UNIDAD IV

VALORACIÓN DE LA EFECTIVIDAD DE LOS

DESINFECTANTES

OBJETIVO GENERAL
Valorar mediante técnicas adecuadas la efectividad de agentes antimicrobianos.

OBJETIVO ESPECÍFICO
Mediante un reto microbiano, comprobar la efectividad de un antiséptico o desinfectante y de un
conservador

INTRODUCCIÓN
En el control de la contaminación microbiana y la prevención de infecciones, juegan un papel muy
importante los procesos de esterilización y desinfección.

Hay una gran diferencia entre estos procesos, mientras esterilización es un término absoluto,
desinfección no lo es. Esterilización implica la muerte o eliminación total de vida microbiana y
desinfección involucra por lo general, la destrucción de microorganismos pero no de esporas, un
desinfectante no necesariamente mata a todos los microorganismos presentes en la zona en que actúa,
pero si baja la población a niveles que permiten buenas condiciones para evitar infecciones.

La esterilización se realiza principalmente por métodos físicos: calor, filtración o radiación y la

desinfección usualmente relaciona el uso de germicidas químicos en forma líquida y ocasionalmente
gaseosa.

Los agentes germicidas dependiendo de su aplicación, pueden describirse como: desinfectantes,

antisépticos, conservadores, sanitizantes y quimioterapéuticos. Para establecer su uso potencial, se
deben determinar algunos parámetros básicos:

- Espectro antimicrobiano
- Actividad: letal o inhibitoria
- Toxicidad
- Y si causa irritación o sensibilidad
Además de estos parámetros también se consideran otros factores:

- pH del agente y del sistema.

- Materia orgánica (sangre, pus, materia fecal, etc.) presente en el sistema.
- Componentes de la formulación.
- Tamaño del inóculo.
- Estabilidad del agente antimicrobiano a los cambios de pH.
- Resistencia o sensibilidad de los microorganismos.
- Y en el caso de desinfectantes, deben de considerarse, la temperatura y la dilución.

Para obtener una evaluación completa de un agente antimicrobiano deben efectuarse cuidadosamente
una serie de pruebas y el registro de condiciones definidas, estableciendo su uso, esto debe de ser
reevaluada en el laboratorio en su formulación final mediante pruebas específicas.

Todas estas pruebas, tienen un principio común, “La exposición de una población microbiana al agente
antimicrobiano, con la subsecuente determinación de células sobrevivientes al tratamiento” ya sean
bacterias, hongos o virus. En el caso de los virus se realiza mediante el reconocimiento de células
huésped en cultivo de tejidos, en huevos o in vivo en animales.

PROCEDIMIENTO
Material

Por quipo:

1 Matraz nefelométrico estéril.

1 Matraz Erlenmeyer de 250mL estéril.
1 Matraz Erlenmeyer de 250mL con un magneto estéril.
1 Agitador magnético.
6 Tubos de 16 x 150mm con tapón de rosca estériles.
11 Cajas de Petri estériles.
1 Matraz Erlenmeyer con 100mL de solución salina isotónica estéril.
1 Matraz Erlenmeyer con 100mL de solución amortiguadora diluida estéril.
1 Matraz Erlenmeyer con 99mL de solución amortiguadora diluida estéril.
2 Tubos de 16 x 150mm con 7 mL de agar nutritivo inclinado.
1 Tubo de 22 x 175mm con 15mL de agar nutritivo inclinado.
1 Matraz Erlenmeyer con 100mL de agar para cuenta estándar.
4 Tubos de 2 x 175mm con 20mL de agar para cuenta estándar con solución neutralizante.
1 Tubo de 16 x 150mm con 9 mL de solución neutralizante (con tapón de rosca).

Microorganismos prueba:

Staphylococcus aureus ATCC 65382

Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442
Escherichia coli ATCC 11229
Métodos

A. Preparación de los Microorganismos:

a) Para activar el cultivo stock de los microorganismos prueba, efectuar 2 resiembras diarias
consecutivas, e inocular a 35-37°C durante 20-24 horas.
b) A partir de estos cultivos resembrar c/u en un tubo de 22 x 175mm que contenga 15mL de agar
nutritivo inclinado e incubar bajo las mismas condiciones.
c) Recuperar el crecimiento de cada tubo con 3mL de solución salina isotónica estéril, estandarizar
la suspensión, en condiciones asépticas entre 70 y 80% de transparencia (50-75 UK 1 ). La
suspensión así tratada contiene aproximadamente 75 a 125 x 106 UFC 2 /mL (5-8 x 108/mL en la
curva de McFarland).

B. Preparación de la muestra:

a) Diluir el producto a la concentración recomendada.

b) Transferir una alícuota de 99mL de la solución del producto a un matraz Erlenmeyer de 250mL
(por duplicado).
c) Inocular c/u de los matraces preparados en el inciso anterior procediendo como se indica a
continuación:
d) Agitar el matraz, mediante un agitador magnético, y suspender la agitación justamente antes de
la inoculación para que en el momento de la misma, aún exista un movimiento residual del
líquido y así facilitar la incorporación del inóculo.
e) Inocular 1mL de la suspensión del microorganismo entre el centro y el extremo de la superficie
del líquido introduciendo ligeramente la pipeta evitando tocar con la pipeta el cuello o las
paredes del matraz durante la inoculación.
f) Exactamente a los 30 seg transferir 1mL de cultivo expuesto a 9mL de la solución
neutralizante, agitar perfectamente y
g) Transferir alícuotas de 1mL y 0.1mL a cajas de Petri estériles, agregar agar para métodos
estándar con neutralizante, homogeneizar perfectamente y permitir que solidifique el medio,
invertir e incubar las placas durante 48 horas a 35-37°C.

C. Determinación de la Cuenta Inicial:

a) Preparar 2 matraces con 99mL de la solución amortiguadora de fosfatos diluida estéril.

b) Transferir 1mL de la suspensión de microorganismos y efectuar las siguientes diluciones
decimales necesarias para obtener placas que contengan entre 30 y 300 colonias por placa.
c) Colocar 1mL de cada una de las diluciones en cajas de Petri estériles, agregar agar para métodos
estándar, dejar solidificar, invertir e incubar las placas durante 48 horas de 35-37°C.
d) Después del periodo de incubación contar las colonias de las placas, tanto del producto de
prueba como del control.

1
UK = Unodades Klett
2
UFC = Unidades Formadoras de Colonias
 e) Reportar los resultados. Calcular el porcentaje de reducción relacionando el número de
microorganismos inicial y el obtenido después del contacto con el producto.
f) Para que la prueba sea válida el número inicial de microorganismos debe estar entre 75 y 125 x
106 células/mL.
g) El producto debe cumplir con el estándar de efectividad de 99.99% de reducción a los 30 seg de
contacto.

BIBLIOGRAFÍA
- AOAC Methods Desinfectantes pp56-68
- Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos 5ª. Edición, México, 1988, pp201-209.
- United States of América Pharmacopia XXI. Microbiological test. Pp 151-156.
- WB Hugo and AD Russell Pharmaceutical Microbiology 3ª. Edición.
1