Beruflich Dokumente
Kultur Dokumente
in vitro
RII + SIII
24 ore
seria T i n special bacteriofagul T2, unul din cei mai mari bacteriofagi (24002500 ). Bacteriofagul este constituit din cap i coad. Capul conine n interior
ADN iar nveliul (capsida) i coada sunt constituite din proteine (figura 3.1).
Fagii se reproduc numai n celulele bacteriene cu ajutorul aparatului enzimatic al
acestora.
Infecia viral are loc astfel: fagul se prinde cu filamentele codale de
membrana bacteriei. Enzimele fagului dizolv n acest punct membrana bacteriei,
iar ADN fagic este introdus prin coada acestuia n celula bacterian. ntr-un
interval de timp destul de scurt, n interiorul bacteriei se formeaz cteva sute de
bacteriofagi, bacteria fiind distrus (liza bacteriei) i fagii sunt eliberai putnd
infecta alte celule. Faptul c bacteriofagii se reproduc n interiorul bacteriei,
denot c ADN fagic are capacitatea de a se autoreproduce (funcia autocatalitic)
i n acelai timp deine informaia genetic necesar sintezei proteinelor proprii
necesare constituirii capsidei pe baza aminoacizilor liberi din celula bacterian
(funcia heterocatalitic).
Fig. 3.2. Bazele azotate, zaharurile i radicalul fosforic din acizii nucleici
60
O=P
OH
OR2
OR1
Fosfodiester
molecula bicatenar alctuiesc structura teriar iar interaciunea dintre dou sau
mai multe molecule bicatenare alctuiesc structura cuaternar a acizilor nucleici.
Watson i Crick au stabilit c macromolecula de ADN este alctuit din
dou catene polinucleotidice, paralele, nfurate elicoidal n jurul unui ax comun
imaginar, o caten avnd un sens ascendent (3' 5') iar cealalt un sens
descendent (5' 3').
Distana dintre dou nucleotide succesive este de 3,4 iar pasul elicei
este de 34 , ceea ce corespunde la 10 nucleotide. Diametrul macromoleculei de
ADN este de 20 (figura 3.3.).
Molecula
de
ADN
are
dimensiuni foarte mari fiind cea
mai mare molecul biologic, cu o
mas molecular ce poate ajunge la
12-16 x 106 daltoni (1 dalton =
1/12 din masa atomului de C).
Cele dou catene din molecula
de ADN se leag ntre ele prin
puni de hidrogen ce se realizeaz
ntre o baz azotat purinic de pe
un lan i o baz azotat
pirimidinic de pe cellalt lan.
Prin urmare, n macromolecula
de ADN exist urmtoarele tipuri
de legturi: adenin-timin (A-T),
timin-adenin (T-A), guanincitozin (G-C) i citozin-guanin
Fig. 3.3. Modelul structurii bicatenare a
(C-G).
moleculei de ADN
Cele dou catene polinucleotidice din molecula de ADN sunt
complementare, n sensul c ordinea nucleotidelor de pe o caten determin
ordinea nucleotidelor de pe cealalt caten. Legturile de hidrogen dintre bazele
azotate, duble, ntre adenin i timin (A = T) i triple ntre guanin i citozin
(G C), dei sunt legturi slabe, sunt destul de numeroase de-a lungul
macromoleculei de ADN pentru a-i asigura stabilitatea i coeziunea. Legturile
chimice slabe, cum sunt cele de hidrogen, sunt eficiente numai n cazul
moleculelor complementare, cum este ADN i anume cnd o protuberan a unei
molecule intr ntr-o cavitate a altei molecule.
Luate separat, moleculele pirimidinice sunt mai mici dect cele purinice
ns cuplurile purin-pirimidin sunt de aceeai dimensiune, conferind
macromoleculei de ADN regularitate i stabilitate. Macromolecula de ADN este
stabil la temperaturile fiziologice, datorit numrului mare de legturi chimice i
faptului c moleculele de baze azotate se gsesc n interiorul moleculei contactul
lor cu apa fiind limitat.
62
Codul cu dublete
(16 combinaii)
AA
GA
CA
UA
AG
GG
CG
UG
AC
GC
CC
UC
Codul cu triplete
(64 combinaii)
AU
GU
CU
UU
AAA
AGA
ACA
AUA
GAA
GGA
GCA
GUA
CAA
CGA
CCA
CUA
UUA
UGA
UCA
UUA
AAG
AGG
ACG
AUG*
GAG
GGG
GCG
GUG*
CAG
CGG
CCG
CUG
UAG
UGG
UCG
UUC
AAC
AGC
ACC
AUC
GAC
GGC
GCC
GUC
CAC
CGC
CCC
CUC
UAC
UGC
UCC
UUC
AAU
AGU
ACU
AUU
GAU
GGU
GCU
GUU
CAU
CGU
CCU
CUU
UAU
UGU
UCU
UUU
U
UUU
UUC
A treia
nucleotid a
codonului 3'
UUA
UUG
CUU
CUC
CUA
CUG
AUU
AUC
AUA
AUG
GUU
GUC
GUA
GUG
Fen
Leu
Leu
Ileu
Met
Val
fMet
UCU
UAU
UCC
UAC
UCA
UCG
CCU
CCC
CCA
CCG
ACU
ACC
ACA
ACG
GCU
GCC
GCA
GCG
Ser
Pro
Tre
Ala
Tir
UGU
UGC
UAA
Non 2
UGA
UAG
CAU
CAC
CAA
CAG
AAU
AAC
AAA
AAG
GAU
GAC
GAA
Non 1
UGG
CGU
CGC
CGA
CGG
AGU
AGC
AGA
AGG
GGU
GGC
GGA
GAG
His
Glu
Asp
Liz
Ac.asp
Ac.glu
75
GGG
Cis
Non
3
Tri
Arg
Ser
Arg
Gli
U
C
A
G
U
C
A
G
U
C
A
G
U
C
A
G
n mod obinuit fiecare codon (triplet) codific un singur aminoacid. Sa constatat, n unele cazuri, c un codon poate codifica mai muli aminoacizi. Aa
este cazul codonilor GCG care codific alanina i arginina; CGG-prolina i
arginina; GGA-glicerina i acidul glutamic; AGG-glicina i fenilalanina. Se
afirm c aceast nsuire reprezint un avantaj evolutiv, deoarece nlocuirea unui
aminoacid cu altul printr-o mutaie, ntr-o caten polipeptidic este mai puin
duntoare, dac cei doi aminoacizi au proprieti asemntoare.
Codul genetic este neacoperit n sensul c doi codoni vecini nu au
nucleotide comune i este fr virgule, ntre doi codoni nu exist spaii sau ali
codoni care s joace rolul unor semne de punctuaie.
S-a demonstrat c citirea mesajului genetic ncepe dintr-un punct fix, se
realizeaz ntr-un singur sens, astfel c, absena unui nucleotid (deleie) sau
adugarea altuia (adiie), schimb sensul mesajului.
Universalitatea codului genetic n lumea vie demonstreaz pe de o parte
vechimea sa i, totodat, constana sa n timp.
ATP + H2O
78
AA1 + ATP + E
AA1 - ARNs1 +
+ AMP + E
AA1 - ARNs1 +
+ AMP + P P
79
din mediu se realizeaz cu ajutorul a trei enzime, a cror sintez este determinat
de trei gene structurale ce alctuiesc operonul 1ac. Genele respective se gsesc
dispuse alturat pe cromozomul bacterian: z+, determin sinteza enzimei galactozidaza, care se gsete liber n citoplasm i care desface lactoza n
galactoz i glucoz; y+ determin sinteza - galactozid permeazei, care este
localizat n membrana celulei bacteriene i permite intrarea lactozei n celul i
gena a+ ce determin sinteza enzimei galactozid trans-acetilaza a crei aciune este
necunoscut.
gena este cea mai mic unitate care produce un anumit efect fenotipic.
Ca unitate mutaional, gena este cea mai mic parte dintr-un genom,
care prin mutaie d natere la alela sau alelele sale, cu caracter modificat.
Ca unitate de recombinare, gena este cel mai mic segment dintr-un
cromozom, care se poate transfera prin crossing-over pe cromozomul omolog i n
interiorul cruia nu are loc crossing-over (unitate indivizibil de crossing-over).
Acest mod de a defini gena s-a dovedit a fi simplificat, deoarece chiar la
nceputul secolului XX s-a demonstrat c gena este o unitate genetic mult mai
complex, format din sublocusuri sau subgene.
Existena subunitilor de gen a fost dovedit de E. B. Lewis n anul
1951 la locusul lozenge (lz) de la Drosophila melanogaster. Locusul lz se gsete
pe cromozomul X n poziia 27,7 uniti de recombinare i determin modificri
n pigmentaia ochilor, structura faetelor i fertilitatea femelelor.
Heterozigoii obinui n urma ncrucirilor dintre mutante ale locusului
lz, au avut fenotip mutant cu caractere intermediare. n urma analizei a peste
100.000 de indivizi, Lewis a gsit i 0,02% indivizi de tip normal (slbatic),
nemutani, desprinznd concluzia c ntre subgenele locusului lozenge a avut loc
un crossing-over. Locusul lozenge cuprinde cel puin trei uniti ntre care apare
un mic procent de recombinare.
Fiecare din cele trei subuniti, cnd apare singur n genom, este
lz + +
. Cnd individul
recesiv i determin un fenotip normal, cu genomul: 1
+++
heterozigot cuprinde doi factori (lz1 i lz2), ei pot fi pe acelai cromozom (poziie
lz 1 lz 2 +
lz 1 + +
sau cte unul de fiecare cromozom omolog
(poziie trans).
cis):
+++
+ lz 2 +
Fenotipurile sunt diferite, n primul caz este normal iar n al doilea caz este
mutant.
Acesta demonstreaz c locusul lozenge este un locus complex, alctuit
din mai multe subuniti.
Pe baza efectului cis-trans s-a ajuns s se stabileasc dac dou mutaii
foarte asemntoare aparin unei serii alelice ale aceluiai locus sau sunt nealele i
aparin la doi loci diferii.
Dou gene sunt alele, cnd aparin aceluiai locus i dac heterozigotul
n poziie trans are un fenotip normal, nseamn c genele respective sunt nealele.
Apogeul n concepia clasic despre gen, l-a constituit ipoteza "o gen
- o enzim" elaborat de G. W. Beadle i E. L. Tatum (1941). Conform acestei
ipoteze, sinteza fiecrei enzime este determinat de informaia unei gene, deci
ntre gene i enzime ar exista raportul de 1:1. Mutaia unei gene determin
blocarea sintezei unei enzime, care la rndul ei, determin oprirea ntregului lan
metabolic.
Elaborarea ipotezei "o gen - o enzim" a fost posibil n urma unor
experiene efectuate la ciuperca Neurospora crassa. La aceast ciuperc s-a
elaborat o metod rapid de identificare a mutantelor biochimice. Metoda const
90
Substrat
Gena A
Gena B
Enzima A
Enzima B
Produsul A
Gena C
Enzima C
Produsul B
Produsul C
ARN
proteine
94
S-au folosit dou caractere ale acestui fag: forma plajelor de liz (r) i
irul de gazde (host range) notat cu h. Bacteriofagii de tip slbatic (r+) n
momentul n care infecteaz bacteria formeaz zone sau plaje mici ce au un halou
difuz. Apariia acestui halou se datoreaz suprainfeciei provocate de generaiile
succesive ale bacteriofagului T2, existnd un numr mare de bacterii
suprainfectate, dar nelizate, formnd pe marginea plajei un halou difuz.
Bacteriofagii mutani r- determin o liz rapid a bacteriilor, fr ca
suprainfecia s inhibe sau s ntrzie liza, astfel c, aceste plaje sunt mai mari i
fr halou, cu marginile clare.
Tipul slbatic h+ poate liza sua B de E.coli, dar nu poate liza sua B2.
Dac un amestec de bacterii B i B2 sunt infectate cu bacteriofagi h+ ntreaga
cultur apare tulbure din cauz c unele bacterii au fost lizate iar altele nu.
Mutanta h- a bacteriofagului T2 lizeaz ambele sue B i B2 ale bacteriei,
producnd plaje de liz obinuite, cu halou.
Dac se fac infecii mixte cu dou sue ale bacteriofagului T2, cu
genotipurile h-r+ i h+r- s-a constatat c n cultur apar i bacteriofagi recombinai
h-r- i h+r+ datorit unui schimb de material genetic ntre genomurile fagilor.
Dac n experiena respectiv se introduce i o a treia mutant, poate fi
stabilit ordinea i distana dintre genele bacteriofagului pe baza procentului de
recombinare.
101