Introducción

1.1. DAÑOS EN EL ADN Y SISTEMAS DE REPARACIÓN

Ya que los procesos implicados en la integración de ADN extraño son básicamente

idénticos a aquellos responsables de la reparación de las roturas de tipo DSB, un mayor
conocimiento del proceso de recombinación desencadenado por la rotura en el ADN sería
la base para mejorar la eficiencia de gene targeting en plantas.

La recombinación homóloga es la principal vía de reparación de roturas en la

doble cadena del ADN en levaduras y procariotas, a diferencia de lo que ocurre en
eucariotas superiores en los que es el mecanismo de NHEJ el que predomina en la
reparación de estas lesiones. Esto tiene un gran impacto en la mejora genética de plantas
cultivadas, ya que el mecanismo predominante para la reparación de DSBs es también el
usado para la integración del ADN foráneo.

1.1.1. ROTURAS DE DOBLE CADENA DEL ADN (DSBs)

El genoma de cualquier organismo está expuesto a una amplia variedad de agentes

causantes de estrés genotóxico, tanto agentes endógenos (intracelulares) como
ambientales. Las consecuencias biológicas que pueden tener estos agentes sobre el
genoma van a depender de la naturaleza química de la alteración y, en último caso, la
toxicidad o mutagénesis del daño va a depender de la eficiencia de los mecanismos
celulares implicados en la detección, el reconocimiento y la eliminación de este daño, y
de su precisión a la hora de reparar las lesiones.

Las roturas en la doble cadena de ADN están entre las formas más citotóxicas de
daño del ADN, y pueden dar lugar a aberraciones cromosómicas e inestabilidad del
genoma. Aunque estas roturas pueden originarse en un genoma por distintas causas como
la radiación ionizante o diferentes agentes químicos, la principal causa de la aparición de
DSBs en una célula suele ser la proliferación de errores durante la replicación del ADN,
ya que este proceso puede convertir una rotura de cadena simple en una DSB. La
reparación errónea o la ausencia de reparación pueden llevar a graves alteraciones en el

3
 Introducción

genoma, con lo que la adecuada reparación de éstas es fundamental para el

mantenimiento de la integridad del genoma.

1.1.2. MECANISMOS DE REPARACIÓN DE DSBs EN EL

ADN

Las roturas de tipo DSB en el ADN pueden ser reparadas fundamentalmente a través de
dos mecanismos: mediante recombinación homóloga (HR), o mediante recombinación
ilegítima (NHEJ).

La reparación mediante recombinación homóloga requiere grandes tramos de

secuencias homólogas, que serán empleados como molde para la reparación del daño. En
el mecanismo de reparación mediante NHEJ se unen los extremos de ADN originados
tras la rotura, los cuales tienen muy poca o ninguna homología, de forma no conservativa,
y en algunos casos perdiendo información genética. Por ello, el mecanismo de NHEJ
debe ser regulado con precisión para mantener la integridad del genoma.

Aunque frecuentemente se refiere a las vías de NHEJ y HR como propensa al

error y libre de errores, respectivamente, esto no deja de ser una simplificación. Las
roturas “limpias” con extremos complementarios pueden ser reparadas mediante NHEJ
perfectamente, de hecho en mamíferos más del 50% de las DSBs producidas por
nucleasas son reparadas mediante NHEJ sin introducir errores en la secuencia. En otros
casos, se emplean microhomologías que suponen pequeñas deleciones o inserciones. En
el caso de reparación mediante HR, si el molde empleado en la reparación es
completamente homólogo, la precisión suele ser del 100%. Sin embargo, con excepción
de las cromátidas hermanas, el resto de moldes no son perfectamente homólogos,
produciéndose en muchos casos procesos de conversión génica (Shrivastav y col., 2008).

1.1.2.1.Recombinación Homóloga

Existen tres modelos de recombinación homóloga, los cuales están basados en gran
medida en los estudios llevados a cabo en levaduras (Bray y West, 2005; Britt y May,
2005; Puchta, 2005).

8
 Introducción

Modelo DSBR (Double-Strand Break Repair)

Este es el modelo que explica la recombinación meiótica. El proceso se inicia con una
rotura en el ADN de tipo DSB y supone la formación de uniones Holliday como
intermediarios, produciendo cruzamientos entre cromosomas homólogos alineados, más
que entre cromátidas hermanas.

En meiosis, las DSBs en el ADN se producen por la proteína SPO11, y estas

roturas son reparadas únicamente mediante la vía de recombinación homóloga, usando la
secuencia del cromosoma homólogo. SPO11 se une covalentemente a los extremos 5’ del
ADN, de manera que el siguiente paso es la formación de una mella en el ADN próxima
al lugar de la rotura, con la consiguiente liberación de la proteína SPO11 junto con unos
pocos nucleótidos. Para llevar a cabo esta liberación se requiere la acción, entre otras, de
las proteínas MRE11 y RAD50, integrantes del complejo MRN. Tras el corte en el ADN
y la liberación de SPO11, se generan colas de ADN de cadena sencilla de extremo 3’,
proceso que está mediado por una nucleasa aún no identificada, y también se ha
implicado aquí al complejo MRN. Estas colas son cubiertas por la proteína RPA
(Replication Protein A) y por RAD51, la cual forma unos filamentos que promueven la
búsqueda de zonas de homología y la invasión de la hebra (Figura 1.3). Tras la síntesis
del ADN empleando como molde esta región homóloga, la cadena invasora es liberada y
se liga con el otro extremo de la rotura, resultando en la formación de una molécula unida
a través de dos uniones Holliday (Figura 1.4).

3
 Introducción

Figura 1.4 La unión Holliday, se produce

Figura 1.3 Esquema del modelo DSBR que explica
el mecanismo de recombinación en meiosis.
cuando dos moléculas duplexas de ADN
implicadas en la recombinación se
intercambian en una región de homología
para dar lugar a una estructura
ramificada que tiene cuatro brazos
duplexos. Dependiendo de la orientación
del corte, las uniones Holliday se pueden
resolver por conversión génica, donde las
dos moléculas de ADN mantienen sus
secuencias flanqueantes, o por
sobrecruzamiento, donde estas secuencias
se intercambian.

Aunque estos intercambios son necesarios para la correcta segregación de los

cromosomas homólogos durante la meiosis, podrían ser peligrosos durante la reparación
de DSB en células somáticas, si se produce entre cromosomas o cromatidios no alineados,
o entre secuencias repetidas dispersas, pudiendo generarse deleciones, duplicaciones o
translocaciones.

Modelo SDSA (Synthesis-Dependent Strand Annealing)

Este modelo de reparación juega un papel importante en la reparación de las roturas de
tipo DSB en células somáticas, pudiendo usar como sustrato para la recombinación una
cromátida hermana, cromosomas homólogos, o una región ectópica de homología en el
genoma.

8
 Introducción

Igual que en el modelo anterior, la reparación es iniciada por una digestión del
extremo 5’ formando una larga cola de ADN de cadena sencilla 3’, que invade un dúplex
homólogo y ceba la síntesis de ADN (Figura 1.5A). En contraste con el modelo DSBR, el
ADN sintetizado de nuevo se re-alinea con la otra parte de la rotura, reparando la rotura y
reduciendo la probabilidad de formación de uniones Holliday y de sobrecruzamientos, los
cuales podrían ser altamente mutagenéticos si esta reparación ocurre entre regiones
ectópicas con menor homología. No obstante, la formación de uniones Holliday puede
ocurrir durante la reparación SDSA, y los sobrecruzamientos podrían no ser mutagénicos
si se restringen a cromátidas hermanas.

Figura 1.5 Vías de reparación de DSBs en células somáticas. La HR es iniciada por una digestión
del extremo 5’, formando largas colas 3’ las cuales son cubiertas por la proteína RPA. (A) En el
modelo de SDSA la formación de filamentos de RAD51 promueve la búsqueda de homología y la
invasión de la hebra, pudiendo formarse uniones Holliday. (B) En el modelo SSA se toma como
molde para la reparación repeticiones homólogas próximas al lugar de la rotura, con pérdida de
la información situada entre estas repeticiones.

3
 Introducción

Ambos mecanismos de recombinación homóloga, SDSA y DSBR, pueden operar

en células somáticas y meióticas, aunque la frecuencia relativa será diferente en los
distintos tipos celulares, predominando la vía de DSBR en células meióticas, mientras que
en células somáticas opera en mayor medida como mecanismo de reparación la vía SDSA
(Bray y West, 2005).

Modelo SSA (Single-Strand Annealing)

Este tercer mecanismo de recombinación homóloga funciona cuando se producen roturas
de tipo DSB en regiones con secuencias repetidas. Igual que en los modelos anteriores,
una exonucleasa con actividad 5’→ 3’ actúa formando colas simplexas 3’, que en este
caso se alinean con las regiones homólogas proporcionadas por las secuencias repetidas.
El modelo SSA describe una reacción no conservativa, ya que da lugar a la pérdida de la
información situada entre las repeticiones alineadas una vez que se repara la rotura
(Figura 1.5B).

Hay evidencias de que estas tres vías de recombinación homóloga están actuando
en plantas, y el convencimiento creciente de que gran parte de la maquinaria molecular es
común entre los diferentes mecanismos de recombinación homóloga (Puchta, 2005;
Schuermann y col., 2005). Las frecuencias de recombinación van a variar enormemente,
dependiendo del origen de las secuencias receptoras y donadoras. En células somáticas de
plantas, la reparación de DSBs en el ADN mediada por recombinación homóloga ocurre
rara vez, aproximadamente en uno de cada 100.000 acontecimientos de reparación. Las
frecuencias son similares, entre 10-5 y 10-7, en la reparación de DSBs cuando se utilizan
secuencias ectópicas homólogas. Esto indica que, al menos en células en fase G 1 del ciclo
celular, la recombinación homóloga juega un papel muy minoritario en la reparación de
estas roturas en plantas (Puchta, 1999). En cualquier caso, en situaciones donde se
encuentran secuencias homólogas disponibles próximas al lugar de rotura, como por
ejemplo si la rotura ocurre entre repeticiones en tándem, hasta una tercera parte de estas
roturas son reparadas vía SSA, y aproximadamente un 7% por SDSA (Orel y col., 2003;
Siebert y Puchta, 2002).