MEDIOS DE AISLAMIENTO Y ENRIQUECIMIENTO

Si se desea recuperar determinados m.o. de sus ecosistemas naturales (agua, tierra, alimentos,
etc.) puede recrearse en el laboratorio un medio ambiente artificial que favorezca el crecimiento de
ellos frente a otros m.o. que los acompañen en ese ecosistema. Se puede emplear un medio de
cultivo y condiciones de incubación (atmósfera, temperatura, pH) considerando las características
fisiológicas del m.o. buscado, para otorgarle ventajas frente al resto de m.o. de ese ecosistema.
Pretendemos inhibir la mayor cantidad posible de m.o. no deseados, de manera que estos no
interfieran durante el aislamiento de los que sí interesan.

Un esquema general para el enriquecimiento, aislamiento e identificación de m.o. es el siguiente:

Fuente de inóculo Caldo de enriquecimiento Aislamiento Identificación

Debemos realizar las siguientes consideraciones si deseamos detectar y aislar un determinado tipo
de m.o. y simultáneamente minimizar la interferencia de otros:

Muestra
Elegir la muestra adecuadamente. El m.o. que se está buscando debe ser factible de estar
presente, ya sea si lo estamos buscando per se, o como contaminante.
Debemos considerar si es útil someter la muestra a un tratamiento previo. Cuanto mayor selección
se realice en este paso inicial, menos selectivos deberán ser los medios de cultivo a utilizar.
¿Debemos comenzar con un enriquecimiento o aislar la muestra directamente? Si el m.o. que
deseamos aislar está en un bajo número, se siembra la muestra en un caldo de cultivo que
favorezca su multiplicación (enriquecimiento). Cuando un enriquecimiento se realiza en un medio
formulado para frenar el desarrollo de m.o. acompañantes no deseados, se denomina
enriquecimiento selectivo. Cuando el m.o. deseado está en alto número, no se necesita realizar un
enriquecimiento, y se puede sembrar la muestra en un medio sólido adecuado directamente.

Medio de cultivo
Debemos realizar una formulación adecuada de los medios de cultivo empleados. En general en
las primeras etapas se utilizan medios de cultivo selectivos. Dicha selectividad se puede determinar
ya sea, a) agregando un inhibidor de la flora acompañante, o b) haciendo el medio restrictivo al
incluir un nutriente que sólo el m.o. deseado sea capaz de utilizar.
Debemos utilizar las condiciones de incubación adecuadas: temperatura, luz, atmósfera (aerobia o
anaerobia, atmósfera con concentración de CO2, etc.).
Los componentes del medio de cultivo que se pueden manejar son:
• Fuente de carbono. A modo de ejemplo, se podrían quitar todos los compuestos orgánicos
para permitir el crecimiento de m.o. autótrofos que son capaces de obtener su fuente de
carbono del CO2 (que difunde de la atmósfera al medio o por agregado de bicarbonato). O
incluir exclusivamente una fuente de carbono particular, por ej, fenol si queremos aislar
degradadores de ese compuesto.
• Fuente de nitrógeno. Se puede omitir el agregado de fuente nitrogenada (orgánica u
inorgánica) para permitir el crecimiento de fijadores libres de nitrógeno, que son capaces
de obtener su fuente de nitrógeno del N2 atmosférico.
• Fuente de energía. Si no se agrega ningún compuesto capaz de ser utilizado como fuente
de energía y se incuba a la luz, sólo crecerán los m.o. fotosintéticos que usan la luz como
fuente de energía.
• Se pueden agregar o no compuestos que sean utilizados como factores de crecimiento
(vitaminas, aminoácidos, ácidos nucleicos, ácidos grasos, etc.) según se necesiten o no.

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PRUEBAS BIOQUÍMICAS

INDOL
Introducción
El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptofano. Las
bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con
producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. La producción de indol es una característica
importante para la identificación de muchas especies de m.o.

Principio
La prueba de indol está basada en la formación de un complejo rojo cuando el indol reacciona con
el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo del reactivo de
Kovacs descrito más adelante. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano.

Medios y reactivos
Caldo triptofano
Peptona o digerido pancreático de caseína 2g
Cloruro de sodio 0,5 g
Agua destilada 100 ml

Reactivo de Kovacs
Alcohol amílico o isoamílico 150 ml
p-dimetilaminobenzaldehído 10 g
HCl conc. 50 ml

Procedimiento
Inocular el caldo triptofano con el m.o. en estudio e incubar a 35°C durante 18 a 24 horas. Al
finalizar este período, añadir 5 gotas de reactivo por la pared interior del tubo.

Interpretación
El desarrollo de un color rojo intenso en la interfase del reactivo y el caldo, segundos después de
añadir el reactivo indica la presencia de indol y un resultado de la prueba positiva.

Controles
Escherichia coli: positivo
Klebsiella pneumoniae: negativo (mayoría de las cepas)

ROJO DE METILO - VOGES-PROSKAUER (RM VP)

Principio
Una de las características taxonómicas que se utilizan para identificar los diferentes géneros de
enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporción de productos de fermentación que se originan
por la fermentación de la glucosa. Se conocen dos tipos generales: la fermentación ácido-mixta y la
fermentación del 2,3 butanodiol. En la fermentación ácido mixta se forman fundamentalmente
láctico, acético y succínico, además de etanol, H2 y CO2. En la vía del butanodiol se forman
cantidades menores de ácido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol,
etanol, H2 y CO2.
El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo de viraje entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo),
que se utiliza para visualizar la producción de ácidos por la vía de fermentación ácido mixta.
El acetil-metil-carbinol (o acetoína) es un producto intermediario en la producción de butanodiol. En
medio alcalino y en presencia de oxígeno la acetoína es oxidada a diacetilo. Este se revela en
presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia

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Medios y reactivos
Caldo RM/VP
Peptona 7g
Glucosa 5g
Fosfato dipotásico 5g
Agua destilada 1L

pH = 6,9 ± 0,1

Indicador de pH rojo de metilo

Rojo de metilo 0,1 g en 300 mL de etanol 95°
Agua destilada 200 ml

Revelador VP
alfa-naftol (solución al 5% en etanol 95°)
Solución de KOH al 40% en agua destilada

Procedimiento
Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no más de 24 horas del m.o. en estudio. Incubar a
35°C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubación transferir 1 mL del caldo a un
tubo limpio para VP. En el caldo restante revelar RM agregando unas 4 - 8 gotas del indicador rojo
de metilo. Para revelar VP agregar 0,6 ml (10 gotas) de alfa-naftol al 5% y 1 gota de KOH al 40%.
Agitar cuidadosamente para exponer el medio al oxígeno atmosférico y dejarlo reposar durante 10
a 15 minutos.

Interpretación
La prueba RM es positiva si se desarrolla un color rojo estable. Esto indica que la producción de
ácido es suficiente para producir el viraje del indicador y el m.o. fermentó la glucosa por la vía de
ácido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como
positivo.
La prueba VP es positiva si se desarrolla un color rojo-fucsia luego de 15 minutos, que indica la
presencia de diacetilo, producto de oxidación de la acetoína.

Controles
RM positivo, VP negativo: Escherichia coli
RM negativo, VP positivo: Enterobacter aerogenes

UTILIZACIÓN DE CITRATO
Introducción
La utilización de citrato como única fuente de carbono es una prueba útil en la identificación de
enterobacterias.

Principio
La utilización de citrato como única fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato
como única fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinización del medio. Este aumento
de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.

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Medios y reactivos
Medio de Simmons
Fosfato diácido de amonio 1g
Fosfato dipotásico 1g
Cloruro de sodio 5g
Citrato de sodio 2g
Sulfato de magnesio 0,2 g
Agar 15 g
Azul de bromotimol 0,08 g
Agua destilada c.s.p. 1L

pH = 6,9

Procedimiento
Se inocula la superficie del agar inclinado con una sola estría en el pico. Utilizar un cultivo de 24
horas en un medio sólido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir
falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inóculo. Incubar a 35°C durante 4
días.

Interpretación
El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estría, acompañado o no de
un viraje del indicador al azul.

Controles
Positivo: Klebsiella spp.
Negativo: E.coli

DESCARBOXILACIÓN DE LISINA Y ORNITINA

Introducción
La descarboxilación de aminoácidos es llevada a cabo por descarboxilasas y se forman aminas y
CO2. Cada descarboxilasa es específica para un aminoácido y la reacción es completa e
irreversible. Los aminoácidos ensayados habitualmente para la identificación son lisina, ornitina y
arginina.

Principio
El caldo descarboxilasa de Moeller es el medio base más comúnmente usado para la
determinación de las descarboxilasas en enterobacterias. Se prepara un tubo con el medio
conteniendo el aminoácido a ensayar y un tubo control con medio base sin aminoácido. Se cubren
con una capa de aceite mineral (vaselina líquida) para hacer el medio anaerobio de manera que
ocurra la fermentación de la glucosa que contiene. Durante las primeras etapas de la incubación en
ambos tubos se observará viraje del indicador de pH del medio al ácido, por la fermentación de la
glucosa. Luego, si el aminoácido es descarboxilado, se forman aminas que provocan un retorno al
color original del medio o un viraje al alcalino.

Medios y reactivos
Base de Moeller
Peptona 5g
Extracto de carne 5g
Glucosa 0,5 g
Piridoxal 0,005 g
Púrpura de Bromocresol 0,01 g
Rojo de cresol 0,005 g
Agua destilada c.s.p. 1L

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pH final = 6,0

Caldo Lisina o Ornitina de Moeller: Preparar igual al medio base y agregar 10 g del aminoácido (1%
de concentración final de la forma levo, utilizar el doble si se usa la forma dl del aminoácido ya que
solo la levo es activa). Agregar aceite mineral para formar una capa de 1 cm de espesor.

Procedimiento
Inocular con un cultivo puro de 24 horas un tubo de base de Moeller con el aminoácido a estudiar
(lisina u ornitina) y un tubo de la base (control sin aminoácido). Incubar a 35°C durante 18 a 24
horas.

Interpretación
El ensayo puede ser leído si en el tubo control se observa crecimiento y viraje del indicador al
amarillo indicando que se dio la fermentación de la glucosa y un descenso de pH que permite la
activación de las descarboxilasas. El retorno al color azul-violeta en el tubo que contiene el
aminoácido indica una reacción positiva debida a la liberación de aminas por descarboxilación.

Controles
Descarboxilación de lisina positiva: Enterobacter aerogenes
Descarboxilación de lisina negativa: Enterobacter cloacae
Descarboxilación de ornitina positiva: Serratia spp
Descarboxilación de ornitina negativa: Klebsiella spp.

FENILALANINA DESAMINASA
Introducción
La fenilalanina es un aminoácido que por desaminación oxidativa forma un cetoácido, el ácido
fenilpirúvico. Sólo los géneros Proteus y Providencia poseen la fenilalanina desaminasa, lo que
permite diferenciarlas del resto de las Enterobacterias.

Principio
La prueba de la fenilalanina se basa en la detección del ácido fenilpirúvico luego del desarrollo del
m.o. en un medio que contiene fenilalanina. Para eso se agrega cloruro férrico que forma un
complejo de color verde con el ácido fenilpirúvico. El medio de cultivo no puede contener extractos
de carne o peptonas por su contenido variable en fenilalanina.

Medios y reactivos
Agar fenilalanina
DL fenilalanina 2g
Extracto de levadura 3g
Cloruro de sodio 5g
Fosfato de sodio 1g
Agar 12 g
Agua destilada c.s.p. 1L

pH = 7,3

Cloruro férrico
Cloruro férrico 10 g
HCl concetrado 2,5 g
Agua destilada c.s.p. 100 ml

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Procedimiento
Inocular el agar en pico de flauta con un cultivo puro de 24 horas e incubar a 35°C durante 18-24
horas. Luego de transcurrido el período de incubación, agregar 4 o 5 gotas de reactivo de cloruro
férrico, directamente sobre la superficie del agar.

Interpretación
La aparición inmediata de un color verde intenso indica la presencia de ácido fenilpirúvico y una
prueba positiva.

Controles
Positivo: Proteus
Negativo: Escherichia coli

TSI (TRIPLE SUGAR IRON)

Introducción
El agar triple azúcar hierro es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de
producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. También
permite la detección de la producción de H2S. Es un medio útil para la identificación de
enterobacterias.

Principio
El agar se prepara en forma de pico de flauta. Esto determina que
existan dos cámaras de reacción dentro del mismo tubo. La porción
inclinada (pico) expuesta en toda su superficie al oxígeno es aerobia
y la porción inferior (fondo) está protegida del aire y es relativamente
anaerobia.

Al crecer un m.o. en el TSI, el pico tiende a virar al pH alcalino (color

rojo por el rojo fenol) por la producción de aminas, debido a la
utilización aerobia de las peptonas. En el fondo del tubo -donde no hay oxígeno- la degradación de
peptonas es menor y no se generan aminas, de manera que se pueden detectar la producción de
pequeñas cantidades de ácido (color amarillo por el rojo fenol). Si se inoculan m.o. no
fermentadores no se formarán ácidos, pero por la producción de aminas en el pico, todo el medio
quedará rojo.

La glucosa en el TSI está en una proporción 10 veces menor que la lactosa y la sacarosa. Si el TSI
es inoculado con una bacteria fermentadora de glucosa pero no de lactosa ni de sacarosa, la
cantidad de ácido producida por fermentación será baja (porque la cantidad de glucosa inicial es
baja). En las primeras horas (10 a 16 hs) de incubación se producirá viraje del indicador al amarillo
en todo el tubo (pico y fondo), pero al continuar la incubación, el pico del tubo retornará al rojo por
la producción de aminas debida a la degradación aerobia de las peptonas antes descrita.
Si el m.o. fermenta la lactosa y/o la sacarosa, como las concentraciones de estos azúcares son 10
veces mayores a la glucosa, se producirá gran cantidad de ácido (que no puede ser neutralizado
por la producción de aminas en la superficie), por lo tanto todo el tubo (pico y fondo) virará al color
amarillo (ácido).

La producción de H2S a partir de tiosulfato se pone en evidencia por precipitación del sulfuro
ferroso (negro). Como esta reacción se da preferencialmente en medio ácido, un ennegrecimiento
del fondo del tubo (que puede cubrir todo el fondo del tubo y enmascarar el color amarillo) se lee
como fermentación de algunos de los azúcares del medio. Además puede observarse la
producción de gas (H2 y CO2), ya sea como burbujas en el fondo del tubo, por ruptura del agar o
desplazamiento del mismo hacia la superficie.

Pág. 33
Medios y reactivos
TSI
Extracto de carne 3g
Extracto de levadura 3g
Peptona 15 g
Proteosa peptona 5g
Lactosa 10 g
Sacarosa 10 g
Glucosa 1g
Cloruro de sodio 5g
Sulfato ferroso 0,2 g
Tiosulfato de sodio 0,3 g
Agar 12 g
Rojo fenol 0,024 g
Agua destilada 1L

pH = 7,4 ± 0,2

Procedimiento
Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm
del fondo del tubo. Tras retirar la punta del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro
lado. Incubar a 35 °C durante 18-24 hs, pero no más de 24 hs..

Interpretación y Controles
Para el TSI siempre se informa el resultado en el siguiente orden: pico, fondo, producción de gas y
H2S.

Pico alcalino/fondo alcalino (Alc/Alc/gas-/H2S-)

No hay fermentación de azúcares. Característica de bacterias no fermentadoras como Ej.
Pseudomonas sp

Pico alcalino/fondo ácido (Alc/A/gas-/ H2S-)

Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. No hay producción de gas ni de H2S.
Ej. Shigella spp.

Pico alcalino/fondo ácido (Alc/A/gas-/ H2S+)

Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. No hay producción de gas, si de H2S.
Ej. Salmmonella typhi.

Pico alcalino/fondo negro (Alc/A/gas+/H2S+)

Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, producción de gas y producción de ácido
sulfhídrico. Ej. Salmonella spp. (la mayoría de las especies de Salmonella).

Pico ácido/fondo ácido (A/A)

Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse H2S o no. E.coli (A/A/H2S -)
A estos resultados se les agrega el resultado de la producción de gas. Ej. A/A/gas+/H2S-.

Pág. 34
LIA (LYSINE IRON AGAR)
Introducción
Este ensayo permite diferenciar los m.o. que producen descarboxilación o desaminación de la
lisina. Se puede detectar además la producción de H2S. Es muy utilizado en las técnicas de
búsqueda de Salmonella, principalmente para descartar otras bacterias que dan colonias de
aspecto similar en los medios diferenciales utilizados durante el aislamiento selectivo.

Principio
Durante las primeras etapas de la incubación el fondo virará el indicador de pH del medio al ácido
(amarillo) por la fermentación de glucosa. Luego, si el aminoácido es descarboxilado se formarán
aminas que provocan un retorno al color original del medio o hacia un viraje al básico (color
violeta).
En la desaminación se produce un ácido carboxílico y NH3 y se visualiza en la superficie la
aparición de un color rojo intenso. La producción de H2S a partir de tiosulfato se visualiza por la
precipitación de sulfuro ferroso de color negro.

Medios y reactivos
Peptona 5g
Extracto de levadura 3g
Glucosa 1g
L-lisina HCl 10 g
Citrato férrico amónico 0,5 g
Tiosulfato de sodio 0,04 g
Púrpura de bromocresol 0,02 g
Agar 15 g
Agua destilida 1L

pH = 6,7 ± 0,2

Interpretación y controles
pico alcalino/fondo alcalino/H2S +, descarboxilación de lisina positiva. Ej.: Salmonella choleraesuis.
pico rojo/fondo ácido/H2S-, desaminación de lisina positiva, descarboxilación de lisina negativa. Ej.:
Proteus mirabilis.
pico alcalino/fondo ácido/H2S- descarboxilación de lisina negativa. Ej. E. coli
pico alcalino/fondo ácido/H2S+ descarboxilación de lisina negativa, producción de H2S. Ej.
Citrobacter freundii.

PRODUCCIÓN DE PIGMENTOS PARA PSEUDOMONAS SP.

Introducción
La capacidad para producir pigmentos como pioverdina (fluoresceína) y piocianina es una
característica importante para la identificación de especies de Pseudomonas. Algunas de ellas
elaboran sólo fluoresceína (ej. Ps. fluorescens) y otras ambos pigmentos (ej. Ps. aeruginosa). La
piocianina solamente es producida por Ps. aeruginosa aunque no todas las cepas de esta especie
la producen. Se han diseñado medios de cultivo que potencian la elaboración de uno de los
pigmentos e inhiben la formación del otro.

Principio
El medio King A (o Pseudomonas Agar P) potencia la elaboración de piocianina mientras que el
King B (o Pseudomonas Agar F) potencia la elaboración de fluoresceína e inhibe parcialmente la
de piocianina. Estos pigmentos son solubles en agua y difunden al medio. La piocianina es un
pigmento azul-verde mientras que la fluoresceína es amarillo-verdoso y fluoresce cuando es
expuesto a la luz UV (λ=254 nm). Existen pigmentos amarillo-verdosos producidos por algunas
especies de Pseudomonas que no fluorescen.

Pág. 35
Medios y reactivos
King A King B
Peptona 20 g Proteosa Peptona 20 g
Glicerol 10 g Glicerol 10 g
K2SO4 10 g K2HPO4 1,5 g
MgCl2 1,4 g MgSO4.7H2O 1,5 g
Agar 15 g Agar 15 g
Agua 1L Agua 1L

Los medios se reparten en tubos, se esterilizan a 121ºC durante 15 minutos y se dejan solidificar
inclinados.

Procedimiento
Inocular los tubos por estrías. Incubar a 35ºC durante 24 hs.

Interpretación
Observar al UV, la producción de pigmento azul-verdoso en el medio King A y la de pigmento
amarillo-verdoso, en el King B

Controles
Pseudomonas aeruginosa: King A +
P. fluorescens: King A -
P. fluorescens: King B +
P. stutzeri: King B -

DNASA - DESOXIRRIBONUCLEASA
Introducción
La actividad desoxirribonucleasa (DNAsa) se ha demostrado fundamentalmente en los géneros
Staphylococcus y Serratia y consiste en la propiedad de degradar el ADN a fracciones de menor
peso molecular. Esta característica se ha utilizado para identificar las especies de Serratia
marcescens y Staphylococcus aureus. Weckman y Catlin demostraron la estrecha correlación entre
la producción de DNAsa de los cultivos de Staphylococcus aureus con la producción de coagulasa.

Principio
Los m.o. DNAsa positivos degradan el DNA cuando son incubados en un medio que lo contiene.
Esto puede ser visualizado de diferentes maneras: ya sea inundando las placas crecidas con HCl
0,1 N y observando zonas transparentes alrededor de las estrías o incorporando al medio
indicadores como azul de toluidina o verde de metilo (viran a rosado cuando el test es positivo).

Medios y reactivos
DNAsa agar
Triptosa 20 g
ADN 2g
NaCl 5g
Agar 15 g
Azul de toluidina* 0,1 g
Agua c.s.p. 1L

* o verde de metilo

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Procedimiento
Estriar la superficie de la placa e incubar a 35°C durante 18-24 horas. Observar el viraje del
indicador a rosado alrededor de las estrías.

Interpretación
Un resultado positivo está dado por el viraje del indicador en la zona de la estría a rosado.

Controles
Positivo: S.aureus y Serratia marcescens
Negativo: S.epidermidis:

COAGULASA
Introducción
La coagulasa es una enzima proteica con actividad semejante a la protrombina, capaz de
transformar el fibrinógeno en fibrina, provocando la formación de un coágulo visible en un sistema
analítico adecuado. Se cree que la coagulasa funciona in vivo, produciendo una barrera en el sitio
de infección estafilocóccica. En el laboratorio, la prueba de coagulasa se utiliza más comúnmente
para diferenciar al Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) de otros Staphylococcus.

Principio
La coagulasa se halla presente en dos formas, “libre” y “fija”, cada una de las cuales posee
diferentes propiedades que requieren el uso de técnicas de determinación diferentes:
Coagulasa fija (prueba en portaobjetos): la coagulasa fija está unida a la pared celular bacteriana.
Los hilos de fibrina formados entre las células suspendidas en plasma (que contiene fibrinógeno)
provocan su aglutinación, indicada por la presencia de agregados visibles en el portaobjetos.
Coagulasa libre (prueba en tubo): la coagulasa libre es una enzima extracelular que se halla
presente en los filtrados de cultivos. Cuando una suspensión de bacterias productoras de
coagulasa se mezcla en partes iguales con plasma en un tubo de ensayo, se forma un coágulo
visible como consecuencia de la utilización de los factores de coagulación del plasma de manera
similar a cuando se añade trombina.

Medios y reactivos

Plasma coagulasa (Difco, o BBL)

Cultivo de Staphylococcus de 24 horas en un agar nutriente o caldo nutriente.

Procedimiento
Prueba en portaobjetos
Colocar una gota de agua destilada sobre un portaobjetos
Emulsionar suavemente el organismo en estudio en la gota de agua de manera de obtener una
suspensión cargada homogénea. Agregar una gota de plasma reconstituido junto a la gota de la
suspensión del m.o. Mezclar bien con el ansa. Inclinar el portaobjetos hacia uno y otro lado,
observando la formación inmediata de un precipitado granular o de grumos blancos.

Prueba en tubo
Colocar asépticamente 0,5 ml de plasma reconstituido en el fondo de un tubo estéril.
Añadir 0,5 ml de cultivo de 24 horas (o suspensión en suero fisiológico de un cultivo en placa).
Mezclar por rotación el tubo, evitando remover o agitar el contenido.
Colocar en baño de agua a 37°C y observar cada hora hasta 4 horas y luego a las 24 horas, la
formación de un coágulo visible.

Pág. 37
Interpretación
Prueba en portaobjetos: una reacción positiva se detecta usualmente en 15 a 20 segundos por la
aparición de un precipitado granular. La prueba se considera negativa si no se observa aglutinación
en 2 a 3 minutos. Esta prueba es solo presuntiva y todos los cultivos que den resultados negativos
o positivos tardíos deben verificarse mediante la prueba en tubos ya que algunas cepas de
Staphylococcus aureus no producen coagulasa fija.
Prueba en tubos:

1+: pequeños coágulos no organizados.

2+: pequeños coágulos organizados.
3+: gran coágulo organizado.
4+: todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando se invierte el tubo.
Se consideran positivos los grados 3+ y 4+

Controles
Positivo: S.aureus
Negativo: S.epidermidis:

PRUEBA DE LA BILIS ESCULINA

Introducción
La prueba de la bilis-esculina está basada en la capacidad de ciertas bacterias, particularmente los
estreptococos del grupo D, de hidrolizar la esculina en presencia de bilis al 1 o 4%. La esculina es,
químicamente, un derivado de la cumarina (6-b-glucósido-7-hidroxicumarina), que por su estructura
pertenece a los glucósidos. Por definición, éstos están constituídos por dos restos unidos por un
puente de oxígeno. En el caso de la esculina, uno de los restos es una glucosa y el otro la 7-
hidroxicumarina (que no es un hidrato de carbono, y es denominado aglucona).

Pág. 38
Principio
Las bacterias capaces de desarrollar en bilis y también hidrolizar esculina, producen glucosa y
esculetina (7,7 dihidroxicumarina) y ésta puede visualizarse en un medio con una sal de hierro, por
formación de un complejo marrón oscuro o negro.

Algunos medios bilis-esculina incluyen también azida sódica para inhibir el desarrollo de
organismos Gram negativos, transformándose en selectivos para estreptococos.

Medios y reactivos
Medio bilis-esculina
Peptona 5g
Extracto de carne 3g
Bilis de buey 40 g
Esculina 1g
Citrato férrico 0,5 g
Agar 15 g
Agua destilada 1L

Procedimiento
Se estría el organismo en estudio en placas o tubos en pico de flauta del medio bilis-esculina. Se
incuba a 37°C durante 24 horas.

Interpretación
La esculetina difunde hacia el medio de agar por ser hidrosoluble. La reacción es positiva si se
observa un ennegrecimiento difuso del tubo o un halo marrón oscuro o negro alrededor de las
colonias en placa.

Controles
Positivo: streptococo del grupo D
Negativo: estreptococo no del grupo D

UREASA
Introducción
La urea es una diamida del ácido carbónico que puede ser hidrolizada con liberación de amoníaco
y dióxido de carbono.

Principio
La ureasa es una enzima que poseen muchas especies de m.o. que pueden hidrolizar urea de
acuerdo a la siguiente reacción química:

Urea + 2H2O CO2 + H2O + 2NH3

El amoníaco reacciona en solución para formar carbonato de amonio, produciéndose alcalinización

y aumento de pH del medio.

Medios y reactivos
El caldo urea y agar urea de Christensen son los dos medios mas comúnmente usados en los
laboratorios para la detección de la ureasa de m.o.

Pág. 39
Caldo de Stuart
Extracto de levadura 0,1 g
Fosfato monopotásico 9,1 g
Fosfato disódico 9,5 g
Urea 20 g
Rojo fenol 0,01 g
Agua 1L

pH = 6,8

Agar urea de Christensen

Peptona 1g
Glucosa 1g
Cloruro de sodio 5g
Fosfato monopotásico 2 g
Urea 20 g
Rojo fenol 0,012 g
Agar 15 g
Agua 1L

pH = 6,8

Procedimiento
Inocular el caldo con una ansada cargada con el cultivo puro del m.o. o estriar la superficie del
agar. Incubar a 35°C durante 24 hs.

Interpretación
Los m.o. que hidrolizan urea rápidamente pueden producir reacciones positivas en 1 a 3 hs. Las
especies mas lentas pueden requerir 3 o mas días.
Caldo: una coloración rojiza indica alcalinazación e hidrólisis de urea
Agar: una coloración rojiza en el medio indica hidrólisis de urea positiva. Los degradadores lentos
producen coloración parcial (generalmente el pico), los rápidos producen coloración en todo el
tubo. Si no hay hidrólisis el medio permanece con el colo original (amarillo) y se observa
crecimiento.

Controles
Positivo: Proteus sp
Negativo: Escherichia coli

Pág. 40
PROBLEMAS TEÓRICOS

GENERALIDADES
La identificación de una cepa bacteriana requiere comparar las características de esa cepa con las
características de las especies conocidas descritas. Esta descripción se encuentra en el Bergey’s
Manual of Determinative Bacteriology.
Las propiedades que usa para clasificar los procariotas en grandes grupos (secciones del Manual
de Bergey) son las morfológicas, el tipo de pared y la tolerancia al oxígeno. Esas son generalmente
las características por donde se comienza la identificación de una bacteria. Puede ocurrir que esta
sea una nueva bacteria, en ese caso comparando con las ya descritas sólo podremos decir que se
parece mucho a una especie ya descrita pero que no pertenece a la misma.
En la mayoría de los análisis de rutina en un laboratorio de microbiología el problema que se
presenta no es identificar una bacteria aún no descrita, sino determinar si una cepa aislada
pertenece o no a una especie de interés. El conocimiento de las propiedades de esa especie de
interés se utiliza en el proceso de aislamiento para seleccionar especies con determinadas
características. Por ej. si se quiere determinar si en una muestra de agua están presentes
estreptococos fecales (cocos Gram positivos anaerobios facultativos) utilizará medios y
condiciones de incubación tales que excluyan a otros grandes grupos de bacterias como los cocos
Gram positivos anaerobios estrictos y durante su análisis incubará aeróbicamente.
La información de la ecología del m.o. aislado, es decir la muestra de la cual proviene, así como el
proceso de aislamiento del mismo reducen considerablemente el espectro de especies posibles.
Por ello, en el proceso de identificación es posible que no necesite analizar todas las
características que indica el Manual de Bergey.
Otra razón por la cual el número de características a analizar puede reducirse es que en la mayoría
de los análisis microbiológicos se busca confirmar o descartar que la cepa aislada pertenece a una
especie dada. Si la cepa no pertenece a la especie de interés, no es necesario identificarla. Por ej.
si en una muestra dada para la cual se exige ausencia de Pseudomonas aeruginosa se aisla una
bacteria que pertenece al género Pseudomonas pero no es de la especie P. aeruginosa, no es
necesario determinar a que especie del género pertenece.

Problema I (E.coli)

Antecedentes
Las bacterias de la especie Escherichia coli son bastones Gram negativos que no reducen sulfato
cuyo hábitat natural es el intestino humano y de animales de sangre caliente. Las cepas de E. coli
generalmente no son patógenas, sino indicadores de contaminación fecal. Su presencia en una
muestra implica que otros m.o. de origen fecal, incluyendo patógenos, pueden estar presentes en
la misma. Sólo algunas cepas de E.coli son agentes etiológicos de infecciones gastrointestinales.
Estas cepas patógenas entéricas se diferencian entre si y de las no patógenas por su biotipo,
generalmente asociado a la presencia de plásmidos.
En los procedimientos de rutina de análisis de especialidades farmacéuticas y de alimentos se
determina la presencia o el número de bacterias de la especie E.coli pero no se determina si esas
cepas son potenciales patógenos entéricos. Cuando hay sospecha de presencia de E.coli
patógena se realiza una serotipificación de un numero determinado de cepas aisladas y/o se
envían a Centros de referencia.
La contaminación fecal puede originarse en las materias primas utilizadas en la elaboración de un
producto o por contaminación durante o posteriormente al proceso de elaboración. El número de
bacterias generalmente depende del tipo de producto y proceso y determina el procedimiento que
se realizará para aislar bacterias que pertenezcan a la especie E.coli. El otro factor que determina
el procedimiento de aislamiento es la flora acompañante: la proporción relativa de E.coli a las
demás bacterias presentes y las propiedades fisiológicas de esas otras bacterias.
En muestras que se preparan a partir de materias primas que no deben tener contaminación fecal
(como medicamentos preparados a partir de materias primas sintéticas) o en muestras en las
cuales después de su preparación se ha realizado un proceso para disminuir la carga bacteriana
(alimentos pasteurizados) se podría esperar un número muy bajo de E.coli. En esas muestras se

Pág. 41
realiza un procedimiento de búsqueda, en el cual por siembra en medios de enriquecimiento se
aumenta el número de bacterias para después realizar su aislamiento e identificación.
En muestras de origen natural (generalmente materias primas de origen natural como leche no
pasteurizada, aguas presumiblemente contaminadas) se podría esperar un número mas alto de
estas bacterias. En ese caso no se realiza la etapa de enriquecimiento sino que directamente se
cuenta el número de estas bacterias empleando un método de recuento de bacterias viables en un
medio selectivo para E.coli.
En ambos casos la etapa siguiente es determinar si las colonias aisladas pertenecen o no a la
especie E.coli. Los procedimientos oficiales para su detección en alimentos y medicamentos
generalmente llegan a esta etapa después del aislamiento en medios selectivos y diferenciales.
Los medios selectivos mas comunes utilizan inhibidores para las bacterias de origen fecal que
acompañan a E.coli (como enterococos) o para bacterias que no son de origen fecal. Los medios
sólidos generalmente contienen sales biliares y cristal violeta y los medios líquidos que se emplean
para el recuento por número más probable de coliformes en alimentos y agua (Caldo Lauril Sulfato,
Caldo Lactosa Bilis Verde Brillante y caldo Escherichia coli) contienen lauril sulfato de sodio o sales
biliares y verde brillante. Estos medios son generalmente diferenciales porque tienen además
lactosa - E.coli fermenta lactosa y glucosa- y un modo para detectar su fermentación (indicadores
de cambio de pH) o la producción de gas en medio líquido (campanas de Durham).
Las colonias aisladas en medios selectivos no necesariamente son cultivos puros debido a que el
inhibidor del medio puede detener el crecimiento de los otros m.o. contaminantes sin eliminarlos.
Se debe reaislar en un medio no selectivo para asegurarse de obtener un cultivo puro. En el
reaislamiento se debe observar si hay colonias con una o varias morfologías y se debe proseguir el
análisis sólo con las colonias con morfología macro y microscópica características de la especie
que se busca aislar.
EN ESTA COMO EN CUALQUIER OTRA IDENTIFICACION ES IMPORTANTE QUE CONOZCA
LAS CARACTERISTICAS PRINCIPALES –DE ACUERDO AL MANUAL DE BERGEY- DEL
MICROORGANISMO QUE INTENTA IDENTIFICAR.

Problema
En jarabes preparados a partir de extractos naturales de plantas la Farmacopea Europea exige
ausencia de E.coli en 1 mL de jarabe. Para realizar dicho análisis se realiza un enriquecimiento en
caldo lactosa, se aislan colonias de dos tipos en medio Mac Conkey incubado entre 43-450C: 1)
colonias rojas con halo de precipitación alrededor, 2) colonias incoloras sin halo de precipitación.
¿Cuáles son las colonias que podrían pertenecer a la especie E. coli?

Ud. recibirá un reaislamiento de una colonia sospechosa en medio Agar Lactosa Rojo Fenol.
¿Cómo crecería una cepa de E. coli en ese medio?
¿Que ensayos adicionales a la observación de la colonia y de sus características en el medio de
cultivo debe realizar en el momento para determinar si dicha colonia puede ser E. coli?
¿Que otras propiedades puede deducir a partir de este crecimiento? De acuerdo a ellas, la cepa
que tiene en ese reaislamiento podría pertenecer a la sección en la cual el Manual de Bergey ubica
a E.coli? ¿En que Familia se ubica a E. coli? ¿Que propiedades debería determinar para distinguir
esa Familia de las otras de la misma sección?

¿En que caso puede afirmar que tiene un cultivo puro?

¿Puede continuar con las etapas de identificación? Si no puede, ¿que procedimiento realizaría?

De acuerdo a la Farmacopea Europea, la cepa sospechosa que Ud. tiene hasta ahora (colonias
típicas en el medio selectivo) indica la presencia probable de E.coli. Para la confirmación se
recomienda el test para la producción de indol y otras pruebas bioquímicas.
¿En qué consiste la prueba de indol?
¿Qué resultado espera para esta prueba si fuese E.coli? Utilice la tabla de pruebas bioquímicas
para Enterobacterias resumida del Manual de Bergey. (recuerde que el número que aparece en la
tabla es el % de cepas que dan un resultado positivo para ese test en el total de cepas analizadas)

Pág. 42
Podría “perderse” alguna cepa de E.coli si realizara sólo esta prueba? Es decir una cepa que,
siendo E.coli, no la puede identificar como tal porque la cepa da un resultado atípico en la
producción de indol.

La recomendación de la American Public Health Association (APHA) para el análisis de alimentos

incluye tres pruebas además del indol: Rojo de Metilo, Voges –Proskauer y Citrato. Las 4 pruebas
se resumen en la sigla IMViC (Indol, Metilo, Voges, Citrato).
¿Qué cree que se logra incluyendo mas pruebas bioquímicas?
¿En qué consisten estas pruebas? ¿Qué resultados espera para E.coli?
Los manuales de métodos del APHA dan por identificada una cepa como Ecoli si el resultado de las
pruebas IMViC es ++-- (Indol y Rojo de Metilo positivos, VP y Citrato negativos) o si es -+--.
¿Podría “perderse” una cepa de E.coli en este caso?
¿Podría darse el caso al revés, es decir que identifique como E.coli una cepa que no es?

Problema II (Salmonella)

Antecedentes
Las bacterias del género Salmonella son bastones Gram negativos que no reducen sulfato cuyo
habitat es el intestino humano y de animales. Aunque no todas las especies de Salmonella son
igualmente patógenas, todas son importantes para la salud pública, y por tanto el procedimiento de
análisis debe estar dirigido a recuperar cualquier especie que pertenezca a este género.
En especialidades farmacéuticas y alimentos –a diferencia de muestras clínicas- se espera
un número bajo de estas bacterias, que además pueden estar fisiológicamente dañadas debido al
procesamiento y almacenamiento de la muestra. Debido a ello en el análisis de estas muestras se
incluyen siempre etapas de enriquecimiento. El aislamiento generalmente se realiza en mas de un
medio de cultivo (no todas las especies de Salmonella crecen en un solo tipo de medio sólido). Los
medios selectivos más comunes utilizan inhibidores como el colorante verde brillante o sales
biliares para bacterias que no son de origen fecal. Varios de estos medios son diferenciales porque
tienen además lactosa o xilosa y un modo para detectar su fermentación (indicadores de cambio de
pH) o lisina y la detección de la decarboxilación. La etapa siguiente es determinar si las colonias
aisladas pertenecen o no al género Salmonella. Las pruebas bioquímicas y la serología se usan de
rutina para la identificación presuntiva en laboratorios de análisis microbiológico. La identificación
definitiva se realiza en centros de referencia por serología.
Recuerde que las colonias aisladas en medios selectivos no necesariamente son cultivos puros
debido a que el inhibidor del medio no elimina los otros m.o. contaminantes. Se debe reaislar en un
medio no selectivo para asegurarse de obtener un cultivo puro. En el reaislamiento se debe
observar si hay colonias con una o varias morfologías y se debe proseguir el análisis sólo con las
colonias con morfología macro y microscópica características de la especie que se busca aislar.

Problema
En preparaciones farmacéuticas que contienen plantas medicinales la Farmacopea Europea exige
ausencia de Salmonella en 10 g de la preparación. Para realizar dicho análisis se realizan dos
etapas de enriquecimiento: una en caldo lactosa y la siguiente en un caldo selectivo con
tetrationato, bilis y verde brillante. A partir de allí se aislan colonias en mas de un tipo de medio de
cultivo selectivo: en uno de ellos, el Agar Verde Brillante (que tiene además lactosa, sacarosa y rojo
fenol), crecen dos tipos de colonias: 1) colonias que viran el medio a amarillo, 2) colonias incoloras
que no viran el medio a su alrededor.
¿Cuáles colonias podrían pertenecer al género Salmonella?

Ud. recibirá un reaislamiento de una colonia sospechosa en medio Agar Lactosa Rojo Fenol.
¿Cómo crecería una cepa de Salmonella en ese medio?
¿Qué ensayos adicionales a la observación de la colonia y de sus características en el medio de
cultivo debe realizar en el momento para determinar si dicha colonia puede ser una especie de
Salmonella?

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¿Qué otras propiedades puede deducir a partir de este crecimiento? De acuerdo a ellas, ¿la cepa
que tiene en ese reaislamiento podría pertenecer al grupo de bacterias en el cual el Manual de
Bergey ubica a las especies de Salmonella?
¿En qué Familia se ubica a las especies de Salmonella? ¿Que propiedades debería determinar
para distinguir esa Familia de las otras de la misma sección?

¿En qué caso puede afirmar que tiene un cultivo puro?

¿Puede continuar con las etapas de identificación? Si no puede, ¿que procedimiento realizaría?

De acuerdo a la Farmacopea Europea, la cepa sospechosa que Ud. tiene hasta ahora (colonias
típicas en los medios selectivos) indica la presencia probable de bacterias del género Salmonella.
La identificación presuntiva se realiza con la prueba bioquímica llamada Tripe Sugar Iron (TSI).
¿En que consiste esta prueba?
¿Que resultados espera para las distintas especies del género Salmonella? Utilice la tabla de
pruebas bioquímicas para Enterobacterias resumida.

¿Podría “perderse” alguna cepa de Salmonella? Es decir una cepa que, siendo Salmonella sp., no
la puede identificar como tal porque la cepa da un resultado atípico en esta prueba.

La Farmacopea Europea recomienda la realización de otras pruebas bioquímicas y pruebas

serológicas para la identificación definitiva.
La recomendación de la American Public Health Association (APHA) para el análisis de alimentos
sigue un procedimiento similar para enriquecimiento y aislamiento pero usa otras pruebas
bioquímicas como la producción de indol, y la descarboxilación de lisina entre otras. Recuerde
además que, durante el aislamiento, se eligieron para la identificación las cepas no fermentadoras
de lactosa. ¿Que cree que se logra incluyendo mas pruebas bioquímicas?
¿En que consisten estas pruebas? Que resultados espera para las especies de Salmonella?

¿Podría “perderse” alguna cepa de Salmonella en este caso?

¿Podría darse el caso al revés, es decir que identifique como una especie del género Salmonella a
una cepa que no lo es?

Problema III (P. aeruginosa)

Antecedentes
En el curso de una investigación epidemiológica de varios casos de infección por Pseudomonas
aeruginosa en una sala de atención de quemados, se realizaron cultivos de los posibles fuentes o
reservorios de la bacteria en el ambiente.
Ud. recibirá una placa de Agar Cetrimide sembrada con uno de los antisépticos analizados,
cultivada durante 24 horas a 37C, en aerobiosis. Se solicita que determine si el antiséptico pudo
ser el reservorio o fuente de la cepa de Pseudomonas aeruginosa que provocó los casos de
infección.

¿Qué tipo de medio de cultivo es el Agar Cetrimide? ¿Las bacterias que crecen en él requieren
factores de crecimiento? ¿Requiere altas concentraciones de NaCl?

¿A cuál sección del Manual Bergey corresponde la o las bacterias en estudio?

¿Podría tratarse de una bacteria aerobia estricta? Como haría para confirmar que se trata de una
bacteria aerobia estricta?

¿Cuál es el fundamento de los ensayos King A y King B? Si una cepa creciera en Agar Cetrimide
con producción de un pigmento difusible de color azul, realizaría ambos ensayos?

Pág. 44
¿Es el antiséptico analizado un posible reservorio de la cepa que causó las infecciones en los
pacientes?

El antiséptico del cual se obtuvo este aislamiento fue una solución de un compuesto de amonio
cuaternario. ¿Es posible suponer que fuera un reservorio para P. aeruginosa?

Problema IV (S. aureus)

Antecedentes
Las bacterias pertenecientes a la especie Staphylococcus aureus son cocos Gram positivos, que
pueden ser patógenos para el hombre. Las principales afecciones que producen son intoxicación
alimentaria, por producción de una toxina termoresistente en alimentos, e infecciones de piel.
Existen seres humanos que son portadores sanos de S. aureus, el cual se aloja en narinas y piel. A
partir de esas fuentes, puede llegar a los alimentos donde su proliferación constituye un riesgo
potencial para la salud pública por la posible producción de enterotoxinas.
Las siguientes situaciones llevan a analizar los alimentos para determinar la presencia o el
número de células de S. aureus:
A) confirmar si es el agente causal de una enfermedad alimentaria.
B) determinar si un alimento o ingrediente es una fuente potencial de estafilococos
enterotoxigénicos
C) demostrar contaminación post-proceso, que generalmente se debe a contacto humano con
alimentos procesados.

Los alimentos que se sospecha fueron vectores de una toxiinfección alimentaria debida a S.
aureus frecuentemente presentan altos números de células del m.o.. En cambio, si se sospecha
una contaminación post proceso, puede esperarse una población menor. En general S. aureus no
es el único m.o. presente en el alimento, por lo cual debe emplearse medios selectivos para su
aislamiento y recuento.
Las especialidades farmacéuticas también se analizan para detectar S. aureus, debido a la
posibilidad de causar infecciones en piel y mucosas. En este tipo de muestras, por lo general se
exige ausencia de S. aureus en 1 g de producto.

Los medios selectivos contienen inhibidores de otros m.o., de modo de impedir el desarrollo de
otras especies. Los agentes selectivos más comúnmente usados en medios para S. aureus son
NaCl (S. aureus puede crecer en presencia de concentraciones entre 5.5% y 10%) y telurito de
potasio (K2TeO3, S. aureus reduce el telurito de potasio, produciendo colonias negras), y otros
cloruro de litio, polimixina, azida de sodio y neomicina.
Debe considerarse que el uso de los agentes selectivos no garantiza la completa inhibición de
otros m.o., como por ejemplo miembros de los géneros Bacillus, Micrococcus, Streptococcus y aún
levaduras. Por esta razón, la aparición de colonias típicas no es suficiente y debe confirmarse si
dichas colonias típicas desarrolladas en placas de medio selectivo verdaderamente pertenecen a la
especie S. aureus.

Problema
Una familia presenta síntomas de toxiinfección alimentaria 2 a 4 horas después de comer, con
náusea, vómitos, diarrea y dolor abdominal. Esta sintomatología puede deberse al desarrollo de
elevados números de S. aureus y formación de toxina en el alimento ingerido. Se decide analizar
una muestra remanente de queso artesanal que formó parte de la comida, de modo de determinar
si el m.o. responsable fue S. aureus.

¿Qué método puede usarse para aislar S. aureus de dicha muestra si el m.o. estuviera presente en
números altos?

Pág. 45
A Ud. se le entregará una placa de MSA proveniente de esta muestra. Considerando que las
bacterias del genero Staphylococcus son fermentadoras de glucosa y manitol. ¿Es posible afirmar
que en la muestra había S. aureus? ¿Por qué?

En caso de que haya que continuar el análisis:

¿Cómo determinaría si las colonias típicas corresponden a S aureus o no? ¿Qué morfología y
reacción al Gram presenta el género Staphylococcus?
¿Cómo se clasifican las bacterias de este género según sus relaciones con el oxígeno?
¿Cómo puede diferenciarse el género Staphylococcus de otros relacionados? (Deberá recurrir a
Tablas del Manual de Bergey que tendrá para consulta en clase)

¿Cómo puede diferenciarse S. aureus de otras especies del género Staphylococcus?

Pág. 46
DETERMINACIONES CUANTITATIVAS DE LA BIOMASA - RECUENTOS

Se propone la siguiente clasificación:

1. Recuentos (determinación del número de microorganismos)

• Recuento en placa ya sea en superficie o incorporado

• Método de las diluciones múltiples o del Número Más Probable (NMP)
• Filtración por membrana e incubación de ésta sobre medio de cultivo sólido
• Recuento microscópico directo de los m.o., ya sea en frotis o en cámaras
• Filtración por membrana, coloración del filtro, y conteo al microscopio .
• Conteo electrónico, usando contadores de partículas.

2. Determinación de la masa celular

• Medida de la masa
• Medida del volumen
• Determinación del contenido de N
• Turbidimetría y nefelometría

3. Determinación de la actividad celular

• Determinación de una actividad enzimática

• Determinación de un metabolito
• Medida del consumo de oxígeno
• Medida de ATP
• Calorimetría
• Medida de impedancia
• Radiometría (de CO2)

Al momento de elegir la técnica de recuento a emplear, se debe tener en cuenta el tipo de muestra
sobre la que se va a trabajar, porque es posible que algunos de los métodos no sean aplicables.
Cuando es necesario llevar a cabo diluciones, la toma y preparación de la muestra se realiza de la
manera descrita anteriormente (toma de muestra). En las descripciones que siguen se denominará
homogeneizado a la muestra preparada para su análisis microbiológico.

Pág. 47
RECUENTOS

RECUENTO EN PLACA
Permite determinar indirectamente el número de m.o. presentes en una muestra en base a que se
desarrollen en medio de cultivo, en placa, formando colonias. Por lo tanto se determinan por este
método sólo las células microbianas VIABLES en las condiciones de trabajo (nutrientes, atmósfera,
temperatura). Como las colonias pueden originarse tanto de una célula como de un grupo de
células, se utiliza el término: UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (u.f.c.) Además, a los
efectos de que todas las células que están en una placa tengan una adecuada disponibilidad de
nutrientes, y que la incertidumbre del método sea menor, se establece que las condiciones óptimas
de recuento se dan cuando desarrollan entre 30 y 300 colonias por placa. Esta regla general se
usa siempre que no haya una especificación diferente. Para alimentos se utilizan el rango de
colonias óptimas entre 25 a 250 ufc por placa. Si fuera posible y necesario se puede repetir el
recuento para obtener placas con un número de colonias óptimas.

Procedimiento
La preparación de la muestra se realiza como para cualquier método utilizando diluyentes
adecuados. Se preparan diluciones decimales sucesivas (relación muestra/volumen de dilución 1
en 10), partiendo en general de 10 g o mL de muestra en 90 mL de diluyente para la primera
dilución (1/10 o 10-1). Para la segunda dilución (1/100 o 10-2) se toma 1 mL de la 10-1 y se descarga
en 9 mL de diluyente y así sucesivamente. Se descarta la pipeta luego de cada descarga.

Cada vez que se prepara una dilución en necesario homogeneizarla adecuadamente para lograr
una distribución de los m.o. en todo el volumen de dilución. Esto se logra por agitación (si es un
frasco con tapón hermético se realiza con agitación durante 25 veces, formando un arco de aprox.
30 cm y si es un tubo con agitación con Vortex). También puede cargarse y descargarse un
determinado volumen de la dilución con una nueva pipeta (al menos tres veces), y finalmente tomar
el volumen deseado .

Según la carga esperada, o permitida, se eligen las diluciones a sembrar.

Cuando se esperan cargas altas, se siembran no menos de tres diluciones consecutivas Ej.: 1:10
(10-1), 1:100 (10-2), 1:1000 (10-3).
Una vez preparadas las diluciones, se siembra dentro de los 15 minutos siguientes .

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ANTES DE PROCEDER A LA SIEMBRA SE ROTULAN LAS PLACAS CON LOS SIGUIENTES
DATOS:

Identificación de la muestra: Nombre y/o código

Dilución, Volumen sembrado
Superficie o incorporado
Fecha
Operador

SIEMBRA INCORPORADA
Se deposita 1 mL de cada dilución en placas estériles, vacías, por duplicado. Se puede emplear la
misma pipeta para todas las diluciones si se comienza por la más diluida. Posteriormente, se
agrega a cada placa 15 a 20 mL del medio de cultivo a emplear, previamente fundido y
termostatizado a 45ºC (en baño o estufa). Se agita moviendo la placa tapada sobre la superficie de
la mesa con movimiento circular, horario y antihorario yy hacia delante y hacia atrás.
En algunas situaciones puede sembrarse un volumen diferente, en general no más de 3 mL por
placa.

SIEMBRA EN SUPERFICIE
Se deposita en la superficie de las placas que ya contienen el medio de cultivo, 0.1 mL de cada
dilución. Se realiza duplicado para cada dilución. Se puede emplear la misma pipeta para todas las
diluciones si se comienza por la más diluida. Luego de realizada la descarga de la muestra, se
procede a extenderla sobre toda la superficie de las placas para que se absorba, usando rastrillo
estéril.

Medio de cultivo
Se elige según el tipo de m.o. que se quiere contar pudiendo emplearse medios selectivos o no
selectivos.

Incubación
Una vez enfriado el agar en el caso del recuento incorporado, y absorbida la muestra en el caso de
recuento en superficie, las placas se invierten, y se ponen en la estufa que corresponde según los
m.o. a contar, durante el tiempo propuesto en la técnica correspondiente.

INTERPRETACIÓN
Finalizado el período de incubación se observa con buena luz a efectos de visualizar todas las
colonias y diferenciarlas de cualquier partícula de muestra que pueda confundir. Contar todas las
colonias desarrolladas por placa, marcando cada una con un lápiz de tinta indeleble. Se cuentan
como colonias individuales todas aquellas que disten de las colonias próximas una distancia al
menos igual al diámetro de la colonia más pequeña.

Cuando se utilizan medios NO SELECTIVOS se procede de la siguiente forma:

1) Se cuentan en primer lugar las placas que tengan entre 30 y 300 colonias (o 25 – 250). Se
hace el cálculo multiplicando por la inversa de la dilución y luego se promedian –si
corresponde- los valores de las distintas placas y diluciones. Para el informe final se toma en
cuenta solo los valores de estas placas.

Si no hay placas que contengan entre 30 y 300 colonias proceder de la siguiente manera:
2) Si sólo hubieran placas con menos de 30 colonias, se hace el cálculo multiplicando por la
inversa de la dilución y se informa igualmente el resultado, expresándolo por g o mL de
muestra. En este caso se informa el resultado como ESTIMADO.
Si no hubiera colonias en ninguna de las placas, se informa como: Menor que 1 o 10 (según
sea incorporado en superficie) por la inversa de la dilución menor.

Pág. 49
 3) Si en todas las placas hubiera más de 300 colonias, se estima el resultado. Si no es
posible distinguir colonias individuales (crecimiento confluente) se puede informar el
resultado como mayor de 300 por la inversa de la dilución mayor. Si es posible distinguir
colonias individuales y están homogéneamente distribuidas, se cuentan las colonias en una
superficie conocida de la placa y luego se extrapola a la superficie total de la placa: 65 cm2
para las de vidrio comunes, o 57 cm2 para las de plástico.
Se siguen las siguientes reglas:
• Si hay menos de 10 colonias por cm2, se cuentan 13 cuadrados de 1 cm de lado: 7
consecutivos horizontales y 6 consecutivos verticales. El total de colonias contadas
se multiplica por 5 o 4.4 según el tipo de placa, para estimar el número de colonias
en toda la placa. En este caso se informa el resultado como ESTIMADO
• Si hay más de 10 colonias por cm2, se cuentan 4 cuadrados de 1 cm de lado, y el
promedio se multiplica por 65 o 57 según el tipo de placa. En este caso se informa
el resultado como ESTIMADO
• Si hay más de 100 colonias en 1 cm2, no se cuentan sino que se estima el
resultado como mayor de 6500 o 5700 por placa.
Una vez estimado el número de colonias por placa, se aplica el factor de conversión para
expresar el resultado por gramo o mL de muestra, de acuerdo al método (incorporado o
superficie), y a las diluciones sembradas.

Es frecuente que desarrollen colonias extendidas sobre la superficie o el fondo y bordes de la

placa, o que se den cadenas de colonias unidas. Este tipo de crecimiento se denomina "spreaders"
y se cuentan como una. Cuando el spreader cubre más del 50% de la placa, esta no debe
contarse. Cuando el spreader cubre una superficie menor del 50%, se cuentan las colonias en el
resto de la placa, SOLO si están uniformemente distribuidas.
Si en todas las placas hay spreaders se informa : Spreaders

Todas las situaciones en las que no se pueda informar el recuento por no caer en los casos
anteriores, (ej.: contaminación, mal funcionamiento del medio), se informa como: "Accidente de
laboratorio"

Cuando se emplean medios SELECTIVOS, el número de colonias que se considera óptimo para
contar, suele ser menor de 300, es necesario referirse a la técnica correspondiente (de referencia)
a los efectos de la interpretación de los resultados.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE AMBOS MÉTODOS:

Incorporado Superficie
Mayor cantidad de muestra. Menor cantidad de muestra
Mayor precisión Menor precisión
Mejor aprovechamiento de nutrientes Peor aprovechamiento de nutrientes
Dificultades al subcultivar colonias Facilidad para subcultivar colonias
Visualización de colonias dificultosa Fácil visualización
Temperatura del agar puede afectar la
No se afectan los m.o. termosensibles
viabilidad de algunos m.o.
En aerobiosis sólo crecen aerobios y anaerobios
Se desarrollan m.o. microaerofilicos
facultativos

Pág. 50
Expresión de los resultados:

Se informan los resultados de recuento con sólo DOS CIFRAS SIGNIFICATIVAS, redondeando los
valores cuando corresponda. Redondear la segunda cifra significativa a la inmediata superior si la
tercera cifra es 6 ,7, 8 o 9. Redondear la segunda cifra significativa a la inmediata inferior si la
tercera cifra es 1, 2, 3 y 4. Si la tercera cifra es 5 redondear hacia arriba si la segunda cifra es
impar y hacia abajo si es par

Ej.: 137 se informa 140 ó 1,4 x 102

145000 se informa 1,4 x 105

En el informe de un recuento en placa se expresa,:

Recuento de ..............(tipo de microorganismo): X u.f.c. /g o mL

NUMERO MAS PROBABLE (NMP) O METODO DE LOS TUBOS MULTIPLES

Se basa en la determinación de la presencia o ausencia de un determinado tipo de m.o. (en función
de que crezcan o de que produzcan determinada reacción en el medio), en cantidades
decrecientes de muestra. Se analizan en forma paralela por triplicado o quintuplicado porciones de
la muestra cada vez menores inoculadas en un medio líquido. Por ejemplo, se utilizan un total de
nueve tubos con medio de cultivo, en tres de los cuales se siembra 0,1 g. de muestra, en tres 0,01
g y en los otros tres restantes 0,001 g. Luego de la incubación, se observan y cuenta el número de
tubos positivos.
Según el tipo de m.o que se desea contar se utilizan medios de enriquecimiento selectivo o medios
nutrientes. En función de esto se puede considerar como positivos aquellos tubos en los que:
1) Hubo crecimiento que se detecta como aparición de turbidez (siempre que la muestra
sembrada no enturbie el medio).
2) Detección de productos del metabolismo del m.o.
a) producción de gas que se observa en una campanita invertida (Durham) en el tubo.
c) viraje de indicador (de pH, de potencial redox, etc).
d) producción de pigmento.
e) otros (reducción de NO3-, producción de indol, hidrólisis de una proteína, etc)

Ocasionalmente, es necesario subcultivar cada uno de los tubos positivos, o presuntamente

positivos a placa, o a otro tubo (con el mismo u otro medio) a efectos de confirmarlo.

El número de tubos (positivos) que se busca en las tablas para el informe final es el que resulta de
esta etapa de confirmación, siendo el valor anterior sólo un valor presuntivo. La interpretación de
los resultados, se hace en base a una distribución de tipo Poisson, y en general se emplean tablas
preparadas de acuerdo a la cantidad de muestra que se siembra en cada serie de tubos.

Ejemplo 1:

Nº de tubos sembrados: 3 3 3
Volumen por tubo (mL) 1 1 1
Dilución de la muestra: 10-2 10-3 10-4
Equivalente en g de muestra 0,01 0,001 0,0001
Tubos positivos 3 1 0

El resultado 3-1-0 se busca en tabla III y se obtiene un valor de 43/g ó mL, cuando en la primer
serie de tubos se siembra 0,1 g. Como en nuestro caso no estamos en condiciones hay que
realizar la conversión. En este caso resulta claro que estamos sembrando diez veces menos en la

Pág. 51
primera serie de tubos (0,01 g), por lo tanto el factor a utilizar es multiplicando el resultado de tabla
por diez. El resultado a informar es entonces: NMP de (tipo de m.o) = 43/g.

Una manera general de calcular el resultado es multiplicar el valor de tablas por el inverso de la
dilución sembrada en la serie del medio. Ej:

3 1 0 en Tabla III 43/g

NMP de tipo de m.o/mL = 43 x 1/dilución de la serie del medio = 43 x 1/10-3 = 430/g ó 4,3 x 102/g
100 100

Ejemplo 2:
Nº de tubos sembrados: 5 5 5
Volumen de muestra en c/u (mL): 10 1 0,1
Número de tubos positivos: 2 0 0
(dos tubos positivos para la primera dilución, ninguno en las siguientes)

De la tabla IV surge el valor: 5/mL. Como la siembra no esta realizada en las condiciones de la
tabla debe aplicarse el factor de corrección.
El resultado final se informa: NMP de .... (tipo de m.o):= 5 x 1/100= 0,05/mL ó 5/100 mL
100
Si la muestra es agua es habitual informar el resultado por 100 mL.

Pág. 52
Es de fundamental importancia antes de leer la tabla, asegurarse que esté construida para
condiciones similares a las de trabajo, que sea para igual número de tubos por serie, y para
cantidades de muestra que sean múltiplo o submúltiplo ya que hay variedad de tablas según el
número de tubos y diluciones a sembrar.
La corrección se hace utilizando proporcionalidad inversa. En todos los casos el valor informado se
considera un índice de la carga microbiana, y se conocen los límites de confianza para cada valor.

Dado que la distribución de las células obedece una distribución de Poisson puede calcularse el
número de células promedio de la dilución sembrada cuando no se trabaja en las condiciones más
comunes para las que existen tablas, usando la siguiente ecuación:

NMP/g o mL = ___________Nº de tubos positivos____________________

(mL o g de muestra X mL o g de muestra)

en tubos negativos en todos los tubos

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL MÉTODO:

Puede emplearse para aquellos m.o. que no crezcan en medio sólido y para aquellos m.o. de
crecimiento lento (paras los cuales se evidencia el crecimiento por una reacción y no por turbidez)

Este método es especialmente útil para determinar cargas microbianas bajas, menores de 10 por
gramo para sólidos o menores a 1 por 10 mL para líquidos, pero puede igualmente emplearse para
cargas mayores utilizando las diluciones apropiadas.

Asimismo, es el único método a utilizar en el caso de muestras como por ejemplo polvos
insolubles, en los que no es aplicable el método de filtración ni es recomendable el recuento en
placa debido a la presencia de partículas.
Se prefiere también este método cuando los m.o. son de lento crecimiento, o cuando han sido
sometidos a condiciones adversas (temperatura alta, desecación, etc.)
Es posible enumerar también por este método m.o. anaerobios utilizando en los tubos medio
prerreducido, que se tapan con vaselina-parafina luego de inocular, e incuban en condiciones
aerobias.

FILTRACION POR MEMBRANA

Este método consiste en hacer pasar un volumen determinado de muestra líquida, o solución en
agua o en solvente apropiado estéril a través de un filtro de membrana estéril (diámetro 50 mm,
poro 0,45 µm), colocado en un equipo de filtración.
Luego de enjuagar con soluciones estériles apropiadas se retira el filtro, y se lo coloca sobre la
superficie de una placa de Petri con el medio de cultivo a utilizar e incuba.

Los filtros pueden ser de distintos materiales; en microbiología se emplean de nitrato o acetato de
celulosa generalmente, y pueden tener bordes hidrofóbicos, que minimizan la adsorción de
conservadores y antimicrobianos.

Luego de transcurrido el tiempo de incubación, se cuentan las colonias desarrolladas en el filtro. Se

considera que las condiciones óptimas del método se dan cuando desarrollan entre 20 y 200
colonias en el filtro. Se utilizan filtros reticulados, y existen reglas para el conteo:

Pág. 53
 1) Si hay 1 o 2 colonias por cuadrado del retículo, o menos, se cuentan todas.
2) Si hay entre 3 y 10 por cuadradito, se cuentan 10 cuadrados, y se promedia, multiplicando
por 100 para obtener el número de colonias en el filtro (se multiplica por 100 porque el área
del cuadrado representa la centésima parte del área total del filtro).
3) Si hay entre 10 y 20 se cuentan 5 cuadrados y promedia, multiplicando luego por 100.
4) Si hay más de 20 se considera >2000 por filtro
Toda vez que se utilice el promedio por cuadrado, el recuento se informa como ESTIMADO.

Ventajas y desventajas:
Sirve para determinar cargas muy bajas, pues se puede filtrar volúmenes de 100 y hasta 1000 mL.
Es además el método de elección para muestras líquidas o solubles que contienen agentes
antimicrobianos, por cuanto no es necesario neutralizarlos.

Expresión de los resultados:

Una vez conocido el número de colonias por filtro, se expresa el valor en u.f.c. al igual que el
recuento en placa expresándolo por gramo, o mililitro de muestra.

RECUENTO MICROSCOPICO DIRECTO

Este método permite determinar el número de células microbianas, por observación en el

microscopio. La muestra puede utilizarse tal cual, (si es líquida como leche o cultivos puros en
medio líquido), o puede prepararse una dilución tal como se realiza para otros métodos de
recuento.

Se basa en contar m.o. en una cantidad conocida de muestra utilizando frotis coloreados, cámaras
del tipo de las de contar glóbulos, o las especialmente diseñadas para contar hongos en alimentos
como la cámara de Howard.

Se determina el número TOTAL de células presentes (VIABLES Y NO VIABLES) Ocasionalmente

se pueden utilizar colorantes que indiquen diferentes estados metabólicos de las células. Por
ejemplo en un recuento en cámara de un cultivo de levaduras con azul de metileno, se pueden
distinguir las células VIABLES (no absorben el colorante, se verán transparentes) de las NO
VIABLES (absorben el colorante y se verán azules).

Recuento sobre frotis coloreado

Se marca sobre un portaobjetos limpio y desengrasado, un cuadrado de 1 cm de lado. Sobre la
superficie opuesta del portaobjetos, se deposita en el centro 0,01 mL de muestra ya sea con ansa
calibrada o con micropipeta. Se extiende por todo el cuadrado con ansa. Se deja secar en posición
horizontal. Se fija y colorea, ya sea por Gram o con azul de metileno 1 minuto (método de Breed
para leche).

Se observa por inmersión, contando los m.o. en cada uno de varios campos. El número de campos
a contar depende del número de m.o. por campo y del factor del microscopio. Se transcribe la tabla
que se propone para el recuento directo en leche (Standard Methods for the Examination of Dairy
Products APHA)

Número de campos a contar según el factor del microscopio y el número de microorganismos:

Pág. 54
 Factor del microscopio
Microorganismos por campo
300000 400000 500000 600000
Menos de 1 30 40 50 60
1 a 10 20 20 20 30
Más de 10 10 10 10 20

Cálculo del factor del microscopio

Con objetivo de 40 x, o 100 x, se mide el radio del campo utilizando un portaobjetos calibrado, o el
retículo de una cámara cuenta glóbulos. Si se utiliza el de 40 x, luego debe hacerse la corrección
utilizando el factor 40/100 para llevarlo al aumento de trabajo.

Se calcula el área del campo: π r2

El número de campos por cm2 es: 1 / π r2

Si se extendió en 1 centímetro cuadrado 0,01 mL de muestra, el número de campos por mililitro,

llamado Factor del Microscopio (FM), se calcula de la siguiente forma:

FM = 100 / π r2 donde r se expresa en cm, o FM = 10000/ π r2 con r en mm.

Expresión de resultados

Una vez contado el número de m.o. en los campos que corresponde, se promedia, y multiplica por
el Factor del microscopio; de esa forma se obtiene el resultado que se expresa en términos de:

Recuento microscópico directo = N microorganismos por mL

Recuento en cámara de Neubauer

Es una cámara que se utiliza para contar glóbulos (En E se cuentan eritrocitos y en L los
leucocitos) y está diseñada de manera de contener una cantidad fija de líquido. Consta de un
cuadrado central de 1 mm de lado dividido en 25 cuadraditos. Cada uno de ellos está, a su vez,
dividido en 16 cuadrados.

Se coloca un cubreobjetos sobre la zona cuadriculada, apoyado sobre dos hombros laterales de
manera que cuando hay un buen contacto entre ellos, queda una distancia de 0.1 mm entre el
cubreobjetos y la cámara. Esto determina que el líquido quede contenido en un volumen de 0.1
mm3.

Ventajas del método:

Es rápido
Los frotis se pueden guardar
Las exigencias de equipo son mínimas
Se pueden observar las diferentes morfologías de los m.o.
Se observan tanto los m.o. viables como los no viables

Desventajas del método:

La cantidad de muestra analizada es poca
Provoca cansancio del operador
Sólo sirve para muestras con cargas superiores a 10.000 por mL.
Es difícil distinguir los m.o. de las partículas de muestra
Una inadecuada distribución de la muestra sobre la superficie del portaobjetos puede ocasionar
serios errores.

Pág. 55
DETERMINACIÓN DE LA MASA CELULAR

TURBIDIMETRÍA

Este método da información sobre el contenido de macromoléculas, y no sobre el número de

células.

En el laboratorio de microbiología se usa un colorímetro, o un espectrofotómetro y se mide la

absorbancia de la suspensión de m.o. en comparación con un blanco que es el medio esterilizado,
y sin sembrar. Cuanto mayor es el número de células en suspensión, tanto menor es el porcentaje
de luz que atraviesa el medio.

Se cumple una ley similar a la de Lambert-Beer y A

expresando la relación en términos de masa microbiana y
absorbancia, la ecuación es la siguiente:

A= k x W:

donde: Absorbancia
k: constante
W: masa celular
W
La gráfica correspondiente construida con valores reales
muestra una desviación a medida que aumenta la masa microbiana.

Para utilizar la medida de la absorbancia como método de recuento, es necesario hacer para cada
m.o. una curva de calibración, midiendo el número de m.o. por otro método de recuento. El método
se emplea fundamentalmente para preparar inóculos, cuando se trabaja con cultivos puros.

ESCALA DE MAC FARLAND

Pág. 56
Existe la posibilidad de estimar cargas altas de m.o., comparando a simple vista con una escala
formada por tubos numerados de 1 a 10 y elaborada con diferentes cantidades de sulfato de bario.
Se conoce la cantidad aproximada de células bacterianas a que corresponde cada tubo, y de esa
forma se puede estimar la cantidad de m.o. presentes. Este método sólo da una estimación del
número de m.o. (viables y no viables) y sirve sólo para cargas altas. Tiene la ventaja de ser muy
rápido y no es necesaio disponer de espectrofotómetro.

Tubo Millones de bacterias/ mL

1 300
2 600
3 900
4 1.200
5 1.500
6 1.800
7 2.100
8 2.400
9 2.700
10 3.000

Pág. 57
ALGUNAS APLICACIONES DE RECUENTOS

MICROORGANISMOS INDICADORES
Los métodos usados para el aislamiento y el recuento de los m.o. patógenos en agua, alimentos,
etc. pueden no ser eficaces debido a que dichos m.o. se encuentren en muy baja cantidad, sobre
todo en presencia de números altos de otros m.o. También puede ocurrir que tengan una
distribución irregular en la muestra. Aún cuando se cuenta con métodos sensibles, en general son
largos y costosos; además, hay patógenos que no pueden determinarse en laboratorios no
especializados, como, por ejemplo, el virus de la hepatitis A. Estas dificultades han impulsado a
que se utilicen grupos de m.o. de detección y enumeración más fáciles y cuya presencia en cierto
número se considera como una indicación de que la muestra estuvo expuesta a condiciones que
pudieron determinar la llegada a la misma de m.o. peligrosos y/o permitir la proliferación de
especies patógenas. Estos grupos de m.o. se denominan indicadores.
Se usan como m.o. indicadores aquellos cuya relación con los patógenos ha sido
estudiada.

Los indicadores utilizados más frecuentes son:

- mesófilos aerobios totales o heterótrofos

- Enterobacterias
- Coliformes totales y fecales
- Estreptococos fecales y Enterococos
- Clostridios sulfito-reductores

AGUA

El análisis microbiológico de muestras de agua tiende a determinar la calidad sanitaria de ésta y su

aptitud para distintos usos. En general, los métodos utilizados están diseñados de modo de
detectar el grado de contaminación del agua con desechos de origen humano y/o animal.
Tradicionalmente se han usado ensayos para la determinación de m.o. indicadores más que para
la determinación de patógenos.

El grupo de bacterias coliformes ha sido siempre el principal indicador de calidad de los distintos
tipos de agua; el número de coliformes en una muestra se usa como criterio de contaminación y
por lo tanto, de calidad sanitaria de la misma.

Los coliformes son bastones Gram (-), aerobios o anaerobios facultativos que fermentan la lactosa
con formación de gas cuando se incuban 48 horas a 35ºC. Incluye los géneros Escherichia,
Enterobacter, Klebsiella y especies lactosa positivas de otros géneros. También interesa la
determinación de coliformes fecales que representan la fracción de coliformes que provienen de
intestinos y materias fecales de hombre y animales de sangre caliente (coliformes termotolerantes).
Esto provee información importante sobre la fuente y el tipo de contaminación presente.

Un método muy utilizado para el recuento de coliformes en agua ha sido siempre el NMP, pero han
ido variando los medios de cultivo, las condiciones y las técnicas de manera de obtener cada vez
mayor sensibilidad y precisión hasta hacerlo aceptable como método estándar. Los distintos
métodos de NMP para coliformes totales se basan, en primera instancia, en una selección de los
m.o. que producen gas de lactosa a 35ºC. Por ello, el primer paso es siempre la siembra en tubos
de algún caldo lactosado, con tubo de fermentación para recoger el gas que pueda producirse. A
esto sigue una confirmación en un medio líquido selectivo y/o una determinación de los coliformes
fecales cuya diferenciación se realiza en base al hecho de que pueda producir gas de lactosa en
un medio apropiado cuando se incuba a 44,5ºC mientras que los demás coliformes no.

Pág. 58
También es muy utilizado el método de filtración por membrana para el recuento de bacterias
coliformes totales y fecales. Es un método altamente reproducible, puede usarse para analizar
volúmenes de muestra relativamente grandes y se obtienen resultados en menor tiempo que con el
NMP. Sin embargo, no puede aplicarse a cualquier tipo de muestra y tiene sus limitaciones.
También se encuentra entre los métodos estándar. A los efectos de la filtración por membrana debe
replantearse la definición de coliformes: bastones Gram -, aerobios o anaerobios facultativos, que
dan colonias oscuras con brillo metálico en medio Endo, luego de 24 hs. de incubación a 35ºC. La
determinación de coliformes fecales por filtración puede hacerse a partir de las colonias
desarrolladas en Endo o directamente incubando la membrana en medio m-FC e incubando a
44,5ºC.

Para la detección simultánea de coliformes totales y Escherichia coli se puede utilizar la prueba de
sustrato enzimático. En este caso el grupo de coliformes totales se define incluyendo todas las
bacterias que presentan la enzima beta-D-galactosidasa, que hidroliza el sustrato cromogénico (por
ejemplo, ONPG) liberando el cromógeno. Como E. coli se incluyen todas las bacterias que dan
positiva la reacción de coliformes totales y que tienen actividad beta-glucuronidasa, que hidroliza el
sustrato fluorogénico (por ejemplo, MUG), liberando el fluorógeno.

También se usa como indicador de contaminación fecal el grupo Estreptococos fecales que
incluyen especies de Estreptococos grupo D de Lancefield (Enterococcus faecalis, E. faecium,
Streptococcus equinus, S. bovis) y algunas subespecies y una especie del grupo Q (Streptococcus
avium). El grupo Enterococos estaría incluído dentro de estreptococos fecales y comprende las
especies Enterococcus faecalis y E. faecium y sus subespecies (origen humano) y también se usa
como indicador de contaminación fecal en agua.

El hábitat normal de los estreptococos fecales es el intestino del hombre y los animales de sangre
caliente, por lo tanto son indicadores de contaminación fecal, sobre todo en muestras de lagos,
estuarios, ríos, etc. La identificación de las especies puede proporcionar información sobre la
fuente de contaminación debido a que algunas especies son específicas de sus huéspedes; por
ejemplo, una predominancia de S. bovis o S.equinum indicaría una contaminación por heces no
humanas.

El recuento de heterótrofos totales consiste en un método estandarizado para determinar la

densidad de bacterias heterótrofas, mesófilas aerobias y anaerobias facultativas en el agua. Así se
obtiene información útil que se estudia junto con el índice de coliformes; también se le usa para
controlar un proceso de tratamiento de agua o para verificar la calidad del agua tratada, luego de
recorrer toda la red de distribución.

También interesa estudiar la presencia o el recuento de Pseudomonas aeruginosa en distintos tipos

de agua (potables, recreacionales, de industrias, etc.)

Otro grupo de indicadores que ha comenzado a utilizarse en aguas lo constituyen los colifagos. Los
colifagos son bacteriófagos de coliformes que se encuentran siempre que haya coliformes totales y
fecales. De acuerdo a estudios de correlación entre número de colifagos y coliformes en agua, se
podría utilizar el índice de colifagos como índice de calidad sanitaria de agua. Además, como son
más resistentes a la cloración que los coliformes, pueden ser mejores indicadores de desinfección
que éstos últimos.

El método de enumeración se basa en la formación de playas de lisis. Los colifagos (bacteriófagos)

infectan y se multiplican en bacterias sensibles a ellos. Esto provoca la lisis celular de esas
bacterias y liberación de partículas virales que infectarán a las células bacterianas adyacentes. A
medida que éstas bacterias se vayan lisando, se formarán zonas claras, conocidas como “playas
de lisis”, entre el crecimiento confluente de la bacteria utilizada. La cepa utilizada en los ensayos es

Pág. 59
una cepa de E. coli sensible a la infección por colifagos (ATCC 13706). La metodología empleada
está descripta en el “Standards Methods for the examination of water and wastewater".

BIBLIOGRAFÍA

Los métodos de referencia para los análisis antedichos se pueden encontrar en:

- "Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater", APHA-AWWA-WPCF, 20th Ed.
Normas UNIT: 856-91, 857-91, 858-91, 893-91, 894-91, 942-93, 943-93.
Normas ISO (varias)

Las normas vigentes en nuestro país respecto a la calidad microbiológica de los diversos tipos de
agua se pueden encontrar en:

- Normas de calidad de agua potable...…………… OSE

- Reglamento Bromatológico Nacional …………… Ordenanza P.E. 315/94
- Ordenanza Bromatológica Municipal ...................I.M.M (Decreto 27235)
- Norma 833/90....................………………………...UNIT
- Decreto 253/79 (12/89).....…………………...........Poder Ejecutivo
- Decreto 16235 (1974)....…………………..............Junta de Vecinos de Montevideo

Para el análisis de diferentes tipos de muestras, y los límites aconsejados se puede consultar:

- Standard Methods for the examination of Dairy Products", APHA, 16 th Ed., 1992.
- U.S. Food and Drug Administration Bacteriological Analytical Manual, AOAC,Gaithersburg, MD,
8th ed., 1995..
- Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, 16th Ed., 1995.
- Microorganisms in foods 1 & 2" ICMSF.
- USP 28.
- Reglamento Bromatológico Nacional
- Normas UNIT (varias)
- Ordenanza Bromatológica Municipal (IMM)
- Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 1992, 3rd Ed.
- Farmacopea Europea y suplementos
- Normas ISO (varias)

Pág. 60
EJERCICIOS DE RECUENTOS

1) Se realiza un recuento en placa de una muestra sólida por siembra incorporada de 0,5 mL en
cada placa en VRBA de las diluciones que se indican. Se incuba 24 hs a 35 ºC. Se cuentan las
colonias rojas desarrolladas. Informe claramente los recuentos para los siguientes resultados:

Dilución sembrada y número de ufc

Muestra
10-2 10-3 10-4
1 0 0 0
2 190 28 0
3 > 300 114 9
4 5 0 0

2) Se realizaron recuentos por NMP en dos muestras de gelatina en caldo lauril triptosa. Se
sembraron tres tubos por dilución, (1 mL de dilución por tubo) y se incubó a 35ºC durante 48
horas. ¿Cómo informaría los recuentos si obtuvo los siguientes resultados?:

Dilución sembrada y tubos positivos

Muestra
10-2 10-3 10-4
A 3/3 1/3 0/3
B 3/3 3/3 3/3

3) Diseñar un método de recuento para cada uno de los siguientes casos:

a) Determinar la aceptación o rechazo de una muestra de carne a la que se le acepta un

límite de S aureus de 104 /g.
b) Determinar la aceptación o rechazo de una muestra de harina a la que se le exige menos
de 100 microrganismos aerobios mesófilos por gramo.

4) En una muestra de almidón se exige una carga bacteriana menor de 105 /g. ¿Cuál de los
siguientes métodos utilizaría para el análisis y cuáles no? Fundamente su elección y diseñe el o los
experimentos (diluciones a sembrar, medios, temperatura y tiempo de incubación).
Recuento en placa
Recuento microscópico directo
NMP
Turbidimetría

5) Explique que método (volúmenes a sembrar, medios, temperatura y tiempo de incubación)

utilizaría para hacer el recuento de coliformes en agua potable si la exigencia es de 0/100 mL.

Pág. 61
6) Se realizó el recuento en una muestra de agua de pozo por filtración. Se filtraron 10mL de la
dilución 1/10 (-1), se colocó la membrana en una placa de TSA y se incubó por 48hs, se contaron
30 colonias en la placa. ¿Cómo se expresa el resultado?

7) ¿Cómo informaría el recuento por NMP de las siguientes muestras de agua de playa con los
siguientes resultados?

Muestra 1. (se sembró 1 mL de cada dilución se incubaron los tubos a 35°C por 48 hs.)

Dilución sembrada y tubos positivos

Medio
-1 -2 -3
CLT 3/3 3/3 2/3
CLBVB (subcultivo) 1/3 0/3 0/3

Muestra 2. (se sembró 1 mL de cada dilución se incubaron los tubos de CLT a 35°C por
48 hs. y EC a 44,5 °C por 24 hs.)

Dilución sembrada y tubos positivos

Medio
-2 -3 -4
CLT 2/3 1/3 0/3
EC (subcultivo) 0/3 0/3 0/3

8) Las normas vigentes para la calidad microbiológica del pescado fresco indican:
n= 5, c=3, m=106 M=107 Heterótrofos mesófilos.
n= 5, c=3, m=104 M=106 Heterótrofos psicrófilos.
n= 5, c=3, m=103 M=2x103 Staphylococcus aureus.
n= 5, c=3, m=4 M=400 Coliformes fecales.

¿Cómo haría cada recuento? Especificar el método, las diluciones, medios de cultivo y temperatura
de incubación.

9) Las normas de calidad microbiológica de un producto farmacéutico líquido de uso oral indican:
un límite de 500 ufc/mL para bacterias heterótrofas.

Se realiza el recuento del producto en TSA de dicho producto (que contiene parabenos) sembrando
1 mL (incorporado) de las diluciones que se indican y se obtienen los siguientes resultados:

Dilución sembrada y número de ufc

0 -1 -2
3 40 5

De acuerdo a estos resultados ¿qué puede concluir?

Pág. 62
Se realiza la validación del procedimiento expuesto en el ejercicio anterior. Para ello se prepara
una suspensión de un cultivo de E. coli . Se realiza el recuento de esta suspensión de E. coli y se
obtiene:

Recuento en placa (TSA) en superficie (0,1mL)

Dilución sembrada y número de ufc

-5 -6 -7
358 70 6

Para realizar la validación, se inocula 1 mL de la dilución –7 de la suspensión de E. coli preparada

anteriormente y se agrega a cada una de las placas sembradas con las diluciones del producto
líquido (0, -1 y -2) y se obtiene el siguiente resultado:

Dilución sembrada de producto (+ suspensión) y

número de ufc
0 -1 -2
55 113 75

¿Se considera el método validado?

¿Qué recomendaciones haría para analizar esta muestra? ¿Podría utilizar otro método?.

Pág. 63
MUESTREO PARA ANALISIS MICROBIOLOGICO

La primera etapa del análisis microbiológico es la extracción de la o las muestras de un lote y

cualquier resultado carece de significado si la muestra no ha sido apropiadamente tomada. Es
responsabilidad del laboratorio de control constatar que la muestra que se analizará es
representativa del lote y rechazarla antes de realizar el análisis si se tiene indicios de que no lo es.

Generalmente en los textos especializados se describen los protocolos para el muestreo en las
áreas clínicas, de alimentos, de aguas y de medicamentos y es necesario referirse a ellos en
primera instancia. Aquí señalaremos algunas consideraciones generales aplicables a las tres
últimas áreas.

El lote es el número de unidades o la cantidad de un producto que ha sido sometido a las mismas
condiciones durante un proceso determinado. Esta es una consideración teórica puesto que es
difícil asegurar la uniformidad durante la mayoría de los procesos conocidos. Por ej. en una
esterilización por vapor no todas las zonas del autoclave alcanzan la misma temperatura, sin
embargo se considera que todos los recipientes sometidos a ese proceso en esa instancia
constituyen un lote.

Se considera que una muestra o un conjunto de muestras son representativas de un lote cuando
reflejan, tanto como sea posible, la totalidad del lote.

Para determinar que la muestra es representativa y que no se ha alterado después de la extracción

deben tenerse en cuenta las etapas de: recolección, transporte y preparación para el análisis
propiamente dicho.

1) Recolección

Los planes de muestreo determinan el número, tamaño y zonas de recolección de la muestra. Se

diseñan por criterios estadísticos teniendo en cuenta además algunas características del producto
tales como:

- riesgo potencial para el consumidor, si el riesgo es alto se aumentar el número de

muestras para dismimuir la probabilidad de que llegue al consumidor una muestra contaminada

- facilidad de homogeneizar el lote. Si la producción es en batch y el producto es fácilmente

mezclable, como un líquido, se requiere menor número de muestras que si no lo es; si el lote es un
conjunto de unidades y se presume que no es de calidad uniforme entonces se extraerán
muestras de los puntos donde se supone que la calidad es inferior los cuales se denominan puntos
críticos (en el ejemplo del autoclave éstos serían las zonas donde se alcanza menor temperatura).
A su vez deber considerarse la homogeneidad dentro de la unidad o envase, p.ej. en un alimento
congelado hay un gradiente de temperatura durante el proceso de enfriamiento de tal manera que
la zona central es la que tarda mas tiempo en alcanzar la temperatura de congelamiento.

- posibilidad de controlar y registrar el tratamiento al cual ha sido sometido el producto;

cuanto mayor sea la seguridad de que el tratamiento ha sido correcto para la totalidad del lote, se
requiere menor número de muestras.

Debe tenerse en cuenta que el aumento del número de muestras está restringido por el costo del
análisis y porque existe un límite por encima del cual no hay un aumento significativo de los
intervalos de confianza.

Pág. 64
La muestra se extrae de unidades cuyo envase externo esté inalterado. La extracción se realiza en
forma aséptica para evitar la contaminación de la muestra y del resto del contenido del envase. La
muestra debe identificarse con un número, fecha, origen, contenido e iniciales del extractor.

2) Transporte

Para un producto almacenado en batch la muestra se toma y transporta en recipientes previamente

esterilizados y herméticos. El transporte se realiza de acuerdo a las condiciones de
almacenamiento. Si es un producto alterable debe transportarse refrigerado (0º-4ºC) por no mas de
24hs. Si se trata de un alimento congelado debe conservarse a la temperatura de congelamiento.

El recipiente de transporte no debe llenarse completamente (hasta un 75% de su capacidad) para

permitir homogenizar.

3) Preparación para el análisis

Se debe realizar la observación macroscópica de la muestra y del envase de transporte y registrar

cualquier particularidad. Se procede a la homogeneización de la muestra mediante manipulación
aséptica.

Si es un sólido o una pasta se diluye en buffer o agua peptonada estériles y se mezcla en una
licuadora o en bolsas de plástico previamente esterilizados. Si es un producto oleoso (p.ej. una
pomada) se termostatiza en el diluyente a 35ºC para lograr una emulsión.

Si el análisis se realizará por filtración es necesario disolver el producto en un solvente orgánico

inocuo para los m.o. (p.ej.miristato de isopropilo).

Para alimentos se recomienda que la toma no sea inferior a 10 g y que la relación con el diluyente
sea 1:10. Esta dilución debe prepararse inmediatamente antes del análisis.

APLICACIONES.

I) Muestreo de equipos y utensilios.

Se puede realizar por varios métodos:

a) Enjuagado: consiste en enjuagar el equipo con un volúmen medido de medio de cultivo o de

buffer, el cual es sometido al análisis microbiológico.

b) Contacto de superficie: consiste en pasar un hisopo embebido en buffer por un área

determinada del equipo y posteriormente descargar el hisopo en un volúmen medido de diluyente
el cual es analizado. Este método es recomendado para zonas de difícil acceso, en cambio para
áreas planas se recomienda el contacto directo de la superficie a analizar con un cilindro de agar
del diámetro de una placa de Petri el cual se corta asápticamente, y se expresa el resultado por
área de contacto (Replicate Organism Direct Agar Contact Plates).

c) Inmersión: los utensilios se sumergen en un volúmen determinado de diluyente y se determina el

número de m.o. por unidad.

II) Muestreo de aire.

a) Sedimentación: se exponen placas de agar durante 15' a 2h dependiendo de la contaminación

del área a analizar. Se detectan sólo los m.o. que están adheridos a partículas sedimentables.

Pág. 65
b) Impacto: se hace pasar un volúmen determinado de aire mediante aplicación de vacío a través
de una serie de tamices que retienen distinto tamaño de partícula. Los tamices son incubados
sobre agar y se puede determinar el número de m.o. asociados a partículas de distinto tamaño.

c) Impregnación de líquidos: consiste en hacer burbujear un volúmen determinado de aire a través

de un diluyente estéril el cual retiene los m.o. presentes.

Bibliografía

- Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. APHA (American Public
Health Association), 1976. Ed.Spceck,M.
- Microorganismos in Foods 2: Sampling for microbiological analysis, Principles and specific
applications.
ICMSF (International commision on Microbiological Specifications for Foods), 1974. Ed. Ingram,M.
- Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater APHA, 1976. 14th. ed.
Ed.Rand,M.

Pág. 66
VALIDACIÓN

CONCEPTOS
Validar un proceso cualquiera significa verificar que el procedimiento seguido es el adecuado para
obtener el fin propuesto. Por ejemplo para validar un proceso de llenado aséptico de ampollas
inyectables se prepara un lote en el que se sustituye el producto con medio de cultivo. Se incuba
entonces las ampollas y se observa si hay o no crecimiento, lo que validará o no, el procedimiento
de llenado.
Para validar un proceso de esterilización de un producto en un envase dado, se prepara un lote de
envases llenos con medio de cultivo inoculado con una cepa adecuada. Luego del ciclo de
esterilización se incuba y se observa el crecimiento.
Este concepto se puede aplicar a un proceso analítico. Por ejemplo, si se busca yodo en una sal de
mesa, se ensaya la técnica de análisis en una muestra adicionada de determinada cantidad de
yodo demostrando así que con la técnica empleada se puede detectar el yodo en la concentración
buscada.
El concepto de validación es de especial interés en el análisis microbiológico.
Validar la búsqueda de un m.o. en determinada cantidad de una muestra dada, significa demostrar
que si hubiera estado presente dicho m.o. en determinada concentración, se hubiera encontrado
con la técnica empleada.
Validar el recuento de m.o. en una muestra determinada, significa demostrar que si hubieran
estado presentes en determinado número, se hubiera determinado ese número por el método
aplicado

PROCEDIMIENTO DE VALIDACION
Para validar los procedimientos en si mismos, se parte del medio de cultivo de enriquecimiento (en
el caso de una búsqueda) o del disolvente inicial (si se trata de un recuento) inoculado con el m.o.
adecuado.
Para validar la aplicabilidad de dicho procedimiento a una muestra dada se parte de la muestra en
cuestión inoculada con el m.o. que se desee. Teóricamente, se debe validar para cada m.o. que se
busque o se quiera contar. Como no siempre esto resulta práctico, se pueden seleccionar uno o
dos m.o. que se consideren representantes de los distintos grupos fisiológicos. Por ejemplo, al
efectuar un test de esterilidad se recomienda validar con un m.o. esporulado, una levadura, y un
m.o. anaerobio el medio tioglicolato y con un m.o. esporulado y una levadura el medio TSB.

¿Qué número de m.o. se agrega?

Dependerá de la sensibilidad exigida al método que a su vez es función de la muestra. En general
debemos pensar que si las muestras fueron sometidas a alguna condición drástica, por ejemplo
calor, si los m.o. están presentes lo estarán en bajo número.
Por lo tanto, se debe demostrar que el procedimiento empleado es capaz de recuperar m.o. aún si
se encuentran en bajo número. Al validar un procedimiento de búsqueda habitual (con 10 g de
muestra en 90 mL de caldo de enriquecimiento) se suele agregar de 10 a 100 células del m.o.
adecuado.

INTERPRETACION DE RESULTADOS
a) Se considerará que el procedimiento de búsqueda o recuento está validado si se detecta el m.o.
o se determina en el número esperado con la técnica en cuestión.
b) Si se detecta el m.o. empleando la técnica sobre la muestra inoculada se concluye que el
procedimiento en cuestión es aplicable a dicho tipo de muestra.

En caso de obtener resultados negativos en a) hay que analizar cada paso del procedimiento

Pág. 67
seguido, medios de cultivo empleados, condiciones de incubación, etc. En general, estos factores
están bajo control en un laboratorio de rutina, y se emplean procedimientos ya descriptos.
Es más frecuente el caso de que no valide b), o sea que un procedimiento ya descripto en la
bibliografía y válido en si mismo no resulta adecuado para determinado tipo de muestra. La causa
más frecuente de no validación es la presencia de poder inhibitorio en la muestra analizada. Es
decir la muestra presenta la propiedad de inhibir el desarrollo de m.o., ya sea por contener agentes
conservadores, declarados o no, por su pH u otros motivos.
Se debe estudiar entonces, hasta donde sea posible, la composición de la muestra. Si se conoce la
presencia de conservadores se debe eliminar su acción. Esto se puede conseguir de tres maneras
fundamentales:

a) Por neutralización química, esto es, agregando una sustancia capaz de anular la acción del
agente antimicrobiano. Por ejemplo la acción de penicilinas puede neutralizarse empleando ß-
lactamasas.

Agente inhibidor Neutralizante

Hipoclorito Tiosulfato de sodio
Yodo Tiosulfato de sodio
Parabenos Tween
Comp. amonio cuaternario Tween + lecitina
Comp. mercuriales Tioglicolato o cisteina

b) Por dilución, llevándolos a concentraciones subinhibitorias. Esto se consigue disminuyendo la

toma de muestra o aumentando el volumen del medio inicial.
c) Por filtración, removiendo mecánicamente el conservador. Se efectúa la filtración por
membranas con un tamaño de poro definido que retendrán los m.o. Su uso se limita a muestras
líquidas o solubles.

BIBLIOGRAFIA

- USP XXII, Microbial Limit Tests. Preparatory Testing, p.1479.

- USP XXII, Sterility Tests. Growth Promotion Test
Bacteriostasis and Fungistasis, p.1484
-European Pharmacopeia.1997.pag 84
- British Pharmacopeia, 1988. Test for Microbial Contamination. Validity of the test for especified
microorganisms and Validity of the counting methods, Apendix XVI B
- Microbial Applications of the Inactivation of Antimicrobial Agents, A.D. Russell and col., review of
the Journal of Applied Bacteriology, 1978.

Tabla II extraída del artículo: “Biochemical Identification of New Species and Biogroups of
Enterobacteriaceae Isolated from Clinical Specimens”. Journal of Clinical Microbiology, Jan. 1985,
p. 46-76 Vol. 21, No. 1. J. J. Farmer et al.

Pág. 68
Pág. 69
Tabla III, Índice de NMP y límite de confianza del 95% para varias combinaciones de
resultados positivos para una serie de 3 tubos cada uno con 0,1, 0,01 y 0,001 g ó mL de
muestra.

Combinación Límites de confianza Combinación Límites de confianza

NMP/g NMP/g
de tubos del 95% de tubos del 95%
ó mL ó mL
positivos Inferior Superior positivos Inferior Superior
0-0-0 <3 - - 3-0-0 23 4 120
0-0-1 3 < 0,5 9 3-0-1 39 7 130
0-1-0 3 < 0,5 13 3-0-2 64 15 380
1-0-0 4 < 0,5 20 3-1-0 43 7 210
1-0-1 7 1 21 3-1-1 75 14 230
1-1-0 7 1 23 3-1-2 120 30 380
1-1-1 11 3 36 3-2-0 93 15 380
1-2-0 11 3 36 3-2-1 150 30 440
2-0-0 9 1 36 3-2-2 210 35 470
2-0-1 14 3 37 3-3-0 240 36 1300
2-1-0 15 3 44 3-3-1 460 71 2400
2-1-1 20 7 89 3-3-2 1100 150 4800
2-2-0 21 4 47 3-3-3 >2400 - -
2-2-1 28 10 150

Pág. 70
Tabla IV. Índice de NMP y límite de confianza del 95% para varias combinaciones de
resultados positivos para una serie de 5 tubos cada uno con 0,1, 0,01 y 0,001 g ó mL de
muestra.

Límites de Límite de confianza

confianza del 95% del 95%
Combinación Combinación
NMP/g NMP/g ó
de tubos Inferior Superior de tubos Inferior Superior
ó mL mL
positivos positivos
0-0-0 <2 -- 4-3-0 27 9 80
0-0-1 2 <0,5 7 4-3-1 33 11 93
0-1-0 2 <0,5 7 4-4-0 34 12 93
0-2-0 4 <0,5 11 5-0-0 23 7 70
1-0-0 2 <0,5 7 5-0-1 31 11 89
1-0-1 4 <0,5 11 5-0-2 43 15 110
1-1-0 4 <0,5 11 5-1-0 33 11 93
1-1-1 6 <0,5 15 5-1-1 46 16 120
1-2-0 6 <0,5 15 5-1-2 63 21 150
2-0-0 5 <0,5 13 5-2-0 49 17 130
2-0-1 7 1 17 5-2-1 70 22 170
2-1-0 7 1 17 5-2-2 94 28 220
2-1-1 9 2 21 5-3-0 79 25 190
2-2-0 9 2 21 5-3-1 110 31 250
2-3-0 12 3 28 5-3-2 140 37 340
3-0-0 8 1 19 5-3-3 180 44 500
3-0-1 11 2 25 5-4-0 130 35 300
3-1-0 11 2 25 5-4-1 170 43 490
3-1-1 14 4 34 5-4-2 220 57 700
3-2-0 14 4 34 5-4-3 280 90 850
3-2-1 17 5 46 5-4-4 350 120 1000
4-0-0 13 3 31 5-5-0 240 68 750
4-0-1 17 5 46 5-5-1 350 120 1000
4-1-0 17 5 46 5-5-2 540 180 1400
4-1-1 21 7 63 5-5-3 920 300 3200
4-1-2 26 9 78 5-5-4 1600 640 5800
4-2-0 22 7 67 5-5-5 >2400 --
4-2-1 26 9 78

Pág. 71
TEST DE ESTERILIDAD

INTRODUCCION

El test de esterilidad se aplica a productos que deben ser estériles y se realiza para verificar que
efectivamente están libres de contaminación microbiana.
Deben ser estériles los productos suministrados por vía parenteral (inyectables, sueros), los
materiales que estén en contacto con el medio interno (apósitos, suturas, fluidos para irrigaciones,
material quirúrgico) y los productos oftálmicos. A medida que los avances tecnológicos permiten
obtener productos de mejor calidad, esta exigencia se va extendiendo a otros materiales tales
como los de aplicación ótica o algún tipo de mucosas.

El test de esterilidad se encuentra descrito en las Farmacopeas donde debe ser estudiado como
complemento de este trabajo.

Por esterilidad se entiende ausencia de cualquier forma de vida. El término esterilidad es absoluto.
El proceso mediante el cual se logra este estado se denomina "esterilización" y se define como "el
proceso de eliminar toda forma de vida". Este proceso está diseñado para minimizar la probabilidad
de que haya microorganismos sobrevivientes. Por lo tanto, siempre existe una probabilidad finita de
que quede algún microorganismo vivo.

LIMITACIONES DEL TEST DE ESTERILIDAD

1) El test de esterilidad es un procedimiento destructivo, por lo tanto sólo se puede aplicar a una
parte del lote del material a analizar. Por esta razón no puede asegurarse la esterilidad de todo el
lote.
Empleando conceptos estadísticos se recurre a un plan de muestreo que establece para un nivel
de confianza dado, que el porcentaje de contaminación del lote está por debajo de cierto límite. Por
ejemplo: para un resultado negativo (ausencia de crecimiento) en 20 muestras de un lote dado, se
asegura con un nivel de confianza del 95%, que el nivel de contaminación del lote está por debajo
del 5%. Para asegurar que ese lote tiene un nivel de contaminación menor que el 1%, con un nivel
de confianza del 99%, sería necesario analizar 500 muestras, lo que resultaría impracticable. Como
se observa, tal como está diseñado el método sólo permite detectar una contaminación grosera.

2) El ensayo no garantiza la detección de todos los microorganismos conocidos. Es imposible

diseñar un método que permita recuperar todos los posibles microorganismos contaminantes. Los
medios de cultivo empleados y las condiciones de incubación limitan el número de m.o. a
recuperar, a un cierto grupo. Quedan excluidos por ejemplo los m.o. exigentes, los anaerobios
estrictos y los virus.
A ello se agrega el hecho de que si el material fue sometido a un proceso de esterilización, los
microorganismos sobrevivientes se encuentran "estresados" y aunque no se recuperen en las
condiciones de realización del test, podrían proliferar en medios más ricos como el medio interno.

3) Para darle confiabilidad a un resultado positivo del test (desarrollo de m.o.) habría que
asegurarse de que la contaminación no fue introducida durante la realización del ensayo (falso
positivo). Aunque se han mejorado las condiciones de realización del mismo, todavía siguen siendo
un factor importante de fuente de error. Esto se contrapone a la idea de que se debe aumentar el
número de muestras para aumentar la confiabilidad del test, porque también aumenta la posibilidad
de tener falsos positivos.

MÉTODOS DE ENSAYO

Pág. 72
a) Inoculación directa
Consiste en la transferencia directa del producto a ensayar desde su recipiente de origen al medio
de cultivo apropiado.

b) Filtración por membrana

Consiste en la filtración del producto a ensayar o una dilución del mismo a través de una
membrana de porosidad adecuada (0.45 - 0.2 µm). Los microorganismos quedan retenidos en la
membrana. Ésta se coloca asépticamente en los medios de cultivo y se incuba.
Se aplica a formas líquidas y a productos que puedan solubilizarse en disolventes apropiados
(esterilizables e inocuos para los microorganismos). Permite ensayar un volumen mayor de
muestra. Es particularmente apropiado para productos con propiedades bacteriostáticas o
fungistáticas. Es el método de elección siempre que sea posible.

DISEÑO EXPERIMENTAL

1) Muestreo

Las Farmacopeas establecen el número de unidades a ensayar y la toma según el contenido de

cada unidad. En general se recomienda hacer el ensayo sobre 20 unidades.
Para la selección de las muestras es conveniente conocer el proceso de esterilización, de manera
de ensayar las unidades que tienen mayor riesgo de no haber quedado esterilizadas; por ejemplo,
en una esterilización por calor húmedo se ensayan las unidades que están en los "puntos fríos" del
autoclave.
Obviamente, el producto esterilizado debe estar contenido en un envase que conserve su
esterilidad, por lo tanto si esto no se cumple carece de sentido realizar el test de esterilidad.

CANTIDAD DE MUESTRA A ENSAYAR – FORMAS LÍQUIDAS – USP 25

Volumen mínimo de cada medio

Volumen mínimo a de cultivo (mL) Nº de
Contenido del envase tomar de cada Inoculación Filtración por unidades
unidad directa membrana por
medio
Menos de 10 mL 1 mL 15 100 20
10 a 50 mL 10 mL 40 100 20
50 a 100 mL 10 mL 80 100 20
50 a 100 mL (vía I.V.) Contenido total - 100 10
100 a 500 mL Contenido total - 100 10
Más de 500 mL 500 mL - 100 10

2) Medios de cultivo

Los medios de cultivo fueron seleccionados para favorecer el desarrollo del más amplio espectro
de microorganismos posible. Los recomendados actualmente son: Caldo Tripticasa Soja (TSB o
Tryptic Soy Broth) y Caldo tioglicolato.
El TSB se propone para recuperar bacterias aerobias, hongos y levaduras, y se incuba a 20-25ºC.
El Tioglicolato favorece el crecimiento de microorganismos anaerobios por ser un medio de bajo
potencial redox, aunque permite también el desarrollo de microorganismos aerobios. Se incuba a
30-35ºC. El bajo potencial redox se logra con el agregado de reductores (cisteína y ácido
tioglicólico) y un bajo porcentaje de agar que disminuye la difusión del oxígeno. El medio incluye
resazurina como indicador del potencial redox. Se considera que el medio está apto para el uso
cuando no más del tercio superior del volumen total está oxidado (rosado).

Pág. 73
Los medios deben ser sometidos a dos tipos de controles:

a) confirmar su esterilidad, para ello se incuba un número representante de cada partida (control
negativo) en las mismas condiciones del ensayo.

b) Test de promoción de crecimiento: se debe demostrar que el medio es capaz de promover el

desarrollo de microorganismos. Para ello se inocula dos unidades de cada lote de medio con 10 a
100 células del tipo de microorganismo establecido y se verifica el crecimiento de los mismos
dentro del plazo previsto para el desarrollo del test (control positivo).
Test de promoción de crecimiento – USP 25

Temperatura de
Medio Microorganismo
incubación (ºC)
Bacillus subtilis ATCC Nº 6633 o
30 - 35
Micrococcus luteus Nº 9341
Tioglicolato Candida albicans ATCC Nº 10231 30 - 35
Bacteroides vulgatus ATCC Nº 8442 o Clostridium
30 - 35
sporogenes ATCC Nº 11437
Bacillus subtilis ATCC Nº 6633 20 - 25
TSB
Candida albicans ATCC Nº 10231 20 - 25

3) Determinación de la presencia o ausencia de inhibidor en el producto a analizar

Antes de realizar el test de esterilidad se debe verificar que el producto a ensayar no ejerce
propiedades bacteriostáticas o fungistáticas en las condiciones del ensayo. Para ello se compara el
crecimiento desarrollado en el medio de cultivo, luego de inoculado con una cantidad conocida de
microorganismos, en ausencia y presencia del producto (método de inoculación directa) o de la
membrana usada para filtrar el producto (método por fitración). El crecimiento debe ser similar.
Si se comprueba presencia de inhibidor se debe agregar un agente neutralizante o ajustar la
relación toma de muestra:medio de cultivo hasta que se verifique que no existe inhibición.

4) Procedimiento

a) Condiciones de realización. Cabe recordar que en este ensayo una contaminación accidental
sería crítica. Se debe extremar las precauciones en el manejo de la técnica aséptica y trabajar en
una cabina de flujo laminar. La cabina de flujo laminar consiste en una cabina en la cual hay una
corriente constante y de velocidad uniforme (en forma laminar) de aire filtrado a través de filtros de
alta eficiencia (HEPA = High Efficiency Particulate Air). Estos filtros tienen una eficiencia del 99,97%
en remover todas las partículas mayores o iguales a 0.3 µm. El flujo puede ser vertical (brinda
mayor protección al operador) u horizontal.
El personal que realiza el ensayo también puede ser fuente de contaminación por sí mismos, por
su vestimenta o por las manipulaciones. Se recomienda utilizar vestimenta adecuada (túnica,
tapabocas, cofia y guantes esterilizados) y realizar el menor número de movimientos posibles.
Generalmente se controla la contaminación durante la realización del test por exposición de placas
con medio nutriente que luego se incuban.

b) Apertura de los envases y toma de muestra. Se limpia la superficie exterior de los envases con
una solución de un desinfectante adecuado y se extrae el contenido en forma aséptica. Si se trata
de viales o ampollas conteniendo un líquido se hace la toma con jeringa o pipeta estéril y se
transfiere a los medios de cultivo o directamente al vaso de filtración de la unidad filtrante (si el
volumen es muy pequeño o la solución es viscosa, diluir la muestra con un disolvente adecuado
antes de filtrar).

Pág. 74
Si se trata de productos oleosos solubles en miristato de isopropilo se puede aplicar el método de
filtración. Para los sólidos se busca un disolvente adecuado o se aplica el método de inoculación
directa.
En el caso de paquetes conteniendo artículos esterilizados (algodón, gasa, equipo quirúrgico, etc)
se debe abrir y extraer asépticamente parte de su contenido. En los dispositivos terapéuticos que
requieren la condición de esterilidad sólo para el interior del mismo (por ejemplo cánulas), se hace
fluir los medios de cultivo a través del lumen.

c) Técnica de filtración por membrana. La unidad filtrante consta básicamente de un vaso de

filtración un soporte para la membrana, un embudo y un kitasato. La filtración se realiza por
aspiración con bomba de vacío.
La membrana de filtración está constituída generalmente por polímeros de ésteres de celulosa.
Actúa como filtro de superficie con un tamaño de poro definido y limitado. En el test de esterilidad
se emplean membranas de 0.45 o 0.2 µm de diámetro de poro, lo que permite retener las bacterias
en su superficie. Pueden adquirirse esterilizadas o pueden esterilizarse junto a la unidad de
filtración.
Después de filtrar el producto, especialmente si éste tiene propiedades bacteriostáticas o
fungistáticas, se lava la membrana con líquido de enjuague. En este caso pueden emplearse
también membranas con bordes hidrofóbicos, que impiden que la parte de más difícil acceso a las
soluciones de enjuague (bordes de la membrana) quede embebida de agente inhibidor.
Se desarma la unidad y asépticamente se retira la membrana, se corta a la mitad y se introduce
cada una en los medios TSB y Tioglicolato. Se incuban durante 7 días.

d) Técnica de inoculación directa. Se transfiere directamente y en forma aséptica la toma desde

cada unidad a un tubo conteniendo TSB y a un tubo conteniendo caldo Tioglicolato. Se incuba y se
observa si hay evidencia de crecimiento microbiano al tercer, séptimo y décimocuarto día. Si el
producto por sí mismo deja el medio turbio, subcultivar entre el tercer y el séptimo día a nuevos
medios. Continuar la incubación de los medios originales y los subcultivos hasta que se cumplan
14 días de la inoculación original.

e) Interpretación e informe de resultados. En este párrafo se dan los lineamientos de la USP 25, en
otras farmacopeas pueden aparecer ligeras variantes.
Luego de concluído el período de incubación se examina los medios de cultivo en búsqueda de
evidencia de crecimiento microbiano.
• Si no hay evidencias de crecimiento como desarrollo de turbidez y/o crecimento superficial,
se informa que el producto "cumple el test de esterilidad según farmacopea ....."
• Si hay crecimiento en cualquiera de los caldos empleados se informa "no cumple el test
de esterilidad según farmacopea ....."
• Si hay evidencia de crecimiento y una revisión del proceso seguido para realizar el test,
indica que pudieran haber fallas en los controles negativos o en la técnica aséptica
seguida, se puede declarar no válido el primer ensayo y repetir el procedimiento (primer
reensayo).

No se prescribe en forma oficial, pero se recomienda aislar y caracterizar él o los m.o. que
crecieron en los medios de cultivo. El hecho de que los microorganismos aislados en cada ensayo
sean iguales puede ser una evidencia de que provienen de la muestra y por lo tanto de que el
producto no cumple con el test de esterilidad.

EL TEST DE ESTERILIDAD Y OTROS CONTROLES DE ESTERILIZACION

El control de un proceso de esterilización puede realizarse sobre el producto esterilizado (test de
esterilidad) y sobre el proceso mismo. Los controles del proceso pueden ser físicos (temperatura,
presión, humedad), químicos (viraje de algún indicador, concentración del agente esterilizante) o
biológicos (bioindicadores). Actualmente, el criterio general es emplear un combinación de éstos ya
que los ensayos en el producto final no aseguran, por sí solos, la esterilidad del mismo.

Pág. 75
Se considera que la esterilidad, como parte de la calidad de un producto, debe ser proyectada y
construida y no solo inspeccionada sobre el producto final.

Pág. 76