Micro Practicas Total

Guía de Prácticas: Microbiología Industrial
PRÁC
TIC
A1
MATERIAL DE LABORATORIO, ACONDICIONAMIENTO Y

ESTERILIZACIÓN
I. OBJETIVOS
1) Dar a conocer al estudiante las técnicas para el acondicionamiento y

esterilización de materiales y equipos más empleados en un laboratorio de
microbiología industrial.
2) Ejecutar con habilidad y destreza el acondicionamiento de materiales para el

análisis microbiológico.
3) Justificar la importancia de los métodos de esterilización para el control

microbiológico de los alimentos.
II. MARCO TEÓRICO
El acondicionamiento de los materiales así como la esterilización de los mismos es

el primer paso en el control microbiológico de los alimentos, pues de él dependerá
el éxito del análisis.
2.1.- METODOS DE ESTERILIZACION POR CALOR
El calor actúa desnaturalizando y coagulando las proteínas.
2.1.1.- ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO
Se requiere temperaturas elevadas y un periodo más prolongado de

calentamiento que la esterilización con vapor. Su uso está limitado primariamente
a la esterilización de material de vidrio y aquellas sustancias que sean
impermeables al vapor.
El mecanismo por el cual los organismos son destruidos se basa en los efectos
letales del calor seco debido a la desecación en general, lesión por oxidación y
efectos tóxicos de los niveles de electrólitos.
En ausencia de agua, disminuye el número de grupos polares de la cadena

peptídica y se requiere más energía para abrir las moléculas, de allí la aparente
mayor estabilidad del organismo.
Se emplea el horno o estufa de esterilización, en la que se aplica una temperatura

de 160-170ºC durante 1 hora.
a) Flameo o Llama Directa. Consiste en exponer los materiales a

esterilizar (asas y agujas de kolhe, espátulas, pinzas, tijeras, etc.) al contacto de la
llama de un mechero para eliminar rápidamente los microorganismos del entorno;
Ejemplo: mechero de Bunsen.
b) Aire Caliente. Para ello se utiliza un horno bacteriológico u horno

Pasteur, donde se esteriliza el material a temperaturas de 170º-180ºC por 2 horas.
Es generalmente empleado para esterilizar material de vidrio.
2.1.2 ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO
Se usa el vapor, tanto porque las bacterias se mueren más rápidamente cuando
se encuentran húmedas como porque el vapor proporciona un medio de distribuir
el calor uniformemente en todas partes del recipiente de esterilización, el vapor
debe conservarse a una presión de 1000g/cm3 sobre la presión atmosférica para
obtener una temperatura de 121ºC. Se produce también rupturas de cadena única
en el ADN , y la pérdida de la viabilidad de las células expuestas a calor leve
puede correlacionarse con la introducción de estas rupturas. La lesión de ADN
parece ser enzimática, como resultado de activación o liberación de una nucleasa.
El calor produce tambien una pérdida de la integridad funcional de la membrana y

filtración de pequeñas moléculas y material absorbente de 260 nm. Este material
es de origen ribosómico y aparentemente es resultado de la degradación de los
ribosomas por ribonucleasas activadas por el tratamiento con calor. Existe
tambien degradación del ARN ribosómico y la pérdida de viabilidad de las células
expuestas a temperaturas elevadas.
a) Por Ebullición. Se coloca el material a esterilizar en agua hirviendo

(100ºC) por 15-35 minutos.
b) Vapor de agua sin Presión. Se coloca el material a esterilizar a la

acción del vapor de agua y a temperatura no mayor de 100ºC; para ello puede
hacer uso del autoclave con la espita abierta. Se utiliza para materiales
termolábiles como es el caso de algunos medios de cultivo.
c) Vapor de agua con Presión. Se realiza en un autoclave a 15 libras de

presión y 121ºC por 15-20 minutos. Se emplea para esterilizar medios de cultivo y
todos aquellos materiales que no pueden esterilizarse por calor seco. Se puede
usar; autoclave, pasteurización o tindalización.
c.1) Autoclave: es un equipo construido en acero inoxidable, de forma cilíndrica,

paredes resistentes, puede ser horizontal o vertical; consta de:
♠ Caldera de material resistente, fondo cóncavo cubierta de una

camisa metálica cilíndrica.
♠ Dispositivos para la instalación de la fuente calorífica (gas,
electricidad o vapor de agua).
♠ Orificios superiores para purga de gases de combustión.
♠ Tapa con válvula de seguridad, espita, manómetro.
♠ Canastilla para colocar el material a esterilizar.
2.3 ESTERILIZACIÓN POR FILTRACIÓN
Consiste en hacer pasar las sustancias líquidas o gaseosas a esterilizar a través

de membranas porosas que retienen a los microorganismos; sirve para la
esterilización de sustancias termolábiles. El material filtrante puede ser de
porcelana, tierras de infusorios, acetato de celulosa, etc.
2.4 ESTERILIZACIÓN POR RADIACIÓN ULTRAVIOLETA
Poseen efectos letales y mutagénicos en las bacterias presentando su mayor

efectividad como agente bactericida en la región espectral de alrededor de los
260 nm de longitud de onda, éste método presenta muchas dificultades técnicas.
III. MATERIALES Y EQUIPO
♠ Material de vidrio: pipetas, palcas petri

♠ Erlenmeyer, tubos de ensayo
♠ Papel craff, algodón, gasa, tijeras
♠ Mechero de Bunsen
♠ Horno Pasteur de aire caliente
♠ Autoclave
IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
4.1 PREPARACIÓN DE MATERIAL A ESTERILIZAR
a)Preparación de tubos matraces
♠ Los tubos, matraces y frascos antes de su esterilización deben

llevar sus tapones de algodón respectivamente, los cuales deben cerrar
suavemente no muy flojos ni apretados, ni largos ni cortos, preparados
según el método siguiente:
♠ De acuerdo al tapón a confeccionar se toma el pedazo
convenientemente de algodón de fibra, extendida, rectangular
♠ Practicar un dobles de 1/3 a lo largo de la fibra.
♠ Enrollar de un extremo, presionando sobre si mismo hasta
completar toda la longitud.
♠ Rotar con los dedos el trozo confeccionado aplastando para
dársele la forma de cono truncado, con el diámetro a la medida del
recipiente a taponar, el tapón debe entrar en el recipiente hasta la mitad, y
el otro medio quedar fuera. Se pueden preparar los tapones envueltos en
gasa para evitar el hilachamiento.
Tubos de Ensayo
♠ Formar un paquete de tubos de ensayo taponados,
empaquetarlos con papel kraft y amarrarlos, en su defecto se le envuelve
con papel sólo la zona de las bocas.
Frascos y Matraces
♠ Los frascos y matraces se taponan con algodón, se cubre con
papel kraft y se amarra con hilo pabilo.
♠ Colocar el nombre del medio de cultivo
♠ Rotular la fecha de preparación.
b)Preparación para proteger las pipetas

♠ En el extremo de succión de cada pipeta introducir una
porción de algodón con auxilio de una aguja o puntero delgado, evitando que
quede muy ajustado.
♠ Cortar tiras largas de papel kraft de unos 3 cm. de ancho, y
colocar uno de sus extremos, en una de las puntas del papel envolver la
punta de la pipeta en forma oblicua y envolver toda la longitud de la pipeta
girándose en espiral en forma ajustada y en la parte terminal de la boquilla
se remata con una torsión para protegerla y se rompe el resto de papel
sobrante.
♠ Anotar con un lápiz la medida de la pipeta y la fecha de su
esterilización.
c) Preparación de las placas petri
♠ Cortar papel kraft tamaño adecuado para cubrir íntegramente
las placas petri completas.
♠ Con la parte brillante del papel hacia fuera se envuelve la
placa poniéndose esta en el centro, se envuelve la placa tomándose dos
extremos opuestos del papel, dándose una vuelta alrededor de ella, los otros
dos extremos del papel se doblan en triángulos, rematándose con un fuerte
dobles hacia el dorso de la placa, dándosele una apariencia de paquete de
regalo.
4.2 ESTERILIZACIÓN CON CALOR SECO
El procedimiento de esterilización por aire caliente sólo se puede emplear con

utensilios de vidrio o metal.
a)Procedimiento para la esterilización en horno

♠ Ponga el termostato a l75ºC y encienda el horno.
♠ Si hay un ventilador verifique que esté funcionando.
♠ Vigile el termómetro. Cuando la temperatura llegue a l75ºC.
sígase calentando durante 60 minutos más.
♠ Apague el horno. Espere a que la temperatura descienda
hasta 60ºC. Abra la puerta del horno.
♠ El papel empleado para envolver deberá de haber tomado un
color marrón oscuro, si el color del papel es amarillo pálido indicará que el
horno no se ha calentado bastante. Si el papel se ha ennegrecido indicará
que el horno se ha calentado demasiado.
4.3 ESTERILIZACIÓN CON CALOR HÚMEDO
a)Procedimiento para la esterilización con autoclave

♠ Llene con agua el fondo del autoclave (hasta el soporte de la
canasta). Cerciórese que el agua no toque la canasta. Elimine el exceso de
agua abriendo la espita del drenaje.
♠ Introduzca en el autoclave la canasta con los materiales que
se van a esterilizar, se pueden añadir indicadores de la esterilización, como
ciertas piezas de papel especial que ennegrecen al lograrse la temperatura
adecuada.
♠ Cierre la tapa del autoclave, cerciorándose de que la arandela
de goma se encuentra en su surco. Atornille a niveles iguales los sujetadores
de la tapa, con firmeza pero sin apretarlo demasiado.
♠ Abrir la válvula de salida del aire.
♠ Inicie el calentamiento del autoclave.
♠ Vigile la salida de aire hasta que aparezca un chorro de vapor.
Aguarde 3- 4 minutos hasta que el chorro de vapor sea uniforme y continuo,
esto indicará que todo el aire ha sido expulsado del autoclave.
♠ Cierre a continuación la válvula de salida del aire. Apriétense
los sujetadores de la tapa del autoclave y reduzca la temperatura
ligeramente.
♠ Cuando se obtenga la temperatura adecuada 120ºC se deberá
regular el calor para conservarla. Y esperar por 15 minutos.
♠ Reduzca completamente el calor tan pronto como se cumpla
el tiempo requerido.
♠ Cuando la temperatura descienda a menos de 80ºC abra la
válvula de salida de aire para igualar las presione dentro y fuera del
autoclave.
♠ Deje enfriar el autoclave y a continuación retire
cuidadosamente la canasta con los utensilios estériles.
V. CUESTIONARIO
5.1. ¿Qué método de esterilización utilizó en la práctica, cite algunos ejemplos?.

5.2. ¿Cree usted que es importante acondicionar y esterilizar los materiales antes
del control microbiológico, por qué?
5.3 Cite en forma ordenada cada uno de los pasos a seguir para poner en
funcionamiento el autoclave.
5.4.Compare la resistencia al calor de las células vegetativas con esporas
bacterianas.y explique a que se debe tal diferencia.
5.5.Cite usted tipos de filtros empleados en el proceso de esterilización.
PRÁCTICA2
MICROSCOPIA
I.- OBJETIVOS
1) Identificar cada una de las partes del microscopio óptico, conocer su

función y el cuidado de cada uno de ellas.
2) Conocer la morfología de organismos unicelulares.
3) Conocer los distintos métodos de observación de microorganismos “in
vivo”.
II.- MARCO TEORICO

El microscopio permite la observación de estructuras muy pequeñas que no
pueden ser vistas a simple vista. El poder de resolución de un microscopio esta en
relación inversa a la longitud de onda de la luz usada.
2.1.- PARTES DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

1. Parte mecánica:
- Pie
- Columna (pilar, charnela y brazo)
- Tubo: Revólver
- Tornillo macrométrico o sistema de movimiento rápido
- Tornillo micrométrico o sistema de movimiento lento
- Platina: Pinzas sujetadoras de láminas y mandos coaxiales
- Subplatina: Pieza que asciende y desciende condensador, anillo porta
filtros, diafragma iris y soporte para el espejo
2. Parte óptica del Microscopio:

- Oculares: lentes situados donde va del ojo del observador
- Objetivos: lentes situados en el lado de la muestra
los objetivos traen impresas las siguientes características:
o Magnificación: Ej. x 25
o Apertura numérica (A.N.): Ej. 0,45
o Cualidades de la lente: Ej. Plan cuando se refiere a un objetivo
Planacromático
o Longitud del tubo: Ej. 160 mm
o Corrección de espesor de laminilla Ej. 0,17 mm
o Aparato de iluminación. comprende: Espejo, Condensador,
Diafragma
2.2.- USO DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

1. El M.O. debe agarrarse siempre del brazo, nunca del tubo o platina porque
deteriora el tornillo micrométrico.
2. Disponer el M.O. en una mesa horizontal y a una altura conveniente para
observar sin fatiga Verificar que los oculares estén limpios y en posición
correcta.
3. Cuando se observe preparaciones fijas, puede inclinar el tubo del M.O. para
una mejor comodidad si se trata de Microscopios que no posean el sistema
inclinado. Si se observan preparaciones frescas o”in vivo” debe mantenerse
la platina horizontal.
4. Verificar que los objetivos en el revólver estén en orden progresivo de
aumento.
5. Coloque el objetivo de menor aumento en el eje óptico girando el revólver
hasta que haga “clik”.
6. Suba el condensador hasta que la lente superior este muy cerca de la
platina y abra el diafragma totalmente.
7. Si el Microscopio tiene luz incorporada, encender el interruptor y si tiene
espejo orientarlo hacia la ventana mejor iluminada o al fluorescente más
cercano.
8. Observe por el ocular la iluminación del campo y trate de lograr la máxima
luminosidad moviendo el espejo; luego, si es necesario baje ligeramente el
condensador.
9. Colocar en la platina el preparado a estudiar, cuidando que la laminilla
cubreobjetos quede hacia arriba, la etiqueta hacia la derecha del
observador y que el preparado se encuentre entre el condensador y el
objetivo; es decir, atravesado por los rayos de luz. Este desplazamiento se
logra utilizando los mandos coaxiales.
10. Para iniciar la observación, emplee siempre el objetivo de menor aumento
(panorámico ó 10X) y procure que la distancia objeto-objetivo sea la mínima
(5 mm.), esto se logra bajando el tubo con el tomillo macrométrico y
observando por un lado del Microscopio el descenso del mismo. Luego,
observe por el ocular y simultáneamente suba al tubo con el tomillo
macrométrico hasta enfocar el elemento en estudio, de inmediato utilice el
tomillo micrométrico para dar nitidez a la imagen. Finalmente recorra la
lámina con la ayuda de los mandos coaxiales para su observación integral,
siempre utilizando el tomillo micrométrico para no perder la nitidez.
Cuando se trate de Microscopios en donde la platina asciende al utilizar el
tomillo macrométrico, la distancia objeto-objetivo debe ser de 1 a 1,5 cm.
11. Regular el diafragma iris hasta obtener las mejores condiciones de
contraste.
12. El elemento que desee observar a mas aumento coloque en el centro del
campo y cambie de objetivo girando el sistema de revólver, teniendo
cuidado de girar el objetivo del siguiente aumento (45X) y NO el de
inmersión. Ponga nítida la imagen únicamente con el tomillo micrométrico.
Es importante tener en cuenta que para cambiar de un aumento a otro no
debe manipularse con el tomillo macrométrico porque corre el riesgo de
romper la lámina o la lente frontal del objetivo.
13. Para observar las estructuras con objetivo de inmersión, coloque el
elemento seleccionado en el centro del campo y gire un poco el objetivo, de
manera tal, que quede libre éste sector de lámina para que pueda colocarse
una gota de aceite de inmersión. Luego, continúe girando el revólver hasta
que el objetivo de inmersión (100X) contacte con la gota y encaje en el eje
óptico; finalmente, observe por el ocular y aclare la imagen solamente con
el tomillo micrométrico.
Una vez terminada la observación limpie el objetivo de inmersión y la
lámina con el campo ligeramente humedecido con alcohol isopropílico o
metanol.
2.3.- AUMENTOS DEL MICROSCOPIO Y CALCULO APROXIMADO DE

DIMENSIONES CELULARES
1. Para calcular el aumento del Microscopio, multiplique el aumento del
objetivo por el del ocular.
Ej.: Objetivo 40X y Ocular 10X
40 x 10 = 400 aumentos
2. Para el cálculo aproximado de dimensiones celulares, se debe conocer el
diámetro del campo microscópico que varía de acuerdo al objetivo que se
usa.
Diámetro del campo microscópico

Diámetro del
Ocular Objetivo
campo en micras
10X 10X 1500
10X 45X 400
10X 100X 150
Ejemplo: Si observamos una célula epitelial al Microscopio con objetivo
10X y ocular 10X, y si ésta ocupa la tercera parte del campo
microscópico, concluiremos que la célula mide
aproximadamente 500 micras; es decir, la tercera parte de
1500.
2.4.- CUIDADOS DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

1. El Microscopio debe tomarse por el brazo, nunca por el tubo ó la platina,
porque a la larga deteriora el tomillo micrométrico.
2. Los objetivos y oculares constituyen la parte mas delicada del Microscopio,
por lo que debe tenerse sumo cuidado en su uso. Así, el enfoque debe
hacerse suavemente, evitando que la lente frontal del objetivo roce el cubre
objetos. Por ninguna razón debe desmontarse los objetivos.
El objetivo de inmersión no debe usarse en seco y debe quedar
escrupulosamente limpio después de su uso, para lo cual use el “campo”
ligeramente humedecido con alcohol isopropílico o metanol.
3. Al finalizar la observación microscópica, coloque el objetivo de menor
aumento en el eje óptico dejando un espacio de 2 cm. entre éste y la lentilla
del condensador, luego apague la luz.
2.5.- OBSERVACIÓN “IN VIVO” DE ORGANISMOS UNICELULARES
Indicaciones:
1. Ilumine correctamente su Microscopio, cuidando que la platina esté en
posición horizontal.
2. Coloque la lámina porta objetos en su Microscopio.
3. Ponga una gota del agua estancada en el centro de la lámina de manera
que la luz del Microscopio la atraviese.
4. Proceda a enfocar con menor aumento y observará que tiene exceso de
iluminación y poca visión de la muestra corrija éste defecto bajando el
condensador y cerrando un poco el diafragma iris.
5. Observará elementos fijos, con pocos movimientos y veloces que tienen
características especiales y un fondo de partículas de tierra y cristales
grises y oscuros. Pueden distinguirse:
- Algas, como la espirogira, de color amarillento verdoso a manera de
pequeñas escaleras en cuyo interior se observan los cloroplastos.
- Diatomeas, de diferentes formas y tamaños, se las distingue porque son
brillantes, amarillentas, poco móviles; van desde la forma de un barril
pequeño hasta cigarros o prismas.
- Parameccium, de gran movilidad, atraviesan raudamente el campo de
observación. Son protozoarios que tienen forma ovoide, de zapatilla y se
caracterizan por presentar su cuerpo rodeado de cilios. En su interior
observar el núcleo y vacuolas.
- También puede observarse a la stilonichia, más pequeña que el
Parameccium y con un pelo o cerda en un extremo.
- Algunas veces se visualiza a la Euglena Viridis, caracterizada por
presentar un flagelo largo (Protozoario flagelado).
- La ameba, difícil de visualizar por su transparencia, presenta pocos
movimientos y se desplaza lentamente emitiendo pseudópodos en la
superficie de su cuerpo.
- También puede encontrar Vorticelas, tienen forma de cáliz, con un
pedicelo largo y delgado, generalmente viven en colonias. La superficie
del “cáliz” está rodeada de cilios.
6. Luego, coloque una gota de colorante vital (rojo neutro o azul de metileno)
en su preparado y observe nuevamente los organismos unicelulares.
7. Haga un dibujo de lo observado y coloque los nombres correspondientes.
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2.6.- EXAMEN EN FRESCO DE MICROORGANISMOS
1. Examen en Fresco
Es la forma más simple de realizar la preparación de un espécimen para su
examen microscópico.
Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos.
Hay 2 tipos de técnicas:

a. Preparación en fresco simple “entre porta y cubre”.
Consiste en colocar una gota de líquido con los microorganismos sobre un
porta objetos y luego cubrirla con un cubreobjetos.
b. Gota pendiente
Consiste en colocar una gota de líquido con microorganismos en un
cubreobjetos y cubrirlo con un portaobjetos (de forma invertida) con una
excavación central (portaobjetos excavados). Se debe sellar la preparación con
vaselina alrededor de la excavación.
La ventaja de esta preparación es que no se seca y puede ser observada
durante un tiempo más largo.
II. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
EXAMEN DE MICROORGANISMOS VIVOS

Este examen permite observar microorganismos vivos, se realiza con la
finalidad de observar caracteres de movilidad, morfología, agrupación,
observación de huevos y quistes de parásitos.
EXAMEN EN FRESCO
Material
-Microcopio
-Láminas cubreobjetos
-Láminas portaobjetos
-Agua destilada
-Asas de Kolle
-Gérmenes varios
-Muestras fermentadas
-Cultivo de microorganismos
Metodología
-Si la muestra proviene de un líquido, con un asa de kolle se coloca una
gota de líquido sobre un portaobjeto, sobre el que se coloca un
cubreobjeto.
-Si la muestra proviene de un cultivo sólido, se deposita primero una gota
de suero fisiológico sobre el portaobjetos, para luego con la ayuda del asa
de kolle realizar una suspensión y colocar un cubreobjetos.
-Observar al microscopio con objetivo 40X.
Observación y Resultados
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III. CUESTIONARIO
i. ¿Qué ventajas y desventajas ofrece una preparación en fresco?
ii. ¿Qué ventaja presenta una preparación gota pendiente?
iii. ¿Realice un dibujo del microscopio y señale sus partes?
iv. ¿A qué se denomina campo óptico?
v. ¿Qué es el sistema parafocal?

PRÁCTICA3
PREPARACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO: TINCIÓN GRAM
I.- OBJETIVOS
2) Observar los microorganismos vivos en suspensión: preparaciones
húmedas y coloraciones supravitables.
3) Observar células muertas en frotis seco y teñidas con diferentes
procedimientos de coloración.
II.- MARCO TEORICO

Debido a que las bacterias y otros microorganismos son pequeños y su
protoplasto posee un índice de refracción cercano al agua, se requiere
generalmente tinciones biológicas para visualizarlos adecuadamente o demostrar
el detalle de sus estructuras internas.
Los colorantes están constituidos en su mayoría por el anillo bencénico, y difieren
uno de otro en cuanto al número y disposición de estos anillos y a la sustitución
de los átomos de hidrógeno por otras moléculas. Algunos de los grupos
cromóforos más comunes hallados en los colorantes son: C=C, C=O, C=S, C=N,
N=N, N=O, NO2.
La intensidad de coloración de colorante es proporcional al número de radicales
cromóforos del compuesto.
2.1.- COLORACIONES DIFERENCIALES

PARED CELULAR
El espesor oscila generalmente entre 0.150 µ m y 0.500 µ m de espesor,
pudiendo incluso alcanzar 0.8 µ m (Lactobacillus). Las paredes de las células
jóvenes son más delgadas que las células de cultivo antiguo.
GRAMPOSITIVAS. La pared celular de las Grampositivas está constituida

principalmente por cadenas de peptidoglucano, a menudo unidas por puentes
peptídicos.
Sin embargo estas células contienen también una gran cantidad de ácidos
teicocos, polímeros de glicerol y ribitol unidos por grupos fosfato y
aminoácidos como D-alanina o azúcares como la glucosa están unidos a los
grupos glicerol y ribitol.
GRAMNEGATIVAS. Presentan 3 capas de envoltura distintas, dispuestas de

manera laxa, estas incluyen la membrana externa (ME), con voluta, arrugada
con surcos u ondulante, que contiene el antígeno O somático conocido como
lipopolisacárido LPS, una capa densa intermedia, y la membrana plasmática
interna. Un espesor de 0.0075 µ m.
2.2.- COLORACIONES VITALES

Son los montajes de materia viva teñidos. Suelen utilizarse para ello,
determinados colorantes (azul de metileno, rojo neutro) a muy baja
concentraciones (1/1000, 1/10000). Su objetivo es facilitar la observación,
mediante el colorante de la morfología y la estructura bacteriana, pero sin
provocar alteraciones celulares ni destruir la bacteria.
2.3.- PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS

Este tipo de preparaciones son las más frecuentes, tanto las obtenidas
directamente a partir de muestras clínicas como las obtenidas a partir de
desarrollo de cultivos.
Los pasos a seguir para la realización de una preparación fijada y coloreada

son:
a. Confección del Frotis. Puede prepararse a partir de productos líquidos o

sólidos.
Producto liquido. Para preparar un frotis, se coloca sobre un portaobjetos de
vidrio limpio y seco, una gota del material a estudiar y se extiende con ayuda
del asa de platino.
Cultivo en medio sólido. puede prepararse una suspensión del material en
una gota de solución salina colocada previamente en el portaobjetos,
extendiéndola con ayuda del asa de platino.
b. Secado. Se dejará secar el frotis a temperatura ambiente.
c. Fijación. La fijación tiene como objeto la inmovilización de las estructuras

del material a estudiar en un estado lo mas próximo posible al estado vivo.
Consiste en una muerte rápida de los microorganismos, debida a la
coagulación de las albúminas protoplásmicas. Existe un gran número de
fijadores, tanto en forma simple (etanol, ácido pícrico). Las formas más
habituales de fijación son: por el calor y alcohol en frío.
d. Coloración. Es el proceso de coloración de los microorganismos.
e. Lavado. Eliminación del exceso de colorante.

f. Secado. Se secará la preparación al aire.
CLASIFICACIÓN DE LAS COLORACIONES

La clasificación de los colorantes es algo confusa, pero está basada en los
cromóforos presentes.
a. Según su estructura química. Pueden clasificarse como Ácido o Básico,

término que no índica sus reacciones de pH en solución, sino, si una parte de
la molécula es aniónica o catiónica.
• Los colorantes básicos, tiñen estructuras de naturaleza ácida, como la
cromatina nuclear de las células. Ej: Cristal violeta, Violeta de Genciana,
Verde de Malaquita. Safranina.
• Los colorantes ácidos, reaccionan con sustancias básicas, tales como
estructuras citoplásmaticas, y como colorante de contraste. Ej: ácido
pícrico.
• Los colorantes neutros, cuando se asocia un colorante ácido con uno
básico. Ej: Wright, Giemsa, Hematoxilina - Eosina.
• Los colorantes indiferentes, suelen ser insolubles en agua y solubles en
alcohol. Ej: Sudán III.
CLASIFICACIÓN DE LAS TINCIONES
a. Tinciones Simples. Son las que utilizan un solo colorante y permiten

conocer la morfología y tipo de agrupación bacteriana. ejplo. Tinción azul de
metileno, Tinción fucsina.
b. Tinciones Diferenciales. Utilizan más de un colorante y sirven para

poner de manifiesto las características de afinidad de los microorganismos por
ciertos colorantes como; Tinción Gram, Tinción ácido-alcohol resistente.
c. Tinciones Estructurales. Utilizan más de un colorante y sirven para

poner de manifiesto estructuras bacterianas. como; Tinción de flagelos,
Tinción de esporas, Tinción de cápsulas, Tinción de corpúsculos
metacromáticos
IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
3.1. COLORACIONES VITALES

Estos tipos de exámenes pueden considerarse como preparaciones en fresco
o como técnicas intermedias entre éstas y las preparaciones fijadas y
coloreadas. Son montajes de materia viva teñidas.
Material. Microscopio, Láminas portaobjetos, a examinar, Cubreobjetos,

Solución de azul de metileno (1/1000), Asas de platino, Gérmenes diferentes
Procedimiento
- Sobre el portaobjeto colocar una gota de colorante azul de metileno
(l/l000).
- Colocar una gota de la muestra a examinar y con ayuda de una asa de
kolle mezclar. Seguir el procedimiento (muestra liquida o sólida).
- Observar al microscopio con el objetivo de 40X.
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3.2. PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS
Preparación del Frotis

- Flamee el asa para siembra hasta que se ponga al rojo vivo. Sostenga el
asa inmediatamente arriba de la porción azul de la flama. Ponga el asa tan
cerca de la posición vertical como sea posible. Déjela enfriar (cuente hasta
20).
- Tome una porción de la muestra que se va examinar, colocando el asa en
posición plana en la superficie del líquido.
- Coloque el asa sobre el portaobjeto y aplánese ligeramente en el centro
de éste (el portaobjeto deberá estar numerado).
- Sosteniendo todavía el asa aplanada sobre el portaobjeto muévala
trazando una espiral del centro a la periferia. Debe dejar cierto espacio entre
la muestra y cada uno de los 4 lados del portaobjetos.
- Flamee de nuevo el asa hasta que esté al rojo vivo para destruir
cualesquiera bacterias que se encuentren en ella.
Fijación
- Confirme que el frotis se ha secado completamente al aire libre.
- Pase el portaobjeto tres veces a través de la llama del mechero de
Bunsen, con la muestra hacia arriba.
- Déjelo enfriar antes de aplicar la tinción.
3.3. TINCIONES SIMPLES
Material. Microscopio, Láminas portaobjetos, Azul de metileno (solución

acuosa al 1%), Safranina (solución acuosa 1%), Asas de platino, Gérmenes
diferentes, Aceite de inmersión, Xilol
TINCIÓN DE AZUL DE METILENO

Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorción del
colorante por los diferentes microorganismos es variable, y algunas
estructuras como las esporas absorben el colorante con dificultad son así
fácilmente diferenciables.
Procedimiento
- Tome una lámina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua destilada
para hacer un frotis.
- Con el esa tome una pequeña porción del cultivo en medio sólido y
disuelva en la gota de agua (cuando el cultivo es medio liquido no necesita
de agua). Los frótices que se obtengan no deben ser ni muy gruesos m muy
finos.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente
para obtener la fijación del frotis.
- Cubrir la preparación con el colorante (2 o 3 gotas) y se deja actuar de
unos 5 minutos.
- Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua caiga
directamente sobre el frotis, hasta quitar el exceso de colorante.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y con aceite de
inmersión.
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TINCIÓN DE SAFRANINA
Las bacterias aparecen de color rojo.
Procedimiento
- Tome una lámina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua
destilada para hacer un frotis.
- Con el asa tome una pequeña porción del cultivo en medio sólido y
disuelva en la gota de agua (cuando el cultivo es medio liquido no
necesita de agua). Los frótices que se obtengan no deben ser ni muy
gruesos ni muy finos.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama
suavemente para obtener la fijación del frotis.
- Cubrir la preparación con el colorante de safranina (2 ó 3 gotas) y se
deja actuar de unos 5 minutos.
- Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua caiga
directamente sobre el frotis, hasta quitar el exceso de colorante.
- Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y con aceite
de inmersión.
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3.4. COLORACIONES DIFERENCIALES
Material. Microscopio, Láminas portaobjetos, Set para la coloración de Gram,
Asas de platino, Gérmenes diferentes, Aceite de inmersión, Xilol
TINCIÓN GRAM
El cristal violeta actúa como un colorante primario, que se une a la pared
celular bacteriana luego de un tratamiento con una solución débil de iodo
(Mordiente). Algunas bacterias debido a su naturaleza química de sus paredes
celulares, poseen la capacidad de retener el cristal violeta, aún luego del
tratamiento con un decolorante orgánico, tal como una mezcla de alcohol y
acetona. Tales bacterias se denominan Grampositivas.
Las bacterias Gramnegativas debido a su mayor contenido lipídico en su
pared celular, pierden la coloración primaria del cristal violeta cuando son
tratadas con el decolorante. El colorante secundario o de contraste utilizado
es la safranina. Las bacterias Gramnegativas que han perdido el cristal
violeta, aparecen rojas o rosadas vistas al microscopio, habiendo fijado la
safranina como contracolor a sus paredes celulares.
Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorción del
colorante por los diferentes microorganismos es variable, y algunas
estructuras como las esporas absorben el colorante con dificultad son así
fácilmente diferenciables.
Reactivos
- Solución de Cristal Violeta(Cristal violeta= 1.0 g, Alcohol 95º = 20 ml,
Agua destilada csp=100 ml)
- Solución de Lugol (Yodo en cristales, 1.0 g, Yoduro de potasio= 2.0 g,
Agua destilada= 100 ml)
- Decolorante (Acetona= 50 ml, Etanol= 50 ml)
- Safranina ( Safranina= 0.25 g, Alcohol 95º= 10 ml, Agua destilada
csp=100 ml)
Procedimiento
- Coloque una asada de caldo nutritivo que contiene una mezcla de
bacterias Grampositivas y Gramnegativas sobre una lámina portaobjeto limpia.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente
para obtener la fijación del frotis, con la finalidad de que el material no sea
arrastrado durante el proceso de tinción.
- Colocar el preparado sobre un soporte de tinción y cubrir la superficie con
solución de cristal violeta por 1 minuto. Lavar bien con agua de caño.
- Cubrir el preparado con Iodo de Gram durante 1 minuto. Lavar con agua.
- Sostener el portaobjeto entre el pulgar y el índice y bañar la superficie con
unas gotas del decolorante acetona-alcohol hasta no arrastrar más colorante
violeta. Se requiere unos 10 segundos más o menos.
- Cubrir la superficie con la safranina durante 1 minuto. Lavar con agua de
caño.
- Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y con aceite de
inmersión.
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V. CUESTIONARIO
1. ¿Qué es un colorante y cuáles son sus propiedades?
2. ¿Por qué se le llama a un colorante ácido o básico?
3. ¿A qué se debe la afinidad que tiene un colorante por la bacteria?
4. ¿De qué manera influye el pH en la coloración?
5. ¿Por qué es necesario utiliza métodos de tinción para visualizar a
las bacterias?
6. Escriba la estructura del azul de metileno y safranina
7. Mencione 4 microorganismos que tengan la forma de bacilos
8. Mencione 4 microorganismos que tengan la forma de espirales
9. Dibuje los componentes de la pared celular de los
microorganismos grampositivos y explique la función que cumple cada uno de
ellos.
10. Dibuje los componentes de la pared celular de los
microorganismos gramnegativos y explique la función que cumple cada uno de
ellos.
11. Explique el fundamento de la coloración de Gram y esquematice.
12. ¿A qué se denomina mordiente y mencione tres ejemplos?
13. Mencione tres razones por las que un microorganismo
grampositivo se observa gramnegativo.
14. Dibuje la estructura del colorante cristal violeta
15. Mencione tres microorganismos (género) que sean cocos
grampositivos, bacilos, grampositivos, cocos gramnegativo y bacilos
gramnegativos.
PRÁCTICA4
MEDIOS DE CULTIVO
I.- OBJETIVOS
a. Identificar las diferentes condiciones de un medio de cultivo para que pueda

llevarse a cabo un crecimiento microbiano.
b. Describir los medios de cultivo más empleados en bacteriología.
c. Conocer las aplicaciones y utilidades de los medios de cultivo más corrientes.
d. Saber manejar el material que se emplea en la elaboración de cualquier medio
de cultivo.
II.- MARCO TEORICO
2.1. REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
El medio proporciona los elementos necesarios para el crecimiento microbiano.

De acuerdo con esto, siempre se requerirá una fuente de energía y una fuente
no energética como son las sales, factores de crecimiento, etc., que sin
proporcionar energía son necesarias para su desarrollo.
2.2.1.- REQUERIMIENTOS ENERGÉTICOS DE LOS MICROORGANISMOS
A. FUENTES DE CARBONO
En la mayor parte de los casos, la fuente de carbono corresponde a azúcares
en forma de mono o disacáridos, como glucosa, lactosa, maltosas etc., e
incluso hay microorganismos que pueden utilizar azúcares más complejas para
obtener energía., como es el caso del almidón.
Existen también bacterias capaces de utilizar el gas carbónico CO2 hecho que
es característico de las bacterias fotosintetizantes y quimiolitótrofas.
Otros microorganismos pueden crecer a expensas del metano, benceno e,
incluso hidrocarburos como fuente de energía: Ejemplo: Cladosporium.
Por último, existen especies como Pseudomonas que pueden utilizar como
fuente de energía un gran número de componentes hidrocarbonados
diferentes.
B. FUENTE DE NITROGENO
Pueden presentarse como proteínas completas, que seria el caso de la gelatina
o incluso proteínas aún mas complejas, como es el caso de los extractos de
carne, sales de amonio, o como peptonas etc.
Es frecuente encontrar peptonas como fuente de nitrógeno que corresponden
a péptidos o polipéptidos dependiendo de su complejidad pero en cualquier
caso son también proteínas que están parcialmente hidrolizadas, aunque no se
las deba considerar como tal.
El bio-Thione, es una denominación comercial correspondiente a una peptona
pépsica de carne..
La caseína en forma de peptona tripsica de caseína se usa para estudiar la
formación de indol por parte de la bacteria debido al alto contenido de
triptófano que posee este tipo de peptona. También es utilizada para estudiar
la reducción de los nitratos e incluso para el cultivo de algunos protozoos.
La peptona papaínica de soja, es una fuente de nitrógeno especialmente para
hongos y ciertos gérmenes como Neisserias.
Otra fuente de nitrógeno serian: nitratos, nitrógeno orgánico, amoniaco, sales
de amonio, aminoácidos, etc.
2.2.2. REQUERIMIENTOS NO ENERGÉTICOS DE LOS MICROROGANISMOS

A. FUENTE DE AZUFRE
Todos los microorganismos que utilizan en su metabolismo azufre lo hacen
mayoritariamente en forma de sulfatos, a veces en forma de tiosulfatos y en
otras ocasiones lo pueden obtener a partir de algún aminoácido, ejemplo:
metionina, cisterna, tiamina, etc.
Ejemplo de medios de cultivo: TSI, LIA, SIM, SS.
B. FUENTE DE FÓSFORO
En general, las bacterias que utilizan el fósforo lo suelen hacer en forma de
fosfato.
C. IONES METÁLICOS
Son utilizados por las bacterias bajo la forma de iones a concentraciones muy
bajas. Por ej: el Sodio, el Potasio, Magnesio, Hierro, etc.
También se encuentra otro tipo de iones metálicos Cobalto, Molibdeno.
Estos iones son esenciales para el crecimiento microbiano y dependiendo de su
concentración pueden inhibir el ‘crecimiento de otros, como el caso del sodio
que a concentraciones altas inhibe el crecimiento de un tipo de
microorganismo y facilita el crecimiento de otros.
- Agar Manitol Salado, contiene 7.5% ClNa permite el crecimiento de
Staphylococous.
- Agar Streptococus KF contiene 6.5% ClNa permite el crecimiento del
Enterococus.
D. FACTORES DE CRECIMIENTO
Existen bacterias que aún con los medios antes descritos no crecen o, si lo
hacen, es muy lentamente. A este tipo de bacterias les hace falta además una
serie de componentes definidos que no son capaces de fabricar por sí solas.
A este tipo de componentes se denomina factores de crecimiento y van a
corresponder a algún tipo de aminoácido de bacterias muy exigentes o incluso
vitaminas, bases púricas o pirimidinicas, etc.
Ejemplo de medios de cultivo y microorganismos:
- Agar sangre enriquecido con metionina, ácido glutámico y ácido nicotinico
para el crecimiento de Xanthomonas.
- El Agar Chocolate permite el desarrollo de colonias húmedas, lisas y grises
del Haemophylus influenzae. Este medio contiene hematina (factor X) y está
enriquecido con otros cofactores, como el NAD (factor V), que permite el
desarrollo de este microorganismo.
- Agar Sangre enriquecido con Glicerol - papa (Bordet Gengou) para
crecimiento de Bordetella pertusis. Se observa colonias en “gotas de
mercurio” brillantes es fácil de apreciar.
- Agar sangre enriquecido con nitrógeno suplementario y vitaminas del
complejo B para el crecimiento del Flavobacterium.
E. FACTORES INHIBIDORES
Son componentes que van a impedir el crecimiento de algún tipo de
microorganismo por bloqueo de sus procesos metabólicos.
Los antibióticos son agentes inhibidores o destructores de la propia bacteria.
La azida sódica inhibe el crecimiento de los Gramnegativos.
Algunos colorantes: Eosina Azul de metileno impide el crecimiento bacteriano
de los Grampositivos.
Cristal Violeta impide el crecimiento de los Grampositivos.
Las sustancias inhibidoras son muy útiles para la identificación y tipificación de
pruebas bioquímicas de las bacterias.
Ejemplo de medios de cultivo y microorganismos:
Agar Mac Conkey: Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo
de las bacterias Gramnegativas.
El medio EMB contiene Eosina y azul de metileno que son colorantes de anilina
y van a inhibir el crecimiento de los microorganismos Grarnpositivos,
permitiendo el crecimiento de todas las Enterobacterias.
Agar Salmonella Shigella contiene una alta concentración de sales biliares y
citrato de sodio, inhibe a todas las bacterias Grampositivas y a muchas
Gramnegativas incluyendo las coliformes.
Agar Sulfito Bismuto, contiene el metal pesado bismuto y el colorante verde
brillante los cuales actúan corno inhibidores del desarrollo de todas las
bacterias Grampositivas y de la mayoría de las Gramnegativas, excepto la
Salmonella.
2.3.- CONDICIONES QUE HA DE CUMPLIR UN MEDIO DE CULTIVO
Para que un microorganismo crezca en un medio de cultivo es necesario:

- Una composición de nutrientes adecuada a las necesidades de ese
microorganismo.
- Unas condiciones físico-químicas apropiadas. De acuerdo con ello, habría que
considerar:
A. TEMPERATURA ÓPTIMA
Los microorganismos, pueden clasificarse en una de las cinco categorías siguientes
en función de los rangos de temperatura de crecimiento.
- Los psicrófilos crecen bien a 0ºC y tienen una temperatura óptima o inferior, la
máxima es de 20ºC. Se aíslan del Ártico y Antártico. Pueden crecer a 0ºC,
aunque su temperatura óptima sea 20 a 30ºC y la máxima de casi 35ºC. Las
bacterias y los hongos responsables de la putrefacción de alimentos refrigerados.
- Los Mesófilos, crecen a una temperatura óptima de 20 a 45ºC, siendo la mínima
de 15 a 20ºC y la máxima de casi 45ºC. La mayoría de los microorganismos
pertenecen a esta categoría. Las bacterias patógenas para el hombre suelen
crecer a una temperatura óptima de 37ºC.
- Los termófilos, pueden crecer a una temperatura de 55ºC o superiores. La
temperatura mínima es normalmente de 45ºC y la óptima es de 55 a 65ºC.
Microorganismos que crecen en fardos de heno, tuberías de agua caliente, aguas
termales.
- Los Hipertermófilos, temperatura óptima de entre 80ºC y casi 113ºC, no crecen
por debajo de 55ºC. Microorganismos aislados en zonas calientes del suelo
marino.
RANGOS DE TEMPERATURA PARA EL

CRECIMIENTO MICROBIANO
Temperaturas cardinales (ºC)
Microorganismo Máxim
Mínima Óptima
a
Bacillus psichrophilus -10 23-24 28-30
Microcococcus cryophilus -4 10 24
Pseudomona fluorescens 4 25-30 40
Staphylococcus aureus 6.5 30-37 46
Enterococcus faecalis 0 37 44
Escherichia coli 10 37 45
Neisseria gonorrhoeae 30 35-36 38
Thermoplasma acidophilum 45 59 62
Bacillus stearthermophilus 30 60-65 75
Sulfolobus acidocaldarius 60 80 85
Pyrococcus abyssi 67 96 102
Pyrodictium occultum 82 105 110
Pvrolobus fumarii 90 106 113
Candida scotti 0 4-15 15
Saccharomyces cerevisiae 1-3 28 40
Mucor pusillus 21-23 45-50 50-58

B. GRADO DE HUMEDAD
Va a corresponder a la cantidad de agua que va a necesitar la bacteria para su
crecimiento.
En general, cualquier medio sólido o líquido requiere cierta proporción de agua.
En medios sin agua es muy difícil el crecimiento bacteriano: de ahí que la
liofilización y cualquier método de deshidratación, sea un buen medio de
conservación.
C. pH
Cada especie tiene un rango definido de pH para su crecimiento y un pH óptimo de
crecimiento.
- Los acidófilos tienen un valor de pH óptimo de crecimiento entre 0 y 5.5.
- Los neutrófilos, entre 5.5 y 8.0
- Los alcalófilos prefieren un rango de pH entre 8.5 y 11.5
La mayoría de las bacterias y protozoos son neutrófilos.
La mayoría de hongos prefieren medios ligeramente ácidos, con valores de pH de 4
a 6.
Variaciones intensas en el pH pueden dañar a los microorganismos alterando la
membrana plasmática o inhibiendo la actividad de las enzimas y las proteínas
transportadoras.
El pH óptimo en la mayoría de los casos es cercano a la neutralidad.
Los tiobacilos pueden crecer mejor a pH muy ácido, a pH próximo a 0.
Los bacilos ureasa positivo tal como Proteus crece a pH cercano a 8.
El Vibrio Cholerae crece bien a pH 9.
En un medio de cultivo pueden aparecer variaciones de pH como consecuencia de
los metabolitos que se producen por la degradación de los nutrientes por parte de
las bacterias. Es típico que en la fermentación glucídica se produzca acidificación
del medio o en la degradación proteica utilizando la bacteria sales amónicas como
fuente de energía se alcalinice el medio.
Siempre es necesario tamponar el medio de cultivo, al menos al comienzo para
mantener el pH dentro de los límites fisiológicos.
EFECTOS DEL PH EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO

Límite pH Límite
Microorganismo
inferior óptimo superior
Picrophilus oshimae 0 0.7 SD
Thiobacillus thiooxidans 0.5 2.0-3.5 6.0
Sulfolobus acidocaldarius 1.0 2.5 4.0
Lactobacillus acidophilus 4.0-4.6 5.8-6.6 6.8
Staphylococcus aureus 4.2 7.0-7.5 9.3
Proteus vulgaris 4.4 6.0-7.0 8.4
Escherichia coli 4.4 6.0-7.0 9.0
Clostridium sporogenes 5.5-5.8 6.0-7.6 8.5-9.0
Pseudomonas aeuriginosa 5.6 6.6-7.0 8.0
Nitrosomonas 7.0-7.6 8.0-8.8 9.4

Bacillus pasteurii 8.5 SD SD
Bacillus alcalophilus 8.5 10.6 11.5
D. PRESIÓN OSMÓTICA
Se suele trabajar en condiciones de isotonia (300 miliosmoles) aunque existen
muchas bacterias que pueden crecer a concentraciones algo superiores.
Las bacterias pueden mantenerse vivas y crecer en medios muy acuosos e
hipotónicos; este hecho es debido a su pared rígida que permite que el agua no
penetre en la bacteria y ésta se rompa.
En las bacterias halófilas, su crecimiento so produce especialmente a
concentraciones muy altas de cloruro sódico; Ej: Staphylococus.
Como la concentración osmótica de un hábitat tiene efectos tan marcados sobre los
microorganismos, es de gran utilidad expresar cuantitativamente el grado de
disponibilidad del agua. Se emplea la actividad de agua (aw).
Actividad del
Ambiente Microorganismo
Agua
1.00 (agua pura) Sangre Mayoría de Gramnegativos
no halófilos
0.95 Pan Bacilos Grampositivos,

Basidiomycetes
0.90 Jamón
Cocos, Bacillus, Fusarium, Mucor,
0.85 Salami Rhizopus
0.80 Conservas Staphylococus, Saccharomyces
0.75 Lagos Penicillum

salados
Halobacterium, Aspergillus
Pescado
0.70 salado Actinospora
0.60 Cereales, Aspergillus

dulces
Saccharomyces
Chocolate
Xeromyces
Leche
deshidratad
a
E. CONCENTRACION DE OXÍGENO
Un organismo que puede crecer en presencia de oxígeno atmosférico es AEROBIO,
mientras que otro puede crecer en su ausencia, es ANAEROBIO.
Los ANAEROBIOS FACULTATIVOS no precisan de Oxigeno para crecer, pero lo
hacen mejor en su presencia.
Los ANAEROBIOS AEROTOLERANTES como Enterococcus faecalis pueden crecer
bien tanto en su presencia como en su ausencia.
Por el contrario los ANAEROBIOS ESTRICTOS U OBLIGADOS, ejemplo:
Bacteroides. Fusobacterium, Clostridium, no toleran en absoluto el oxigeno y
mueren en su presencia.
Los anaerobios tolerantes y los estrictos no pueden producir energía mediante la
respiración aerobia y deben utilizar vías de fermentación o respiración anaerobia
para este objetivo.
Finalmente existen unos pocos microorganismos como el Campylobacter, que son
MICROAEROFILOS que son dañados por el nivel de oxigeno atmosférico 20%
precisando para su crecimiento niveles del 2 al 10% de Oxígeno.
2.3.- PRINCIPALES TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO
Existen muchos tipos distintos de medios de cultivo, así como diferentes

clasificaciones. De acuerdo con esto y según criterios se podrían dividir en:
2.3.1.-MEDIOS DE CULTIVO SEGÚN SU PROPORCIÓN EN AGUA

A. MEDIOS SÓLIDOS
Corresponden a aquellos medios donde la proporción en agar está siempre por
encima del 15%.
La importancia, de los medios sólidos es muy grande, pues permite el aislamiento,
purificación y visualización del crecimiento en colonias, así como su posible
identificación a través de medios específicos y diferenciales de caracteres, sólidos
elaboración de antibiogramas, etc.
Ejemplo de medios de cultivo:
- Agar azida sangre, permite el aislamiento de estreptococos y
estafilococos.
- Agar Mac Conkey, permite el crecimiento de microorganismos
Gramnegativos.
- Agar Chapman, permite el crecimiento de Staphylococcus.
- Agar Sabouraud, permite el crecimiento de hongos.
- Agar Nutritivo, permite el estudio de la morfología de las colonias.
B. MEDIOS LÍQUIDOS
también denominados caldos, no contienen agar. Son de gran utilidad para la
realización de recuentos bacteriológicos por turbidimetría, especialmente útil en
levaduras, para la realización de inóculos, para obtener metabolitos primarios o
secundarios, de los microorganismos como: antibióticos, ácidos lácticos, etc.
Ejemplo de medios de cultivo:
- Caldo MRVP, para investigar la ruta utilizada en la degradación de
glucosa.
- Caldo Peptona, para investigar la producción de Indol.
- Caldo Lactosado, para investigar la formación de ácido y gas
- Caldo Selenito, permite el aislamiento de Salmonella en muestras de
heces con abundante concentración de bacterias mixtas.
- Caldo BHI, permite el crecimiento de microorganismos considerados
difíciles de cultivar.
C. MEDIOS SEMISÓLIDOS
Son medios intermedios entre los líquidos y los sólidos; su proporción en agar suele
ser inferior al 5% pero siempre presentan una cierta cantidad que le proporcione
consistencia semisólida. Son útiles para algunas pruebas bioquímicas:
- Agar O-F Hugh Leiffson, que permite, conocer el tipo de metabolismo
oxidativo o fermentativo de la bacteria problema.
- Agar SIM, estudiar movilidad, producción de H2S, Indol.
- Agar MIO, estudiar movilidad, producción de Indol y Ornitina.
2.3.2.- MEDIOS DE CULTIVO SEGÚN SU USO O UTILIZACIÓN
A. MEDIOS PARA AISLAMIENTO

Son medios con la particularidad de poder obtener a partir de ellos colonias
aisladas. Estos, según sea su composición, se pueden a su vez dividir en:
A.1. MEDIOS ENRIQUECIDOS
Son medios a los cuales, como su nombre indica, se les añade además de los
componentes básicos, uno o varios elementos, como por ejemplo caseína soja,
triptófano, etc., que facilitan el crecimiento de algún tipo de microorganismo
generalmente exigentes, lo que nos permite aislar el microorganismo que
buscamos.
A.2. MEDIOS SELECTIVOS
Son medios en cuya composición presentan componentes que impiden el
crecimiento de algún tipo bacteriano.
- El medio Rothe se caracteriza porque en su composición aparece azida sódica
confiriendo al medio propiedades selectivas ya que tal componente va impedir el
crecimiento de todas las bacterias Gramnegativas, permitiendo el crecimiento de
algunas Grampositivas como Streptococus faecalis.
- Medio Salmonella Shigella, contiene en su composición sales biliares, citrato de
sodio y el verde brillante que inhibe a la flora Grampositiva y los hacen con el
grupo coliforme.
A.3. MEDIOS DIFERENCIALES
Corresponden a aquellos medios que presentan las mismas propiedades que los
medios selectivos, es decir, tienen componentes que inhiben el crecimiento de
algunas bacterias y, lo que es más característico de este medio, presentan
sustancias que al ser utilizadas, o no, por las bacterias que van a crecer en dicho
medio, dan una información suplementaria y específica, es decir, diferencial; por
ejemplo:
- El medio Levine (EMB) este medio presenta en su composición eosina y azul de
metileno que inhiben el crecimiento de los Grampositivos y algunas
Gramnegativas, facilitando el crecimiento de la enterobacterias, que según
utilicen o no la lactosa darán lugar a una coloración característica para cada tipo
de microorganismo.
Los medios diferenciales suelen ser también selectivos y se usan con fines de
aislamiento e identificación.
- Agar TSI, que permite investigar si un microorganismo es capaz de utilizar la
Glucosa, Lactosa y Sacarosa, además si puede producir H2S.
- Agar LIA, permite investigar si un microorganismo descarboxila o desamina el
aminoácido Lisina.
- Agar Citrato de Simmons, investiga si el microorganismo es capaz de utilizar el
citrato como única fuente de carbono.
B. MEDIOS PARA CRECIMIENTO EN GENERAL
Son medios ya sea en forma líquida o sólida que sirven para el cultivo de la mayor
parte de las bacterias. Su composición va a corresponder a una fuente de carbono,
una fuente de nitrógeno, sales y agua. Dentro de los medios generales más
empleados tendríamos el caldo común, que está compuesto por extracto de carne,
peptona, glucosa, cloruro de sódico y agua.
C. MEDIOS DE MANTENIMIENTO DE CEPAS
Son medios que suelen tener los nutrientes necesarios para mantener a las cepas
vivas durante períodos de tiempo relativamente largos manteniéndose tales
medios generalmente a temperaturas lo suficientemente bajas en cada caso como
para impedir su crecimiento. Ejemplo, leche descremada que congelada se utiliza a
menudo para mantener cepas durante meses.
2.3.3.- MEDIOS DE CULTIVO SEGÚN SU COMPOSICIÓN
A. MEDIOS NATURALES
B. MEDIOS SEMISINTÉTICOS
C. MEDIOS SINTÉTICOS
D. MEDIOS COMPLEJOS
2.3.4.- MEDIOS DE CULTIVO SEGUN SU PRESENTACIÓN

A. MEDIOS DESHIDRATADOS O LIOFILIZADOS
B. MEDIOS YA PREPARADOS
C. MEDIOS SÓLIDOS EN PLACA PETRI
D. MEDIOS SÓLIDOS EN TUBO
D.1. Con Agar Inclinado
D.2. Con Agar Semi-Inclinado o Pico de Flauta
E. MEDIOS LÍQUIDOS EN TUBO
III.- MATERIALES Y REACTIVOS

e. MATERIAL REQUERIDO
- Matraces 250 ml, 100 ml. 50 ml Probetas de 50ml, 100 ml. Baguetas.
Balanza. Espátula. Agua destilada. Placas petri .Tubos de ensayo
f. MEDIOS DE CULTIVO
- Agar nutritivo. Agar TSI. Agar Citrato de Simmons. Agar Mac Conkey
Agar Sabourau. Agar LIA . Agar Manitol salado.
VI. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

4.1. PREPARACIÓN
- Para la preparación de medios de cultivo se usa agua destilada.
- El medio de cultivo a preparar debe ser pesado, según la cantidad que esta
indicada en la etiqueta del medio de cultivo.
- Agregar el medio de cultivo en el matraz, y añadir la mitad del volumen de
agua que se requiere, agitar suficientemente para conseguir una suspensión
homogénea, después incorporar el agua restante, aprovechando esta
adición para desprender e incorporar al conjunto las partículas del medio de
cultivo que hubieran quedado adheridas a la pared interna del recipiente.
- Los medios nutritivos que contienen agar deben ser calentados para
conseguir su disolución.
- Para reconocer que se ha alcanzado una disolución completa, al agitar no
debe adherirse el medio a la pared interna del recipiente; la solución es
viscosa y resbala libremente.
- Tapar el matraz con el tapón de algodón, envolver con papel Kraft y pabilos.
4.2. ESTERILIZACION
- Se esterilizará el medio de cultivo, ya disuelto en el autoclave en caso de
ser necesario.
- El tiempo es de 15 minutos a 121ºC.
4.3. REPARTICION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
- Debe verterse el medio de cultivo a una temperatura de 45-55ºC.
- Previamente hay que remover el medio de cultivo haciéndolo oscilar en
sentido circular su recipiente para garantizar la homogeneidad del medio.
- Los tubos llenos con medios de cultivo esterilizado, todavía líquido, se
colocan en la posición deseada:
o Pico y Fondo o Pico de flauta o semi inclinado
o Pico o inclinado
o Fondo
o El medio de cultivo se deja solidificar en la posición lograda.
- Repartir:
o En Placas (aproximadamente 16 a 20 ml) los siguientes medios de
cultivo:
 Agar nutritivo
 Agar Mac Conkey
o En Tubos: la posición de pico y fondo (aproximadamente 4 ml)
 Agar TSI (3)
 Agar LIA (2)
o En Tubos: la posición de pico (aproximadamente 2 a 3 ml)
 Agar Citrato de Simmons (2)
o En tubos: la posición de Fondo (aproximadamente 3 ml)
 Agar SIM (2)
o En tubos: los siguientes medios líquidos (aproximadamente 3 ml)
 Caldo MRVP (2)
 Infusión Cerebro Corazon o BHI (2)
4.4. ALMACENAMIENTO
- Los medios de cultivo deshidratados deberán conservarse en lugar seco,
protegidos contra la luz, a una temperatura de 15ºC a 30ºC, y en envases
bien cerrados.
- Los medios de cultivo preparados, listos para su uso, tienen un sólo tiempo
limitado de conservación. Cuando no se indique otra cosa y bajo
condiciones adecuadas de conservación es de varios meses. Se recomienda
temperatura de 4 – 8ºC.
- Las placas petri, preparadas con el medio de cultivo, deberán preeintarse
con cinta adhesiva su borde lateral, para impedir fugas entre el cuerpo de la
placa y la tapa.
4.5. COMPOSICION Y PREPARACIÓN DE CADA UNO DE LOS MEDIOS

UTILIZADOS
AGAR NUTRITIVO
a. Composición
Peptona, 17.0 g. Extracto de carne, 3.0 g. Cloruro de sodio, 5.0 g
Agar – Agar, 12.5 g. Agua destilada, 1000 ml
b.Preparación
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________
c. Descripción del Medio

3.1. Requerimiento Energético
Fuente de carbono: ________________________
Fuente de nitrógeno: _______________________
3.2. Requerimiento no Energético
Fuente de azufre: _________________________
Fuente de fósforo: ________________________
Iones metálicos: __________________________
Factores de crecimiento: ____________________
Factores de arranque: ______________________
Factores inhibidores: ______________________
3.3. Según su proporción en agua

_________________________________________________________
3.4. Según su uso o utilización
_________________________________________________________
3.5. Según la composición

_________________________________________________________
3.6. Según su presentación

_________________________________________________________
AGAR MAC CONKEY

1. Composición
Peptona de caseína 17.0 g. Rojo neutro 0.03 g. Peptona de carne 3.0 g.
Cristal violeta 0.001 g. Lactosa 10.0 g. Sales biliares 1.5 g. Cloruro de
sodio 5.0 g
Agar – Agar 12.5 g. Agua destilada 1000 ml.
2. Preparación
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________
3. Descripción del Medio

Fuente de azufre: _________________________
Iones metálicos: __________________________
Factores inhibidores: _______________________

_________________________________________________________

_________________________________________________________

_________________________________________________________

_________________________________________________________
AGAR TSI
1. Composición
Extracto de carne, citrato de amonio, 0.2 g. Extracto de levadura,3.0 g. ,
peptona de sacarosa,
Tiosulfato de sodio, 0.3 g. Peptona, 20.0 g. Rojo de fenol, 24 mg.,
sacarosa,
Cloruro de sodio,5.0 g. Lactosa, 10.0 g. Agar – Agar, 12 g. Glucosa, 1.0 g
Agua destilada, 1000 ml
2. Preparación
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________

Fuente de azufre: ________________________
Fuente de fósforo: _______________________
Iones metálicos: _________________________
Factores de crecimiento: ___________________
Factores de arranque: _____________________
Factores inhibidores: _____________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
MEDIO EMB.
1. Composición
Fosfato dipotásico, 1.0 g. , 5.0 g. Sulfato de magnesio, 0.2 g, peptona, azul de
metileno, lactosa, sacarosa, caseina, Agar – Agar, 12.5 g. Agua destilada, 1000 ml
2. Preparación
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________

Fuente de azufre: _________________________
Iones metálicos: __________________________
___________________________________________
___________________________________________
_____________________________________________
3.6. Según su presentación.
_____________________________________________
CALDO MRVP
1. Composición
Peptona de caseína 7.0 g
Dextrosa 5.0 g
Fosfato dipotásico 5.0 g
Agua destilada 1000 ml
2. Preparación
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________

Fuente de azufre: _________________________
Iones metálicos: __________________________
Factores de crecimiento:____________________
3.3. Según su proporción en agua _________________________________
3.4. Según su uso o utilización. __________________________________
3.5. Según la composición. ________________________________________
3.6. Según su presentación.
___________________________________________
PRÁCTICA5
SIEMBRA DE MICROORGANISMOS
VI. OBJETIVOS
1) Explicar los diferentes tipos de siembra que puedan realizarse.
2) Saber llevar a cabo los diferentes métodos de siembra e inoculaciones.
3) Proporcionar los medios adecuados para que el alumno trabaje en
condiciones de asepsia y esterilidad.
VII. MARCO TEORICO

Para poder estudiar los microorganismos, se necesita como requisito previo poder
cultivarlos en condiciones de laboratorio y, por tanto inicialmente deben ser
aislados.
Para ello, se dispone de muestras, que muchas veces suelen presentar los
siguientes problemas:
- Que no existe la cantidad suficiente de microorganismos que se busca.
- Que las muestras contengan varios tipos de microorganismos, pacte de los
cuales son contaminantes, haciéndose necesario su aislamiento inicial para
obtener cultivos puros.
2.1. SIEMBRA
Procedimiento que consiste en inocular a los microorganismos en medios de
cultivo adecuados para que se desarrollen y multipliquen, de acuerdo a sus
exigencias vitales, para que en condiciones óptimas de temperatura y tiempo
de inoculación, puedan desarrollarse y multiplicarse IN VITRO. Se siembra con
dos finalidades:
a. Para hacer un aislamiento.
b. Para hacer un transplante.
AISLAMIENTO
Permite la separación de los microorganismos al estado de pureza a partir de
una muestra problema. Se requiere un medio sólido con gran superficie para
que los microorganismos al ser diseminados sobre el medio, generen su
progenie (cepa) por formación de colonias separadas. Si se aíslan especies
distintas, cada colonia tendrá características especiales, la morfología
bacteriana será también distintiva.
TRANSPLANTE
Significa la separación previa de la cepa a un medio de cultivo apropiado en
tubo, que puede ser líquido o sólido.
Se conserva la cepa pura, y por subsiguientes transplantes en medios

especiales, se logra conocer las propiedades culturales y bioquímicas y como
resultado la identificación específica. Los trasplantes se pueden realizar:
1. De líquido a sólido.
2. De líquido a líquido.
3. De sólido a sólido.
4. De sólido a líquido.
2.2. MATERIAL DE SIEMBRA O INOCULACION
Existen los siguientes materiales:
♠ ASAS DE SIEMBRA
El asa de siembra consiste de un alambre de Nichrome o platino, con una
punta en asa o recta y en el otro extremo insertado con un mango cilíndrico
para un uso sencillo.
Se utiliza para inoculación o siembra por estría en medios sólidos, presentan

un arco bastante cerrado en su extremo cuyo diámetro es mas o menos
específico es decir muchas asas son calibradas y corresponden a un volumen
determinado de siembra las más utilizadas son las de 0,01 mililitro que se
esterilizan por flameado.
♠ HILOS DE PLATINO (ASA EN PUNTA)

Son similares a las asas con la diferencia de no presentar arco en su extremo,
únicamente es un hilo. Se utiliza para la siembra por picadura en medios
semisólidos y sólidos.
♠ ASAS DE DIGRASKY
Son asas de vidrio en forma de triángulo más o menos abierto. Se utiliza para
extender el inóculo líquido previamente adicionado en la placa, a través de
una pipeta pasteur. Se esteriliza en autoclave, aunque generalmente se
puede hacer empapando en alcohol y prendiendo la llama hasta agotar el
alcohol del asa.
♠ HISOPOS
Se utiliza para la toma de muestras, para transportar muestras sin que esta
sufra desecación, deterioro o contaminación. Sirve para extender la muestra a
través del hisopo en el medio de cultivo. Se suele comercializar ya estéril listo
para utilizar y desechables.
♠ PIPETAS
Se pueden disponer de forma individual o en paquetes. Pueden ser de vidrio,
reutilizables por esterilización o de plástico, generalmente desechables.
Pueden ser graduadas (contienen volúmenes específicos), en cuyo caso su
aspiración se realizará con aspiradores para pipeta tipo pera o prepipeta. La
pipeta pasteur no contiene volúmenes graduados son muy utilizados en
bacteriología y cuya aspiración se realiza con chupetes de goma. También nos
encontramos con micropipetas utilizadas para la siembra de microlitros y
mililitros en un determinado medio de cultivo.
2.3. PREPAPACION DE INOCULOS

Un inóculo corresponde a una cantidad suficiente y representativa de
microorganismos problema. Así pues, se debe partir, por un lado, de un,
cultivo puro y, por otro lado, de una concentración adecuada de
microorganismos problema.
Si la muestra no es pura se aplicará distintos métodos para el aislamiento

mediante técnicas específicas, como es el caso de la siembra por estrías en
placa o por agotamiento, o la técnica de la placa invertida, que en general va
a permitir el crecimiento más o menos separado de los microorganismos. Es
muy útil usar medios de cultivo enriquecidos específicos y diferenciales que
permitan el crecimiento del tipo de microorganismos concreto que buscamos.
De esta forma, una muestra natural que en principio no es pura puede ser
aislada y desarrollada como puro.
♠ METODOS DE PREPARACION DE INOCULOS

Si la muestra es sólida o semisólida se tomará siempre con asa de siembra
estéril. Si la muestra es líquida se tomará con pipeta graduada o pipeta
pasteur estéril en cantidad suficiente y, en ambos casos se homogenizará
2.4. PREPARACIÓN DE INÓCULOS

Si la muestra es sólida o semisólida se tomara siempre con asa de siembra
estéril. Si la muestra es líquida se tomará con pipeta graduada o pipera
pasteur estéril en cantidad suficiente, y en ambos casos se homogenizará
posteriormente en el medio específico de cultivo.
Si la muestra tomada con asa de siembra estéril se adiciona a un medio

líquido se homogenizará y se dejará crecer a la temperatura adecuada, que
generalmente para organismos patógenos coincidirá con la temperatura
corporal, dejándolos crecer aproximadamente 24 horas. En ocasiones
excepcionales se hace necesario la utilización de un rotavapor para que el
crecimiento se establezca por igual en todo el medio líquido, aunque esto va a
depender de su aplicación posterior y de la cantidad de inóculo que se
requiera.
Si la muestra se toma con asa de siembra estéril y se adiciona en un medio de

cultivo sólido, se utilizara diferentes técnicas de siembra y posteriormente se
verificará el cultivo, ej. siembra por agotamiento.
Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta pasteur y se adiciona a

un medio liquido, se homogenizará la mezcla inicial por agitación y se dejará
crecer a una temperatura de 37ºC por 24 horas. Es importante que los
inóculos sean siempre jóvenes.
Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta pasteur y ésta se añade a

un medio sólido, se extenderá con el asa de Digrasky, previamente estéril a
través de toda la placa incubándose a un a temperatura adecuada durante 24
horas. Se requieren también cultivos jóvenes.
Los medios líquidos pueden ser agua destilada estéril, solución salina estéril o
caldo de cultivo base.
A veces es necesario partir de un inóculo con un número aproximados de

microorganismos problema. En estos casos, los inóculos se establecen en
medios líquidos y el número de microorganismos se recuenta de forma
aproximada, por comparación de medios líquidos con diferentes gradientes de
turbidez. Este es el caso de la escala de Mc-Farland formada por una batería
de tubos cada uno de las cuales tiene distinta turbidez según la concentración
de sulfato bárico. Cada tubo corresponderá a una determinada concentración
de microorganismos.
2.5. METODOS DE INOCULACION O SIEMBRA (MÉTODOS DE

AISLAMIENTO)
El paso de una muestra microbiana aun medio de cultivo, ya sea líquido o
sólido se denomina siembra o inoculación.
El paso de una muestra microbiana de un medio de cultivo a otro se
denomina resiembra.
La siembra del inóculo puede realizarse en medio sólido o en medio líquido.
2.5.1. SIEMBRA DEL INÓCULO EN EL MEDIO SÓLIDO

Estas siembras pueden darse en placa o en tubo.
2.5.2. SIEMBRA DEL INÓCULO EN PLACA

Todo aislamiento implica el agotamiento de una muestra sobre la superficie
del medio sólido. Se va descargando gradualmente el inóculo, para que en los
últimos planos del medio queden escasas células aisladas que en el ambiente
nutritivo se irán multiplicando, logarítmicamente hasta formar colonias puras.
Los métodos de aislamiento varían según el dispositivo de siembra y la forma
de distribuir el inóculo.
Cualquiera que sea el método ensayado, aprovechando el máximo de
superficie del medio se logra el aislamiento de mayor numero de cepas
microbianas.
CLASES DE SIEMBRA
- Siembra por agotamiento o por estrías.
- Siembra por difusión.
- Siembra por diseminación.
a. SIEMBRA POR AGOTAMIENTO: ESTRIA SIMPLE

Con el asa de siembra (previamente esterilizado por flameado) se construye
una cantidad adecuada de muestra problema depositando el inóculo en uno
de los extremos superiores de la placa, a partir de aquí se realizará
movimientos en zig - zag de un extremo a otro de la placa no tomándose en
ningún momento nuevos inóculos y no levantándose el asa hasta concluir la
siembra en toda la placa.
- ESTRIA MÚLTIPLE
Se tomará la muestra problema con el asa de siembra previamente estéril y
dicho inóculo se depositará en el extremo superior de la placa, extendiéndose
de un extremo a otro de ésta solo en la parte superior. Flameado el esa de
platino y girando ligeramente dicha placa repetiremos el proceso anterior que
nos permitirá arrastrar la muestra desde uno de los bordes donde quedó la
muestra hasta el otro extremo superior de la placa. Se vuelve de nuevo a
flamear el asas de platino sin coger muestra como en el caso anterior y
siguiendo la misma dirección se repite la operación hasta un total de cuatro o
cinco veces, que son los que vienen cavida aproximadamente en una placa,
teniendo en cuenta que el último tramo se efectuará hacia el interior de la
misma.
El resultado son colonias cada vez más separadas como consecuencia de que
cada vez que se va arrastrando y separando más la muestra. Es importante
que para separar estas colonias se realice en cada estría un flameado previo
del asa de siembra.
- TECNICA DE LOS CUATRO CUADRANTES

Con un rotulador para vidrio, en la base de la placa (reverso), se dibujan dos
líneas perpendiculares que deberán cruzarse en el centro de la placa de tal
forma que esta queda dividida en cuatro cuadrantes iguales. Se tomará con
el asa de siembra estéril una cantidad de inóculo y se adicionará en el
extremo superior de uno de los cuadrantes extendiéndose por todo ese
cuadrante en forma de zig - zag. Realizamos la misma operación sin flamear
el asa en todos los demás cuadrantes siguiendo un orden de tal forma que
iremos arrastrando el microorganismo problema observándose en el ultimo
cuadrante las colonias mas aisladas o separadas.
- TECNICA DE LOS TRES GIROS

Se rotula la placa en forma análoga al caso anterior. Se toma inóculo con el
asa de platino y se siembra por estría la mitad superior de la placa. Sin
flamear el asa de platino giraremos la placa unos 90º y volveremos a sembrar
una segunda vez. Así sucesivamente hasta completar toda la siembre
(girando de nuevo la placa 900) ésta técnica no es muy utilizada.
b. SIEMBRA POR DIFUSION (TÉCNICA DE BARRY)

En este método, el medio de cultivo se mezcla con el inóculo, al solidificar las
colonias crecen en diferentes niveles, los cuales servirán para contaje de
colonias.
Para ello en el medio de cultivo previamente fundido (de 20 a 25 ml de medio

a una temperatura de 45 a 50ºC) en el tubo, en el tubo se adicionará la
cantidad de inóculo que oscila entre 0,1 a 0,4 y se homogenizará la muestra
en el tubo mediante el vibrador.
Una vez, constituida la muestra, se vierte ésta en la placa petri estéril y se

dejará solidificar, la mezcla también se podría realizar en la misma placa petri,
aunque la homogenización en este caso es más difícil. Esta técnica es
utilizada, por ejemplo, para la determinación de CMI (concentración mínima
inhibitoria) de un antibiótico frente a determinados microorganismos.
c. SIEMBRA POR DISEMINACIÓN (CON ASA DE DIGRASKY).

Consiste en adicionar el medio sólido, un inóculo que puede oscilar entre 0,2 y
1 ml según los casos con una pipeta graduada estéril, y posteriormente se
extiende con el asa de Digrasky también estéril. Esta técnica se puede utilizar
para el recuento de células viables, antibíogramas, etc.
- TECNICA DE SIEMBRA POR DILUCION

Se dispondrá de un batería de tubos con medio de cultivo específico o agua
estéril según los casos. Se adicionará una cantidad de muestra liquida o sólida
en los tubos sabiendo la cantidad de muestra o inóculo que se añade en el
tubo inicial. Se agitará hasta homogenizar. Con la pipeta estéril se tomará una
cantidad exacta y se adiciona al segundo tubo, que se homogeniza.
Repetimos la operación anterior con el tercer tubo y así sucesivamente hasta
obtener la dilución deseada. Con la dilución obtenida por ej. l0-4 y 10-5 inocular
en placas de cultivo una cantidad exacta y extender con el asa de Digrasky
previamente estéril. Incubar a temperatura óptima de 24 horas y
posteriormente recontar. Existen muchas variaciones de este método. Una de
ellas es hacerlo en medio de cultivo agar, donde se mezcla en los tubos la
muestra y se diluye hasta obtener la dilución deseada; posteriormente son
vertidos en placas y se le deja solidificar.
2.6. SIEMBRA DEL INÓ7CULO EN TUBO
a. SIEMBRA POR ESTRIA EN MEDIO SÓLIDO INCLINADO

Se toma con asa de siembra previamente esterilizada por flameado una
cantidad de muestra adecuada. Se añade al tubo desde el fondo de la
superficie de ésta realizando movimientos ascendentes en zig - zag hasta
completar toda la superficie del medio. Este método es utilizado para
conservar cepas durante largos períodos, así como para la realización de
ciertas pruebas bioquímicas como la prueba de ureasa.
b. SIEMBRA POR PICADURA

Se suelen tomar con hilo de siembra aunque en algunas ocasiones también
puede hacerse con asa de siembra. Consiste en introducir el asa en el medio
de cultivo que se encuentra en el tubo hasta el fondo de esta y en posición
central. Esta técnica se utiliza para la siembra de medios de cultivo
semisólidos ej. medio de oxidación - fermentación de Hugh-Leiffson.
c. SIEMBRA POR PICADURA Y ESTRIA

Consiste en la utilización de las dos técnicas anteriormente descritas. Este
método se lleva a cabo cuando el medio es sólido y está inclinado. Primero se
realiza la siembra por picadura y posteriormente la siembra por estría ej.
prueba de medio KIA y la prueba en medio citrato entre otras.
2.7. CULTIVOS PUROS: AISLAMIENTO EN PLACA Y TRANSFERENCIA

CELULARES
El empleo de microorganismos en Biotecnología se fundamente en la

obtención de cultivos puros, que están constituidos por una única especie
microbiana. La mayoría de las aplicaciones en biotecnología conlleve el uso de
cultivos puros.
La mayoría de los métodos de obtención de cultivos puros se basa en algún

método de dilución. El método más útil y práctico es el aislamiento en placa,
en el que un cultivo mezclado se inocule y se extiende sobre la superficie de
un medio de cultivo de modo que las células individuales queden separadas
una de otras. Cada célula aislada crece ahora para formar una colonia y, por
lo tanto, un cultivo (o clon) puro puesto que las células que componen la
colonia son la progenie de una única célula original.
Existen varios métodos para confirmar la pureza de un cultivo:
1. Repitiendo la operación de aislamiento; una colonia aislada procedente de un

aislamiento en placa inicial debería dar lugar al repetir la operación a colonias todas
del mismo tipo, y cuya morfología concuerda con la del aislamiento inicial.
2. El examen microscópico de los organismos procedentes de una colonia deberían

mostrar un único tipo celular. Los métodos diferenciales de tinción Gram, son útiles
pare establecer que la colonia una mezcla de tipos microbianos diferentes.
Es necesario emplear una técnica aséptica para transferir los cultivos puros y
para mantener la esterilidad a los medios y soluciones. Trabajando
asépticamente, el biotecnólogo tome prudentemente las precauciones
necesarias para prevenir la contaminación o de las soluciones con
microorganismos no deseados.
VIII. MATERIALES Y EQUIPOS
Material de Vidrio
- Tubos de ensayo (16 x 125) (13 x 100)
- Placas petra
- Pipetas 1ml, 5ml, 10 ml
- Erlenmeyer
Equipos
- Estufa 37ºC
- Autoclave
Otros materiales
- Gradillas
- Mechero Bunsen
- Asas de siembra
- Algodón
- Pinzas
Reactivo y Medios de cultivo
- Medios de cultivo
• Agar Mc Conkey
• Agar nutritivo
• Agar chocolate
• Agar Saboraud
• Agar TSI, LIA (tubos pico de flauta)
• Agar SIM (tubos fondo)
• Caldo MRVP, SRI
Reactivos
- Reactivo Covak’s
- Rojo de metilo
IX. PROCEDIMIENTO DE MUESTRAS
4.1. SIEMBRA DE UNA MUESTRA LÍQUIDA CON EL ASA DE DIGRASKY

Muestra: Inóculo de un cultivo puro
Medio de cultivo: Agar nutritivo
Propósito: Demostrar la susceptibilidad a los antimicrobianos.
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
4.2. SIEMBRA POR AGOTAMIENTO O AISLAMIENTO EN ESTRIA

Muestra: Orina
Medio de cultivo: Agar Mac Conkey
Propósito: Obtener colonias aisladas para observar sus características
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
4.3. TÉCNICA DE LOS CUATRO CUADRANTES

Muestra: Muestra fermentada
Medio de cultivo: Agar Sabauraud
Propósito: Obtener colonias aisladas para observar sus características
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
PRÁCTICA6
DEMANDA QUÍMICA DE OXIGENO (DQO)
a.- Fundamento.
Se define como el oxigeno químicamente equivalente al bicromato consumido en este

proceso. Cada (Cr2O7)-2 consume 6 electrones para formar Cr3+, y cada O2 consume 4
electrones para formar agua, por consiguiente un mol de (Cr 2O7)-2 es equivalente a 1.5
mol de oxígeno en este cálculo ( Harris, 2007).
Se define también, como la cantidad de oxigeno expresado en mg/l consumido por las
sustancias oxidables en las condiciones de ensayo, contenidas en 1 litro de agua. Se
usa un oxidante fuerte como el dicromato de potasio. Esta determinación no hace
distinción entre sustancias biodegradables y no biodegradables, tal es el caso de la
celulosa, que biológicamente se degrada con mucha lentitud, pero que oxidada con
dicromato, se degrada rápidamente. Lo inverso también ocurre, pues algunos
compuestos carbonados son degradados por bacterias, pero no son oxidados por el
bicromato (caso de algunos alcoholes y ácidos), salvo que esté presente un
catalizador, como los iones plata, por lo cual es recomendable adicionar AgSO 4.
Asimismo el dicromato no es capaz de oxidar a los hidrocarburos aromáticos, y la
piridina. (Romero, 1999)
El método se basa en la oxidación de la materia orgánica contenida, por el dicromato
de potasio, agregado en exceso.
CnHaOb + cCr2O7-2 + 8cH ------- vCO2 + (a/2 + 4c)H2O + 2cCr+3
Donde: c = (2n/3) + (a/6) – (b/3)
Posteriormente se valora el exceso no consumido de dicromato usando ioduro de
potasio, que libera yodo.
Cr2O7K2 + 6IK + 4 H2SO4 ------- K2SO4 + (SO4)Cr2 + 7H2O + 3I2
Luego el iodo es valorado por el tiosulfato de sodio, 0.025 N
2S2O3Na2 + I2 ---- 2INa + S4O6Na2
b.- Reactivos.
Solución de sulfato de plata. Se toman 6.6 gr. de AgSO4 se colocan en un matraz de

1000 ml, con 250ml de agua bidestilada, y con precaución se agregan 50 ml de SO4H2
(d= 1.84), para disolver el reactivo. Una vez frío se lleva a volumen con agua
bidestilada.
Solución de bicromato de potasio. 2.5 g de Cr2O7K2 en 500 ml de acido ortofosforico al
85%, es conveniente triturar el bicromato en mortero, macerándolo en unas gotas de
acido ortofosfórico para facilitar la disolución se agregan 500 ml de H2SO4 (d=1.84),
se agita con varilla de vidrio, y se filtra en lana de vidrio.
Solución de yoduro de potasio. 55 gramos de IK en 200 ml de agua bidestilada.
Solución 0.025 N de tiosulfato de sodio.
Solución de almidón.
Solución de glucosa al 1%. La glucosa debe ser preparada en el momento de uso.
c.- Procedimiento.
En un balón de 500 ml de cuello esmerilado, se colocan 5 ml de la muestra que se

diluye con poca agua y se agrega 1 ml de solución de sulfato de plata, que eliminará
la interferencia de eventuales cloruros presentes, actuando también de catalizador en
el proceso de oxidación. Se le agregan 20 ml de la solución oxidante de bicromato. Se
conecta al balón un refrigerante, se calienta a reflujo durante 25 min exactamente
controlados desde el momento en que comienza la ebullición. Se deja enfriar y se
enjuaga el refrigerante, dejando caer unos 50 ml de agua, desconectar el refrigerante
y agregar unos 100 ml de agua al balón, se enfría nuevamente y se agregan 10 ml de
la solución de ioduro de potasio.
Paralelamente se conduce un ensayo en blanco donde la muestra ha sido sustituida
por agua bidestilada
El exceso de bicromato no consumido en la oxidación habrá reaccionado con el
ioduro y liberado el equivalente en yodo, que será titulado por el tiosulfato (Romero,
1999).
Cálculo.
DQO (mg/l) de O2 =F.N.(A-B)8000/D
Donde:
F = factor de corrección.
N = Normalidad de la solución de tiosulfato.
A = ml de tiosulfato de sodio gastados en la titulación del blanco.
B = ml de tiosulfato de sodio gastados en la titulación de la muestra.
D = ml de la solución problema.
d.- cuestionario.
1.- Explique, cual es el objeto de hacer hervir la muestra.

2.- Explique para que se usa el tubo vertical sobre el balón.
3.-Que utilidad práctica, tiene el uso de la DQO.
4.- Que ventajas y desventajas tiene el uso de la DBO como indicador de la
contaminación de aguas residuales.
5.- Que ventajas y desventajas tiene el uso de la DQO como indicador de la
contaminación de aguas residuales.
P
R ÁC
TIC
A7
CONTEO DE CÉLULAS MICROBIANAS
I. OBJETIVO
1) Determinar el recuento directo de células microbianas con la cámara de
contaje celular.
II. FUNDAMENTO TEÓRICO

Una suspensión celular se caracteriza por presentar un número de
partículas microscópicas dispersas en un fluido. Habitualmente será
necesario determinar tanto la densidad de las células en la suspensión
como el porcentaje de éstas que son viables.
Para determinar la densidad de las células se emplean diferentes técnicas,

desde la relativamente simple cámara de contaje celular de la que existen
numerosas variantes, entre ellas la que empleamos (cámara de Neubauer),
hasta equipos automáticos de contaje celular como el “Cell Coulter”.
Sin embargo, es posible determinar la densidad celular empleando

métodos más sencillos. Nos basta con una cámara de contaje celular, por
ej. la cámara de Neubauer, y un microscopio. Una cámara de contaje
celular es un dispositivo en el que se coloca una muestra de la suspensión
a medir. El dispositivo presente unas señales que determina un volumen
conocido (x microlitros). Al contar bajo el microscopio el numero de
partículas presentes en ese volumen se pueden determinar la densidad de
partículas en la suspensión de origen.
La cámara de Neubauer es una cámara de contaje adaptada al microscopio

de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con
una depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la
ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve en la imagen. Es
un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre dos líneas
consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área sombreada y marcada L
corresponde a 1 milimetro cuadrado. La depresión central del cubreobjetos
está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se
cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1
milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos
es de 0.1 milímetro cúbico, es decir 0.1 microlitro.
Si contamos las cuatro áreas sombreada (L) observando un total de x

células entre las cuatro áreas, la concentración en la suspensión celular
será :
Concentración en la suspensión (células / mL) == 10000 (x/4)
En la imagen puedes observar el aspecto de una de las regiones marcadas

como L y que en el microscopio se ven como una cuadrícula de 16
pequeños cuadrados de 0.25 milímetros de lado. Esta imagen ha sido
tomada empleando un microscopio invertido de contraste de fases.
Existen numerosos modelos de cámaras de contaje celular adaptadas a su

uso en microscopía. En la imagen puedes observar una cámara de
Neubauer doble, como las que usas en el laboratorio de prácticas.
El recuento directo al microscopio es tedioso, pero es una forma rápida de

estimar la cantidad de células microbianas, sin embargo, tiene algunas
limitaciones:
1) No se distinguen las células muertas de las células vivas.
2) Las células pequeñas son difíciles de ver bajo el microscopio y
posiblemente se omitan algunas células.
3) La precisión es difícil de lograr
4) Se requiere un microscopio de contraste de fases cuando no se ha teñido
la muestra.
5) El método no es adecuado para suspensiones de células de baja
densidad. En el asa de bacterias, en una suspensión de células con
menos de 106 células por mililitro, se podran ver pocas o ninguna
bacteria.
III. MATERIALES Y REACTIVOS

- Cultivo de E. coli - Cultivo de levadura
- Matraz - Pipetas
- Cámara del Neubauer -Pipeta Pasteur
- Estufa - Microscopio
IV. METODOLOGÍA
CARGANDO LA CÁMARA
Agita la suspensión celular con el vórtex. Aspira una pequeña cantidad
de suspensión con una pipeta Pasteur. Deposita una gota pequeña en
la superficie pulida de la cámara de recuento cerca del extremo del
cubre. La suspensión entrará en la cámara por capilaridad. Una
cámara adecuadamente llenada contiene células solo en el espacio
contenido entre el cubre y la cámara de recuento. No debería sobrar
fluido que cayera en los surcos.
CUESTIONARIO
1.- Investigue las características de:
Cámara de cuenta de Petroff – Hausser, equipos automáticos de Contaje
celular, Otros métodos de recuento celular
2.- Indique como diferencia las células viables de células totales.
3.- Describa los métodos directos e indirectos de contaje celular.
PRÁCTICANº8
CURVA DE CRECIMIENTO
I. INTRODUCCIÓN
Los cultivos bacterianos actúan como suspensiones coloidales,
absorbiendo y reflejando la luz que incide sobre ellos. La turbidimetría
mide la entidad de luz transmitida por la suspensión, mientras que la
medida de la luz difractada recibe el nombre de nefelometría. Por estos
procedimientos se puede estimar el número de bacterias en el cultivo, ya
que, dentro de un rango, la luz absorbida o difractada por una suspensión
bacteriana es directamente proporcional a la concentración de células en
el cultivo. El espectrofotómetro es el aparato que se utiliza para la medida
de la luz transmitida. Este aparato proporciona luz monocromática por
medio de un filtro que permite sólo el paso de la longitud de onda elegida.
La cantidad de luz transmitida por una suspensión bacteriana es medida
por una célula fotoeléctrica e inversamente proporcional a la cantidad de
bacterias. Normalmente la multiplicación bacteriana no se expresa como
disminución de la luz transmitida (transmitancia), sino como aumento de la
luz absorbida (absorbancia), ya que esta última es directamente
proporcional al número de bacterias presentes en la suspensión. La
relación entre la transmitancia y la absorbancia se expresa
matemáticamente de la siguiente manera:
Absorbancia = 2 - log % de transmitancia
Para la medida de la luz difractada se emplea e! nefelómetro.
Para el manejo práctico de los cultivos bacterianos en estudios de

turbimetria es muy útil el uso de matraces con brazo lateral, ya que
permite la realización de medidas sin necesidad de tomar muestras del
cultivo, evitando así el riesgo de contaminación por la manipulación.
II. OBJETIVOS
1) Determinar los principios generales en un crecimiento microbiano.
2) Realizar una curva de multiplicación bacteriana.
III. FUNDAMENTO TEÓRICO

Durante el crecimiento celular, todos los constituyentes de la célula
aumentan en cantidad, en la mayoría de organismos el crecimiento
continua hasta que la célula se divide en dos nuevas células, proceso
denominado fisión binaria. Cada una de las células hijas recibe, un
cromosoma completo, copias de todas las macromoléculas, monómeros e
iones inorgánicos.
El intervalo para la formación de dos células a partir de una se llama

generación y el tiempo requerido para que esto ocurra se llama tiempo de
generación o tiempo de duplicación, el que yana entre los
microorganismos, algunos crecen rápidamente y se dividen en solo 20 a 30
minutos, otros requieren de una a tres horas, otros de varias horas o
incluso días.
3.1.CURVA DE CRECIMIENTO
Si se inocula un medio liquido con células microbianas, procedentes
de un cultivo que ha crecido a saturación, en el que se ha
determinado el número de células variables por minuto
periódicamente y trazamos una gráfica de ello, se obtiene una curva
de crecimiento. Esta curva se divide en cuatro fases
fundamentalmente y son las siguientes:
1. Fase de Rezago.- Llamado fase de adaptación, los
microorganismos se encuentran desprovistos de metabolitos,
enzimas y otros constituyentes que deben ser sintetizados hasta
alcanzar concentraciones que permitan que el crecimiento se
reinicie.
2. Fase Exponencial.- Llamada fase logarítmica, es consecuencia de
la división celular y las nuevas células crecen en progresión
geométrica, se sintetiza nuevo material celular a velocidad
constante aumentando la masa en forma exponencial.
3. Fase Estacionaria.- Los nutrimentos se agotan y se acumulan
productos metabólicos tóxicos. Aquí cesa el crecimiento de una
población.
4. Fase de Declinación.- Llamada fase de muerte celular en el
cultivo, varia con el microorganismo y condiciones de cultivo, la
velocidad de mortalidad aumenta hasta alcanzar un nivel sostenido.
Fases de Crecimiento
Latencia Exponencial Estacionaria Muerte
Rezago Logaritmo Nutrientes se agotan
Declinación
Adaptación Divisón celular Acumulan metabolitos tóxicos
Crecimiento Sesa crecimiento
1
9,0
Log 10 organismos
Turbidez 0,75
viables/ml
Densidad óptica
8,0 Viables (densidad óptica)
0,5
7,0
0,25
6,0
5,0 0,1
Tiempo
IV. PARTE EXPERIMENTAL
MATERIALES Y REACTIVOS
- Cubres
- Cultivo E. Coli sobre un slant de agar nutritivo
- Cubetas
- Solución salina estéril
- Pipetas Pasteur
- Pipetas estériles
- Caldo nutritivo estéril
- Placas estériles
- Contómetro
Equipo
- Mechero Bunsen
- Estufa de incubación a 37ºC
- Microscopio
- Espectrofotómetro
V. METODOLOGIA
5.1. CRECIMIENTO EN MEDIO LÍQUIDO
Curva de Crecimiento.- Las células que están creciendo en un

cultivo discontinuo (en un matraz en agitación) normalmente
experimentan cuatro diferentes estadios de crecimiento: una fase de
latencia (lag), una fase de crecimiento estacionado, y una fase de
muerte. Las células en fase de latencia, que proceden de una alícuota
de un cultivo anterior que ha sido transferida a un medio nuevo, no
crecen en seguida.
Primero tienen que adaptarse al nuevo medio antes de comenzar a

crecer a un ritmo rápido. La duración de esta fase de latencia depende
de numerosos factores: la edad y genotipo del inóculo, de la
temperatura, de la concentración en nutrientes del cultivo viejo y
nuevo, de la aireación, y de la concentración de toxinas que pueden
haberse formado en el cultivo viejo.
Una vez que las células empiezan a crecer rápidamente, se dice que
han entrado en la fase de crecimiento logarítmica (log) o exponencial.
En este estadio las células crecen rápidamente, y a diferencia de las
células de las fases de latencia y estacionaria, la mayoría de las
células se hallan en el mismo estado fisiológico. La velocidad de
crecimiento durante la fase log depende del nivel de nutrientes y de la
aireación de cultivo. La constante de velocidad de crecimiento (u) sirve
para definir la velocidad de crecimiento de un cultivo durante un
crecimiento equilibrado: u = In2/g (g es el tiempo medio de
duplicación o tiempo de generación).
Conforme se consumen los nutrientes en un crecimiento discontinuo y

se van acumulando productos inhibitorios, la velocidad de crecimiento
va disminuyendo, hasta llegar a detenerse al llegar el cultivo a la fase
estacionaria. En la fase estacionaria las células no están todas en el
mismo estado fisiológico; algunas todavía se están dividiendo mientras
que otras ya han comenzado a morirse. Pero la población total se
mantiene constante. Conforme se agota la mayor parte de los
nutrientes, el número de células que mueren sobrepasa al número de
células que se producen, y el cultivo entra en la fase de muerte.
Realización (Fig. 1)
(Todas las maniobras que se describen a continuación se deben
realizar en condiciones de esterilidad en las proximidades del
mechero.)
1.Añadir solución salina estéril al slant de E. coli hasta cubrirlo
completamente (entre 2 y 3 mi) y resuspender las bacterias en la
solución salina por agitación.
2. Tomar 0.5 ml de la suspensión bacteriana con una pipeta
estéril y añadirlos a un matraz con 50 mi de CN estéril.
3. Incubar el matraz en un baño termostatado a 37 ºC, con
agitación (200 rpm).
4. Medir la absorbancia del cultivo a distintos tiempos
(longitud de onda aconsejada: (540 nm). Ajustar el
espectrofotómetro a 100 % de transmitancia con un tubo
conteniendo CN estéril antes de cada medida.
5.Recoger alícuotas de 4 ml del cultivo a los tiempos de 0-2-4-6-8-10-
12-14-16-18-20-22-24 hrs de incubación y colocadas en refrigeración
hasta su lectura
6. Dibujar una curva de multiplicación con los datos obtenidos,
colocando en el eje de abscisas los valores de tiempo y en el de
ordenadas los de absorbancia.
Cuestionario:
1. ¿Por qué se calibra el espectrofotometro a 100% de transmitancia
con medio de cultivo estéril?
2. ¿Por qué motivo puede ser de alguna forma útil conocer la curva de
multiplicación de una bacteria?
3. Identificar en la grafica las fases del desarrollo microbiano.
PRACTICA9
AISLAMIENTO DE BACTERIAS POR EL MÉTODO DE DILUCIÓN EN PLACA
OBJETIVOS
Aprender la técnica de dilución para el aislamiento y cuenta en placa de diferentes
fuentes de inóculo.
INTRODUCCIÓN
Dentro del grupo de recuentos microbianos a base de cultivos con formación de
colonias, la técnica por vaciado en placa es la mas utilizada. La muestra en
cantidades conocidas se deposita en cajas petri estériles, se adiciona el medio de
cultivo fundido a una temperatura de 45°C y se mezcla con la muestra.
Después de la incubación se cuentan las colonias desarrolladas las que multiplicadas
por el inverso de la dilución que corresponda permite estimar el número de
microorganismos viable por gramo o mL de muestra, obviamente con las condiciones
de prueba (medio de cultivo, condiciones fisicoquímicas y tipo de colonias contadas),
el recuento obtenido se referirá a determinado grupo de microorganismos. Esta
técnica permite la mayoría de las veces cuantificar la contaminación en alimentos,
medicamentos.
MATERIAL REACTIVOS
Tubos de rosca, Cloruro de sodio, Gradilla Agar nutritivo, Mechero, Juegos de tinción
de Gram, Cajas petri, Pipetas de 1 y 10 ml, Cilindro para esterilizar pipetas,
Parrilla, Agitadores magnéticos, 1 probeta de 100 ml, Vaso de precipitados 1000 ml,
Matraz erlenmeyer de 2000 ml, Balanza analítica, Microscopio de luz, Portaobjetos,
Cubreobjetos, Gasa, Algodón, Papel de estraza, Cuenta colonias.
Material que deben traer los alumnos: muestras (agua residual, bebidas refrescantes,
yogurt), franela, masking-tape, algodón, gasa, alcohol.
METODOLOGÍA
1.- Preparación de reactivos y medio de cultivo:

a) Solución isotónica: Pesar 0.09 g de NaCl y disolviendo en 100 ml de agua destilada
b) Agar nutritivo: Preparar 200 ml de medio siguiendo las indicaciones del reactivo.
2.- Envolver cajas de petri y pipetas.
3.- Colocar en un tubo de rosca 9 ml y en el resto 9.9 ml de solución isotónica.
4.- Esterilizar el material, los tubos con solución salina y el medio de cultivo en el
autoclave a 15 lb/plg2, durante 15 minutos.
5.- Hacer frotis y tinción de Gram a la muestra a cultivar.
6.- Bajo condiciones estériles hacer las diluciones en la solución isotónica estéril, de
acuerdo a la figura 1.
7.- Tomar 0.1 ml de la dilución 10-3 y colocar en dos cajas de petri bajo condiciones
estériles. Inocular de la misma manera con las diluciones siguientes
8.- Se realizará el conteo en placa por superficie.
9- Incubar las cajas en forma invertida a 30°C, de 24 a 48 horas.
10.- Considerar las siguientes reglas para la realización del reporte de la práctica:
Reglas para conteo en placa. Seleccionar aquellas placas donde aparezcan de 30 a
300 colonias, pues hay menor error en el conteo.
Contar todas las colonias de la placa. Si el número se estima mayor de 300 y no hay
diluciones subsecuentes: 301-500 colonias se divide en dos partes y el número de
colonias contadas se multiplica por 2.
501-800 colonias se divide en cuatro partes y el número de colonias contadas se
multiplica por 4.
>800 colonias se cuentan de 10 a 20 cuadros se promedia y se multiplica por el
número de cuadros que ocupa la caja.
El número de colonias contadas deberá ser multiplicada por el inverso de la dilución y
considerar si la técnica fue por vertido o por superficie (debido al volumen de la
muestra).
Redondear la cifra obtenida en el recuento de tal forma que haya dos dígitos al inicio
de la cifra por ejemplo: 129 se reporta 130, 2,417 se reporta 2400, 49 se reporta 49
Fig. 1
RESULTADOS
Reportar el número de unidades formadoras de colonia/ml de muestra de TODOS
LOS EQUIPOS en una tabla con los resultados de todos los equipos y discutir.
Presentar descripción de morfología de colonias y microscópica.
CUESTIONARIO
1. Indique la importancia de utilizar el método de dilución para el aislamiento de
microorganismos.
2. Comparar el método de dilución con el de estría para el aislamiento de
microorganismos.
3. Porque el número de microorganismos es el resultado de multiplicar el número de
colonias por el inverso de la dilución.
4. De los datos obtenidos en la práctica cuales cree que sean congruentes y cuales no
y porque
PRÁCTICA10
AISLAMIENTO Y CULTIVO DEL RHIZOBIUM
V. OBJETIVO
- Obtener nódulos de Rhizobium de raíces de alfalfa.
- Observación microscópica de bacterias de Rhizobium
VI. FUNDAMENTO TEÓRICO

La producción agrícola basada en leguminosas es fundamental para la
alimentación humana, especialmente si es en equilibrio con el ambiente. Por ello
la interacción natural de estas plantas con una bacteria del suelo a nivel de la
raíz, es ecológicamente importante, como medida para evitar el uso excesivo de
fertilizantes nitrogenados que deterioran el suelo y contaminan el ambiente.
La fijación biológica del N2, solo se observa cuando la bacteria reconoce a su

hospedero, lo infecta a través de los pelos radicales para que en la matriz de las
células corticales induzca una meiosis y mitosis acelerada que da lugar a un
tejido hipetrofiado: El nódulo en el sistema radical de la leguminosa para
entonces Rhizobium ha perdido su pared celular y se ha transformado en un
bacteroide, mientras que por la enzima llamada nitrogenasa fija el N2 y lo
convierte en amonio, que luego transfiere al ribosoma vegetal para la síntesis de
proteínas vegetales; simultáneamente por la fotosíntesis la leguminosa reduce el
C02 en carbohidratos que servirán como fuente de carbono y energía para
Rhizobium, y con ella al aumentar la reserva de la glucosa mantenerlo activo en
el nódulo hasta cubrir las necesidades de N de la planta.
Por tanto el uso de inoculantes a base de Rhizobium que reducen la aplicación de

fertilizantes químicos al suelo; incrementan el contenido de N en el cultivo
vegetal, su peso seco y mantienen el rendimiento en las leguminosas, lo que en
consecuencia al bajar su costo de producción y la contaminación de mantos
acuíferos y suelos, es vital para una agricultura sustentable.
GRUPOS DE INOCULACIÓN CRUZADA Y ASOCIACIONES

DE Rhizobium – LEGUMINOSA
Especies de
Grupo de Género Leguminosa
Inoculación Rhizobium hospedero incluida
cruzada
R. meliloti Medicago Alfalfa
Grupo de alfalfa
Melilotus Trebol dulce
Trigonella Alholva
R. Trifolium Trébol
Grupo del trébol
leguminosarum
biovar trifolii
VII. MATERIALES Y REACTIVOS
Material Biológico
- Raíces de alfalfa con nódulos
Matraces
- Placa Petri
- Pinzas bisturí
- Mecheros
- Vasos PP 100 ml
Reactivos
- Agua destilada estéril
- Hipoclorito de sodio 2.5%
- Bicloruro de Mercurio 0.2%
- Medio PSA (papa sacarsa agar)
VIII.METODOLOGÍA
1. Preparación del Medio PSA
Sancochar 125 gr de papa pelada con 250 ml de agua destilada, hasta que las
papas estén cocidas.
Filtrar la solución de cocción y a 100 ml de volumen adicionar 3 gr de
sacarosa y 1.2 g agar – agar autoclave 120ºC 15? Y proceder a plaquear
2. Observación Microscopia de Bacterias de
Rhizobium
- Obtener los nódulos de Rhizobium de las raíces de alfalfa.
- Caracterizar los nódulos según posición en las raíces, color, forma, tamaño.
- Lavar con agua destilada los nódulos y realizar disección del nódulo sobre un
porta objeto y dejar caer el líquido interno para realizar un frotis.
- Fijar el frotis de Rhizobium.
- Realizar coloración Gram
- Observación en el microscopio a 100X
3. Cultivo de Rhizobium en Medio PSA
Esterilización de nódulos
- Disponer los nódulos en un matraz de 100 ml
- Lavar con etanol 70%, 1 minuto, decantar.
- Lavar en hipoclorito de sodio al 2.5% de 5 – 8 minutos, decantar
- Lavar con agua destilada estéril 3 veces
- Realizar la disección del nódulo con la ayuda de pinzas y bisturí sobre papel
estéril.
- Dejar caer el líquido interno del nódulo seccionado apretando con la pinza o
pasar sobre la superficie del medio.
- Tapar la placa y llevarla a incubar a 26 – 27ºC en estufa, 5 días.
CUESTIONARIO
- Qué otros medios se utilizarían para el cultivo de Rhizobium.
- Cuál es la ruta metabólica que utiliza el Rhizobium.
- Cuál sería la importancia industrial del aislamiento y cultivo de Rhizobium.
Abono de poliuretano
(NC&T) Geoff Robson y su equipo de la Facultad de Ciencias Biológicas han descubierto que ciertos hongos pueden
degradar el plástico en la tierra. Además, la velocidad de la degradación aumenta cuando lo hace el volumen de
estos hongos o se agregan nutrientes a la tierra para estimular la actividad de los mismos.
Ahora están efectuando estudios para asegurarse de que la degradación

de los poliuretanos no afecte adversamente al proceso de compostaje o a
sus productos.
Éste es un hallazgo importante. Los poliuretanos se usan para fabricar muchos productos y ocupan un gran volumen
en los terrenos usados como basureros, quedándose estos rápidamente sin espacio. Debido a ello, los poliuretanos
resultan un gran contaminante medioambiental.
Este estudio abre la posibilidad de que los hongos puedan utilizarse para degradar estos materiales en lugar de
arrojarlos a los vertederos.
Recomienda esta página
- Ahora el equipo está investigando cuál sería el mejor modo de
aplicar sus hallazgos al manejo de la basura de poliuretano. Un
posible método sería rociarlo con los hongos.
El objetivo final es obtener compost a un costo razonable

empleando el poliuretano, junto con otros materiales, y usando los
medios ya existentes.
Nuevo modo de generar electricidad

(NC&T) De un modo parecido a como las olas arrastran pequeños objetos flotantes en el mar hasta depositarlos en la
playa, una ola térmica (un pulso móvil de calor) viajando a lo largo de un cable microscópico puede impulsar a los
electrones a través de éste, creando así una corriente eléctrica.
El ingrediente principal en esta singular receta son los nanotubos de

carbono. Estos tubos, de sólo unos nanómetros de diámetro, forman parte
de una familia de nuevas moléculas de carbono, que incluye a las buckybolas y a las láminas de grafeno, con
muchas y asombrosas aplicaciones potenciales.
El equipo de Michael Strano y Wonjoon Choi del MIT, ha logrado que su sistema suministre una cantidad de energía
que, en proporción a su peso, es aproximadamente 100 veces mayor que la de una pila de ión-litio de peso
equivalente.
La cantidad de energía liberada es mucho mayor que la predicha por los cálculos termoeléctricos. Si bien muchos
materiales semiconductores pueden producir un potencial eléctrico cuando se calientan, ese efecto es muy débil en el
carbono. Hay por tanto algo más actuando tras ese singular fenómeno.
- Una posible aplicación práctica del fenómeno sería permitir la Recomienda esta página
creación de nuevos tipos de aparatos electrónicos
extremadamente pequeños (por ejemplo, del tamaño de un grano
de arroz), entre los que podrían figurar dispositivos para
tratamiento médico inyectables en el cuerpo, sensores fijos, e
incluso sensores móviles esparcibles como el polvo en el aire.
Aunque los nanocables son diminutos, se podría agruparlos en conjuntos numerosos para así posibilitar el
suministro de cantidades significativas de energía para aparatos más grandes.
-

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Guía de Prácticas: Microbiología Industrial

MATERIAL DE LABORATORIO, ACONDICIONAMIENTO Y

1) Dar a conocer al estudiante las técnicas para el acondicionamiento y

2) Ejecutar con habilidad y destreza el acondicionamiento de materiales para el

3) Justificar la importancia de los métodos de esterilización para el control

II. MARCO TEÓRICO

El acondicionamiento de los materiales así como la esterilización de los mismos es

2.1.- METODOS DE ESTERILIZACION POR CALOR

El calor actúa desnaturalizando y coagulando las proteínas.

2.1.1.- ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO

Se requiere temperaturas elevadas y un periodo más prolongado de

En ausencia de agua, disminuye el número de grupos polares de la cadena

Se emplea el horno o estufa de esterilización, en la que se aplica una temperatura

a) Flameo o Llama Directa. Consiste en exponer los materiales a

b) Aire Caliente. Para ello se utiliza un horno bacteriológico u horno

El calor produce tambien una pérdida de la integridad funcional de la membrana y

a) Por Ebullición. Se coloca el material a esterilizar en agua hirviendo

b) Vapor de agua sin Presión. Se coloca el material a esterilizar a la

c) Vapor de agua con Presión. Se realiza en un autoclave a 15 libras de

c.1) Autoclave: es un equipo construido en acero inoxidable, de forma cilíndrica,

♠ Caldera de material resistente, fondo cóncavo cubierta de una

2.3 ESTERILIZACIÓN POR FILTRACIÓN

Consiste en hacer pasar las sustancias líquidas o gaseosas a esterilizar a través

2.4 ESTERILIZACIÓN POR RADIACIÓN ULTRAVIOLETA

Poseen efectos letales y mutagénicos en las bacterias presentando su mayor

III. MATERIALES Y EQUIPO

♠ Material de vidrio: pipetas, palcas petri

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

4.1 PREPARACIÓN DE MATERIAL A ESTERILIZAR

a)Preparación de tubos matraces

♠ Los tubos, matraces y frascos antes de su esterilización deben

b)Preparación para proteger las pipetas

4.2 ESTERILIZACIÓN CON CALOR SECO

El procedimiento de esterilización por aire caliente sólo se puede emplear con

a)Procedimiento para la esterilización en horno

4.3 ESTERILIZACIÓN CON CALOR HÚMEDO

a)Procedimiento para la esterilización con autoclave

5.1. ¿Qué método de esterilización utilizó en la práctica, cite algunos ejemplos?.

1) Identificar cada una de las partes del microscopio óptico, conocer su

II.- MARCO TEORICO

2.1.- PARTES DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

2. Parte óptica del Microscopio:

2.2.- USO DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

2.3.- AUMENTOS DEL MICROSCOPIO Y CALCULO APROXIMADO DE

Diámetro del campo microscópico

2.4.- CUIDADOS DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

2.5.- OBSERVACIÓN “IN VIVO” DE ORGANISMOS UNICELULARES

2.6.- EXAMEN EN FRESCO DE MICROORGANISMOS

Hay 2 tipos de técnicas:

II. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

EXAMEN DE MICROORGANISMOS VIVOS

ii. ¿Qué ventaja presenta una preparación gota pendiente?

iii. ¿Realice un dibujo del microscopio y señale sus partes?

iv. ¿A qué se denomina campo óptico?

v. ¿Qué es el sistema parafocal?

PREPARACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO: TINCIÓN GRAM

II.- MARCO TEORICO

2.1.- COLORACIONES DIFERENCIALES

GRAMPOSITIVAS. La pared celular de las Grampositivas está constituida

GRAMNEGATIVAS. Presentan 3 capas de envoltura distintas, dispuestas de

2.2.- COLORACIONES VITALES

2.3.- PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS

Los pasos a seguir para la realización de una preparación fijada y coloreada

a. Confección del Frotis. Puede prepararse a partir de productos líquidos o