26 - 4, PROCEDIMIENTOS DE CALIBRACION 4.1 Calibracién mediante espectrofotometria UV-visible Procedimiento general Por lo general, para el andlisis mediante espectrofotometrfa UV-visible es posible preparar curvas de calibracién “permanentes." Esto se refiere a que una curva de calibracién puede usarse con varios lotes de andlisis, durante varios meses. Se prepara una nueva curva de calibracién, cuando de patrones muestran un cambio de la pendiente 0 cuando se comienza a usar un nuevo lote de reactivos. La curva estindar inicial debe incluir un blanco reactive y, por lo menos, ocho esténdares que cubran toda la escala de concentraciones que se usardn en los andlisis rutinarios del laboratorio y que permite medir el método analitico. El instrumento debe ponerse en cero con agua destilada. A este punto se denomina “Linea base del blanco.” EI blanco “de reactivos” se refiere a la respuesta analitica (por ejemplo absorbancia) causada por los reactivos cuando se analiza agua pura que no contiene el pardmetro. Cuando se traza la curva de calibracién, no se resta el blanco reactivo de las otras lecturas, sino que se trata como un punto correspondiente a la concentracién cero (por ejemplo, C = 0). Las curvas de calibracién pueden ser lineales 0 no lineales. En la mayorfa de casos, cuando la curva es lineal se aplica la Ley de Beer. Para definir la curva de calibracién que mejor representa la relacién entre la absorbancia (A) y la concentracién (C) se pueden usar célculos de regresién lineal de la siguiente manera: Dado que A = mC +b donde: A = absorbancia C = concentracién-27- Se puede demostrar que: m= bos no = m = BzAC - Labo nbc? - (Ec)? Ba _,, Zc b= 24 -n 7 2 la pendiente de la curva de calibracién (también denominada "factor de calibracién"). la interseccién del valor de absorbancia o del eje "y’. el nimero de observaciones (lotes de valores de C y de A). Aunque estos cdlculos pueden realizarse manualmente, resulta mucho mds conveniente utilizar una computadora o una calculadora manual para elaborar el andlisis de regresién. Por ejemplo, dados los siguientes resultados de concentracién (C) con relacién a la absorbancia (A),-28- se puede calcular, m = (pendiente) = 0.0493 b = Ginterseccién dey) = 0.035 La ecuacién de la mejor linea se da mediante la siguiente ecuacién: A = 0.0493C + 0.035 Con el fin de trazar estos valores en un papel cuadriculado, se sustituye simplemente dos valores para C, se calculan los valores correspondientes a A, se ubican los dos puntos en un gréfico y Iuego se les une con una linea recta. Por ejemplo, se puede calcular C = 0, A = 0.035; y C = 10.0, A = 0.528. Estos valores pueden ser marcados y puede trazarse una linea recta tal como lo indica la figura 2. Ahora, la curva de calibraci6n esté lista para ser usada en el andlisis de muestras. Recuerde que la curva fue elaborada sin hacer correcciones en el blanco. Se entiende que las muestras deben analizarse y los valores de la concentracién deben calcularse, usando la curva sin hacer, correcciones por el blanco en forma directa. Por regla general, el blanco, los estandares y las muestras deben analizarse exactamente de la misma manera, En algunos casos, se puede corregir el blanco; entonces, de cierto modo se cambia el procedimiento analitico. En lugar de usar la curva de calibracién de la figura 2, que incluye un valor positivo de absorbancia a la concentracidn cero, sélo se usa el factor de calibracién, En otras palabras, en un lote de andlisis se procesan tanto las muestras como el blanco, luego se substrae el valor de absorbancia del blanco del mismo valor de la muestra. La concentracién de la muestra se calcula por medio de la siguiente ecuacién. c= 4 factor de calibracién Si se usa el ejemplo anterior, el factor de calibracién es 0.0493, por lo tanto, la concentracién se puede calcular de la siguiente manera: Esta ecuacién es equivalente y paralela a la curva de la figura 2, pero con la interseccién en el origen (A=0, C=0).ABSORBANCIA 0.9: 0.8 0.7: 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 O41 6 8 10 CONCENTRACION Figura 2 CURVA DE CONCENTRACION 12 14 16-30- ‘Cuando se usa una curva de calibracién "permanente" o factor se requiere verificar su -exactitud con cada lote de andlisis, mediante el andlisis de un patrén o estdndar de verificacién', antes de analizar las muestras .. Asimismo, se recomienda analizar un blanco antes de la ‘muestra, no para verificar la curva de calibracién, sino para observar la pureza y estabilidad de Jos reactivos. Estos valores del blanco también pueden ser trazados en una carta de control que tiene 0 como valor central y sirve para controlar los cambios en la pureza de los reactivos. En conclusién, una vez que se ha establecido la curva de calibracién, un lote tipico de andlisis conileva lo siguiente: 1) Se coloca la absorbancia en 0 (100% de transmisién) con agua destilada. 2) Se determina la absorbancia del blanco de reactivos, 3) Se analiza el esténdar o patrén de verificacién para validar la exactitud de la curva de calibracién. 4) Se analizan las muestras (hasta 10). 5) Se repiten los andlisis del blanco o testigo de reactivos. Si se van a analizar més de 10 muestras en un lote, se repiten los pasos del 3 al 5 tantas veces como sea necesario, hasta que se completen los andlisis. En el paso 3 si se estima conveniente, puede analizarse més de un patrén o esténdar de verificacién. ‘Tal como se sefialé antes, también éstos pueden usarse en el control de su Finalmente, por lote se analizan por los menos 2 blancos para poder calcular el I{mite de deteccién. Para mayores detalles, véase el anexo 4. + La concentraciG del patrdn 0 estindar de verficacién, por lo general, ea de sproximadamente 0.9 Cm, donde el ‘Cm representa el Iimite superior de concentracién que puede ser medido con el método analtico. "Bata alta ‘concentraciSnes sensible para dtectar los cambios que se producen en Ia curva de calibracién, A menudo, wmbiéa se analiza el patr6n 0 eatindar de verificaciéa de una concentracién menor (0.2 Crm) para controlar niveles menores. Estos patrones o eatindares de verificacién pueden ser usados como mucstras de control cuando se miden smente para verificacién de la curva de ealibracién y para aplicar lor datos de la cartas de control de la precision.-31- ANEXO 4 ESTIMACION EXPERIMENTAL DE LOS L{MITES DE DETECCION Por lo general, en métodos que usan espectrofotometria UV-visible, se determina experimentalmente sus Ifmites de detecciGh, por medio de la evaluacién de la variabilidad de los andlisis del blanco. La teorfa del Itmite de deteccién adoptada est4 tratada con detalle en el informe técnico N° 66 del Water Research Center, pp. 44-49. Como ejemplo se discute la aplicacién de esta teorfa, La ecuaci6n bésica para calcular el Ifmite de deteccién es la siguiente: Limite de deteccién (LD) = 2.83 to, Six en donde toy = el punto del 10% del t de student para pruebas dobles cola y Sw = _la desviacién estindar del blanco dentro de un grupo. Con el fin de calcular el valor de S,g, analizar los blancos por duplicado en una serie de lotes. Mientras mayor sea el ntimero de determinaciones (por duplicado) medidas, mejor seré la estimacién del Ifmite de deteccién. La ecuacién usada para calcular la desviacién estdndar dentro de un grupo es la siguiente: ee 2m en donde di = la diferencia entre las determinaciones del blanco, dentro del lote. m = _ el mimero de determinaciones del blanco por duplicado. A continuacién, se sefiala un ejemplo de la determinacién del Ifmite de deteccién de los andlisis de mercurio con datos generados en el CEPIS/LAB.-32- Blanco1 | Blanco 2 | diferencia di Lote No. Ge/) Ged Ez 1 521 so | 03 2 459 M45 3 608 139.24 x 104 4 480 386 88.36 x 104 eee 231,25 x 104 iat Le a pas 10* | 0.0537 donde sustituyendo LD = 2.83 ty; Sq = 2.83 (2.13) (0.0537) ~ 0.324 yg/l Notese que el valor del t de student corresponde al valor que tiene cuatro grados de libertad en el punto del 10% del t de student para las pruebas doble cola. A continuacién, se Presentan los valores del t de student de uso comtin en el célculo del Ifmite de deteccién. rados de libertad 1 2 3 4 5 6 7 8 6.31 2.92 2.35 2.13 2.02 194 189 1.86 grados de libertad eA AS 723-20. 183° 1810 1.78) LIS) 1.72 Para una buena estimacién del Iimite de deteccién, se debe analizar blancos duplicados en un mimero mayor de lotes, y no s6lo los cuatro utilizados en el ejemplo. Para el edlculo inicial, se sugiere un m{nimo de diez lotes de datos, luego se vuelve a calcular, a medida en que se encuentren disponibles mas mediciones y, por ende, més grados de libertad.4.2 Calibracién de autoanalizadores 4.2.1 Introduccién 1 uso de antoanalizadores paral andisis det agua ex cada vex mayor; ademés, exisn procadimints disponibles para calibra ¥ obtener buenos reultados anltios a partir de Ins lecturas instrumentales. Esta seccién describe los procedimientos recomendados por el Water Research Centre (WRC) de Inglaterra, mediante su Informe Técnico N° 32. Aguf s6lo se incluyen aquellos procedimientos que se usan para la calibracién y evaluacién del sistema Autoanalizador I (AAII). Para mayores detalles puede consultarse el mencionado informe. E] uso de métodos de calibracién y evaluacién apropiados depende de la exactitud requerida para los resultados analfticos de un programa en particular (algunos pardmetros pueden requerir diferentes), y del tipo de instrumento que se use (por ejemplo el AAI oel AID. Por ello, no es posible usar un mismo procedimiento para todas las situaciones; en su lugar, se pone énfasis en principios generales y sugerencias sobre los procedimientos que pueden usarse en diversas aplicaciones. 4.2.2 Calibracién La respuesta de los sistemas AAI se obtiene en unidades % T (porcentaje de transmisién), mientras que la respuesta para los sistemas AAI se obtiene en absorbancia. Esta diferencia puede deterinar el uio de diferentes méodos en algunos aspectos de a calibracin, El sistema AAII es mds simple y su uso se esté difundiendo; éste se describe a continuacién. Sistema AAIT El procedimiento que se recomienda para cada lote de muestras en las que se va a medir un parémetro particular es el convencional, el que consiste en calibrar el equipo mediante el andlisis de soluciones patrén, y luego el de muestras. El andlisis de patrones se repite periddicamente, Generalmente se incluye uno de concentracién cero y otro de concentracién parecida a la de las muestras que se van a medir. Los distintos aspectos de este método se discuten en las secciones 2.1.1 a la 2.1.6, las cuales pueden estudiarse conjuntamente con la figura 3, como una manera de verificar los pasos seguidos para lograr una calibracién éptima.= 34- 4.2.2.1 Estabilizacién pretiminar del sistema Al inicio, debe medirse la solucién de lavado en forma continua hasta que la respuesta del instrumento sea estable. La experiencia indicard el tiempo requerido; sin embargo, éste puede variar de parémetro a pardmetro. 4.2.2.2 Seleccién de las soluciones patrén o esténdares de calibracién En la calibracién inicial, por lo general deben emplearse seis soluciones patrén 0 estindares de calibracién (incluido el blanco*). Estos esténdares deben tener una estrecha relacién con las concentraciones de 0.0 Cm, 0.2 Cm, 0.4 Cm, 0.6 Cm, 0.8 Cm y 1.0. Cm, en donde Cm representa la mayor concentracién que debe cubrir la curva de calibracién, En un sistema particular es posible reducir el ntimero de soluciones patrOn o esténdar, Por ejemplo, si los anélisis muestran una curva de calibracién recta, los estandares correspon- dientes a 0,0 Cm, 0.5 Cm y 1.0 Cm son suficientes’, Las soluciones patrén o esténdares tienen que ser preparadas siguiendo instrucciones claras, tantas veces como sea necesario, de acuerdo a la estabilidad de las soluciones. 4.2.2.3. Respuesta inicial para los patrones o estindares 0.0 Cm y 1.0 Cm Silos cambios en las respuestas de los patrones o estandares 0,0 Cm y 1.0 Cm (durante el andlisis del conjunto de muestras) no tienen importancia, se puede colocar el instrumento en cero en el caso del blanco y en un nivel de respuesta méxima para el caso del esténdar 1.0 Cm. Luego, las concentraciones de las muestras se pueden leer directamente. Si hay cambios apreciables en las respuestas de los estindares 0.0 Cm y 1.0 Cm, es mejor registrar la respuesta. En el caso del blanco, en una escala ligeramente superior a cero y, en el caso de la solucién patrén o esténdar 1.0 Cm, un valor ligeramente menor al méximo de la escala. Con estas mediciones y experiencia, se puede determinar los valores correctos para realizar los ajustes. 1 E1termino “blanco” se refiere 2 una solucién de composicion idéntica a las otras soluciones patrén 0 ‘estndares, sin el analito. Se analiza exactamente como los otros patrones o esténdares, es decir, se ‘coloca en el recipiente para muestras (sobre Is rejila para las muestras)..-35- 4.2.2.4 Orden de los andlisis de los patrones o estdndares de calibracién El orden adecuado para el andlisis de los patrones o estandares de calibracién depende de ' naturaleza y magnitud de la contaminacién crurada' entre una solucién y otra. Es ideal Que Jos sistemas se seleccionen y operen empleando una relacién muestra/agua tal que la contaminacién cruzada carezca de importancia, Sin embargo, es necesario conocer: (i) la relacién muestra/agua de dilucién, (ii) el auimero y estabilidad de las muestras a ser analizadas, y (iii) la exactitud requerida (error aceptado). Con frecuencia aparece alguna de las siguientes ‘contaminaciones cruzadas: a) Contaminacién cruzada de poca importancia En este caso, por lo general, el orden de los andlisis carece de importancia; sin embargo, si lo tomamos en cuenta el proceso se hace mds simple. Para ello, podriamos seguir el siguiente orden: 0.0 Cm, 0.2 Cm, 0.4 Cm, 0.6 Cm, 0.8 Cm, 1.0Cm y 0.0 Cm. Estos siete andtisis deben Hlevarse a cabo después del control inicial del agua de dilucién y de la solucién patrén o esténdar 1.0 Cm. b) —Contaminacién cruzada de porcentaje constante Cuando una solucién se mezcla parcialmente con la solucién que la precede y el grado de mezcla es constante, el orden del andlisis (a) de la figura 2 produciré una curva de calibracién ‘con una pendiente menor que la real, Este efecto, a menudo, puede carecer de importancia. Sin embargo, se puede reducir mediante el siguiente orden en los andlisis de los patrones 0 esténdares 0.0 Cm, 0.4 Cm, 0.2 Cm, 0.8 Cm, 0.6 Cm, 1.0 Cm, 0.0 Cm. Este orden asegura la anulacién de los errores positivos y negativos producidos por contaminacién cruzada, ) Contaminacién cruzada debido a la absorcién En algunos autoanalizadores, los compuestos de color suelen ser absorbidos en la superficie del tubo, celda de flujo continuo, etc. Por ello, resulta comin que al pasar de una solucién de alta concentracién a una de baja concentracién, aumente la contaminacién cruzada. Esto se puede apreciar observando los residuos que quedan en la parte superior. En estas condiciones, es mejor analizar los esténdares en orden ascendente, es decir 0.0 Cm, 0.0 Cm, 0.2. Cm, 0.4 Cm, 0.6 Cm, 0.8 Cm, 1.0 Cm, 0.0 Cm y 0.0 Cm. Si la contaminacién fuese de grandes proporciones, podria resultar necesario analizar tres blancos sucesivos cada vez que se La mayor contaminacion cruzada puede ocurrir cuando las muestras contienen componentes absorbidos €en las superticies internas de los sistemas de los autoanalizadores. Por ello, debe prestarse especial atencidn @ los posibles efectos debidos a la contaminacién cruzada. Por ejemplo, cuando se analizan afiuentes que contienen aceites y grasas, la magnitud de la contaminacién cruzada puede evalvarse mediante el andlisis de tres porciones de un estandar 0.9 Cm, tres porciones de un estdndar 0.1 Cm y ‘tes porciones adicionales del esténdar de 0.9 Cm.36 - analice una solucién de concentracién alta; la respuesta del primer blanco se usa para evaluar los resultados dei tercer blanco de cada grupo de tres. d) Otros tipos de contaminacién cruzada ‘Si Ja contaminacién cruzada es de importancia, pero su naturaleza es diferente a la de (b) y (©), Se requiere de otro orden de andlisis, seleccionado de acuerdo con la experiencia local. 4.2.2.5 Controles regulares de calibracién durante cada perfodo Lo ideal serfa que la curva de calibracién no sufra cambios de consideracién durante un perfodo completo de trabajo, por ello, vale la pena tratar de mejorar el rendimiento analftico para lograr estabilidad? en las mediciones. Sin embargo, esto no siempre puede lograrse, atin ast, la estabilidad siempre debe confirmarse en forma experimental mediante el control periédico de la calibracién, a) Contaminacién cruzada de poca importancia En este caso, por Jo menos se necesitan, dos soluciones patron o estindar para el control de la calibracidn; un blanco para verificar el cero y una solucién patrén o estdndar para verificar la pendiente de la curva de calibracién, En forma regular y periédica se debe analizar un patrén o esténdar de 1.0 Cm y otro de 0.0 Cm en este orden’. El niimero de muestras que se debe analizar entre cada control‘ se trata en la seccién 3. b) — Contaminacién cruzada actual Se debe tratar en lo posible que las muestras que se analizan en cada lote tengan una concentracién bastante similar; aunque, obviamente, dicha concentracién puede variar de un lote a otro. Cuando se adopta este método, por lo general resulta conveniente que se realicen algunos cambios en los procedimientos de (a). ‘La concentracién del patrén o esténdar de control debe ser similar a la de las muestras de su lote. Por ello, puede necesitarse soluciones patrén de control con diferente concentracién, de acuerdo al lote de muestras a analizar; 0 sea, las concentraciones de las soluciones patrén de control pueden variar de un grupo a otro. + Los fabricantes de Autonnalizadores Technicon exigen que la deaviacin de los sistemas AAII no sea mayor al 2% Por hora; en cato de que la detviacién fuera mayor, Ia compahita Technicon debe resomendar medidas al especto. + Por lo general, se espera que el esténdar de 1.0.Cm, que es e de mayor sensibilidad, permita detectar los cambios en la pendiente de la curva de calibracién. * De aqui en adelante, usaremos el término grupo o lote para referimos a los andlisis que se realicen entre Js controles de calibracién sucesivos.37- 1, estaprLTzAcron ree sacelén 2.1.10 dodi tate de a soluctén de Lands contirus fasts que acto adecundaanta tle. 2. ANSTE INICIAL DE LAS RESPUESTAS PARA Los ESTANDARES eee y 8c (Secon 2.1.39 ar savor concentracion dal rango 1 ser calibrade a necttable.s trate SS tn peupuecta ar Ineetabte 23. AMLISIS OF (05 ESTAR DE cautaeaciow eceign 2.1.0 FIGURA 2 PROCEDINIENTOS PARA LA CALIBRACION DE LOS SISTEMAS AA11= 38- 4 GEO REGULAR DE LA eALIORUCION OURINTE ADA CoRRIOA Saccien 2.1.3) SI hay contaninectén eruzada O18G Gee Cumndo ws poutble, con cade fot] ouo gufa general, las prosbas tas musetras Aen nar de core ee eae centracign slallar y doe porcio- 15 anblisi (mventras y prve oe bes de control de salida) 46 ser ral izaseng at ote, en realtor, 5. REED DE LA CALIBRATION FINAL (Gcclen 2.1.69 Oanrh dipnares S VARS-39- ii, Se debe analizar sucesivamente dos porciones del blanco en forma conjunta con el patrén de verificacién, ya que la primera puede proporcionar una lectura més elevada de lo normal. iii. Asf mismo, es necesario analizar dos porciones sucesivas de la primera muestra del lote, ya que la primera puede dar resultados erréneos. En este método debe tomarse en cuenta més factores que permitan observar e indicar que la contaminacién cruzada no tiene mayor importancia, 4.2.2.6 Control final de la calibracién Si no existe la seguridad de que la curva de calibracién siga siendo lineal durante todo el perfodo, entonces debe volverse a analizar todo el conjunto de soluciones estdndares iniciales de calibracién, Sin embargo, siempre que la curva de calibracién se prepare al inicio y se verifique durante un perfodo, seré suficiente realizar el andlisis de las dos soluciones patron que se especifican en la seccién 2.1.5, para conéluir este perfodo. 4.2.3. Andlisis de las muestras 4.2.3.1 Niimero de andlisis que deben realizarse entre cada control de calibracién El nimero de andlisis que se realice entre cada control de calibracién depende tanto de la estabilidad de ta calibracién, como de la precisién que se requiera. En general, es conveniente realizar 15 andlisis entre cada control de calibracién, nimero que puede ser variado de acuerdo a la experiencia. Dentro de estos 15 andlisis se analizarén conjuntamente muestras y soluciones patrones 0 estindares de control (véase la seccién 5). 4.2.3.2 Orden del andlisis de las muestras Cuando la contaminacién cruzada en muestras sucesivas carece de importancia, el orden en que se las analiza tampoco tendré importancia. Por lo tanto, el orden lo determinard la estabilidad de las muestras. Si la contaminacién cruzada es importante, los errores que surjan de esta fuente deben controlarse mediante el andlisis de muestras, de acuerdo a un orden predeterminado que permita minimizar los errores de concentracién de las muestras sucesivas y los patrones o estindares de control. (Véase también la seccién 2.1.5 (b)).4.2.4 Evaluacion Sistemas AAI 4.2.4.1 Preparacién de la curva de calibracién Si la calibracién es estable durante una corrida, los valores de la concentracién podrén leerse directamente de los registros 0 de la impresora. En este caso no se requeriré de una curva de calibracién, Algunas veces es conveniente usar este método; sin embargo, se prefiere el que se describe en el siguiente parrafo. Si la curva de calibracién varia durante un perio, se sugiere emplear el siguiente procedimiento. Se traza una linea para unir las respuestas de: () el primer blanco, exactamente antes del primer patrén de calibracién y Gi) _ el dltimo blanco de la serie inicial de patrones de calibracién (seccién 2.1.4), Las alturas méximas de todos esos patrones 0 esténdares, se miden a partir de la linea base y se grafican contra las concentraciones conocidas. La mejor linea recta que se obtenga de Ja unién de los puntos, constituye la curva de calibracién. Si se sigue el procedimiento que se delined en la seccién 2.1.4 (b), el pemiltimo blanco debe registrarse como un punto y la curva de calibracién se traza a partir del origen, Cuando los resultados se obtienen con una impresora, las lecturas de los dos blancos, (@ ¢ (ii), de Ja serie inicial de calibraci6n, deben examinarse con el fin de determinar si es necesario hacer alguna correccién a la desviacién de la linea base. Si fuera necesario, las lecturas de la impresora o del cuadro de registros se usan como respuestas analiticas y se corrigen sobre la base que se establecié en el pérrafo anterior. 4.2.4.2 Verificacién de la curva de calibracién Con el fin de definir las respuestas de las determinaciones sucesivas a partir del blanco’ a través de cada corrida, se traza una I{nea apropiada en el registro y a partir de ésta se miden las alturas méximas de las muestras y patrones o estindares de verificacién. Las concentraciones que corresponden a las alturas méximas de los patrones o estindares de verificacién deben obtenerse a partir de la curva de calibracién, En caso de que as concentraciones se encuentren cerca del valor real, podré emplearse la calibracién inicial para todas las muestras durante la corrida. Si las concentraciones que se obtienen para los patrones © esténdares de concentracién difieren sisteméticamente del valor real por un gran margen, las $ Si se usa el procedimiento delineado en la seccién 2.1.5 (bl, esta linea se debe trazar a partir de las. respuestas del segundo blanco de cada par.-41- respuestas que se obtuvieron para los patrones de verificacién deben emplearse en la elaboracién de una serie de curvas de calibracién, Cuando los resultados de cada lote de muestras controladas con un patrén de verificacién no varfan en forma apreciable, se puede usar otra curva de calibracién. Cada una de estas curvas de calibracién, se obtiene por medio de la altura méxima del patrén de verificacién corregido por el blanco graficado contra la concentracién de los patrones y dibujando una linea entre el punto del patron y el origen. Otra vez si se usa impresora y se ve la necesidad de crear una serie de curvas de calibraci6n, éstas deben efectuarse, teniendo en cuenta el proceso anterior, 4.2.4.3 Obtencién de resultados analiticos de las muestras Cada medida de la muestra, corregida por la altura méxima del blanco, se convierte en concentraci6n al usar la curva de calibracién apropiada (véase la seccién 4.2.2.5 (b), punto (ii)). 4.2.5 Control de calidad analitica Para estimar la precisiGn de los resultados analiticos se realizan pruebas experimentales. Estas se discuten en detalle en (1) y (2). Las prucbas requeridas se eligen teniendo en cuenta su aplicacién particular; sin embargo, la siguiente informacién puede resultar de utilidad. Las soluciones patrén o esténdar pueden emplearse para verificar la precisién y algunas fuentes de errores sistemdticos. Si la calibracién inicial para analizar muestras se usa durante una corrida, la solucién patrén 0 esténdar de verificacién (seccién 2.1.5) actia como un estindar de control'. Por el contrario, si ese patrén o esténdar de verificacién se usa para definir curvas de calibracién (seccién 4.1.2) es necesario emplear otro patron o estindar para el control de calidad. La concentraci6n que constituye el estdndar de control, puede ser igual o diferente del estindar de verificaciOn, segtin se requiera. En documentos como el Technical Memoréndum TM 56 (2), se discute sobre la seleccién apropiada de la concentracién del patrén. Si ademés del patrén o estindar de verificacién, se analiza un patrén o esténdar de control, éste debe ser el diltimo que se realice antes que se midan los esténdares de verificacién con cada lote de andlisis (seeci6n 2.1.5). Los resultados requeridos para el control esténdar, deben evaluarse a partir de la curva de calibracién que se emplea para las muestras del mismo lote. Asimismo, una muestra por lote se analiza por duplicado. Un esquema simple puede ser el analizar una segunda porcién de la primera muestra de cada lote. Este andlisis se realiza antes del de los patrones o estdndares de control y si éstas no se analizan, se efectia antes de los patrones o estindares de verificacién. i termino “estandar de control* se refiere a una solucidn esténdar que se analiza y evalia como muestra. Ei resultado de este andlisis, se emplea en el control de calidad analitica,-42- ‘Mientras mayor sea la experiencia con respecto a la precisi6n de los resultados, la confiabilidad de los sistemas analfticos aumenta, pudiéndose reducir pasos dentro del control de calidad analitica. Por ejemplo, tanto las mediciones del esténdar de control, como el de la muestra duplicada, pueden aplicarse en lotes altemnos y no en cada lote, La calibracién del autoanalizador se efectia con cada grupo de andlisis. Al prepararse (como usualmente se hace) patrones o estindares de control a partir de la misma solucién cestdndar que se usa para preparar los patrones o esténdares de calibracién, los resultados de los patrones de control no revelardn exrores sistemdticos causados, por ejemplo, por el empleo de soluciones patrones o esténdar incorrectas 0 soluciones (reactivos) deterioradas, Sin embargo, se recomienda mantener el control de la calibracién y operacién de los instrumentos. més sensibles. Cambios repentinos o pequefias desviaciones ameritan una revisién de los patrones © estindares y de los reactivos.ti 2. -43- EJEMPLOS DE AUTOANALIZADOR CON UN SOPORTE DE MUESTRAS Sistemas AAIL Con ef fin de ilustrar los diferentes aspectos vertidos en las secciones 2, 3 y 5, se muestra algunos ejemplos sobre el orden en que deben analizarse las soluciones Contaminacién cruzada de poca importancia CALIBRACION ESTABLE CALIBRACION INESTABLE Prueba No. Solucién Prueba No. Soucion | 1 Blanco 1 Blanco 26 Patrones de calibracién 26 Patrones de calibracién 7 Blanco 7 Blanco 8-20 Muestras 1-13 8-20 Moestras 1-13 21 ‘Muestra 1 21 Muestra 1 2 atrones de control 22 Patrones de control 2B Blanco 23 Patrones de calibracién 24.37 Muestras 14-26 24 Blanco 38 Muestra 14 25-37 Muestras 14-26 39 Patrones de control 38 Muestra 14 40 Blanco 39 Patrones de control 41 Ciclos repetidos 8-23 40 Patrones de calibracién 4 Ciclos repetidos 7-233. Contaminacién cruzada presente CALIBRACION ESTABLE CALIBRACION INESTABLE Solucién Prueba No. Solucién 1 Blanco 1 Blanco 2 Blanco 2 Blanco 38 Patrones de calibracion | 3-8 Patrones de calibracién 9 Blanco 9 Blanco 10 Blanco 10 Blanco 11-23 Muestras 1-13 11-23 Muestras 1-13 24 Muestra 1 24 Muestra 1 5 Patrones de control | 25 Patrones de control 26 Blanco 26 Patrones de calibracién 27 Blanco 27 Blanco 28-40 Muestras 14-26 28 Blanco 41 Muestra 14 29-41 Muestras 14-26 42 Patrones de control | 42 Muestra 14 a Ciclos repetidas 9-25 | 43 Patrones de control 44 Patrones de calibracién 45 Ciclos repetidos 9-26 i Véase la seccién 4.2.2.4 donde se establece el orden de los andlisis de los patrones 0 esténdares de calibracién. 4.3 Procedimientos de calibracién y de control de calidad mediante la espectrofoto- metria de absorcién atémica En general, la espectrofotometria de absorcién at6mica se encuentra libre de muchos de los errores comunes a otros andlisis quimicos. En lo que respecta al andlisis de metales, Ia técnica es bastante espectfica y sus mediciones pueden ser muy precisas y estar relativamente libre de errores sistemdticos. Sin embargo, existen ciertas fuentes de error que si se presta atencién al proceso de calibracién y los procedimientos de control de calidad pueden ser identificados, corregidos y controlados. Antes de establecer los procedimientos de calibracién y de control de calidad, es necesario discutir brevemente sobre algunas definiciones y principios bésicos. En primer lugar, en este documento se define al método analitico como “El grupo de instrucciones escritas que definen completamente al procedimiento que debe adoptar el analista, con el fin de obtener el resultado analitico que requiere”. Bajo esta definicién, el método-45- analitico debe ser especifico y, si se quiere obtener buenos resultados, el analista debe cefiirse a las instrucciones para desarrollar la medicién. Dado que el método esté formado por un “grupo de instrucciones escritas", no es posible decir, que “el método es preciso”. Mas bien debe decirse que los resultados analfticos tuvieron una precisién de". Diversos laboratorios usan el mismo método, sin embargo, el que ‘obtengan los mismos resultados, tanto para Ja precisién como para el error sistemAtico depende de c6mo se hayan realizado los andlisis. Esta afirmacién no excluye que el método pueda tener tendencia inherente a obtener resultados imprecisos 0 errores sistemdticos. Sin embargo, el grado de error sistemdtico, asf como los valores espectficos depende del desempefio de cada laboratorio. El requerimiento de que todos los blancos, patrones o estdndares y muestras se analicen exactamente por el mismo procedimiento, tiene estrecha relacién con la definicién antes mencio- nada, puesto que permite reducir el error sistematico asociado a la calibracién o blanco. Si los procedimientos que se usan para analizar los blancos, patrones o esténdares y muestras difieren en algiin punto, el analista deberd determinar experimentalmente si esta diferencia origina errores sisteméticos aceptables. En el anexo se trata el tema de estimacién del “limite de deteccién" de forma independiente. En los andlisis de trazas, generalmente se preficre “corregir el blanco" de los resultados analiticos de las muestras (p.c. resultado = resultado de la muestra menos el resultado del blanco). En el procedimiento de calibracién que se sigue en el CEPIS/LAB primero se coloca la aguja del instrumento en cero con el blanco (p.e. blanco del reactivo), de esta manera, la correccién por el blanco se convierte en una parte inherente del método analftico. Por otro lado, para que el procedimiento de correccién del blanco sea adecuado, es necesario que se corrija el blanco de cada una de las muestras. Si se usa el procedimiento de calibracién que se ropone, el instrumento debe colocarse en cero con el blanco cada vez que se requiera medir niveles bajos de trazas de metales. Si el resultado de la muestra es mayor que el blanco, no se necesitaré realizar ninguna correccién ni repetir el andlisis, En las secciones siguientes s6lo se discutir los procedimientos de calibracién que deben seguirse al analizar un grupo de muestras (4.6 més). Cuando se analicen pocas muestras, podré usarse cualquiera de los métodos que se describen en el capitulo sobre "Recoleccién y Manejo de Datos". Una vez que los principios han sido mencionados y comprendidos se procederd a discutir los procedimientos de calibracién y de control de calidad espectficos.- 46 - En un laboratorio se utilizan diversos métodos de andlisis, sin embargo, para los Propésitos de este estudio, los métodos pueden clasificarse en tres grupos: (1) Metales disueltos en agua - Filtracién a través de un filtro membrana de 0.45 u. e inyeccién acuosa directa. (2) Cantidad total de metales ~ DigestiGn, seguida de inyeccién acuosa, en el agua 3) Cantidad total de metales ~ Digestién vigorosa, seguida de inyeccién en suelos, sedimentos o lodos acuosa. En ciertos casos se usa otros métodos de anélisis (p.c. extraccién por solvente); al Tespecto, debe consultarse al Coordinador de Garantfa de Calidad en qué condiciones es itil aplicar estos procedimientos, asf como todo lo relacionado con los procedimientos de calibracién y control de calidad. En el primer caso, se suele preservar las muestras de agua con HNO; (3 ml por litro) 1:1 redestilado 0 de calidad ultrapuro para andlisis de trazas. En consecuencia, todos los blancos y los patrones o esténdares deben prepararse con una cantidad similar de HNOs; y seguir las, instrucciones para la calibracién. Esto se hace con el fin de no confundir conceptos sobre la calibracién y el control de calidad que se esté tratando. Esta eleccién es arbitraria puesto que, si se desea, los datos de la determinacién de los Ifmites de detecci6n en diversos grupos pueden acumularse, conjuntamente con los de la calibracién. El procedimiento de calibracién es como sigue: (1) Se coloca la aguja del instrumento en "cero" con el blanco adecuado al andlisis (p.e. blanco con HNO; agua bidestilada o solvente). @) Se calibra con un minimo de cuatro patrones o esténdares. @) Se analiza muestras (hasta nueve). (4) Se analiza el patrén o esténdar de verificacién de concentracién equivalente a 0.9 Cm, donde Cm es el limite superior de la concentracién que mide el método analftico, (5) Si es posible, se analiza un segundo est4ndar de verificacién que equivale a 0.2 Cm. (© Se repite los pasos (3 al 5) hasta terminar de analizar las muestras. En este primer caso, que podria usarse para el andlisis de aguas de consumo, u otro tipo de aguas limpias, no habria diferencia entre el andlisis de patrones o estdndares de calibracién y los de verificacién.-47- Los resultados de los andlisis de patrones o esténdares de verificacién se registran en los formularios que tiene el laboratorio para tal fin. Una vez analizado un buen ntimero de patrones © esténdares de verificacién (p.c. 20 0 més), se puede preparar las cartas de control, y los subsiguientes patrones o esténdares de verificacién pueden usarse como esténdares de control. Para el segundo tipo de andlisis (p.e. presencia total de metales en e! agua) se requiere de digestin. Si, tanto los blancos como los patrones o estindares y las muestras se analizan siguiendo exactamente el mismo procedimiento, la calibracién serd idéntica a la que se emples en el caso 1. Sin embargo, con frecuencia, se preparan patrones o estindares de calibracién directamente con HNO, diluido, mientras que las muestras se digieren antes del andlisis. Al seguir este procedimiento, también se debe analizar un patrén o esténdar de verificacién que haya pasado por el proceso de digestién (p.e. analizar un patrén 0 esténdar de verificacién por medio del mismo procedimiento que se usé pata la muestra). El patron o esténdar de verificacién provee de informacién sobre la precisiGn, pero, ademés, indica si en la calibracién hay algtin error sistemético. Del mismo modo que el patrén o estindar de verificacién, el blanco debe pasar por todo el procedimiento, incluyendo la digestién, con el fin de proveer una base para la correccién del blanco. Se debe enfatizar que esto s6lo es necesario cuando la calibracién de patrones 0 estindares se realiza de manera distinta a las muestras. En suma, se tiene dos posibles procedimientos de calibracién para el segundo tipo de andlisis: (a) Cuando los biancos, est4ndares y muestras se procesan en forma idéntica, tanto la calibracién como el control de calidad se efectian de la misma forma que en el caso 1. (b) Cuando los estindares de calibracién se analizan en forma diferente que las muestras: (1) Se coloca la aguja de! instrumento en "cero" con el blanco con HNO,. 2) Se calibra directamente con los esténdares preparados con HNO). @) Se analiza las muestras (hasta 9). (4) Se analiza el patrén o esténdar de calibracién de la concentracién que equivale a 0.9 Cm, utilizando un patrén o estdndar de verificacién durante todo el procedi- miento (p.e. incluye la digestién). (5) Si es posible se analiza un segundo patron o esténdar de verificacién de una concentracién que equivale a 0.2 Cm, usando el procedimiento descrito en (4), (©) Se analiza el blanco (p.e. usar el blanco durante todo e! procedimiento), requerido para hacer la "correccién por el blanco" de los resultados de las muestras. Asimismo, se acostumbra determinar el imite de detecci6n a partir de la variabili- dad del blanco; por ello en cada grupo se analiza un segundo blanco.- 48 - Finalmente, el principio bésico que consiste en analizar de la misma forma blancos, patrones o estindares y muestras no es posible en el andlisis de suelos, sedimentos y lodos. No hay forma de preparar un blanco o un patrén o est4ndar de suclo, ya que es imposible tener la seguridad de que el metal de interés esté ausente de la muestra del suelo que se usaré para preparar el blanco y el patrén o estdndar. Incluso, la mayorfa de los suelos, contienen trazas de casi todos los metales de interés. ‘Debido a la complejidad de las matrices de los suelos, es muy frecuente encontrar interferencias quimicas, adems de la presencia de metales. Por ello, usamos el método de calibracién de adicin de un patrén o esténdar, con el fin de reducir el error por las interferen- cias, En este método se realiza una calibracién preliminar con patrones o esténdares diluidos con HNO. Luego, se analiza la muestra y se registra la absorbancia resultante. Se separa alfcuotas de la muestra y se efectian adiciones del analito de interés. Estas adiciones corresponden al 50, 100 6 150% de la cantidad de analito que se supone contiene la muestra, las soluciones se analizan y se registran las correspondientes absorbancias. Posteriormente, se traza una Ifnea entre las absorbancias y las concentraciones, como se indica en la Figura 1, en Ja cual puede leerse la concentracién de la muestra. Este procedimiento puede corregir algunos errores sisteméticos causados por las interferencias; sin embargo, no puede corregir todas las fuentes de errores sistemdticos. Para corregir el error por el blanco, se hace por medio del andlisis de blancos, de acuerdo al método establecido (p.e. uno debe pasar por el procedimiento de digestién). En conclusiGn, se usa el siguiente procedimiento para el andlisis de suelos, sedimentos y lodos.-49- Cero Absorbonce Cone Absorbancia Adicién 0 Addn 1 Addn 2 ‘Adda 3 cero, No adicién Addn det 50% Addn del 100% Addn del 150% Cone. de la ale canti- a le cantided ala cantidad muestra dd supucsta sspucata supuesia Figura 4 CURVA DE CALIBRACION DE ADICIONES ESTANDAR-50- (dd) ‘Se coloca “cero* con el blanco de HNO, diluido. 2) _Secalibra directamente con los estdndares preparados con HNO; (es suficiente con una calibracién aproximada que usa un patrén o estindar simple). (3) Se analiza la muestra (determinar la absorbancia de la muestra). (4) Se hace tres adiciones estandar sobre la base de la estimacién preliminar de la curva de calibracién y se analizan como sigue: (@) adicién del 50% a la cantidad supuesta, (b) adicién del 100% a la cantidad supuesta. (© adiciéa del 150% a la cantidad supuesta. (5) Se elabora un diagrama que contiene cuatro valores de absorbancia obtenidos experimentalmente, como se indica en la figura 3 y se hace una inferencia con el fin de determinar la concentracién de la muestra 1. (6 Se repite los pasos del (3 al 5) con todas las muestras que se van a analizar, A pesar de que el procedimiento mencionado se usa para analizar muestras del suelo!, sedimento o lodo, también se usa en el andlisis de muestras acuosas con matrices complejas. Para determinar la recuperacién se usa un estdndar de adicién simple. Tomando como base esta recuperacién se decide si es necesario realizar el procedimiento completo de adicién esténdar. Para mayores detalles, vea la seccién correspondiente al tema en el Manual de Métodos de la EPA. Cuando se sigue el procedimiento de adiciones patrén o estindar, no siempre se necesita llevar a cabo el andlisis de los patrones o estandares de verificacin, puesto que los esténdares estén incorporados dentro del procedimiento mismo. Sin embargo, es esencial que la prepara- cién de las soluciones patrén o estdndar sea exacta, con el fin de evitar errores sisteméticos dentro del procedimiento analftico. Por ello, se pone extremo cuidado en la preparacién de las soluciones patrones o estdndares y cuando se hacen las adiciones (exactas) a las muestras. En discusiones precedentes, se ha puesto énfasis en el uso de soluciones patrones 0 estindares para verificacién y control de la precisién de los andlisis. El uso de soluciones esténdar también puede indicar la presencia de errores sisteméticos en el procedimiento de calibracién, Asimismo, los andlisis de los blancos constituyen un medio para evaluar, detectar y corregir una posible contaminacién de los reactivos, y para estimar el I{mite de deteccién. De otro lado, se puede usar otros procedimientos de control de calidad para ciertos tipos de muestras, como las pruebas de control de precision y de recuperacién, de acuerdo a los objetivos del programa de medicién. La precisién de los andlisis de las muestras se evalilan mediante el andlisis regular de dos porciones de una muestra real y la grfica de la diferencia de resultados: de la primera y de la La palabra “suelo” se emplea aquty en el resto de ta discusién para denominar al sedimento, lodo y suelo.-S1- segunda porcién, tomando como valor medio cero. Ei desvio patrén que se usa para fijar, tanto Jos limites de advertencia como los de rechazo en la carta de control es dos veces mayor a la desviacién estdndar dentro de cada lote de resultados individuales sujetos a la misma desviacién patrén que est siendo graficada, Este tipo de control esté limitado a muestras cuyas concentraciones tienen desviaciones patrén similares. Si se dan muchos rangos de concentracién © rangos de desviacién esténdar, se elaboran cartas de control en cada caso. Las pruebas de control de recuperacién de las muestras se realizan con el fin de evaluar errores sisteméticos que tienen su origen en las impurezas de las muestras. Las recuperaciones que se observan estén graficadas en una carta de control, que tiene como valor central la recuperacién teérica. Si los resultados de la muestra y la muestra enriquecida constituyen respectivamente R, y R, el resultado de la recuperacién A es: Si S, depende de la concentraci6n del analito y las concentraciones de las muestras varfan apreciablemente, ningtin valor de S, se aplicard a los resultados de las pruebas de recuperacién. Por ello, este tipo de control se aplica mas a muestras cuyas concentraciones no tienen mucha variaci6n. La cantidad del analito que se agrega a la porcién “enriquecida” de la muestra es la misma, En el capitulo sobre errores analiticos del Manual de Andlisis de la Contaminacién del agua se presenta una discusién detallada sobre las cartas de control con ejemplos experimentales. Si se requiere de ayuda adicional en la preparacién de las cartas de control, se debe consultar al Coordinador de Garantia de Calidad, En vex de oroperr un cograme de oe detos como ae inca ene ig 3, 3 Pune labor one ecuscion de represion lineal y su valor sbeokito ge toma como correspondiente ale cncenracin de lt muestra.-52- ANEXO 5 L{MITE DE DETECCION La teorfa sobre los Ifmites de deteccidn detalla, en el Informe Técnio N° 66 del Water Research Centre, pp. 44-49. Aquf s6lo se discute la aplicacién de esta teorfa en la espectrofo- tometria de absorci6n atémica y se pone énfasis en las mediciones y en el método de cAlculo. El fundamento para establecer el limite de deteccién es la variabilidad de la medicién del blanco. Con el fin de realizar este célculo, la variabilidad se mide como la desviacién esténdar dentro de un lote. Generalmente, una mejor estimacién se obtiene por medio de la combinacién de las desviaciones estindar que se obtuvieron a partir de las mediciones del blanco por Guplicado de varios lotes. Para obtener una estimacién preliminar del Ifmite de deteccién, se mide la variabilidad del blanco dentro de un mismo lote. Ambos procedimientos se discuten en este documento, El analista debe elegir cual es el procedimiento més apropiado y conveniente para el laboratorio. Antes de proceder a medir el blanco, el analista debe calibrar el instrumento. Esto es necesario si se necesita convertir los valores de respuesta del blanco a unidades de concentracién (Claro esté que para el registro directo de la concentracién, la respuesta luego de Ja calibracién se da en unidades de concentracién), El analista decide el procedimiento de calibracién que usard. El criterio primario que debe considerar es la capacidad para hacer el andlisis de suficientes soluciones patrones estindares, de tal forma que la variabilidad de la respuesta de los patrones o estandares no afecte la exactitud del célculo del limite de deteccién, Si el Iimite de deteccién se estima a partir de mediciones del blanco medidos dentro de ‘un mismo lote, se prefiere calibrar por medio de mediciones repetitivas (cuatro o ms) de una misma solucién patr6n o esténdar, cuya concentracién es aproximadamente 20 veces el valor del ‘Amite de deteccién probable. Luego, el resultado promedio de estas mediciones repetitivas se emplea para calibrar la respuesta del blanco, El que se utilice para calibrar un estdndar de una concentracién 20 veces el valor del limite de deteccién probable, se debe a que a menores concentraciones el error aleatorio de las mediciones podria generar errores inaceptables en Ia catibracién, Si el limite de deteccién se estima a partir de determinaciones del blanco (tomados por duplicados) en varios lotes de andlisis, 1a calibracién se debe realizar de manera normal (p.e. medicién de por lo menos cuatro soluciones patrones o est4ndares, con el fin de determinar el factor de calibracién). Para calibrar, se coloca el instrumento en cero, de acuerdo con el procedimiento descrito en la parte principal de este capftulo, Para ello se emplea un blanco (de reactivos). En algunos-53- casos es mds conveniente usar agua destilada en vez del blanco. Esta eleccién no debe afectar el resultado final, porque lo que interesa es la variabilidad del blanco y no los valores absolutos. ‘La estimacién del limite de detecciéa, a partir de la variabilidad del blanco dentro de un mismo lote, se debe realizar con once medicines por lo menos (diez grados de libertad). El cdlculo de la desviacién estandar dentro del lote es como sigue: 5_- Fin donde: x valores para las respuesta del blanco individuals n = niimero de los resultados Para estimar el Ifmite de deteccién de varios lotes a partir de determinaciones del blanco por duplicado, se calcula la desviacién esténdar dentro del lote de la siguiente manera: 7 ba (LL ‘2m donde: di = diferencia entre las determinaciones del blanco dentro de un mismo lote m ‘= numero de determinaciones del blanco medido por duplicado Para mayores detalles sobre el uso de esta fOrmula para el cdlculo de desviacién esténdar, véase el anexo 4 del capitulo "Procedimientos de Calibracién”.-Visible*. Finalmente, el limite de detecci6n también puede calcularse por medio de la combinacién de estimaciones de la desviacin est4ndar procedentes de lotes que contienen distinto nimero de determinaciones del blanco. En este caso, las desviaciones estndar se calculan para los lotes individuales y se aplica Ja ecuacién (1) ya mostrada. Luego, estos valores individuales se combinan por medio de la siguiente ecuacién: @) S=x = Niimero de los grados de libertad de las soluciones individuales usadas para estimar S,, La estimacidn de S, tiene v, grados de libertad. Por ejemplo, si se dan las siguientes mediciones del blanco en dos lotes: Lote 1: 0.29, 0.04, 0.13, 0.22, ug/l Lote 2: 0.35, 0.14, 0.03, 0.26, 0.08, 0.02, 0.17, 0.31, 0.07 ng/ ‘La estimacién de las desviaciones est4ndar para cada grupo es como sigue: S, = 0.1086 y S, = 0.1225 Las desviaciones del esténdar del blanco combinadas dentro del mismo lote, se calculan de la siguiente forma: Est. [30010867 + 6(0.12257 Sa = | mpe = | NCI Some” ones Después de calcular la desviacién esténdar del blanco, el Iimite de deteccién se calcula por medio de la siguiente formula: L = 2.83 &, Sp donde: LD —-= mite de detecci6n tar = coeficiente de la "t" de student al 10% para pruebas bilaterales con 11 g.l. Se = desviacién esténdar del blanco dentro de un lote. ‘De los datos del ejemplo, se puede calcular el Ifmite de deteccién: LD = 2.83 (1.795) (0.1189) 6 LD ~ 06 ug/l Nétese que los grados de libertad, en todos Jos casos, son iguales a la suma de los grados de libertad de cada lote individual y que los grados de libertad para cada lote es un grado menor que el ntimero de mediciones en el lote.-55- ANALISIS DE MERCURIO POR ABSORCION ATOMICA ‘Se corre los patrones 0 estdndares (el blanco y cuatro patrones o esténdares en el rango analftico). Se registra los valores de porcentaje de absorcién. Se corre las muestras desconocidas. Se registra los valores de porcentaje de absorcidn. Se convierte los valores de porcentaje de absorcién en absorbancia (A) usando la tabla. Se traza la Ifnea de A con relacién a la de concentracién (C) de los esténdares. (Se aplica la regresiGn lineal para establecer la linea de mejor ajuste. Se puede realizar esta ‘operacién con una minicomputadora y as{ se obtiene una copia del gréfico). ‘Se lee los valores de la concentracién de las muestras desconocidas, usando los valores de absorbancia (A). (Para concentraciones bajas, ¢s necesario realizar correcciones del blanco, con el fin de mejorar la exactitud de la medida). ) 2 3) 4) xd Se corte los patrones 0 est4ndares (el blanco reactivo y cuatro patrones o estdndares en el rango analitico). ‘Se registra los valores de porcentaje de absorcién. ‘Se corre muestras desconocidas y el blanco para la correccién de la absorcién base. Se registrar los valores del porcentaje de absorci6n. ‘Se convierte los valores del porcentaje de absorcién en absorbancia (A) usando la tabla. ‘Se corrige los valores de absorbancia (A) de las muestras desconocidas, substrayendo a las absorbancias de las muestras la absorbancia del blanco. Se traza la Ifnea de A con relacién a la de concentracién (C) para los patrones 0 estnda- res (se aplica la regresién lineal para establecer la linea de mejor ajuste). Se puede realizar esta operacién en una minicomputadora, para obtener una copia del gréfico.-56- TABLA I - VALORES DE ABSORBANCIA EN PORCENTAJE DE ABSORCION Para convertir la absorcién en porcentajes (%A) a absorbancia, buscar el porcentaje de absorcién que més se acerque a un digito entero en la columna de la izquierda; Jea la Iinea hori- zontal hasta llegar a Ja columna que corresponde a la décima del porcentaje deseado y lea el valor de absorbancia. Por ejemplo, el valor de absorbancia que corresponde al 26.8% de absorcién es 0.1355.ALELLE » a eas $3228 8828889 Nota: Determinar por medio de los registros de la computadora o por medio de célculos, la pendiente de la curva de calibracién. G(X) = 0.01599 + 0.02876 F(X) donde 0.02876 = pendiente = m Una vez que se conoce la pendiente y asumiendo que los valores corregidos de! blanco regresen a la concentracién cero, cuando la absorbancia es cero, convertir los valores de absorbancia corregidos del blanco en concentracidn, valigndose de la siguiente Telacién: c-™ A donde: C = concentracién en ug/l m = pendiente de la curva de calibracién ‘A = absorbancia. Los valores de concentracién que se sitéen por debajo del Iimite de deteccién en forma experimental, deben registrarse como (100 - 01 Dy - 52° para % « (1.00 - 0.01 DI d) R (1.00 + 0.01 Dy] ™ d donde: 2& = toos de student con (m-1) grados de libertad y un nivel de probabilidad de Qe 4.4.2.5 Determinacién de los blancos ‘Antes de procesar cualquier muestra, se demuestra con el andlisis de un blanco (la EPA Io denomina como un método del blanco con agua destilada) que todo el material de vidrio y los reactivos estén libres de interferencia. De igual modo, cada vez que se procesa un blanco, ‘0 cuando hay cambio de los lotes de reactivos para evaluar la posible contaminacién crdnica del laboratorio, se analiza un lote de muestras. Los valores de las determinaciones del blanco se usan también para la determinacién del Imite de deteccién. 4.4.2.6 Determinaciones de Ifmites de deteccién Los limites de deteccién dependen det tipo de detector, las caracterfsticas y cantidad de los compuestos interferentes presentes, y concentracién de la preparaciGn de la muestra. En la ausencia de picos interferentes, el detector de conductividad térmica es capaz de detectar cantidades de material en el rango de microgramo; el detector coulométrico en el rango de nanogramo; el detector de ionizacién de llama en el rango de 10 pg y los detectores de captura de electrones y termoidnicos en el rango de picogramo.-67- A continuaci6n, se describe el método usado para estimar el Ifmite de deteccién del método analitico. Este se basa en la variabilidad del blanco, donde el blanco es procesado siguiendo la totalidad del método analitico. El(los) compuesto(s) de interés, como normalmente sucede, no se presentan en el bianco y la respuesta de éste normalmente corresponde al ruido de fondo. En cromatografia de gases, una estimacién simple del Ifmite de detecci6n se basa en por lo menos diez andlisis de un blanco. Este procedimiento es especificado en varios métodos recomendados por la EPA con la siguiente férmula: AxAt LD (nai) = Bx At » X pail LD = Ifmite de deteccién en ug/l u otras unidades de concentracién apropiadas A = cinco veces el nivel de ruido en mm a un perfodo exacto de retencién correspondiente al compuesto de interés 0 el desplazamiento de la linea base en mm para el cero tedrico a un perfodo de retencién exacto correspondien- te al compuesto de interés B = altura del pico (mm) del patrén o estindar de concentracién igual aX pg/l Att = factor de atenuacién, " Nota: El estAndar de concentracién X yg/l debe ser minimo 10 veces el valor final estimado del limite de deteccién. ‘Muchas veces las interferencias en las muestras incrementan el ruido comparado con el fondo (background) del valor del blanco usado en el célculo del limite de deteccién. Si esta interferencia es seria, el limite de deteccién calculado no es valido. En este caso, si se necesitan hacer mediciones y las concentraciones estén cerca del Ifmite de deteccién, es necesario una extraccién més fuerte. Las constantes interferencias pueden invalidar la utilidad del Ifmite de deteccién de una muestra especifica, Se considera que el valor estimado es de utilidad cuando es caracteristica Propia del método analftico e indica que el laboratorio es capaz de cumplirlo bajo circunstancias controladas. El Ifmite de deteceién se calcula para un método analitico especifico. Por ejemplo, el método puede sefialar que se tome un litto de muestra, que se concentre a 10 ml, y que del extracto se inyecte 5 pl. Si se realiza cualquier desviacién de las instrucciones del método se debe esperar un cambio en el Ifmite de deteccién (por un factor correspondiente). Las desviaciones en e] método deben ser tomadas en cuenta cuando se reportan los resultados de las muestras naturales.-68- 4.4.3 Gufas para la revisi6n del cromatégrafo de gases INSTRUMENTO FRECUENCIA COMPUESTO A PROCEDIMIENTO REVISAR Cromat6grafo do gus con Diaria Resolucién y reproducti- El instrumento se acon- detector de captura de Dilidad de la relaci6a ——_dcion con un esténdar y lectrones Greafaltura del pico luego se calibra. Los estén dares so repiten cada 5 smuestras para actualizar la calibraciéa. Mensusl Contaminscién del DCE! La salida y el fondo det detector se monitorea para dotectar posible contamine- ign. Los DCE se timpian térmicamente el fin de ‘semana una vez por mes. Mensual Resoluciéa Si se conoce el estindar de ‘Cromstégrafo de gas con Anusl o cuando sea Contaminacid del DIF* detector de ionizacion de necessrio Tama Diaria Resoluciéa y reproducti- Dilidad de la relacién Srcalaltara del pico " DCE: detector de captura de electrones * DIF: detector de ionizacién de Hama 4.4.4 Revisién de las columnas cromatogréficas de gas PCB inyectado y se com- ‘para con ta del mes ante- rior. Se fimpia el detector ma- ‘mualmente usando un equipo do HP El instrumento se ovalia con un estindar calibrado. Los esténdares se repiten cada 5 mucstras para actus- lizar Ie calibracién, La revisién de las columnas cromatogréficas se leva a cabo midiendo el factor de pico asimétrico, Este factor compara la base de la segunda mitad del pico cromatogréfico con la primera mitad de éste, tal como se aprecia en la figura 6. Para cada tipo de columna se deben establecer los valores aceptables del factor de pico asimétrico. Por ejemplo, en la realizacién de andlisis de plaguicidas se acepta si el factor de pico de aldrin es menor que 2.Figura 6 CALCULO DEL FACTOR DE PICO BC Factor de a ‘actor de pico Ejemplo de célculo: Altura de pico = DE = 100 mm 10% de altura de pico = BD = 10 mm Ancho del pico a 10% de la altura de pico = AC = 23 mm AB = 11 mm BC = 12mm Por Jo tanto, el factor de pico = 12/11 = 1.1 44,5 Técnicas de inyeccion Una fuente frecuente de error en 1a cuantificacién de compuestos orgdnicos por cromatografia gas-Ifquido es la inyeccién de la muestra, ya que la cantidad de muestra que se inyecta no es reproducible. Porque la técnica de inyeccién no es de la uniformidad que se desea 0 es deficiente,-10- Antes de usar una jeringa se revisa que esté totalmente limpia, libre de residuos, porque la falta de limpieza puede estropear completamente el cromatograma. Se toma un tamafio de muestra moderado en un frasco que luego es sellado. Si el frasco de la muestra es pequefio y/o un buen nimero de muestras van a ser colectadas, el frasco es primero presurizado por inyeccién de un gas inerte (por ejemplo, el gas acarreador) en e! fraseo, Con una jeringa munca se debe obtener una muestra cuando hay presién negativa dentro del frasco de la muestra. Se empuja totalmente el émbolo, con cuidado de no tocarlo. Se agita el frasco con la muestra, Se toma la jeringa en forma vertical para atrapar al gas y que éste pueda ascender y escapar. Se inserta la aguja en el frasco, de tal forma que esté en su totalidad inmersa en la muestra. En seguida, se mueve el émbolo hacia afuera y a una distancia corta hasta humedecer la superficie interior del émbolo y del cuerpo de la jeringa, Esto neutraliza cualquier movimiento del liquido, debido a la capilaridad. Después, mediante bombeo, se retira el émbolo hasta llenar la jeringa entre un 5 y un 10%. Se retira la aguja, se toma la jeringa verticalmente, se lena la aguja cuidando que no presente burbujas o espuma. Se empuja el émbolo lentamente y sacude el exceso de Iiquido deteniendo el émbolo en la marca previamente seleccionada. El exceso de Iiquido de la aguja es descartado después que ésta se ha sacado del frasco, Si se descarga mientras se encuentra la aguja dentro del frasco, puede presentarse una pequefia pérdida de muestra al retirar la aguja. Se debe leer cuidadosamente la graduacién de la jeringa. La mejor manera es tomar la jeringa frente a los ojos quedando la parte final del émbolo en posicién horizontal. Esto elimina cualquier paralelaje que pueda causar lecturas erréneas. ‘También se recomienda que la parte final del émbolo, que contiene un volumen de Iiquido siempre sea lefdo en el “tope”, es decir, en el borde de la linea de calibracién, Esto eliminaré cualquier posibilidad de error, debido al espesor de la I{nea de calibracién. Mientras se lee el volumen contenido en la jeringa, se debe revisar de nuevo que no haya en la muestra burbujas o materia extraiia, Frote la aguja para limpiarla con un pafio, tenga cuidado de no Jlimpiar cualquier muestra fuera o e! extremo de la aguja y nos transfiera el calor que puedan generar los dedos a la aguja. En un répido movimiento, se introduce la aguja a través del septum del cromatégrafo y se inyecta la muestra. Inmediatamente después de inyectar la muestra se retira la aguja para prevenir la vaporizacién del liquido remanente en la aguja con el consiguiente resto. Después de que la aguja ha sido retirada, Ia jeringa puede ponerse verticalmente con la aguja hacia arriba y el émbolo empujado hacia afuera a una distancia corta. Esto arrasa con el Iiquido residual fuera de la aguja al interior de la jeringa, donde este volumen pueda medirse. La cantidad total inyectada puede determinarse restando el volumen residual del volumen original en la jeringa. ‘Otra técnica que puede usarse es succionar una pequefia cantidad de aire en la jeringa, tomar las muestras y finalmente otro poco de aire, Eso nos dard una especie de "sandwich" de liquido entre dos fracciones de aire. El volumen de la muestra Iiquida puede leerse exactamente por medio de las graduaciones de la jeringa. Después de introducir la aguja a través del septum, el émbolo puede empujarse totalmente. El aire delante de la muestra permite la medicién exacta del volumen de Ifquido contenido y el aire detrés del Ifquido permite que toda Ia muestra sea inyectada en el cromatégrafo, No habré residuos remanentes ni espacios muertos entre el extremo del émbolo y el inicio del contenedor de la jeringa. Uno de estos dos métodos-1- es recomendado particularmente si la jeringa esté equipada con una aguja desechable. El método del “sandwich” descrito sélo es usado para muestras que no se contaminen por el aire. Si este ultimo es un contaminante, la muestra puede ser puesta como "sandwich" entre dos capas del Bas acarreador. Para muestras pequefias de 0.05 a 1.0 microlitros se dispone de jeringas y agujas, con Jas cuales se toma la muestra Iiquida. La parte inferior del émbolo y la punta de la aguja forman parte del volumen total contenido en la jeringa. Esto asegura una medicién exacta de la cantidad inyectada y esencialmente elimina cualquier efecto final. El volumen de la muestra se lee en el contenedor como una jeringa ordinaria. Un problema especial es el muestreo de Ifquidos altamente viscosos. Con frecuencia, la viscosidad puede disminuir por calentamiento de la muestra en una jeringa protegida y mantenida a alta temperatura hasta el momento de la inyeccién; si ésta no contiene fracciones ligeras, las cuales serdn vaporizadas por la alta temperatura. Otra manera de muestrear es por encapsulado en un contenedor de metal o de vidrio. Otro método de manejo de muestras viscosas es el disolverlas en un solvente neutro de baja viscosidad. La solucidn puede manejarse ficilmente con una jeringa estindar. El problema es encontrar un solvente que no interfiera. Tal solvente es dificil encontrar para ‘muchas muestras, por lo que este método, que tebricamente es posible, en la préctica tiene poco uso. Algunas muestras lfquidas son manejadas bajo presién para obtener las fracciones de gas en solucién, La muestra puede estar contenida en un frasco con un septum fuerte. El problema es que tan pronto como la aguja es retirada del septum del frasco de la muestra, el cextremo de la aguja es expuesto a la presi6n atmosférica. El contenido y los gases presurizados en la muestra Iiquida se expandirin a través de la aguja y escapardn a la atmésfera. Sin ‘embargo, el didmetro interior de la aguja es pequeiio, 0.006 pulgadas 0 menos. Si se hace répidamente, puede taparse con un tapén de caucho 0 con una pieza pesada de material de septum, Para hacer esto se coloca un tapén contra el septum de bote de la muestra antes de insertar la aguja. La aguja perfora el tapén, antes del septum, Cuando la aguja se retira del frasco de la muestra, la punta queda dentro del tapén, entonces ésta se coloca contra el septum del cromatégrafo y Ta aguja se desliza a través de éste antes de entrar al septum a la columna. Con este procedimiento se mantiene dentro de la jeringa, muchos de los gases aunque algunos se pierden antes y después de los deslizamientos de la aguja.