Curso Basico HPLC v.08

Curso Básico de
Cromatografía de Líquidos
de Alta Resolución
HPLC
(High Pressure Liquid Chromatography)
(High Performance Liquid
Chromatography)
(High Priced Liquid Chromatography!!!!)
BUAP-CUV Sep.,12, 2008

Definición.

Cromatografía es una técnica analítica basada en la
separación parcial o total de los componentes de una
mezcla como consecuencia de su migración
diferencial en un sistema dinámico formado por una
fase estacionaria y una fase móvil.
2
Proceso de separación cromatográfica
Fase móvil
Mezcla
Fase
estacionaria
Inyección Migración Elución
Separación de los componentes de

una muestra
3
Etimología
El botánico ruso Mikhail Semyonovich

Tswett (1872-1920), es conocido como el
“padre de la cromatografía”, como
resultado de sus experimentos en los
cuales usó columnas tipo gis “chalk” para
separar pigmentos extraídos de hojas.
Tswet presentó los principios básicos de
su método de separación en 1902,
después publicó dos artículos en 1906
en los cuales llamó al método
cromatografía.
4
Clasificación
De acuerdo a la naturaleza de la fase móvil, la
cromatografía se clasifica en :

CROMATOGRAFIA DE GASES (Gas)

CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS (Líquido)

En ambos casos , la fase estacionaria se encuentra
contenida en una tubería llamada COLUMNA.
5
Clasificación
Cromatografía
LSC
GSC
Partición
Empacada (Reparto)
Capilar Exclusión por
GLC tamaño.
Empacada Intercambio
iónico.
Capilar
6
Mecanismos de Separación
Xm
PARTICIÓN
S ADSORCION
EXCLUSIÓN
7
INTERCAMBIO
IÓNICO
Aplicaciones Generales
Bioquimica Clínica Polímeros
Farmacéutica
Alimentos y
Bebidas
Forense
Ambiental y Agropecuaria
Forestal
8
Aplicaciones Generales
Insecticidas: carbamatos, organofosforados

Fungicidas: benzimidazoles, carbamatos
Herbicidas y reguladores del crecimiento: ureas,
fenilureas, triazinas, glifosatos( diquat/paraquat)
Aflatoxinas: B1, B2, G1, G2
Micotoxinas: deoxinivalenol (DNO)
Acidos Fenólicos, Carbohidratos
Proteínas, Aminoácidos
Antocianinas
Vitaminas Liposolubles e Hidrosolubles
Drogas de Abuso
Antibióticos,Esteroides,Analgésicos
9
Sistema Cromatográfico,
INYECTOR BOMBA
FASE MÓVIL
COLUMNA
DETECTOR SISTEMA DE DATOS
10
Proceso de separación cromatográfica
11
Tiempo de Retención
tR
t´r= tr-
to
1 < κ ´ <
20
to= tiempo muerto
tr= tiempo de retención absoluto
12
Factor de Capacidad
13
Resolución (R)
• Mide la separación entre dos

picos
• Considera la distancia y el
ancho entre dos picos adyacentes
14
Resolución (R)
R = ___( tr2-tr1 )___

1/2(W1 + W2)
tr2 ,tr1 = tiempos de retención de ambos picos

W1,W2= anchos de pico en la base
15
Resolución (R)
Resolución vs
Concentra-
ción.
•Para columnas
nuevas es
recomendable que
R> 1.5
16
Resolución (R)
La curva Gaussiana representa la distribución estadistica

resultante de las moléculas en el espacio que ocupan
17
Resolución (R)
Existen tres fuentes

que contribuyen al
ensanchamiento de
bandas:
La eficiencia de la
columna es una
función de la longitud
de la columna y del
tamaño y uniformidad
de las partículas
18
Resolución (R)
Existen tres fuentes

que contribuyen al
ensanchamiento de
bandas:
19
Eficiencia (N) [número de platos teóricos]
• Mide los
efectos de
ensanchamiento
de pico que se
presentan
cuando un
componente
migra a través
de la columna
20
Altura Equivalente de un Plato
Teórico (HETP)
• La HETP relaciona la longitud de la

columna con el número de platos teóricos.
• Valores de HETP más pequeños -> columna
más eficiente.
21
Teórico (HETP)
• La Ecuación de Van Deemter es una
expresión teorica que define la eficiencia de la
columna. Es la suma de los tres elementos que
contribuyen al ensanchamiento de las bandas
22
Teórico (HETP)
A = Difusión de Eddy
B = Difusión Longitudinal
C = Resistencia a la
transferencia de masa
µ = Flujo de fase móvil
23
Eficiencia
(N, Número de Platos teóricos )
• Número de veces que un
componente presenta un estado
de equilibrio entre las dos fases
• Se expresa cuantitativamente
como el Número de Platos Teóricos
24
Selectividad, α
• Selectividad es
la medida de que
una columna pueda
distinguir entre dos
componentes
Se ajusta al hacer
cambios de fase
móvil y fase
estacionaria
25
Resolución vs Selectividad,
Capacidad y Eficiencia
26
Resolución vs Selectividad,
Capacidad y Eficiencia
• Rs = 0.8
• N = 7000
• α = 2.1
27 • .κ ´~1
Teória en práctica
• pico1 Tr=5.0
• pico2 Tr=6.2
• To=1.3
• W1=0.13
• W2=0.15
• L=25cm
• Calcular:.κ ´,
α, R, N y HETP
28
Definiciones en Resumen
Eficiencia
• Cuan estrechos son los picos
– Medida del desempeño de la columna/fase
estacionaria
Factor de Capacidad
• Cuan bien es retenido un compuesto
Selectividad
• La retención relativa de 2 compuestos
Resolución
• La separación relativa de 2 compuestos
• Evalua la separación en su totalidad
29
Optimización de una Separación
– Factor de Capacidad
Para optimizar el Factor de Capacidad:

Ajustar la fuerza del solvente
Cambiar la fase estacionaria (columna)
30
Optimización de una Separación–
Selectividad
Para optimizar la Selectividad (separación):

Cambiar la composición de la fase móvil
Usar aditivos en la fase móvil
Cambiar la fase estacionaria
Cambiar el pH y/o la temperatura
31
Optimización de una Separación–
Eficiencia
Para optimizar la eficiencia de la columna :

Disminuir el tamaño de partícula
Emplear el flujo acorde al mínimo de la grafica HETP
Emplear un solvente menos viscoso
Incrementar la temperatura de la columna
Incrementar la uniformidad de la partícula
32
II. Instrumentación
2.1 Fase móvil

2.2 Sistema de bombeo
2.3 Inyectores
2.4 Columnas
2.5 Detectores
33
SISTEMA CROMATOGRAFICO
INYECTOR BOMBA
FASE MÓVIL
COLUMNA
DETECTOR SISTEMA DE DATOS
34
2.1 Fase Móvil - Caracteristicas
Preparación de la Fase Móvil

Seleccionando la Fase móvil correcta
• La consideración principal al elegir un sistema de
solventes es seleccionar uno que separe
adecuadamente los analitos. Además de la calidad en
la separación, la fase móvil debe:
• No alterar la columna ni sus características
• Ser compatible con el detector
• Disolver la muestra
• Tener una viscosidad baja
• Permitir la recuperación fácil de la muestra, si es
necesario.
• Ser de pureza elevada y no tóxico
35
• Ser comercialmente disponible a un precio razonable
2.1 Fase Móvil - Preparación
A) FILTRACIÓN
MEMBRANAS
 Material
 Tamaño de Poro
36
B) DESGASIFICACIÓN
 Ultrasonido
H
e
 Gas Inerte  Agitación y
vacío
37
B) DEGASIFICACIÓN
38
C) PREMEZCLADO
 Es recomendable medir los volumenes
individuales y mezclarlos en un reservorio comun.
 Cuando se mezclan solventes orgánicos con
agua siempre se obtiene un ∆ V de mezcla negativo.
 Para preparar MeOH/Agua 50/50, no se debe
colocar 500 ml de metanol en el matraz aforado y
añadir 500 ml de agua porque no serian suficientes
para llevar al aforo.
39
D) BUFFERS
 Los buffers seran necesarios cuando se analicen
muestras que contengan analitos ácidos o básicos.
 Las concentraciones recomendadas son del orden
de 10 a 20 mM; de ser necesaria una mayor concentración
asegurarse que no se presente precipitación.
 Recordar que el intervalo de amortiguamiento es de
máximo +/-1.5 unidades en torno al valor de pka (ver
tabla).
 El pH debera ajustarse en el buffer acuoso
(teniendo considerado la modificación del pH por el
solvente orgánico).
40
D) BUFFERS
 Recordar que el intervalo de amortiguamiento es de
máximo +/-1.5 unidades en torno al valor de pka (ver
tabla).
41
D) BUFFERS

42
2.1 Fase Móvil – Mantenimiento
Preventivo
ACERO INOXIDABLE
PEEK
P/N: 28-211524-00 SOLVENT BOTTLE FILTER 10 µM,
TITANIUM
43 P/N: 27-180387-00 SOLVENT RESERVOIR FILTER, 10
UM, SS
Pureza de disolventes
Verifique con los proveedores el rango apropiado de
trabajo en UV de los disolventes
•El oxígeno disuelto incrementa la abs en la región del
UV lejano.Esnecesario desgasificar para lograr alta
sensibilidad en esta región.
•La absorción del oxígeno causará drift y ruido.
Depende de la temperatura
•Las sales de par iónico (TMA) pueden contener

impurezas que absorben en la región UV. Usar de la
más alta pureza
44
Cuidados con disolventes

Filtración
• Mantener los reservorios tapados.
45
Solventes

Solventes para fase inversa
• La mayoría de la LC por fase reversa utiliza agua
como el componente principal de la fase móvil
• El agua es el líquido polar más común
• Casi todos todos los compuestos, excepto los más
polares o más iónicos, experimentan una fuerza
hidrofóbica fuerte que los conduce a la fase
estacionaria y causa su retención
• Se debe utilizar siempre agua grado hplc
46
Solventes

Solventes para fase inversa
• El ajuste de la concentración orgánica del modificador
B es el medio primario de cambiar la retención
• Los tres más comunes son acetonitrilo, metanol y
tetrahidrofurano
47
Solventes

Solventes para cromatografia de iones
• La cromatografía en fase normal utiliza mezclas.
• utiliza un buffer acuoso a un pH que mantenga a los
analitos con carga.
• Para los ácidos, el pH debe ser mayor a 5
• Para las bases, el pH debe ser menor a 5
• Mientras que la concentración del buffer aumenta,
aumenta la fuerza solvente y la retención disminuye
• Se puede agregar solvente orgánico para cambiar la
retención y la selectividad
• El metanol se elige generalmente porque proporciona una
mejor solubilidad
48
Solventes

Solventes para cromatografia de iones
• El reactivo de par iónico es generalmente un ion de
cadena corta
• Para la separación de bases protonadas se utiliza el
pentan sulfonato, hexan sulfonato, o el heptan sulfonato
• Para la separación de ácidos ionizados, se emplea el
tetraetil-amonio o el tetrabutil-amonio
49
Solventes

Programación de Solventes
• Las condiciones a considerar cuando se elige la fuerza
óptima de fase móvil son resolución, duración del análisis
y el factor de la capacidad
• La resolución debe siempre ser por lo menos 1.5 para
análisis de cuantificación
• Tiempos de análisis más cortos pueden ser alcanzadas
usando un solvente más fuerte para los picos
suficientemente resueltos
• Una buena referencia es hacer que todos los picos se
eluyan con con valores de k ' entre 1-20
50
2.1 Bombas - Caracteristicas
 Operar a presiones elevadas

 Libre de pulsaciones
 Inerte
 Operar con gradiente de solventes
51
Objetivo de la Bomba
En la cromatografía clásica, la separación se realiza por
efecto de la gravedad (Tamaño de partícula 50-100
micrometros, tiempo de separación de una a varias
horas)
La disminución de tamaño de partícula como soporte de
la fase estacionaria (3, 5 o10 micras) exige forzar al
líquido a cruzar a través de la columna por medio de
una bomba.
Las bombas comerciales basan su diseño en pistones

reciprocantes
52
Funcionamiento de la Bomba
FASE MÓVIL
FASE MÓVIL
53
•El disolvente es entregado por la bomba con el pistón
reciprocante.(10 μL/min -10 mL/min)
•El diseño del pistón con un control electrónico de su movimiento

(stroke) proporciona un flujo ligeramente pulsante.
•Un damper reduce la pulsación del flujo.
•Una cámara de mezclado proporciona una homogenización de los
disolventes atras del punto de inyeccion de la muestra.
•Un transductor de presión convierte la presión del sistema en una
salida eléctrica que se despliega en la pantalla
54
•El movimiento del pistón es controlado por la rotación de la leva
(cam).
•Un ciclo completo en la bomba consiste del movimiento del pistón
para llenar el cabezal, en el cual el pistón viaja en reversa
(alejandose del cabezal de la bomba) y un movimiento de entrega ,
en la cual el pistón viaja en el sentido del cabezal de la bomba.
•Durante el movimiento de entrega, el disolvente es descargado a
través de la vávula check.
•La rotación de la leva (cam) es determinado por un software de
control del motor.
55
Mantenimiento Preventivo en Bomba
 Mala repetibilidad de tiempos de reten-

ción:
- Fugas (visibles o no visibles)
 SELLOS  Válvulas
 PISTÓN check
Solución:
56
Cambio de pieza dañada
2.1 Bombas– Tipos de Bombas
 Isocrática
 Gradiente
%B
Composición
57 Tiempo
2.1 Bombas– Análisis Isocratico
 Estabilidad en la línea base

 Tiempo de análisis largo
 Presión Constante
 Resolución limitada
58
Solventes

Separación isocratica o por gradiente
• La fase móvil isócratica no puede resolver todas las
separaciones
• Algunas muestras son demasiado complejas
• Resolución pobre de picos tempranos
• Ensanchamiento de picos y coleo de los picos finales
• En la elución por gradiente de solventes, la fuerza de la
fase móvil se incrementa por cambio de la composición de
los solventes en un cierto tiempo
• Elegido para una amplia gama de muestras o de
biopolímeros
• Limpia la columna durante cada corrida
59
• Empleada para estimar condiciones isocraticas óptimas
2.1 Bombas– Análisis con Gradiente
 Resolución de Mezclas Complejas

 Tiempo de Análisis Corto
 Variación de la Presión
 Inestabilidad de Línea Base
 Vida útil de la Columna Limitada
60
2.1 Bombas– Análisis con Gradiente
%B
Composición
Tiempo
61
2.1 Bombas– Desarrollo de un Gradiente
Tiempo %A %B Etapa
(min)
0 100 0 Prerun
20 80 20 Gradiente
30 80 20 Isocratico
35 100 0 Cond. Inicial
40 100 0 Equilibrio
Isocratico
n te
die Cond. Inicial
a
Gr
Equilibrio
62
2.3 Inyector Manual - Caracteristicas
 Válvula de 6 puertos
 2 posiciones: carga e inyección
Utiliza un loop / requiere cambio de loop
para inyectar diferentes volumenes
 Jeringa para introducir la muestra
 Limpieza manual de línea de
inyección
63
2.3 Inyector Manual - Funcionamiento
64
2.3 Inyector Manual - Mantenimiento
Preventivo
 Filtración de la Muestra
 Jeringa (aguja)
apropiada
 Loop correcto
 Limpieza correcta del
65 inyector
2.3 Inyector Automatico –
características
 Válvula de 6 puertos / 2 posiciones

 Utiliza un loop / no requiere de
cambio de loop para volumenes menores
 2 posiciones: carga e inyección
 Aguja / Jeringa para introducir
muestra en forma programada
 Limpieza automática de la línea de
inyección.
66
2.3 Inyector Automatico- Consideraciones
de
Operación
 Jeringa
 El vólumen de muestra es medido
con una jeringa de 250 uL.
 El interior de la jeringa debe estar
libre de burbujas.
De observarse burbujas:
Verificar la degasificación del
solvente de enjuague.
Verificar el buen estado de la
punta del émbolo.
Verificar que la aguja no este
tapada.
Es necesario verificar que no se
67
presenten fugas provenientes del
émbolo de la jeringa.
2.3 Inyector Automatico- Consideraciones
de
Operación
 Válvula de Inyección
 La muestra es introducida por una
válvula automática de seis puertos.
 Emplea tambien un sello/rotor que
puede rallarse. (mala repetibilidad
de áreas)
La falla se evidencia cuando se
observan gotas de líquido en la
punta de la aguja, crecen y se
desprenden.
 Y además, un incremento en la
presión tambien incrementa la
intensidad del goteo.
68
2.3 Inyector Automatico- Resumen de
funcionamiento
 Importante
 Jeringa y tuberia libre de burbujas.
 No fugas en jeringa.
 Presurización de vial solo funciona
si HeadSpace Pressure esta
habilitado.
 Recomendado solo con septas
nuevas.
La aguja de aire es insertada hasta
la parte superior del vial, por lo que
los viales solo llenarlos hasta 2/3 de
alto (Contaminación Cruzada). 2/3 máximo
69
2.3 Inyector Automatico- Mantenimiento
Preventivo
Factores que afectan la Repetibilidad de

Areas
A. MUESTRA
B. MODOS DE INYECCIÓN
C. LOOP
D. EFECTO MEMORIA
(Contaminación cruzada)
70
Preventivo
A) CONSIDERACIONES DE LA MUESTRA
 Compatible (soluble) con la fase

móvil.
 Disuelta en un solvente de la misma
polaridad (o más debil que la fase móvil).
 Libre de partículas suspendidas
(Filtrada)
71
Preventivo
B) MODOS DE INYECCIÓN
Hasta el 50 %
Modo Parcial del volumen
del loop
Toma de 3 a 2
Modo Total veces el volumen
del loop
72
Preventivo
C) Material y tamaño
del LOOP
Tamaño:
5, 10, 20, 50, 100,200,
500 (µ l),1, 2,5 (ml)
Material:
Acero Inoxidable,
Titanio,PEEK
73
Preventivo
D) EFECTO MEMORIA
Contaminación cruzada Son residuos de
muestra (o estándar)
de la inyección
anterior.
Se evidencia en la
inyección de un
blanco inmediato
74 posterior.
2.4 Columnas para HPLC
Diagrama
75
¿Cómo funcionan?
La fase estacionaria esta
empacada dentro la
columna no se mueve.
La fase móvil esta

circulando dentro la
columna a una
velocidad regulada
(flujo constante)
arrastrando a la muestra.
76
¿Cómo funcionan?
Si el analito es más
soluble en la fase móvil
que en la fase
estacionaria, el analito
migrará dentro de la
columna con poca
interacción con la fase
estacionaria.
77
¿Cómo funcionan?
Si el analito es más
soluble en la fase
estacionaria, migrará
más lentamente dentro
de la columna, y
dependiendo de la
magnitud de la
interacción, el tiempo
invertido será más o
menos grande.
78
Clasificación por Dimensiones
Modern HPLC for Practicing Scientists, Michael W. Dong, Wiley – Interscience, 2006
79
Efecto del
cambio en la
longitud de
la columna
80
Clasificación por Características

•Tipo de soporte
• Silica, polimero.
•Grupo químico enlazado
• C18, C8, C4, CN, NH2, Si
•Tamaño de partícula
• 2, 3, 5, 10 um
Longitud
•Tamaño de poro y Area Superficial
3, 5, 10, (60 ~ 200 A) (100 ~ 500 m2/g)
15, 25 cm)
•Densidad de ligando
• 2 ~ 4 µ mol /m2
81
Diámetro Interno (1, 2, 4, 4.6 mm)


•Tipo de soporte
• Silica (SiO2) es el material dominante. Posee una alta
resistencia mecánica y permite fabricar partículas
uniformes.
82

•Tipo de soporte
• Silica (SiO2) posee una
superficie polar que
permite ser
modificada para darle
propiedades no
polares por
tratamiento químico.
• Tiene como limitante
el que se degrada
fuera del intervalo de
pH de 2 a 8.
83

•Tipo de soporte
La Silica (SiO2) tiene como limitante el degradarse
fuera del intervalo de pH de 2 a 8.
84

•Tipo de soporte
• Polímero. Poliestireno divinil benceno
entrecruzado, polieteres y metacrilatos son los
más comunes.
• Tienen como desventaja que regularmente
poseen menos eficiencia comparadas con las
columnas de Si.
• Tienen como ventaja la operación en el intervalo
de pH de 1 a 14.
• Existen nuevos materiales como son la Zirconia
que permiten operar a temperaturas elevadas.
85

Grupo químico enlazado
• C18 C8 C4 CN Ph NH2 Si
No Polar Polar
Fase Reversa Fase Normal
86
Grupo químico enlazado
• C18 C8 C4 CN Ph NH2 Si
C18: Muy hidrofobica, estable y primer elección.
C8: Menos hidrofobica, requiere menos solvente orgánico.
CN: La menos hidrofobica, no muy estable.
Ph: Para compuestos de mediana polaridad. Recomendada
para aromáticos.
C4: Recomendadas para análisis de proteinas.
NH2: Recomendada para carbohidratos.
Si: Adecuada para compuestos orgánicos de polaridad media
87
Tamaño de poro y Area Superficial
• 200 ~ 60 A     Area Superficial (100 a 500 m2)
•     Mayor densidad en fase enlazada
•     Mayor retención (más hidrofóbica)
• No recomendado para
biomoleculas.
88
Densidad de ligando (Carga de carbono [peso Fase Enlas/peso Silica])
• 2 ~ 4 µ mol/m2
89
Clasificación por tecnologia (Pureza de SiO2)
90
Clasificación
por
tecnologia
(Pureza de SiO2)
91
Clasificación
por
tecnología
(Fase estacionaria
modificada)
92
Clasificación
por Tecnología
(Resumen 1)
93
Resumen
94
2.4 Columna – Mecanismos de
Separación Tipo de interacciones
♦No polares - fuerzas de van der Walls
♦covalentes – Formación de puentes moleculares
♦Polar - dipolares y puentes de hidrógeno
♦Ionicas - cationicas y anionicas
95
2.4 Columna – Selección de Columnas
METODO EXISTENTE SELECCIONAR LA COLUMNA
SATISFACTORIO ESPECIFICA
SELECCIONAR
COLUMNA
NUEVA
MUESTRA
PESO MOLECULAR <

2000
PESO MOLECULAR > SOLUBLE EN

SOLUBLE EN
2000 ORGÁNICO
AGUA
SOLUBLE EN SOLUBLE EN
INTERCAMBIO
SOLUBLE EN METANOL
SOLUBLE EN IÓNICO
AGUA HEXANO
ORGÁNICO
EXCLUSIÓN EXCLUSIÓN FASE ENLAZADA

ADSORCIÓN FASE ENLAZADA REVERSA
PERMEACIÓN FILTRACIÓN NORMAL
96
Mercanismos de adsorción
Dependiente de la concentración de soluto y la
temperatura (Isotermas de adsorción)
Retención de Compuestos polares
Orden de elución: menor polaridad más rápido
Columnas: sílica & alumina
97
2.4 Columna – Adsorción
98
2.4 Columna – Partición
Fase enlazada
 Normal
S
 Reversa
m
K = Cs
Cm
99
2.4 Columna – Fase Normal enlazada
100
Características del mecanismo
Interacciones:
Polares (puentes de H2, fuerzas de van Der Walls).
Retención:
Favorecida por disolventes no polares.
Elución:
Fuerza de disolvente aumenta con la polaridad
(hasta disolvente medianamente polares)
Columnas : Ciano y amino
101
2.4 Columna – Fase Normal
102
2.4 Columna – Fase Reversa
103
Caracteristicas del mecanismo
Interacciones:
No polares (inducción de dipolo, dipolo-dipolo)
Retención:
Favorecida con disolventes polares
Elución.
Fuerza de disolvente aumenta disminuyendo polaridad
104
Es la técnica de HPLC más popular:
• Las columnas son estables y de rápido equilibrio.
• El orden de elución es predecible: Si más
hidrofobico el soluto -> mayor retención.
• Agua es uno de los solventes más importantes
• Permite cambios en la selectividad por la adición
de modificadores
• Fase reversa incluye algunas variantes:
• Regular, supresión de iones, ionización
controlada, par iónico y formación de quelatos
metálicos.
105
106
Mecanismos de fase reversa: Fase reversa
clásica
Los solutos no polares son retenidos por la fase
estacionaria .
La elución se logra por cambio en la polaridad de la
fase móvil (disminución de polaridad)
Fase reversa clásica
107
Fase reversa clásica
108
Mecanismos de fase reversa:
Control de la ionización
•Algunos solutos presentan ionización a un valor

determinado de pH.
•Los solutos en forma no ionizable son retenidos por la
fase estacionaria. Al cambiar a su forma ionizable
eluyen de la columna.
•Se emplean soluciones de fosfatos, boratos, citratos.
•Concentración máxima (recomendada) 0.01M
•Compatibilidad de solubilidad con la fase orgánica
•Compatibilidad con el detector
109
2.4 Columna – Intercambio Ionico
carga fija
Ión de la muestra
+  Catiónico
- resina
+  Aniónico
contraión
110
111
Base sílica
Base polímero
112
2.4 Columna – Exclusión
SOLUBILIDAD EN
ORGÁNICO (GPC)
SOLUBILIDAD EN
AGUA (GFC)
113
2.4 Columna – Exclusión
Bomba Fase móvil
Banco de
columnas
Sistema de datos
Detector
114
2.4 Columnas – Uso,
Mantenimiento y Cuidados
Uso:
• Almacenar la columna en un solvente
recomendado por el fabricante.
• Colocar tapones durante no-uso.
• Siempre “lavar” columna con un
solvente fuerte.
• Siempre utilizar guardacolumna o
filtro en línea
115
Precauciones:
• No exceder rango de pH de la
columna.
• No exceder rango de temperatura de
la columna.
• Nunca guardar la columna con sales o
buffer dentro de ella.
• Permitir que la columna se enfrie
antes de detener el flujo.
116
Mantenimiento y Regeneración:
• Tiempo de vida desde 3 hasta 24
meses o de 1000 a 3000 inyecciones.
• El desempeño disminuye con el uso
(incremento en la presión y coleo de
picos).
• Monitorear presión (¡¡bitacoras!!),
probar invertir columna.
• Regenerar la columna con una serie
de solventes de débil a fuerte y
viceversa en forma gradual.
117
Mantenimiento, Cuidados y
Regeneración
SILICA FASE NORMAL

 50 ml de hexano 50 ml de cloroformo
 50 ml de cloruro de 50 ml de cloruro de
metileno
metileno 50 ml de isopropanol
 50 ml de isopropanol 30 ml de cloruro de
 30 ml de cloruro de metileno
metileno 25 ml de fase móvil
 25 ml de fase móvil
Probar la columna
 Probar la columna
Consultar siempre folleto del fabricante
118
2.4 Columna – Regeneración
FASE REVERSA INTERCAMBIO IÓNICO
 50 ml agua caliente 50 ml de agua caliente

( 55 ºC) (55 ºC)
 50 ml de metanol 50 ml de metanol
50 ml de acetonitrilo
 50 ml de acetonitrilo
25 ml de cloruro de
 30 ml de THF metileno
 25 ml de metanol 25 ml de metanol
 25 ml de fase móvil 25 ml de fase móvil
Consultar siempre folleto del fabricante
119
2.4 Columna – Guardacolumna
Bomba
Guarda
Columna
Inyector
Fase móvil
Columna
Sistema de datos
Detector
120
2.4 Columna – Horno
Objetivos
 Aumentar la solubilidad de la
muestra
 Disminuir la presión de la
columna
 Disminuir la selectividad
 Disminuir el tiempo de análisis
121
2.5 Detectores
Uv-vis (λ fija)
Indice de Refracción
Fluorescencia Uv-vis
(Arreglo de diodos)
ELSD
122
2.5 Detectores - ProStar 350
Características
Indice de Refracción
a) Universal
b) Mide el cambio de índice de refracción
entre la celda de muestra y la celda de
referencia.
c) No destructivo de la muestra
d) Baja sensibilidad : %w
e) No compatible con gradiente
123
f) Sensible a la temperatura ambiente
2.5 Detectores - Indice de Refracción
ProStar 350 -Restricciones de Solventes
No recomendados
• Haluros , Formato de Amonio, CCl4
Utilizables abajo del 10%
• Acido Bórico, Anhidro Acetico, KOH
• Sales de Formato de Amonio, perclorato, HPO42-
• Sales de bicarbonato, clorato y nitrato
Utilizables abajo de 30%
• Acido Citrico, NaOH, Sales de Citrato de Amonio, oxalato,
sulfato, H2PO4-
Utilizables abajo de 50%
• Acido Acetico, Acido lactico, Hidrazina,
Nitrato de Amonio, K2CO3, Formato de Sodio
124
2.5 Detectores- Ultravioleta Visible
PS-325 Características
Ultravioleta Visible
a) Alta sensibilidad
b) Mide la absorción de la luz UV o Visible
en el eluyente del HPLC.
d) Selectivo
e) Rango 190-900 nm
f) Compatible con gradiente
125
2.5 Detectores-Ultravioleta Visible
PS-325 Recomendaciones de Operación
• Encender la lámpara por lo menos 15 minutos
antes del análisis.
• Configurar longitud de onda y tiempo de
respuesta.
• La duración de las lámparas es de aprox 2000
hrs, pero pueden fallar antes o después.
126
2.5 Detectores- Arreglo de
Diodos PS-335 Características
a) Sensibilidad similar a UV-VIS

b) Mide la absorción de la luz UV o Visible en el
eluyente del HPLC.
d) Selectivo
e) Rango 190-900 nm
f) Compatible con gradiente
127
2.5 Detectores- PS-335 Resultados
Arreglo de diodos
• Espectro de cada Compuesto,
comparación de
Espectros
• Parámetro de Pureza
• Biblioteca de Espectros
• Cromatogramas a diferentes λ .
128
2.5 Detectores - Arreglo de Diodos
PS-335 Recomendaciones de Operación
• Encender la lámpara por lo menos 15 minutos
antes del análisis.
• Configurar longitud de onda y tiempo de
respuesta.
• Configurar rango de longitudes de onda para
desarrollo de métodos, y porque sea necesario en
trabajo de rutina. Los archivos son muy grandes.
• La duración de las lámparas es de aprox 2000
hrs, pero pueden fallar antes o después.
129
2.5 Detectores- Fluorescencia
PS-363 - Características
• Alta sensibilidad (100 a 1000x)

• Compatible con gradiente
• Selectivo: λ excitación, λ emisión
• Rango de λ s: Ex: 200-850nm y Em:200-900 nm
• Formación de derivados: Precolumna y Post
columna
• Puede trabajar con la lámpara apagada
(Chemiluminescencia, Bioluminescencia)
• GLP integradas (horas de la lampara)
130
PS-363 – Lámpara de Xe.
• Duración aprox de
500 hrs
• Contiene gas Xe
presurizado. Manejese
con cuidado.
• La radiación emitida
es muy intensa.
131
PS-363 - Areas de aplicación
Mercado Farmaceutico / Bioquimico
– Catecholes e Indoles
– Vitaminas
– Derivados OPA de amino ácidos
– Derivados FMOC de amino ácidos
– Marcadores Fluorescentes
Mercado Ambiental
– Carbamatos, Glifosatos
– PNAs
132
3.0 Analisis Cuantitativo
tr4
tr2 tr3
Concentración
tr1
Area
A1 A2 A3
A4
3.1 Por ciento área

3.2 Área Normalizada
3.3 Estándar Externo
3.4 Estándar Interno
133
3.0 Analisis Cuantitativo- Por ciento Area
1. Inyectar la Muestra Problema
tr4 Datos
tr2 tr3
A1
A2
tr1 A3
A4
A1 A2 A3
A4
2. Calcular el % A:
%A = Ai x 100
Σ Ai
134
3.0 Analisis Cuantitativo- Por Ciento
Area Normalizada
1. Preparar una mezcla estándar de concentración
conocida
2. Inyectar la mezcla estándar de calibración
3. Obtener el cromatograma , así como las áreas:

tr4
tr2 tr3
Datos
pico de
referencia A C1
1
tr1 A
2 C2
A3 C3
A1 A2 A3 A4 C4
A4
135
Area Normalizada
4. Calcular los Factores de respuesta Fr:
a) Seleccionar un pico de referencia y asignarle un valor
de Fr = 1
b) Calcular los Fr de los demas Picos:
Fri = A ref x Ci
C ref x Ai
Fr i = Factor de respuesta del pico de interés

A ref = Area del pico de referencia
Ci = Concentración del pico de interés
Ai = Area del pico de interés
136 C ref = Concentración del pico de referencia
Area Normalizada
5. Inyectar la muestra problema, obtener el
cromatograma, asi como sus áreas:
Datos
tr4
tr2 tr3
A1
A2
tr1 A3
A4
A1 A2 A3
A4
6. Calcular las concentraciones de cada uno de los
componentes, en unidades relativas: %w, %v,
% mol
137
Area Normalizada
%Ci = Ai x Fri x100
Σ (Ai Fri)
Ci = Concentración del pico de interés en la muestra

Ai = Área del pico de interés en la muestra
Fri = Factor de respuesta del pico de interés
138
3.0 Analisis Cuantitativo- Estandar Externo
1. Preparar una mezcla de estándares de
concentración conocida con los componentes de
interés
2. Inyectar la mezcla de estándares
3. Obtener el cromatograma, así como sus

respectivas áreas tr 4
Datos tr2 tr3
A
1
C1
A
2 C2 tr1
A3 C3
A4 C4
139 A1 A2 A3
A4
4. Calcular los factores de respuesta de cada
uno de los picos:
Fri = Ci
Ai
5. Inyectar la muestra problema, obtener el

cromatograma , así como las áreas:
140
tr4
tr2 tr3 Datos
A1
tr1 A2
A3
A1 A4
A2 A3
A4
6. Calcular la concentración de cada uno de los
componentes:
Ci = Ai Fri
Ci = Concentración del pico de interés en la muestra
Ai = Área del pico de interés en la muestra
141
3.0 Analisis Cuantitativo- Estandar Interno
Requisitos del Estándar Interno
• Alta pureza
• Estable químicamente y térmicamente
• Estructura química semejante a los
componentes de interés
• Separado e identificado de los componentes
de la muestra
142
1. Preparar una mezcla de calibración que

contenga los componentes de interés, asi como el
componente que servirá como estándar interno
2. Inyectar la mezcla de calibración, obtener el
cromatograma y las áreas
tr4
Datos tr2 tr3
A C1 Est.
1
Interno
A
2 C2 tr1
A3 C3
A4 C4
143 A1 A2 A3
A4
3. Calcular los Fr tomando como referencia el pico
del estándar interno, es decir asignarle un Fr = 1
Fri = Ci X A std int

Ai X C std int

Ci = Concentración del pico de interes
Astd int = Área del estándar interno
Ai = Área del pico de interés
C std int = Concentración del estándar interno
144
4. Inyectar la muestra problema y obtener las
áreas:
tr4 Datos
tr2 tr3
A
1
A
2
tr1 A3 C2
A4
A1 A2 A3
A4
5. Calcular la concentración de cada uno
de los componentes tomando como
referencia el pico del estándar
interno
145
Ci= Ai Fri C std int
A std int
Ci = Concentración del pico de interés

Ai = Área del pico de interés
Fri = Factor del pico de interés
Cstd int = Concentración del estándar interno
Astd int = Área del estándar interno
146

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Curso Básico de

BUAP-CUV Sep.,12, 2008

Inyección Migración Elución

Separación de los componentes de

El botánico ruso Mikhail Semyonovich

Insecticidas: carbamatos, organofosforados

DETECTOR SISTEMA DE DATOS

• Mide la separación entre dos

R = ___( tr2-tr1 )___

tr2 ,tr1 = tiempos de retención de ambos picos

La curva Gaussiana representa la distribución estadistica

Existen tres fuentes

Existen tres fuentes

• La HETP relaciona la longitud de la

Para optimizar el Factor de Capacidad:

Para optimizar la Selectividad (separación):

Para optimizar la eficiencia de la columna :

2.1 Fase móvil

DETECTOR SISTEMA DE DATOS

Preparación de la Fase Móvil

•Las sales de par iónico (TMA) pueden contener

Preparación de la Fase Móvil

Preparación de la Fase Móvil

Preparación de la Fase Móvil

Preparación de la Fase Móvil

Preparación de la Fase Móvil

Preparación de la Fase Móvil

 Operar a presiones elevadas

Las bombas comerciales basan su diseño en pistones

•El diseño del pistón con un control electrónico de su movimiento

 Mala repetibilidad de tiempos de reten-

 Estabilidad en la línea base

Preparación de la Fase Móvil

 Resolución de Mezclas Complejas

35 100 0 Cond. Inicial

 Válvula de 6 puertos / 2 posiciones

Factores que afectan la Repetibilidad de

 Compatible (soluble) con la fase

La fase móvil esta

Clasificación por Dimensiones

Clasificación por Características

Diámetro Interno (1, 2, 4, 4.6 mm)

Clasificación por Características

Clasificación por Características

Clasificación por Características

Clasificación por Características

Clasificación por Características

Fase Reversa Fase Normal

Clasificación por Características

Clasificación por Características

Clasificación por Características

Clasificación por tecnologia (Pureza de SiO2)

PESO MOLECULAR <

PESO MOLECULAR > SOLUBLE EN

EXCLUSIÓN EXCLUSIÓN FASE ENLAZADA

•Algunos solutos presentan ionización a un valor

Bomba Fase móvil

SILICA FASE NORMAL

FASE REVERSA INTERCAMBIO IÓNICO

 50 ml agua caliente 50 ml de agua caliente

Consultar siempre folleto del fabricante

a) Sensibilidad similar a UV-VIS

• Alta sensibilidad (100 a 1000x)

R = _( tr2-tr1 )_