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Trabajo prescrito N 3
Actividad enzimtica
1. Revisin de la literatura
Las enzimas son partes fundamentales en los procesos metablicos de los seres vivos. Estas
son molculas de naturaleza protenica que aceleran las reacciones bioqumicas (Franco
2007 p. 414). Estas protenas funcionan como catalizadores biolgicos que disminuyen la
energa de activacin de las reacciones que catalizan, de forma que aceleran sustancialmente
la tasa de reaccin. Existen miles de tipos diferentes de enzimas presentes en los organismos
vivos, las cuales son muy especficas para determinadas reacciones. Por ejemplo, la enzima
catalasa, la cual se encuentra en mayores concentraciones en rganos como el hgado y los
riones y ms baja en el tejido conectivo y los epitelios (Cspedes, et al. 1996). Estas
enzimas catalizan la descomposicin del perxido de hidrgeno, transformndolo en agua
y oxgeno (Daz 2006 p. 19). El perxido de hidrogeno es un radical libre, este tipo de
molculas son todas aquellas especies qumicas, cargadas o no, que en su estructura atmica
presentan un electrn desapareado o impar en el orbital externo, dndole una configuracin
espacial que genera gran inestabilidad. (Venereo 2002 p. 128). El H2O2, es un radical libre
toxico para las clulas; de manera que, su sintetizacin ayuda a los procesos biolgicas que
tienen lugar dentro de estas. Daz (2006) afirma que las actividades de la catalasa protegen
no slo de forma directa eliminando aniones suproxido y perxido de hidrgeno,
respectivamente, sino que tambin impiden la formacin del radical hidroxilo OH; la especie
reactiva derivada del oxgeno con mayor poder oxidante. (p. 19). Existen algunos factores
que inhiben en las reacciones de las enzimas. Segn Franco (2007) las enzimas son
inestables a altas temperaturas, a valores extremos de pH, etc., lo que eleva el costo al reducir
la vida til de la enzima. (p. 414). Altas temperaturas y un pH muy cido o alcalino pueden
desnaturalizar las enzimas, dejndolas incapaces de realizar la catlisis. Investigaciones
previas indican el efecto de la temperatura en la actividad enzimtica. Por ejemplo, Salas y
Lafuente (1999) demuestran que la catalasa puede ser una mejor enzima antioxidante al
operar en calor-inducido por la tolerancia de refrigeracin de frutas almacenados en fro de
mandarina Fortune (p. 2410). De la misma manera, existen unas molculas llamadas
inhibidores que reemplazan al sustrato porque presentan una estructura molecular similar y
se adhieren al sitio activo de la catalasa influyendo en su actividad enzimtica. Algunos de
estos son el cianuro, la azida, el sulfuro, la hidroxilamina, el paracetamol, la bleomicina, la
adriamicina, la benzidina y el paraquat (Cspedes, et al. 1996). Tambin, la concentracin
1
del sustrato puede inhibir en la catlisis de la enzima. Un estudio cintico muestra que la
catalasa de hgado de bovino (BLC: bovine liver catalase), que es una catalasa pequea, se
inhibe reversiblemente y se inactiva irreversiblemente a partir de 200 mM de H2O2
(Mestdagh, et al. 1996 p. 222).
El estudio de las enzimas catalasa es pertinente porque las especies de oxgeno reactivas
como el radical superxido, el radical hidroxilo y el perxido de hidrgeno (H2O2) se forman
durante la reduccin del dioxgeno en agua. Estas especies pueden daar las protenas, los
lpidos y los cidos nucleicos (Daz 2003 p. 76). Por lo que, la sntesis de estos radicales
libres contribuyen a mantener las clulas del organismo en buen estado. As mismo, hay
inhibidores de la catalasa usados en la medicina para distribuir un medicamento por el
organismo de forma ms eficiente; por ejemplo, la bleomicia y el paracetamol.
La desnaturalizacin de la enzima catalasa por altas temperaturas es uno de los principales
factores por los que se lleva a cabo esta investigacin. Esta desnaturalizacin puede tener
darse en organismos con una temperatura corporal muy alta (fiebre), causando problemas
graves de salud. Especialmente, en las enzimas presentes en el tejido de hgado, porque este
cumple el papel de recuperar y transformar numerosos txicos para hacerlos inofensivos
antes de eliminarlos y destruir los glbulos rojos y los glbulos blancos envejecidos, as como
ciertas bacterias presentes en la sangre. De manera que, la desnaturalizacin de las enzimas
del hgado podra afectar sus procesos metablicos. Por lo tanto, el objetivo de esta
investigacin es analizar el efecto que tienen diferentes niveles de temperatura en la actividad
enzimtica de la catalasa presente en el tejido del hgado.
2. Pregunta de investigacin
Qu efecto tienen diferentes niveles de temperatura en la actividad enzimtica de la
catalasa presente en el tejido del hgado de Bos taurus?
3. Hiptesis
H0: No hay diferencia significativa en los efectos sobre la actividad enzimtica de la
catalasa entre los niveles de temperatura.
H1: Hay diferencia significativa en los efectos sobre la actividad enzimtica de la catalasa
en al menos dos niveles de temperatura.
4. Variables
Independiente
Temperatura (C)
2
20 C
30 C 40 C
50 C
Dependiente
Actividad enzimtica de la catalasa
Controladas
Exposicin directa de la enzima catalasa al fuego
Masa de las muestras de hgado
Tiempo de medicin del porcentaje de oxgeno (60 s)
Inhibidores de la catalasa
Cantidad de sustrato
Enzimas catalasa presentes en el tejido epitelial de la mano.
Temperatura
No controladas
Bajas temperaturas antes del experimento (enfriamiento para mantener el hgado en un
buen estado)
Cantidad exacta de enzimas presentes en la muestra de hgado.
5. Seguridad en el laboratorio
Se debe evitar el contacto del reactivo H2O2 con los ojos y mucosas. Por lo que, para
manipularlo se deben usar los guantes de ltex; ya que, si se hace con las manos
desnudas, se podra inconscientemente frotar los ojos. En caso de que entre en sus
ojos, se deben enjuagar inmediatamente con abundante agua. Si se ingiere, se debe
enjuagar la boca y tomar agua.
6. Mtodo experimental
6.1 Materiales
Tabla 1. Materiales e instrumentos utilizados en el mtodo experimental
Una probeta
graduada 5 ml
0,05
Un vaso de
precipitados 200 ml
5 tubos de ensayo
Termmetro de
mercurio 1,0
Guantes de ltex
Balanza analtica
0,01
1 litro de agua
Una hielera
Cubos de hielo
Un mechero de
alcohol
Embudo simple
Vidrio de reloj
Mortero con pistilo
2 gradillas para
tubos de ensayo
Pinzas para tubo de
ensayo
Un bistur
Trpode
Rejilla metlica
Sensor de oxgeno
Vernier
Fsforos
Perxido de
hidrgeno (agua
oxigenada)
Hgado de res (800
g)
Servilletas
6.2 Procedimientos
1. Calibracin del sensor de oxgeno
Para calibrar el sensor de oxgeno se debi esperar 15 minutos para que este
detectara el porcentaje de oxgeno presente dentro del laboratorio.
2. Rotulacin de los tubos de ensayo
Se utilizaron 5 tubos de ensayo
En cada tubo de ensayo se escribi con un marcador el nivel de temperatura
correspondiente.
En el primer tubo de ensayo se escribi el nivel de 10 C, en el segundo 20 C y as
sucesivamente hasta llegar a los 50 C.
3. Extraccin de las muestras del hgado
Se sac los 800 g de hgado de la hielera. Se coloc anteriormente ah para que el
hgado se mantuviera en buen estado.
Posteriormente, el hgado fue puesto en agua a temperatura ambiente para que su
temperatura se regulara.
Se utiliz un bistur para extraer una muestra del hgado.
Se pes dicha muestra con la balanza analtica
Luego, se puso la muestra en una caja de Petri para mantenerla aislada del ambiente.
Se hizo lo mismo con las 5 muestras por nivel de temperatura.
Se procur que todas las muestras tuviesen igual masa; por lo que, si alguna
sobrepasaba o disminua los 30,79 g era cortada con el bistur hasta acercarse a la
cantidad de gramos requerida.
Para manipular las muestras de hgado se utilizaron guantes de ltex.
4.
14,44+14,03+13,26+13,58+14,11
= 13,88
Para determinar la desviacin estndar se calcul la raz de la sumatoria del valor del
POL menos la media del nivel al cuadrado dividido entre la cantidad. Por ejemplo:
SD=
= 0,46
Para el error absoluto se calcul la sumatoria del valor de POL menos la media del nivel
dividido entre la cantidad.
Ea =
(14,4413,88)+(14,0313,88)+(13,2613,88)+(13,5813,88)+(14,1113,88)
5
= 0,004
7. Resultados
Tabla 2. Masa de las repeticiones de las muestras de hgado por cada nivel de temperatura
Masa de las muestras de hgado (g) 0,01
Nivel de
temperatura
Muestra
Muestra
Muestra
Muestra
Muestra
#1
#2
#3
#4
#5
10
30,79
30,75
30,71
30,69
30,81
-0,04
20
30,75
30,77
30,65
30,79
30,76
-0,05
30
30,80
30,71
30,78
30,76
30,75
-0,03
40
30,62
30,75
30,72
30,77
30,81
-0,06
50
30,78
30,79
30,67
30,82
30,69
-0,04
(C) 1,0
Error absoluto
Muestra
Muestra
Muestra
Muestra
#1
#2
#3
#4
#5
10
14,44
14,03
13,26
13,58
14,11
0,004
20
14,87
14,69
14,45
15,09
15,17
0,004
30
15,54
15,36
15,73
16,03
15,41
0,004
40
14,01
14,12
14,18
13,93
14,06
0,000
50
13,91
13,57
13,43
14,17
13,84
0,004
(C) 1,0
Error absoluto
20
30
40
50
Figura 1. Grfico de dispersin con lneas rectas, marcadores y errores tpicos. La figura muestra el
POL en un transcurso de 60 segundos por cada nivel de temperatura.
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El mayor porcentaje de oxgeno tuvo lugar en el nivel de 30 C. Hubo un aumento desde los
10 C hasta los 30 C donde el porcentaje de oxgeno comenz a decrecer. En los niveles de
20 C y 30 C se encuentran los mayores POL. Los 10 C y 50 C tuvieron las menores tasas
de POL; siendo los 50 C el nivel con el POL ms bajo de todos. Del nivel de 30 C a 40 C
ocurri un descenso significativo. No se observ constancia en los 10, 20 y 30 C porque
hubo aumentos y descensos en cada nivel de temperatura. No obstante, parece que hubo poco
descenso de POL del nivel de 40 C al de 50 C.
Actividad enzimtica
16
15,5
15
14,5
14
13,5
13
10
20
30
40
50
Figura 2. Grfico con lneas suavizadas. La figura muestra la actividad enzimtica de la catalasa
medida por su POL en un transcurso de 60 segundos por cada nivel de temperatura.
Figura 3. Grficos blox plot simples de todos los grupos por nivel de temperatura.
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El nivel que presento mayores intervalos entre sus POL fue el de 10 C. Por otro lado, el de
menores intervalos de POL con respecto a su mediana fue el de 40 C. As mismo, este nivel
fue el nico que pareci seguir una distribucin normal. Se observ variabilidad de medianas
entre todos los niveles de temperatura. Especialmente los niveles de 10 C y 30 C parecieron
tener la mayor diferencia entre sus medianas.
La siguiente tabla muestra los resultados de la prueba de Kolmogorov-Smirnov que verific
la normalidad en los grupos de cada nivel de temperatura. Esta prueba fue necesaria para la
utilizacin de la ANOVA porque requiere que todos los grupos sigan una distribucin
normal.
Tabla 5. Prueba de normalidad con un nivel de significancia de 0,05
Temperatura
(C) 1,0
Kolmogorov-Smirnova
Estadstico
gl
Sig.
10
.223
.200*
20
.165
.200*
30
.207
.200*
40
.133
.200*
.176
5
50
a. Correccin de la significacin de Lilliefors
.200*
Cada uno de los niveles de temperatura tuvieron un p>0,05; por lo tanto, todos los POL de
cada nivel se comportaron como una distribucin normal y fue posible utilizar la ANOVA.
La homogeneidad de varianzas es otro requisito para la utilizacin de ANOVA.
Tabla 6. Prueba de homogeneidad de varianzas
Estadstico
de Levene
gl1
gl2
Sig.
3,277
20
.032
Suma de
cuadrados
Inter-grupos
gl
Media
cuadrtica
Sig.
12,623
3,156
37,570
.000
Intra-grupos
1,680
20
0,84
Total
14,302
24
El anlisis de varianza present un p<0,05. Por lo tanto, de todos los niveles de temperatura,
al menos uno tuvo una diferencia estadsticamente significativa.
La prueba de Duncan agrup las medias de los niveles de temperatura por su homogeneidad;
por lo que, se pudo saber cul nivel estaba difiriendo de los otros.
Tabla 8. Prueba de rango mltiple de Duncan
Subconjunto para alfa = 0.05
Temperatura
(C) 1,0
N
1
2
3
50
5
13.7840
10
5
13.8840
40
5
14.0600
20
5
14.9540
30
5
15.6140
Sig.
.169
1.000
1.000
Se muestran las medias para los grupos en los subconjuntos
homogneos
Los grupos de 50, 10 y 40 C son significativamente similares y son el nico subgrupo con
similitudes. Los de 20 y 30 C no se agruparon con ningn otro nivel de temperatura y fueron
los que tuvieron diferencias estadsticamente significativas con respecto de los otros niveles.
8. Discusin
Los resultados de la prueba ANOVA determinaron que hubo una diferencia significativa en
algunos de los niveles de temperatura. Esto podra explicarse con el hecho de que la
temperatura es uno de los factores directamente influyentes en la actividad enzimtica.
Segn Franco (2007) La temperatura, junto con el pH, es uno de los principales factores que
intervienen en las actividades enzimticas (p. 413). Por lo que, los diferentes grados de
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9. Conclusiones
Hubo un efecto en la actividad enzimtica de los diferentes niveles de
temperatura.
A bajas temperaturas (10 C) la actividad enzimtica fue menor.
A altas temperaturas (40 y 50 C) la actividad enzimtica fue menor.
A temperaturas medias (20 y 30 C) la actividad enzimtica fue mayor.
La temperatura ptima estimada estuvo entre los 20 y 30 C.
Los resultados fueron difirieron con algunos de investigaciones previas.
Al ser el hgado comprado, no se supo con exactitud a que raza de Bos taurus perteneca. Por
tanto, los resultados son ambiguos y no pueden ser estandarizados porque no se conoce la
procedencia de la enzima. Este problema dio lugar a un error sistemtico.
El hgado fue comprado un da antes; por lo que se tuvo que refrigerar para mantenerlo en un
buen estado. Dado que, la temperatura es un factor que inhibe en la actividad enzimtica, es
un error sistemtico el dejar la muestras en bajas temperaturas antes del experimento.
Los cambios en la temperatura se pueden dar en lapsos muy cortos de tiempo. De manera
que, tardar ms de 20 segundos llevando el tubo de ensayo al sensor pudo inhibir
drsticamente en los resultados.
Hubo pocos niveles de la variable independiente. Esto caus que la investigacin se limitara
a tener muy pocas posibilidades de encontrar la temperatura ptima exacta. Para efectos de
esta investigacin, no fue posible hacerlo por el tiempo que requiere.
El uso de un sensor de oxgeno electrnico les dio mucha confiabilidad a los datos porque
elimin posibles errores sistemticos causados por una observacin difusa. As mismo, el
hecho de que el sensor fue recientemente comprado, hizo que se tuviera mucha ms confianza
en sus mediciones. Esto es porque el sensor de oxgeno Vernier utiliza productos qumicos
ubicados en una celda electroqumica los cuales reaccionan con el oxgeno, de esa manera
hace las lecturas de este. Por lo que, al envejecer el sensor las lecturas disminuirn, ya que
los productos qumicos en la celda electroqumica son reducidos.
No se pudo controlar la cantidad exacta de enzimas presentes en las muestras de hgado
porque tal control requiere de instrumentos y procedimientos ms complejos. No obstante,
intentar sacar muestras con igual cantidad de masa fue una forma de intentar minimizar esta
variable y usar guantes evit que hubiese contacto de las enzimas catalasa presentes en la
mano humana y las del hgado. De esta manera, se control al menos este aspecto.
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