind s fie stabile, pentru c pierd puin
din infeciozitate dup cteva ore la 37o. Virusurile nvelite sunt mai temosensibile: titrul infecios scade rapid la
37o.
Infeciozitatea viral, n general, este anulat la 50-60 o pentru 30 min. Excepiile sunt VHB, poliomavirusurile.
Virusurile pot fi conservate la temperaturi sub-nghe i unele suport liofilizarea (nghearea prin uscare) i pot
fi pstrate n stare uscat la 4 o sau la temperatura camerei. Virusurile care suport liofilizarea sunt mai
termorezistente, dac sunt supuse nclzirii n stare uscat. Virusurile nvelite pot s-i piard infeciozitatea dup
pstrare prelungit la -90o i sunt foarte sensibile la nghe-dezghe repetat.
Multe virusuri pot fi stabilizate cu sruri (MgCl2, MgSO4, Na2SO4), la concentraia de 100 moli/L i astfel i
pstreaz infeciozitatea prin nclzire la 50 o timp de o or. Mecanismele prin care srurile stabilizeaz preparatele
virale, nu se cunosc, dar efectul este important pentru prepararea vaccinurilor.
Virusurile sunt stabile la pH cuprins ntre 5 i 9. Enterovirusurile sunt rezistente la condiiile acide. Toate
virusurile i pierd infeciozitatea n mediul alcalin.
Radiaiile uv, x i particulele cu energie nalt inactiveaz virusurile. Doza inactivatoare variaz la diferite
virusuri.
Detergenii neionici (Nonidet, P40 i Triton x-100) solubilizeaz constituienii lipidici ai peplosului, iar proteinele
sunt eliberate fr a fi denaturate. Detergenii anionici (SDS) solubilizeaz nveliul i sparg capsida n polipeptide
distincte.
Formaldehida anuleaz infeciozitatea viral, prin reacia cu acizii nucleici. Virusurile cu genom monocatenar
sunt inactivate mai uor dect cele dublu catenare, dar are efecte adverse minime asupra antigenitii proteinelor.
De aceea, formaldehida a fost adeseori folosit pentru producerea vaccinului inactivat. Antibioticele i
sulfonamidele nu acioneaz asupra virusurilor.
Compuii quaternari ai amoniului nu au activitate antiviral, ca i compuii organici cu iod. Concentraii mai
mari de clor sunt necesare pentru inactivarea virusurilor, n special n prezena proteinelor strine. De exemplu,
tratamentul cu clor al fecalelor pentru inactivarea bacililor tifici, este inadecvat pentru a inactiva virusul polio.
Inactivarea virusurilor se face n scopul sterilizrii laboratorului i echipamentelor sau pentru dezinfectarea
suprafeelor i a tegumentului, pentru dezinfectarea apei i pentru producerea vaccinului viral inactivat.
Sterilizarea se poate realiza cu vapori de ap sub presiune, cu cldur usct, oxid de etilen, iradiere gama.
Suprafeele se dezinfecteaz cu hipoclorit de sodiu, glutaraldehid, formaldehid, acid peracetic. Tegumentul se
dezinfecteaz cu clorhexidin, etanol 70% i iodofori. Pentru producerea vaccinurilor se folosete formaldehida, propiolactona, psoralenul asociat cu radiaia uv sau cu detergeni.
Bibliografie
Jeffery K., Pillay D. 2004. Diagnostic Approaches - n vol. Principles and Practice of Clinical Virology, 2004, fifth Edition,
ed. Arie J. Zuckerman, Jangu E. Banatvala, John R. Pattison, Paul D. Griffith, Barry D. Schoub, John Wiley & Sons, Ltd.
Kangro H. O. 1990. The Diagnosis of Virus Infections, n vol. Topley and Wilsons Principles of Bacteriology, Virology and
Immunity,8th Ed. M. Tom Parker, Lesslie H. Collier.
McIntosh K. 1990. Diagnostic Virology, n vol. Virology, Second Edition, edited by B. N. Fields, D. M. Knipe et al., Raven
Press, Ltd, New York.

27. CHIMIOTERAPIA INFECIILOR VIRALE

If it were not for the great variability among individuals, medicine might as well be a science and not an art (sir William Osler, 1892).

Chimioterapia s-a impus ca metod de tratament a infeciilor virale care nu beneficiaz de vaccin. Cei mai
simpli ageni infecioi sunt cel mai greu de controlat.
Condiia major a unui compus antiviral este selectivitatea. Inhibitorii multiplicrii virale nu trebuie s
produc efecte toxice asupra celulelor, esuturilor i organelor gazdei. Dificultatea major n calea gsirii unor
ageni antivirali, se datoreaz incapacitii agenilor chimici de a discrimina ntre mecanismele multiplicrii virale
i procesele de biosintez celular. Discriminarea acestor procese nu este posibil n totalitate, deoarece moleculele
specific virale sunt sintetizate de aparatul celular: ribosomii i enzimele sintezei proteice. Din aceast cauz,

chimioterapia infeciilor virale rmne o problem major a cercetrii biomedicale. Insuccesele terapiei infeciilor
virale, comparativ cu succesele terapiei infeciilor bacteriene, se datoreaz diferenelor fundamentale ntre bacterii
i virusuri: bacteriile sunt organisme autonome, cu metabolism propriu, iar virusurile sunt entiti cu organizare
acelular, care interacioneaz cu substratul celular viu ntr-o modalitate specific, prezentnd un parazitism
absolut, de nivel genetic, nentlnit la bacteriile parazite. Studiile de biologie molecular identific funciile
specific virale ce pot servi ca inte pentru aciunea agenilor chimioterapeutici: ataarea, dezvelirea, sinteza acizilor
nucleici virali, traducerea, asamblarea i eliberarea virusurilor. In contrast cu infeciile bacteriene, la care semnele
i simptomele maladiei nsoesc multiplicarea bacterian, n cazul infeciilor virale, simptomele clinice apar numai
dup o perioad de incubaie adecvat, timp n care multiplicarea viral atinge o rat maxim (Topley i Wilsons,
1990). De aceea, terapia instituit la apariia semnelor clinice ale infeciei virale va fi tardiv. S-au identificat
totui, molecule specifice multiplicrii virale i ageni chimici care interfer cu aceste molecule i inhib
multiplicarea viral. Activitatea antiviral a unui compus, demonstrabil in vitro, nu este suficient pentru a-l
utiliza n clinic. Introducerea n clinic a unui agent antiviral este rezultatul unor studii preclinice foarte
laborioase.
Agenii antivirali trebuie s ndeplineasc anumite condiii:
- s prezinte specificitate pentru un esut sau organ int, n care este localizat infecia viral;
- s nu fie toxici pentru celule;
- s fie activi att intra- ct i extracelular;
- s fie stabili din punct de vedere metabolic.
Pentru virusurile care formeaz plaje de liz n monostratul celular, reducerea numrului de plaje sub aciunea
agentului antiviral este testul edificator esenial al potenialului su antiviral. Activitatea antiviral este definit de
concentraia inhibitorului care reduce cu 50% numrul plajelor de liz. Reducerea randamentului multiplicrii
ofer de asemenea informaii utile, folosind diferite multipliciti de infecie.
Foarte puine infecii virale beneficiaz de tratamentul chimioterapic: cele produse de herpesvirusuri (herpes
simplex i virusul zona zoster), infecia cu HIV i infecia cu virusul influenza. Cele mai bune inte pentru inhibiia
cu ageni antivirali sunt molecule care ndeplinesc o funcie specific viral i care nu au corespondent n celula
gazd. Pentru a identifica moleculele specific virale cu care pot interaciona agenii antivirali, este important
caracterizarea molecular a virusului, structura genomului, dar este necesar cunoaterea evenimentelor moleculare
ale multiplicrii virusului. Toate treptele multiplicrii virale sunt inte poteniale pentru aciunea agenilor
antivirali, dar evenimentele timpurii (ataarea, penetrarea, dezvelirea), sinteza acizilor nucleici i a proteinelor
specific virale, asamblarea i eliberarea se aseamn cu procesele celulare normale i sunt catalizate, adeseori, de
enzime celulare.
27.1. Analogii nucleozidelor
Sinteza acizilor nucleici virali este una dintre intele predilecte ale agenilor antivirali, pentru c se deosebete
de sinteza acizilor nucleici celulari i este catalizat de enzime specific virale: polimerazele ce catalizeaz sinteza
ADN sau ARN viral i kinazele care fosforileaz nucleozidele sunt inte pentru agenii chimioterapeutici antivirali.
Funciile acestor enzime sunt adeseori inhibate selectiv de agenii antivirali, la concentraii semnificativ mai mici
dect cele inhibitoare pentru enzimele omologe ale celulei gazd. Timidin-kinazele catalizeaz fosforilarea C5 al
pentozei, prima treapt a sintezei nucleozidelor pirimidinice (timidina, citidina), pentru a fi ncorporate n ADN.
Nucleozid-kinazele i polimerazele ADN sunt codificate de gene virale i de gene celulare. Proprietile lor difer
foarte mult n ceea ce privete specificitatea de substrat, afinitatea de legare i sensibilitatea fa de diferii compui
chimici. Pe aceste diferene se bazeaz utilizarea analogilor nucleozidelor chimici n terapia antiviral. Analogii
nucleozidelor inhib replicarea acizilor nucleici prin inhibiia activitii polimerazelor virale. Unii analogi sunt
ncorporai in molecula de acid nucleic i blocheaz creterea catenei moleculare. Cei mai eficieni analogi inhib
specific activitatea polimerazelor virale, avnd efect minim asupra polimerazelor celulare. Variantele virale
rezistente apar, uneori cu rapiditate. Administrarea combinaiei de medicamente ntrzie apariia fenomenelor de
rezisten.
Analogii nucleozidelor sunt fosforilai de nucleozid-kinazele virale i celulare i sunt ncorporai n catene
ADN de ctre ADN- polimeraze, intrnd astfel n competiie cu nucleozidele naturale (Bryant, 2001). Analogii
vechi ai nucleozidelor (idoxuridina, trifluorotimidina, vidarabina) sunt relativ toxici pentru organismul uman.
Idoxuridina i trifluorotimidina se leag cu afinitate egal de chinazele virale i celulare, dar sunt inhibitori mai
buni ai ADN-polimerazelor virale. Efectul lor este scderea ratei de sintez a ADN n celulele infectate i
neinfectate. Administrarea sistemic a idoxuridinei pacienilor cu encefalit herpetic, nu a sczut riscul de deces,

iar mielosupresia este accentuat la aproape toi indivizii tratai. Ins, compusul este mult mai eficient i are o
toxicitate mult mai sczut atunci cnd este administrat local (n keratite herpetice).
Vidarabina este analogul adenozinei. S-a sintetizat i s-a studiat ca agent antitumoral.

Structura molecular a bazele azotate componente ale acizilor nucleici. Caracterul aromatic al inelelor purinice i pirimidinice
face ca nucletidele s absoarb lumina UV cu spectre caracteristice, ceea ce permite detectarea, identificarea i quantificarea
nucleotidelor i a derivailor lor.

Structura molecular a nucleozidelor

Structura molecular a nucleotidelor

Structura molecular a vidarabinei

Structura molecular a idoxuridinei

Ulterior s-a evideniat c vidarabina este activ fa HSV, VZV, CMV, virusul vaccinal i unele retravirusuri
tumorale. Mecanismul de aciune implic fosforilarea nucleozidului de ctre enzimele celulare i ncorporarea n
catena de ADN viral i celular, n curs de sintez, rezultatul fiind ncetinirea ratei sintezei ADN. Vidarabintrifosfatul este un inhibitor competitiv al ADN-polimerazei celulare i virale. Este mai activ fa de enzimele virale,
ceea ce face s aib efect inhibitor selectiv fa de sinteza ADN viral. Vidarabina inhib i alte trepte ale sintezei
acizilor nucleici: poliadenilarea ARN i deoxinucleotidil-transferaza terminal. Inhib o enzim de metilare a
ARNt i ARNm. Acest efect face ca vidarabina s fie toxic pentru celulele mononucleare. Se folosete ca unguent
ocular pentru tratamentul cheratitei herpetice. Pentru tratamentul infeciilor herpetice prin administrare
intravenoas, vidarabina a fost nlocuit de acyclovir, datorit slabei solubiliti n ap i toxicitii relativ ridicate.

Ribavirina, un analog sintetic al nucleozidelor purinice(1--D-ribofuranozil-1,2,4-triazol-3-carboxiamida),

a fost sintetizat la nceputul anilor 70. Din punct de vedere structural se aseamn cu guanozina i inozina. In
vitro este activ fa de o gam foarte variat de virusuri ADN i ARN: adeno-, herpesvirusuri, influenza A i B,
virusul respirator sinciial, buniavirusuri, arenavirusuri, reovirusuri i HIV.

Structura molecular a ribavirinei

S-au propus trei mecanisme de aciune, ceea ce explic spectrul su larg de activitate.
a) Medicamentul difuzeaz uor n celulele eucariote, unde este convertit de ctre enzimele celulare, la mono-,
di- i trifosfat. Ribavirin-monofosfatul este un inhibitor puternic al IMP (inozin-monofosfat) dehidrogenazei, o
enzim esenial pentru sinteza GTP. Rezultatul este scderea concentraiei celulare a guanozin-nucleotidului,
necesar replicrii ADN celular i viral;
b) Inhib procesul de bonetare (capping) al ARNm viral, etapa esenial a traducerii mesajului n proteine
virale;
c) Inhib direct ARN-polimeraza dependent de ARN a virusurilor influenza i ntrzie iniierea i alungirea
copiilor de ARNm.
Ribavirina nu este ncorporat n structura acizilor nucleici i nici nu determin terminarea transcrierii ARNm.
Ribavirina este toxic: produce anemie i este embriotoxic. Anemia apare ca o consecin a difuziei i acumulrii
acestui compus n eritrocit, unde nu este inactivat prin defosforilare, deoarece eritrocitul nu posed fosfataze.
Astfel, eritrocitele sunt scoase prematur din circulaie. La doze mari, ribavirina inhib eritropoeza n mduva
osoas. Efectele toxice sunt reversibile dup oprirea tratamentului, dar timpul de njumtire al ribavirinei este de
40 de zile i efectele se prelungesc dup oprirea tratamentului. Nu se administreaz gravidelor, deoarece puii de
oarece se nasc cu malformaii scheletice i probabil efecte asemntoare s-ar produce asupra ftului uman.
Ribavirina se folosete n tratamentul febrei de Lassa. Rata morii pacienilor infectai cu arenavirusul febrei de
Lassa este de 55-76%, dar scade la 5-9% la cei tratai. Ribavirina se administreaz chiar profilactic la cei cu risc
mare pentru febra de Lassa. Febra de Lassa este o infecie hemoragic, produs de un arenavirus, rspndit prin
urina roztoarelor infectate, n ariile endemice (n Africa de vest) i adeseori este fatal. Dup o sptmn de febr
i complicaii nespecifice, apare hemoragia, n special n tractul gastrointestinal i chiar moartea prin oc
hipovolemic. Febra hemoragic cu sindrom renal este cauzat de virusul Hantaan (un bunyavirus), transmis prin
urina roztoarelor.
Medicamentul traverseaz bariera hemato-encefalic i n lichidul cerebrospinal realizeaz concentraii de 50100% din cele serice. De aceea se folosete pentru tratamentul encefalitelor. n 1986 a nceput administrarea sub
form de aerosoli pentru tratamentul infeciilor cu virusul respirator sinciial.
Analogii nucleozidici utilizai n prezent n chimioterapia antiviral, sunt mai puin toxici: acyclovirul este activat
numai in celulele infectate de virus, iar zidovudina inhib reverstranscriptaza, enzim absent n celulele normale
ale organismului.
Acyclovir cunoscut sub denumirea comercial de zovirax (9-(2-hidroxietoximetil) guanina), are cel mai bun index
terapeutic dintre toi agenii antivirali n uz i este intens utilizat pentru tratamentul infeciilor cu virusul herpes
simplex (Gold i Corey, 1986). A fost descoperit n anii 70 de ctre Elion i colab., ntr-un screening pentru
compui cu activitate antiviral. Din punct de vedere chimic este un analog structural al guanozinei, care n locul
ribozei, la baza azotat este ataat o caten lateral neciclic. Acyclovir inhib multiplicarea HSV-1, HSV-2,
VZV, cu toxicitate minim pentru celul. Este mai puin eficient fa de EBV, CMV sau HH-6 (Acosta i Balfour,
2001). Selectivitatea aciunii sale fa de virusurile herpetice este dependent de faptul c este activat numai n
celulele infectate, fiind fosforilat la ACV-monofosfat de timidin-kinaza viral.

Structura molecular a acyclovir

Structura molecular a guanozinei

Acyclovir difuzeaz liber n toate celulele, infectate i neinfectate, dar se activeaz i se acumuleaz numai
n celulele infectate cu herpesvirusuri, deoarece prima treapt a activrii sale, fosforilarea n poziia 5 a catenei
laterale, este realizat numai de o timidin-kinaza (enzim care catalizeaz fosforilarea C5 al pentozei, prima etap
a modificrii nucleozidelor pirimidinice pentru ncorporarea n ADN) specific viral i n msur nesemnificativ,
de timidin-kinaza celular.
Afinitatea Tk HSV pentru acyclovir este de circa 3 milioane de ori mai mare dect a Tk celulare. Acyclovir
este fosforilat mult mai rapid i de aceea este ncorporat preferenial n ADN. Fosforilrile ulterioare la formele
difosfat i respectiv trifosfat (activ) sunt catalizate de kinazele celulare. In cursul replicrii ADN, acyclovirtrifosfatul intr n competiie cu dGTP, care este substratul natural al ADN-polimerazei virale. ADN-polimerazele
catalizeaz ncorporarea nucleotid-trifosfailor: cele specific virale sunt de circa 30 de ori mai sensibile la aciunea
inhibitorului, dect ADN-polimeazele umane. Datorit faptului c molecula de acyclovir ncorporat nu ofer
gruparea 3OH, urmtoarea nucleotid nu mai este legat i replicarea ADN este blocat. Odat cu legarea
moleculei de acyclovir la ADN, se formeaz un complex ternar la care particip acyclovir, ADN-polimeraza i
urmtorul nucleotid, ceea ce duce la scderea ampl a sintezei ADN viral. Toate aceste proprieti fac ca
acyclovirul s aib aciune foarte selectiv asupra multiplicrii virale, efectele sale asupra replicrii ADN celular
fiind nesemnificative (fig. 452). Replicarea ADN al HSV este de 3000 de ori mai sensibil dect replicarea ADN
celular.
ACV

A CV
Ti m idi n-ki naza vir al

A DN

A CV - M onof osf at
K inaze
cel ula r e

A CV - Tr i fos f at

A DN pol imer aza vi ra l

A CV
In hib area
sinte zei ADN

Fig. 452. Ilustrarea schematic a mecanismului de aciune a acyclovir (ACV). Timidin-kinaza viral catalizeaz conversia ACV la ACVmonofosfat, iar treapta a II-a a fosforilrii este catalizat de kinazele celulare. ADN-polimeraza viral ncorporeaz ACV-trifosfat n ADN i
blocheaz sinteza ADN.

Virusurile care codific sinteza unor enzime ale cror omologe exist i n celul, au avantajul c se pot
multiplica n celulele care nu se divid. Herpesvirusurile se deosebesc foarte mult ntre ele, n privina sensibilitii
la acyclovir (Bacon i colab., 2003). HSV este un amestec de tulpini Tk + i Tk-. Tulpinile Tk- au capaciti limitate
de a stabili infecii latente n neuroni, care s se i activeze. Predomin tulpinile Tk +, deoarece sunt mai
neurovirulente i au avantajul selectiv de a stabili infecii latente n ganglionii senzitivi, cu capacitatea de
reactivare. Astfel, HSV-1 i HSV-2 sunt extrem de sensibile, necesitnd in vitro concentraii de 0,04-0,4 g/ml
pentru a obine inhibiia replicrii cu 50%. In schimb, Tk VZV nu fosforileaz acyclovir la fel de eficient ca
enzima omolog de la HSV-1 i HSV-2. Astfel se explic sensibilitatea de 8-10 ori mai mic a VZV la acyclovir.
CMV necesit concentraii foarte mari de acyclovir pentru blocarea multiplicrii virale, deoarece acest virus nu

codific o Tk proprie. Nu se tie dac virusul Epstein-Barr codific o Tk capabil s activeze acyclovir.
Acyclovirul nu poate aciona n faza de laten a nici unuia dintre virusurile herpetice. Un avantaj major al
tratamentului cu acyclovir l reprezint absena unor efecte grave de toxicitate. Administrarea intravenoas produce
o cretere tranzitorie a nivelului seric de creatinin, datorat probabil unei obstrucii la nivelul tubulilor renali. In
literatura de specialitate a mai fost descris un sindrom neurologic tranzitoriu, ale crui manifestri clinice sunt
confuzia, letargia, rareori halucinaii i com. Acest sindrom apare la pacienii imunosupresai, care primesc
intravenos doze foarte mari de acyclovir. Acyclovirul previne recurena herpetic. Dup aplicare zilnic, n doze
mici, sunt suprimate aproape complet recurenele frecvente. Nu produce efecte secundare, chiar dup administrare
prelungit. Dac este administrat profilactic, la pacienii expui radiaiei UV solare sau artificiale, acyclovirul oral
scade frecvena leziunilor herpetice, care se declaneaz n intervalul 2-7 zile, dar nu influeneaz leziunile care
apar n primele 48 de ore de la expunerea la agenii declanatori. Leziunile care apar n primele 48 de ore sunt
consecina reactivrii unor tulpini mai virulente, pe fondul unei reactiviti imunitare suboptimale. Acyclovirul
reduce la 14% morbiditatea encefalitei herpetice.

Structura molecular a citozin-arabinozidei

Rezistena la acyclovir se instaleaz dup administrarea pentru perioade lungi de timp, a dozelor care nu
suprim multiplicarea viral, n condiiile presiunii selective, datorat administrrii acyclovirului, tulpinile Tk + nu
se pot multiplica i o proporie important de virioni sufer conversie de la Tk + la Tk- sau la forme care au
capacitate redus de a codifica Tk. Astfel de mutante sunt rezistente, deoarece nu fosforileaz acyclovir. Dup
oprirea tratamentului, tulpinile Tk- reverseaz la Tk+- Un alt mecanism de rezisten este expresia unei ADNpolimeraze cu afinitate redus pentru acyclovir-trifosfat i respectiv expresia unei Tk cu proprieti alterate de
legare a medicamentului. In aceste cazuri, se recomand administrarea foscarnet, cu un mecanism de aciune
diferit.
Gancyclovir (1,3-dihidroxi-2-propoximetil guanina), este un analog nucleozidic asemntor acyclovirului, cu
deosebirea c mai conine o grupare hidroximetil ce se comport asemntor cu gruparea 3hidroxil a
ribofuranozei. Este activ fa de toate virusurile herpetice umane i este de 100 de ori mai eficient n comparaie
cu acyclovir, fa de CMV uman. Toxicitatea este ns mult mai mare dect a acyclovir i din aceast cauz este
folosit doar n cazul pacienilor imunocompromii cu infecii severe provocate de CMV.

Structura molecular a gancyclovir

Nu se cunoate mecanismul care face ca gancyclovir s fie mult mai eficient dect acyclovir n tratamentul
infeciilor produse de CMV. Gancyclovir este activat specific n celulele infectate cu virusuri herpetice, dar n
special de Tk codificat de gena UL97 a CMV. In celulele infectate cu CMV, gancyclovir este activat de timidinkinaza celular i se acumuleaz n concentraie mai mare dect acyclovir. Gancyclovir-trifosfatul (forma activ a
gancyclovir) este ncorporat n catenele ADN virale, ceea ce duce la scderea ratei replicrii genomului viral.
Datorit prezenei gruprii 3OH, gancyclovir nu funcioneaz ca un terminator al sintezei catenei DNA. Acest
compus are efecte mitogene asupra celulelor mamaliene, este carcinogen i embriotoxic. La om produce efecte
toxice asupra mduvei osoase, la circa 25% dintre cazurile tratate. Studii recente au artat c la 8% dintre pacienii
tratai cu gancyclovir pentru o perioad mai mare de 3 luni, tratamentul a euat, ceea ce sugereaz posibilitatea
selectrii unor tulpini virale rezistente la acest compus.
27.2. Amine ciclice

Adamantanii (amantadina i derivatul ei -metil-amantadina sau rimantadina) sunt utilizai pentru

tratamentul infeciilor cu virusul influenza. Din punct de vedere chimic, sunt amine ciclice care deriv formal de la
hidrocarbura policiclic adamantan.
Amantadina este o amin triciclic, derivatul 1-amino al adamantanului, un compus complex cu 10 atomi
de C, cu o structur de colivie.
Rimantadina este un derivat aproape identic, metilat, al amantadinei. Ambele inhib multiplicarea virusului
influenza A in vitro i in vivo, dar nu inhib virusul influenza B.

Structura molecular a amantadinei

Structura molecular a rimantadinei

Mecanismul de aciune i spectrul activitii antivirale sunt identice, ns rimantadina este metabolizat diferit
de amantadin i produce efecte secundare (febr, insomnie, dificulti de concentrare). Amantadina blocheaz faza
timpurie a infeciei dezvelirea- dar influeneaz i fazele tardive ale multiplicrii: asamblarea virionilor i
nmugurirea (Brady i colab., 1990). Sensibilitatea virusurilor gripale la amantadin este determinat de prezena
proteinei M2 la nivelul membranei plasmatice a celulelor infectate i n cantitate foarte mic n structura virionilor.
S-a presupus c aceast protein ar forma canale ionice care ar permite trecerea protonilor din endosom spre
interiorul virionului ducnd la scderea pH, ceea ce determin eliberarea nucleoproteinei virale n citoplasma
celulei infectate. In cursul procesului de asamblare viral, protonii sunt transferai invers, la exteriorul veziculei de
exocitoz, proteina M2 meninnd nivelul pH peste valoarea la care intregritatea hemaglutininei virale ar fi afectat
i nu ar mai putea fi ncorporat n peplosul viral. Se pare c amantadina blocheaz mecanismul de transfer al
protonilor mediat de proteina M2, inhibnd dezvelirea virionilor, maturarea virionilor sau ambele procese. n
absena acidifierii regiunii centrale a virionului n endosom, proteina M 1 nu se disociaz de complexul
ribonucleoproteic i acesta nu este transferat spre nucleu. Amantadina este mai eficace dac n organism se gsesc
anticorpii specifici preformai. In vitro, la concentraii mult mai mari, adamantanii blocheaz multiplicarea i a
altor virusuri ARN: influenza B i paramixovirusuri. Din aceast cauz, adamantanii se folosesc doar pentru
tratamentul infeciilor cu influenza A. Variantele virale rezistente apar rapid, n 5-7 zile de terapie: 16-45% dintre
izolate virale pot fi rezistente.
Ambele medicamente se gsesc n formulri pentru administrare oral. Amantadina atinge nivelul maxim
n plasm la 2-4 ore dup administrarea oral i peste 90% reapare nemodificat n urin. Se excret prin secreie
tubular i filtrare glomerular. Rimantadina se absoarbe bine dup administrare oral (90%) i atinge valori
plasmatice inferioare amantadinei. Este metabolizat n proporie mare i este eliminat prin mecanisme renale.
Circa 10% se elimin nemodificat. Efectele adverse sunt determinate de tulburri ale activitii SNC: nervozitate,
vertigo, insomnie.
Administrarea profilactic a celor doi compui, n cazul unei epidemii, reduce riscul mbolnvirii cu 5090%. Ambii compui sunt mai eficieni n prevenirea apariiei simptomelor clinice tipice infeciei cu virusul
influenza A, dect n prevenirea apariiei infeciei propriu-zise. Dei este eficient i are toxicitate sczut,
amantadina a fost un eec comercial, deoarece majoritatea indivizilor opteaz pentru vaccin sau pentru
mbolnvire, dect s fac profilaxie zilnic. Rimantadina este utilizat profilactic pentru a proteja persoanele care
nu au fost vaccinate sau nu pot beneficia de vaccin i care au un risc crescut de a face complicaii consecutive
infeciei cu virusul gripal A.
27.3. Inhibitori ai sintezei proteinelor virale: -thiosemicarbazone
Methisazone (-thiosemicarbazone) este un compus sintetic antiviral, inhibitor al multiplicrii poxvirusurilor.

Structura molecular a methisazonei

Pentru ca efectele inhibitorii s fie demonstrabile, compusul trebuie s fie administrat la iniierea procesului
infecios. Mecanismul de aciune este ipotetic: pare s inhibe traducerea ARNm viral tardiv. Consecina este o
reducere net a sintezei proteinelor virale tardive, prin dezorganizarea polisomilor. Odat cu eradicarea variolei,
medicamentul a ieit din uz.
27.4. Foscarnet
Foscarnet (fosfono-formiat trisodic) este un analog al pirofosfatului, care nu se aseamn cu nici un alt
medicament antiviral utilizat n clinic. A fost sintetizat la sfritul anilor 70 ca o alternativ (mai puin toxic i
mai eficient) la acidul fosfonoacetic. Medicamentul este foarte util pentru tratarea infeciilor cu virusuri herpetice
rezistente la acyclovir.

Structura molecular a foscarnet

Spre deosebire de compuii antivirali analogi ai bazelor azotate, foscarnet nu necesit o activare prealabil sub
aciunea kinazelor virale sau celulare. Foscarnet funcioneaz ca un inhibitor necompetitiv al ARN- i ADNpolimerazelor, legndu-se la situsul de legare al pirofosfatului i inhib necompetitiv legarea de substratul
nucleotidic (Piret i colab., 2001). Dei mecanismul inhibiiei sintezei ARN i ADN nu este cunoscut cu exactitate,
una dintre ipoteze sugereaz c forcarnet legat la polimeraz, formeaz un intermediar instabil cu nucleozidmonofosfaii, conducnd la degradarea acizilor nucleici. Foscarnet inhib polimerazele celulare ct i pe cele
virale, dar enzimele virale sunt mult mai sensibile dect cele celulare (cele virale sunt inhibate de concentraii de
1/2 - 1/10 din cele necesare pentru inhibarea enzimelor celulare): inhib polimerazele unor tulpini ale serotipului A
de virus gripal, ale virusurilor herpetice umane, virusului hepatitei B i reverstranscriptaza HIV. Foscarnet s-a
dovedit a fi extrem de eficient n tratarea pacienilor SIDA, infectai cu tulpini de HSV sau VZV rezistente la
aciclovir.
Foscarnet are unele dezavantaje majore. Se administreaz intravenos i dozele trebuie s se repete la intervale
scurte, pentru c timpul de njumtire este foarte scurt (Noormohamed i colab., 1998). De aceea se ncearc
mrirea timpului de njumtire prin conjugare cu alcooli cu catena lung (derivai de la acizi grai). Un alt
dezavantaj, o consecin a structurii sale chimice, este c la pH fiziologic acest compus este ionizat i traverseaz
foarte greu membrana plasmatic celular. In LCR concentraia de foscarnet este de aproximativ 40% fa de cea
plasmatic. Aproximativ 30% din cantitatea de foscarnet se depoziteaz n oase ceea ce determin o cretere a
timpului de njumtire la cteva luni (Sjovall i colab., 1989). Medicamentul produce efecte adverse: perturbarea
funciei renale, induce dezechilibre electrolitice (Ca 2+, PO42-, K+, Mg2+). Are aciune chelatoare intens pentru ionii
bivaleni, n special Ca2+, producnd scdere sever, n funcie de doz, ce poate fi fatal.
27.5. Chimioterapia infeciei cu HIV
Interesul pentru terapia infeciei cu HIV este justificat de numrul n continu cretere al persoanelor
infectate. Astfel, la sfritul anului 1999, 34,3 milioane persoane erau infectate sau manifestau semnele clinice ale
SIDA. n fiecare zi, se infecteaz circa 15000 de persoane. 95% din totalul persoanelor infectate se gsesc n rile
n curs de dezvoltare. Pn n 1999, 18,8 milioane aduli i copii au murit de SIDA, de la recunoaterea epidemiei
ca entitate clinic. Gsirea unor modaliti eficiente de stopare a multiplicrii virale este foarte important pentru
clinic, deoarece SIDA se coreleaz cu un titru viral crescut. Medicaia anti-HIV ncearc s blocheze multiplicarea
virusului n oricare treapt a ciclului su (Schwartz i Nair, 1999). n interiorul celulei, blocarea ciclului de
multiplicare este posibil prin inhibiia reverstranscriptazei sau a proteazei HIV.
Medicamentele cu o relativ eficien anti-SIDA intr n 3 categorii majore:
- analogi ai nucleozidelor, ce acioneaz ca inhibitori ai reverstranscriptazei;
- inhibitori nenucleozidici ai reverstranscriptazei;
- inhibitorii activitii proteazei.

Reverstranscriptaza este enzima viral care convertete informaia genetic viral ARN, ntr-o molecul
complementar de ADN dublu catenar. Inhibiia reverstranscriptazei este produs de analogii nucleozidelor:
zidovudina (azidotimidina - AZT), dideoxiinozina (DDI) (analog guanozinei), dideoxicitidina (DD).

Structura molecular a dideoxiinozinei

Structura molecular a dideoxicitidinei

Analogii nucleozidelor se aseamn cu substanele naturale care intr n compoziia ADN al HIV, dar
trebuie s fie fosforilai de enzimele celulare, deoarece virusul nu codific Tk. Dincolo de punctul ncorporrii
analogilor bazelor, reacia de polimerizare i de sintez a ADN HIV este blocat. Selectivitatea aciunii lor s-a
datorat inhibiiei reverstranscrierii. Compuii din prima generaie au produs toxicitate pe termen lung:
mitocondrial (didanozina), nefrotoxicitate (cidofovir). Ulterior s-au selectat analogi ai nucleozidelor i
nucleotidelor mai puin toxici. Primul compus al grupului este zidovudina (Gotzsche, 1993).
Zidovudina (3-azido-3-deoxitimidina), analog al deoxitimidinei, denumit anterior azidotimidina (AZT), este un
compus de sintez din familia analogilor nucleozidici dideoxi, la care gruprile OH 2 i 3 ale inelului -Dribofuranozic au fost nlocuite cu atomi de hidrogen i respectiv cu gruparea azid (N 3).

Structura molecular a zidovudinei

Iniial (Horwitz, 1964), compusul a fost utilizat pentru proprietile sale antineoplazice, iar ulterior s-au descoperit
cele antivirale (inhibitor al virusului leucemiei felinelor). n 1985 s-a descoperit capacitatea sa de a inhiba HIV.
Compusul a devenit disponibil pentru clinic n 1987, iar n prezent se folosete n schema tratamentului infeciei
cu HIV (De Cock i colab., 1993; Zhou i colab., 1999). Compusul este fosforilat de ctre timidin-kinaza celular,
n celulele infectate i neinfectate, la derivaii mono-, di- i trifosfat care reprezint formele active. Forma
fosforilat direct este inactiv, deoarece nu traverseaz membrana. Zidovudin-trifosfatul, forma activ a AZT, este
un inhibitor competitiv al reverstranscriptazei HIV. Zidovudin-trifosfatul are o afinitate de 100 de ori mai mare
pentru reverstranscriptaz (Km mic) dect pentru substratul natural deoxitimidin-trifosfatul (dTTP) (Km mare).
Zidovudin-trifosfatul este ncorporat n lanul ADN n curs de sintez, ca AZT-monofosfat i datorit faptului c n
poziia 3 se afl gruparea azido i nu o grupare hidroxil, urmtorul nucleotid nu se poate lega i sinteza ADN este
stopat. Reverstranscriptaza nu excizeaz AZT ncorporat. Zidovudina este activ fa de retravirusuri mamaliene
i aviare i fa de virusul Epstein-Barr. AZT se gsete n formulri pentru administrare oral i parenteral. La
concentraia de 1-5 m, AZT inhib activitatea RT, dar nu inhib replicarea ADN celular. Dup administrare oral
se absoarbe repede i total, cu valori maxime n snge la 30-90 min. Penetreaz n LCR i de aceea AZT este
folosit pentru tratamentul manifestrilor neurologice ale SIDA. Este catabolizat n ficat, n principal prin
conjugare cu acidul glucuronic. Din acest motiv metabolizarea zidovudinei este blocat de ali compui care sunt
catabolizai pe aceeai cale la nivel hepatic (ageni antiinflamatori nesteroidici, analgezice narcotice). Un
dezavantaj al acestui compus este timpul de njumtire foarte scurt la nivel plasmatic fapt pentru care necesit
administrare frecvent, dar n celul stabilitatea sa este net superioar. AZT traverseaz bariera placentar.
Dei celulele mamaliene nu posed reverstranscriptaza, totui AZT are toxicitate moderat. Zidovudinmonofosfatul inhib competitiv timidilat-kinaza, enzima care catalizeaz conversia nucleozid-monofosfatului, la

nucleozid-difosfat (Chun i colab., 2001). De aceea, n celulele infectate i n cele normale, nivelul intracelular de
nucleozid di- i trifosfai scade, ceea ce duce la scderea ratei sintezei ADN.
AZT este toxic pentru mduva osoas. Efectele secundare ale administrrii acestui compus sunt: anemie sever,
neutropenie, dureri de cap, miopatie manifestat clinic prin diminuarea capacitii contractile a musculaturii, iar
anatomic, prin apariia mitocondriilor anormale n fibrele musculare. La pacienii supui tratamentelor cu
zidovudin crete riscul de a dezvolta limfoame non-Hodgkin, probabil ca o consecin a imunosupresiei
ndelungate (Hoggard i colab., 2001). La pacienii cu SIDA, supui unui tratament de lung durat cu zidovudin,
s-a constatat instalarea unei rezistene a virusului HIV fa de acest compus. AZT se folosete pentru tratamentul
tuturor stadiilor infeciei cu HIV. Dozele mari de 1200-1500 mg/zi prelungesc supravieuirea, reduc frecvena
infeciilor oportuniste, bolnavul ctig n greutate, viremia diminueaz, iar funcia imunitar se amelioreaz
(Kakuda i colab., 2001).
n prezent, AZT se administreaz n doze mici (300-500 mg/zi) i are efecte secundare limitate. Doza
optim este de 600 mg/zi (Cato i colab., 1998). Dup tratamentul prelungit mai mult de 6 luni, se selecteaz
tulpini de HIV rezistente la AZT, datorit unei mutaii a genei care codific reverstranscriptaza i de aici decurge
ineficiena tratamentului. Zidovudina nu elimin i nu neutralizeaz virusul, ci ncetinete evoluia SIDA. Efectele
toxice majore ale AZT se produc la nivelul mduvei hematoformatoare, cu monocitopenie i granulocitopenie.
Poate induce anemie sever i necesit transfuzie sau oprirea terapiei. Dozele mari produc o stare de ru general i
dureri de cap.
Didanozina (2-3 dideoxiinozina - ddI) este un dideoxinucleozid, analog al deoxiadenozinei. Enzimele
celulare o convertesc la ddI-monofosfat, apoi la dideoxiadenozin (ddA)-monofosfat, ddA-difosfat i ddA-trifosfat
(ddATP), forma activ. Ca i trifosfaii altor dideoxinucleozide, ddATP inhib competitiv RT HIV i acioneaz ca
terminator al catenei de ADN. ADN-polimeraza uman este relativ rezistent la ddATP, dar variantele i sunt
mai sensibile. In vitro, ddATP intracelular este la fel de activ fa de RT HIV, ca i zidovudina. Este activ fa de
tulpinile HIV rezistente la zidovudin. La pH acid gastric, ddI este inactivat datorit hidrolizei legturii
glicozidice dintre glucid i baz. De aceea se administreaz n asociaie cu un tampon al aciditii gastrice.
Acyclovirul i zidovudina sunt activi numai fa de virusurile care se multiplic, iar dup oprirea tratamentului,
multiplicarea viral este reluat. Acyclovir nu mpiedic recurenele ulterioare, iar zidovudina nu oprete progresia
SIDA, ceea ce denot c aceti ageni nu elimin virusurile n stare latent.
O alt clas de medicamente sunt inhibitorii nenucleozidici ai reverstranscriptazei. Compuii din aceast
categorie (neviparina) sunt inhibitori direci ai RT HIV, deoarece interacioneaz cu proteina i altereaz
conformaia situsului catalitic. O singur mutaie, chiar punctiform a genei RT, este adeseori suficient pentru a
diminua eficiena acestor compui.

Structura molecular a neviparinei

n tratamentul infeciilor virale se folosete de asemenea o alt clas de ageni chimici care sunt inhibitorii
proteazei. Proteaza HIV este o aspartic-proteaz, codificat de virus i are rolul de a genera peptide structurale
dintr-un precursor viral. Inhibitorii proteazei sunt reprezentai de molecule peptidice mici, care mimeaz substratul
natural al reaciei (Ikuta i colab., 2000). Ele acioneaz prin blocarea situsului catalitic al proteazei HIV,
mpiedicnd generarea proteinelor virale prin clivarea precursorilor i astfel este stopat procesul maturrii virale. O
singur mutaie a genei ce codific sinteza proteazei HIV este suficient pentru a face ca medicamentele s devin
ineficiente.
N-butyldeoxynojirimycin (N-butyl-DNJ) elimin complet HIV din celulele infectate cronic (Fischer i
colab., 1995). Compusul acioneaz prin inhibiia glicozilrii gp120 a nveliului viral, reducnd capacitatea ei de a
se lega de receptorii CD4. Glicozilarea glicoproteinelor virale este nespecific i este catalizat de enzimele
celulare, dar activitatea N-butyl-DNJ, in vitro, este foarte specific fa de celulele infectate cu HIV.
O alt int a terapiei infeciei cu HIV este ARNm. Principiul const n construcia oligonucleotidelor
mici, complementare genelor virale sau secvenelor ARNm (oligonucleotide antisens). Acestea se leag de acidul

nucleic i blocheaz sinteza proteinelor. Deoarece gena rev are rol reglator esenial, s-a obinut ARN-anti ARNm al
acestei gene. Efectul a fost inhibiia sintezei proteinelor n celulele infectate cronic, in vitro.
Interferena cu prima treapt a ciclului infecios legarea HIV de receptorul CD 4 al membranei limfocitare
a fost propus ca o modalitate de tratament. CD 4 solubil recombinat este o molecul incomplet, din care lipsesc
secvenele transmembranar i citosolic, care se leag cu gp120 i mpiedic legarea virusului de limfocitele T CD4.
Preparatul nu este toxic, dar timpul de njumtire este foarte scurt.
Strategia curent pentru terapia infeciei HIV este denumit HAART (Highly Active Anti-Retraviral
Therapy) i utilizeaz combinaii ale diferitelor medicamente: un inhibitor al proteazei, asociat cu doi analogi
nucleozidici inhibitori ai reverstranscriptazei (Blazevic i colab, 2001). La pacienii supui terapiei HAART,
infecia unor noi celule nu este complet blocat. HIV persist, cu o rat foarte sczut a multiplicrii n rezervorul
celular reprezentat de macrofage, celule T CD 4 neangajate i chiar celulele T CD 4 de memorie, ceea ce permite
eliberarea virionilor progeni i infecia unor noi celule. Dovezile multiplicrii HIV la pacienii tratai HAART sunt
urmtoarele:
- muli pacieni au nivele plasmatice sczute ale ARN viral, sub limita de detectare prin testele convenionale
(200-500 copii/ml), dar detectabile prin metode sensibile care determin cantiti de 10-50 de copii ARN/ml;
- pacienii tratai cu HAART devin aviremici, dar prin metoda hibridizrii in situ sau RT-PCR se detecteaz
celule infectate productiv, care exprim ARN HIV-1 (Servais i colab., 2001);
- diferenele cantitative dintre ADN-HIV total i integrat n celulele TCD 4 sugereaz existena celulelor
infectate recent cu HIV-1, n care ADN este neintegrat. Acestea sunt copii lineare complete revers-transcrise,
care sufer o reacie aberant de legare cap la cap, n loc s se integreze n cromosomul gazdei.
Pentru eliminarea rezervorului de virus se impune creterea dozei terapeutice combinate care s inhibe
complet multiplicarea virusului. Dar rezervorul de virus are o persisten ndelungat, iar terapia HAART este
toxic. Pentru eliminarea rezervoarelor de virus se propune stimularea transcrierii i multiplicrii virale n celulele
infectate latent, sub aciunea citokinelor. Odat cu multiplicarea virusului, celulele mor datorit efectului citopatic
sau expun antigene virale i devin inta aciunii litice a limfocitelor TCD 4 citolitice. Astfel, o combinaie de IL-2,
IL-6 i TNF poate induce activarea i multiplicarea virusului n celulele infectate latent, in vitro. IL-2 produce
creterea numeric a celulelor T CD 4, dar nivelul viremiei a rmas nemodificat. Celulele infectate latent cu HIV-1
nu exprim receptori de nalt afinitate pentru IL-2, citokina poate activa multiplicarea viral prin intermediul
receptorilor de mic afinitate sau indirect prin alte citokine ale cascadei. Asocierea HAART cu un agent care s
activeze specific numai celulele TCD4 infectate latent, ar fi soluia terapeutic ideal. Terapia multipl reduce riscul
emergenei unei tulpini virale cu rezisten multipl.
Terapia anti-HIV este ineficient datorit unor particulariti moleculare i biologice ale HIV:
- genomul viral se integreaz ntr-un cromosom celular i infecia rmne latent o perioad nedefinit;
- virusul se poate disemina prin transfer intercelular direct, fr o faz extracelular;
- virusul infecteaz celule circulante (limfocite, macrofage) i se disemineaz sistemic;
- virusul poate infecta celule ale SNC i agenii terapeutici ar trebui s depeasc bariera hemato encefalic;
- virusul scap aciunii Ac specifici i rmne infecios;
- apariia frecvent a variantelor antigenice.
Imunoglobulinele antivirale sunt disponibile n 3 variante:
- preparatul de globuline imune (IG) pentru injectare intramuscular;
- preparatul de imunoglobuline pentru injectare intravenoas (IVIG) ;
- preparate de imunoglobuline injectabile intravenos, cu titru nalt de anticorpi.
Toate variantele se obin din plasma uman i conin predominant IgG, dar i alte izotipuri. Se pot obine
preparate cu un titru nalt de imunoglobuline fa de anumite antigene virale, prin imunizarea animalelor.
Preparatul IG nu poate fi administrat intravenos, datorit tendinei IgG de a forma agregate, care, in vivo, fixeaz
complementul. Imunoglobulinele sunt mai eficiente dac sunt administrate profilactic, dect terapeutic. Preparatele
IG se folosesc n primul rnd pentru prevenirea hepatitei A i se administreaz pacienilor, n cteva zile dup
consumul alimentelor contaminate. Preparatele IG hiperimune obinute prin imunizarea animalelor se
administreaz postexpunere la VHB i rabie. Preparatul IG specific antirabic se obine din plasma donorilor
hiperimunizai.
27.6. Imunoterapia
Variabilitatea genetic a HIV a mpiedicat dezvoltarea unui protocol al imunizrii SIDA. S-au obinut
anticorpii anti-protein de nveli gp120, pentru blocarea interaciunii gp120 i implicit a infeciei (Takeda i

colab., 1992). Dar abordarea n-a avut succes, deoarece gena ce codific gp120 sufer mutaii i rezult variante
antigenice ale proteinei care nu sunt recunoscute de Ac (Cease i colab., 1987). S-au obinut vaccinuri subunitare,
prin inseria ctorva gene ce codific proteine ale nveliului HIV, n genomul virusului vaccinal sau adeno, ca
vectori de expresie clonai n sisteme celulare. S-a ncercat vaccinarea cu virus inactivat. Preparatul viral inactivat
are utilizare limitat numai la indivizii infectai cu HIV, deoarece metodele de inactivare nu au un grad de
certitudine de 100% i pot fi nsoite de pstrarea unei infecioziti reziduale. Exist ncercri de a obine virus
atenuat infecios pentru a-l folosi ca agent imunizant, deoarece indivizii infectai cu HIV-2 cauzeaz o form mai
uoar de SIDA, cu o perioad de laten mai lung i protejeaz fa de infecia cu HIV-1.
27.7. Rezistena viral la agenii chimioterapeutici
Avnd o structur genetic relativ simpl i fiind metabolic inerte, virusurile au puine mecanisme de a
dobndi rezistena la agenii chimioterapeutici.
Virusurile au dou proprieti care le permit s scape de aciunea inhibitorilor:
- multiplicarea la un titru nalt n celula gazd sensibil;
- apariia mutaiilor cu o rat nalt.
Mutaia este fora motrice a evoluiei sistemelor vii. Virusurile nu ntrunesc criteriile minimale ale celui
mai simplu sistem viu, dar evenimentele mutaionale au o frecven mare.
Cele mai multe virusuri cu genom ADN, au rate de mutaie inferioare ribovirusurilor. Mutabilitatea lor este
puin cunoscut, dar este dedus indirect din diferite observaii: de exemplu, virusurile herpetice pot deveni
rezistente la medicaia antiviral, fapt ce creeaz dificulti clinice.
In general, genomul ribovirusurilor are dimensiuni reduse, iar rata de mutaie/nucleotid/tur de multiplicare
este maxim, fapt care permite o rat de evoluie de milioane de ori mai rapid dect a gazdelor lor. Supuse
permanent presiunii selective a factorilor de aprare a gazdei, evoluia virusurilor este exclusiv adaptativ. Ratele
foarte nalte de mutaie, genereaz aa numitele mutante de roire sau populaii de quasispecii de virusuri, care
confer o mare adaptabilitate multiplicrii virale, menit s compenseze ansa minim a interaciunii cu substratul
permisiv.
Dar rata mutaiei nu trebuie s depeasc un prag al erorilor, care ar genera un virus incapabil de
multiplicare. Quasispeciile de virusuri ARN, se adapteaz la un prag de erori mutaionale, compatibil cu
multiplicarea. Se consider c virusurile se multiplic la limita superioar a mutabilitii i adaptabilitii. Datorit
ratei nalte a mutaiei, clonele de ribovirusuri i retravirusuri sunt quasispecii sau mutante roitoare, care prezint
variaii genetice genomice. Populaiile de quasispecii confer virusurilor cu genom ARN o adaptabilitate perfect
la mediul gazdei i o capacitate de evoluie foarte rapid. Anumite secvene ale genomului sunt mai stabile dect
altele, dar i cele mai stabile sufer mutaii cu o rat superioar n raport cu dezoxiribovirusurile.
Mutabilitatea accentuat se datoreaz naturii intrinseci a funciei ARN-polimerazei virale, predispus la
erori (error prone), ca o consecin a absenei funciei de corectare (proof reading), n timp ce majoritatea ADNpolimerazelor virale i corecteaz erorile proprii. Diferitele familii de ribovirusuri au rate diferite de mutaie.
Dintre enzimele de transcriere i replicare a genomului ARN, RT are o predispoziie mai accentuat la erori, ceea
ce se coreleaz cu o rat nalt a mutaiei n ciclul de multiplicare a retravirusurilor. Genomul integrat ca ADN
proviral este copiat de aparatul enzimatic al celulei, cu o fidelitate relativ i de aceea, retravirusurile endogene
evolueaz foarte lent, comparativ cu cele exogene (infecioase).
Modificarea ARN posttranscriere este o cauz major a apariiei mutaiilor. Modificarea extensiv s-a
descris iniial pentru ARNm al proteinei M (matrix) a virusului rujeolic de la pacienii cu PESS.
In contrast cu modificarea frecvent adenozin inozin (A-I) la unele virusuri ARN, exist cteva cazuri de ARN
viral i celular la care conversia A I, catalizat de ADAR, are loc cu selectivitate nalt, la poziii specifice ale A.
De exemplu, la HDV, ARN editing are rol esenial pentru sinteza a dou proteine cu funcii diferite, de la un ORF:
sinteza AgD se face dup conversia selectiv a codonului terminal amber UAG, la codonul Trp UIG. Antigenul D
este o protein bazic fosforilat i se acumuleaz n nucleii celulelor infectate. Este componenta intern a HDV.
Mecanismul generrii celor dou variante este urmtorul: n timpul replicrii genomului, o fracie a copiilor de
ARN antigenomic, sufer unul sau mai multe evenimente de editing post-transcriere. Unul dintre ele este
esenial: A din mijlocul codonului terminal amber UAG al ARN codificator al Ag D de l95 aminoacizi, este
dezaminat de o enzim a celulei. Dezaminarea A are importan biologic major. Conversia A la I (Inozin)
modific mesajul ARN, deoarece I este recunoscut ca G (nu ca A). Molecula de ARN astfel modificat este
tradus ntr-o protein a crei secven de aminoacizi difer fa de a proteinei native. Codonul terminal amber este

nlocuit cu codonul (UIG) pentru sinteza Trp. ARNm modificat, codific o protein mai mare antigenul D de 2l4
aminoacizi, o protein bazic, fosforilat care se acumuleaz n nucleul celulei infectate.
Pentru virusurile cu genom ARN de polaritate negativ, hipermutaia datorat dezaminrii A este asociat cu
persistena infeciei. Pentru virusurile cu genom ADN dc, modificarea reprezint un mecanism prin care copiile de
ARNm timpuriu sunt inactivate.
Marea diversitate a ribovirusurilor se explic prin mutabilitatea accentuat i adaptabilitatea lor. Cu puine
excepii, virusurile capabile s infecteze insecte i animale superioare sau insecte i plante au genom ARN.
Adaptabilitatea quasispeciilor le permite deplasarea ntre diverse medii selective. Foarte adesea, numai una sau
cteva schimbri mutaionale permit unui virus s dobndeasc virulen, s-i schimbe tropismul i s devin
rezistent la un medicament antiviral sau la anticorpii specifici. Variaiile secvenei de baze a quasispeciilor pot
influena severitatea infeciei virale. Faptul este extrem de important pentru cercettori i pentru clinicieni, care
tind s considere virusul rujeolic, HIV, virusul hepatitei C sau polio, ca entiti infecioase unice, la care diferiii
pacieni rspund diferit. Se ignor natura fundamental a ribovirusurilor, adic mutabilitatea lor accentuat,
materializat n existena quasispeciilor. Heterogenitatea quasispeciilor, caracterul tranzitoriu, ntmpltor,
nedeterminat i imprevizibil al apariiei lor, creeaz o genetic aleatorie, contraintuitiv. Baza ubicvitii
ribovirusurilor este chiar heterogenitatea lor genetic. Existena quasispeciilor ridic probleme insurmontabile
controlului majoritii infeciilor cu ribovirusuri, prin intermediul vaccinurilor. Vaccinarea a avut succes pentru
unele viroze (produse de virusul polio, rujeola, oreionul, variola), deoarece anumii epitopi antigenici ai proteinelor
virale, au o probabilitate mic de a se modifica fr s compromit infeciozitatea lui. Dar pentru alte ribovirusuri
(FMDV, HIV1, virusul hepatitei C) natura efemer a quasispecilor pune probleme dificile n calea identificrii
epitopilor stabili (sau puin variabili) i imunizani (stimulatori ai rpunsului imun protector). Cele mai multe
virusuri ARN, sufer o divergen evolutiv, prin substituia bazelor cu o rata de l/l0 2-l04/nucleotide/an. Rata
evoluiei virusurilor nu este constant. Apariia unor noi ribovirusuri n viitor, este o certitudine. Unele apariii se
vor datora contactului omului cu virusuri vechi de la animalele junglei neexplorate, iar altele vor aprea prin
recombinare, reasortare sau prin mutaie. Apariia este ns condiionat de evoluia rapid a quasispeciilor i de
capacitatea lor de adaptare rapid la gazda uman. Adaptarea rapid va determina transmiterea epidemic sau
pandemic la om, aa cum se ntmpl cu influenza A, HIV 1, sau va implica omul ca o gazd sporadic (virusul
febrei hemoragice etc.). Este foarte probabil ca majoritatea ribovirusurilor umane, s fi evoluat n ultimele mii sau
zeci de mii de ani, dar unele sunt mult mai recente. Dup Brown (l989), virusurile noi au evoluat din
interaciunile genelor cromosomale, cu elemente genetice mobile i cu virusurile vechi i din acest punct de
vedere, evoluia virusurilor este un proces care nu se termin niciodat. Dup Botstein (l98l), produsul evoluiei
virale nu este un virus anume, ci o familie de elemente genetice denumite module, fiecare dintre ele purtnd o
funcie biologic particular. Fiecare virus este rezultatul unei combinaii favorabile de module. Recombinarea
genetic furnizeaz noi variante de module, din care se perpetueaz cele mai adaptate.
De cele mai multe ori, rezistena este rezultatul mutaiei genetice, care produce modificri ale enzimelor
sau ale componentelor structurale ale virionului. Eficiena acestui mecanism se observ n culturile celulare, unde
virusurile dezvolt rezisten dup numai cteva pasaje, n prezena agentului inhibitor. Rezistena
herpesvirusurilor, la pacienii imunocompeteni apare rareori, ns tulpinile rezistente de virus influenza apar cu
frecven mare. n general, virusurile rezistente la aciunea agenilor chimioterapeutici, par s aib o virulen
redus i produc infecii mai uoare, n special herpesvirusurile. Tulpinile rezistente de influenza A sunt a fel de
virulente ca i tulpinile naturale. Detectarea i evaluarea genelor de rezisten se face prin diferite metode. Cele
tradiionale implic inocularea culturilor celulare cu virusuri, expunerea la ageni inhibitori i determinarea
modificrilor ulterioare n celul sau a cantitii de virus progen. Metoda nu este totdeauna relevant pentru
populaiile de virusuri in vivo. Virusurile izolate de la pacieni sunt populaii heterogene, cu sensibilitate diferit la
agenii inhibitori i chiar cu proprieti diferite de multiplicare n diferite substraturi celulare. Metodele noi pentru
detectarea genelor de rezisten sunt cele moleculare, inclusiv PCR.
Evoluia procesului infecios are caracteristici strict individuale, datorate paricularitilor genetice ale gazdei i
ale agentului infecios. De aceea, scopul geneticii medicale este medicina personalizat. Intr-un scenariu (puin
probabil) al viitorului fiecare individ ar trebui genotipizat pentru un numr ct mai mare de locusuri, cu scopul de a
identifica sensibilitatea genetic individual la diferite maladii infecioase sau neinfecioase.
Optimitii sper c medicina poate fi schimbat de la art la tiin, prin dezvoltatea farmacogeneticii.
Famacogenetica este influenat de absorbia medicamentului, de distribuia sa la situsul aciunii, de interaciunea
cu intele sale (enzime sau receptori), de metabolizare i de excreie.
Metabolizarea medicamentului este o etap esenial a farmacogeneticii i este dependent de citocromii P 450.
Genele codificatoare CYP formeaz o familie cu peste 57 de alele funcionale i peste 33 de pseudogene. Produsele

genelor catabolizeaz o varietate larg de substraturi. Modificrile constau n oxidri, peroxidri, reduceri. La om,
medicamentele sunt metabolizate de produsele a 35 gene CYP (1, 2, 3 i mai puin 4). De exemplu, codeina este
metabolizat la morfin (un analgezic). Cei cu deficit al CYP2D6 nu resimt efectul analgezic al codeinei.
Antidepresivele triciclice (nortriptilina), dac sunt metabolizate rapid au efect terapeutic minim, iar cei care le
metabolizeaz insuficient resimt efectele secundare. Agenii chimici ce regleaz contraciile inimii induc efecte
secundare, dac nu sunt metabolizate suficient.
Bibliografie
Lehninger A. L. 1975. Biochimie, vol. I, Traducere dup ediia a II-a, Editura Tehnic Bucureti.
Hoggard P.G., Sales S.D., Phiboonbanakit D., Lloyd J., Maher B.A., Khoo S.H., Wilkins E., Carey P., Hart C. A., Back D. J. 2001.
Influence of Prior Exposure to Zidovudine on Stavudine Phosphorylation In Vivo and Ex Vivo - Antimicrobial Agents and Chemotherapy,
45(2): 577-582.
Kakuda T. N., Page L. M., Anderson P. L., Henry K., Schacker T. W., Rhame F. S., Acosta E. P., Brundage R. C., Fletcher C. V. 2001.
Pharmacological Basis for Concentration-Controlled Therapy with Zidovudine, Lamivudine, and Indinavir - Antimicrobial Agents and
Chemotherapy. 45(1): 236-242.
Bryant M. L., Bridges E. G., Placidi L., Faraj A., Loi A. G. and colab. 2001. Antiviral l-Nucleosides Specific for Hepatitis B Virus
Infection - Antimicrobial Agents and Chemotherapy 45(1): 229-235.
Cato A. III, Qian J., Hsu A., Levy B., Leonard J., Granneman R. 1998. Multidose Pharmacokinetics of Ritonavir and Zidovudine in
Human Immunodeficiency Virus-Infected Patients - Antimicrobial Agents and Chemotherapy 42(7): 1788-1793.
Schwartz S. A., Nair M. P. 1999. Current Concepts in Human Immunodeficiency Virus Infection and AIDS - Clinical and Diagnostic
Laboratory Immunology 6(3): 295-305.
Zhou X. J., Sheiner L. B., DAquila R. T., Hughes M. D., Hirsch M. S., Fischl M. A., Johnson V. A., Myers M., Sommadossi J. P.
1999. The National Institute of Allergy and Infectious Diseases AIDS Clinical Trials Group Protocol 241 Investigators, Population
Pharmacokinetics of Nevirapine, Zidovudine, and Didanosine in Human Immunodeficiency Virus-Infected Patients - Antimicrobial Agents
and Chemotherapy 43(1): 121-128.
Acosta E. P., Balfour H. H. Jr. - Acyclovir for Treatment of Postherpetic Neuralgia: Efficacy and Pharmacokinetics 2001.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy 45(10): 2771-2774.
Bacon T. H., Levin M. J., Leary J. J., Sarisky R. T., Sutton D. 2003. Herpes Simplex Virus Resistance to Acyclovir and Penciclovir after
Two Decades of Antiviral Therapy Clin. Microbiol. Rev. 16(1): 114-128.
Gold D., Corey L. 1987. Acyclovir prophylaxis for herpes simplex virus infection - Antimicrobial Agents and Chemotherapy 31(3): 361367.
Brady M. T., Sears S. D., Pacini D. L., Samorodin R., DePamphilis J., Oakes M., Soo W., Clements M. L. 1990. Safety and
prophylactic efficacy of low-dose rimantadine in adults during an influenza A epidemic - Antimicrobial Agents and Chemotherapy 34(9):
1633-1636.
Noormohamed F. H., Youle M. S., Higgs C. J., Martin-Munley S., Gazzard B. G., Lant A. F. 1998. Pharmacokinetics and Absolute
Bioavailability of Oral Foscarnet in Human Immunodeficiency Virus-Seropositive Patients - Antimicrobial Agents and Chemotherapy
42(2): 293-297.
Piret J., Lamontagne J., Dsormeaux A., Bergeron M. G. 2001. Efficacies of Gel Formulations Containing Foscarnet, Alone or Combined
with Sodium Lauryl Sulfate, against Establishment and Reactivation of Latent Herpes Simplex Virus Type 1 - Antimicrobial Agents and
Chemotherapy 45(4): 1030-1036.
Sjvall J., Bergdahl S., Movin G., Ogenstad S., Saarimki M. 1989. Pharmacokinetics of foscarnet and distribution to cerebrospinal fluid
after intravenous infusion in patients with human immunodeficiency virus infection - Antimicrobial Agents and Chemotherapy 33(7): 10231031.
De Cock K. M., Lucas S. B., Lucas S., Agness J., Kadio A., Gayle H. D. 1993. Clinical research, prophylaxis, therapy, and care for HIV
disease in Africa - American Journal of Public Health 83(10): 1385-1389.
Gtzsche P. 1993. Zidovudine dosage. Nordic Medical Research Councils' HIV Therapy Group - British Medical Journal 307(6905): 682683.
Fischer P. B., Collin M., Karlsson G. B., James W., Butters T. D., Davis S. J., Gordon S., Dwek R. A., Platt F. M . 1995. The alphaglucosidase inhibitor N-butyldeoxynojirimycin inhibits human immunodeficiency virus entry at the level of post-CD4 binding - Journal of
Virology 69(9): 5791-5797.
Blazevic V., Jankelevich S., Steinberg S. M., Jacobsen F., Yarchoan R., Shearer G. M. 2001. Highly Active Antiretroviral Therapy in
Human Immunodeficiency Virus Type 1-Infected Children: Analysis of Cellular Immune Responses - Clinical and Diagnostic Laboratory
Immunology 8(5): 943-948.
Chun T. W., Justement J. S., Moir S., Hallahan C. W., Ehler L. A., Liu S., McLaughlin M., Dybul M., Mican J. M., Fauci A. S . 2001.
Suppression of HIV replication in the resting CD4 + T cell reservoir by autologous CD8+ T cells: Implications for the development of
therapeutic strategies - Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98(1): 253-258.
Takeda A., Robinson J. E., Ho D. D., Debouck C., Haigwood N. L., Ennis F. A. 1992. Distinction of human immunodeficiency virus type
1 neutralization and infection enhancement by human monoclonal antibodies to glycoprotein 120 - The Journal of Clinical Investigation
89(6): 1952-1957.
Cease K. B., Margalit H., Cornette J. L., Putney S. D., Robey W. G., Ouyang C., Streicher H. Z. 1987. Helper T-cell antigenic site
identification in the acquired immunodeficiency syndrome virus gp120 envelope protein and induction of immunity in mice to the native
protein using a 16-residue synthetic peptide - Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 84(12):
4249-4253.

Servais J., Lambert C., Fontaine E., Plessria J. M., Robert I. 2001. Comparison of DNA Sequencing and a Line Probe Assay for
Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Drug Resistance Mutations in Patients Failing Highly Active Antiretroviral Therapy Journal of Clinical Microbiology 39(2): 454-459.
Ikuta K., Suzuki S., Horikoshi H., Mukai T., Luftig R.B. 2000. Positive and Negative Aspects of the Human Immunodeficiency Virus
Protease: Development of Inhibitors versus Its Role in AIDS Pathogenesis - Microbiology and Molecular Biology Reviews 64(4): 725-745.
Hirsch M., Kaplan J.C., DAquila R.T. 1996. Antiviral Agents, n vol. Fields Virology, Third Edition, edited by B. N. Fields, D. M. Knipe,
P. M. Howley et al., Lippincott - Raven Publishers, Philadelphia.
Norkin L.C. 1995. Virus Receptors: Implications for Pathogenesis and the Design of Antiviral Agents Clinical Microbiol. Rev., 8, 2, 1 :
293-315.
Bean B. 1992. Antiviral therapy: curent concepts and practices - Clin. Microbiol. Rev. 5, 146-182.
De Clercq E. 1997.In search of a selective antiviral chemotherapy - Clin. Microbiol. Rev. 10, 674693.
Field, H. J., Vere Hodge R. A. 2007. Antiviral Agents, n vol. Encyclopedia of Virolgy, third edition, Editors Brian V. J. Mahy, Marc H. V.
van Regenmortel, AP.