Beruflich Dokumente
Kultur Dokumente
-acum
acu 10.000
0.000 de aani - ccreşterea
eş e ea pplantelor
a e o agagricole
co e şşi a aanimalelor
a e o pe
pentruu a obţ
obţinee
mâncare şi haine.
-acum 6.000 de ani - în procesele biologice încep să se utilizeze microorganismele,
pentru diversifica gama de produse alimentare (tipuri diferite de pâine, de brânză), şi
pentru a conserva produsele alimentare pe o perioada mai lungă de timp
-perioada ’60 – ’70 – utilizarea constituientilor celulari în procesele biotehnologice
1. Ce este biotehnologia?
Bi –sugereazăă utilizarea
Bio tili proceselor
l biologice;
bi l i
Tehnologie –sugerează realizarea produşilor prin utilizarea de diferite tehnici
definiţie de ansamblu utilizarea controlată sau deliberată a “agenţilor biologici”
(celule vii sau moarte, sau componente ale acestora) în
cadrul unor operaţii tehnice, sau în cadrul unor procese
tehnologice care duc la obţinerea unui produs finit
d
domeniui larg
l d la
de l totalitatea
li tehnicilor
h i il biologice
bi l i utilizate
ili î agricultură
în i l ă până
â ă la
l
cele utilizate la prepararea mâncării
Federaţia Europeană de Biologie (1978)
Utilizarea integrală a biochimiei,
biochimiei microbiologiei şi ingineriei în scopul
obţinerii unei aplicaţii tehnologice (industriale), cu ajutorul
microorganismelor, culturilor de celule şi a părţilor componente ale
acestora
Exemple:
Exemple:
-biotehnologia fermentaţiei, cum este cunoscută astăzi, îşi are originea în introducerea
pentruu pprimaa oa
pe oarăă în seco
secolul
u aal IX-lea
ea a age
agenţilor
ţ o microbiologici
c ob o og c în aanumite
u ep procese
ocese
de fermentaţie şi nu în descoperirea vinului sau a verzei acre sau în înţelegerea
proceselor biologice care au loc;
-obţinerea de biomasă din noroiuri active, selecţia şi producerea la scară largă a
microorganismului Clostridia pentru obţinerea de acetonă şi butanol
Aplicaţii în în industrie
-producerea de biomasă pentru hrana animalelor;
- a unor compuşi chimici utilizaţi în alimentaţie cum ar fi acidul citric, citric acidul
glutamic, unii aminoacizi, antibiotice şi vitamine;
- în industria petrochimică, poate fi utilizată în obţinerea în cantitate mare a etanolului,
acetonei butanolului,
acetonei, butanolului acidului acetic etc;
-este utilizată în obţinerea de produşi celulari din plante şi animale, obţinerea de celule
microbiene modificate pentru a produce antigene, anticorpi sau agenţi terapeutici
diverşi;
ş;
-furnizează agenţi cheie pentru industria alimentară ca de exemplu culturi de celule şi
enzime care duc la o mai bună înţelegere a proceselor şi tehnicilor specifice acestei
industrii;
- are un rol deosebit în tratarea şi purificarea apelor, şi în volatilizarea substanţelor
reziduale.
Definirea termenului din ce în ce mai greu de realizat
Principalele direcţii
de dezvoltare a
biotehnologiilor
moderne sunt
determinate:
- de
d descoperirile
d i il
recente din domeniul
biologiei moleculare;
- de cerinţele
societăţii faţă de
anumite aspecte cu
care aceasta se
confruntă, cum ar fi:
criza energetică,
epuizarea
p rezervelor
de hrană de pe
planetă, probleme
ecologice şi de
bioremediere.
Figura 1. Principalele aplicaţii ale biotehnologiei
Introducere
Clasificarea diferitelor tipuri de biotehnologii
microbiene
1. în funcţie de tipul de celule cu care se lucrează: vegetale
animale
2. în funcţie de domeniul în care-şi găseşte aplicaţie deosebim următoarele
categorii de biotehnologii:
- industriale, includ obţinerea de produşi farmaceutici, de reactivi de laborator, de
produse alimentare;
- agricole, studiază aspecte privind rezistenţa plantelor la anumiţi factori patogeni
şşi a toleranţei
ţ faţăţ de factorii de mediu defavorabili, implicarea
p în sisteme
simbiotice la diferite specii de plante, multiplicarea speciilor horticole şi
obţinerea de noi hibrizi sexuaţi;
- medical veterinare, se referă în special la nutriţia animală, creşterea rezistenţei
animalelor la atacul agenţilor patogeni, reproducere artificială şi predeterminare
a sexului, conservarea resurselor genetice animale;
- ecologice, sunt incluse toate metodele şi tehnicile de epurare biologică a apelor
uzate
t sau poluate,
l t a aeruluil i sau a solurilor
l il degradate,
d d t extracţia
t ţi de d minereuri
i i cu
ajutorul microorganismelor;
- sănătate publică, crearea unor sisteme de diagnosticare.
Introducere
Rolul cercetării fundamentale
satistica
ssatistic
s ca gglobală
ob în v
viitor
o cea mai
a mare
a e pa
partee a industriei
dus e va u
utilizaa p
procedeele
ocedee e de
fermentaţie, inginerie genetică, biologie moleculară ceea ce
imprimă un salt tehnologic covârşitor
natura interdisciplinară etape
1. manipularea genetică a organismului gazdă
- o genă din ADN animal este clonată într-o celulă a unui microorganism.
- se realizează în laborator de către cercetători specializaţi în domeniul
biologiei moleculare geneticii şi biochimie;
- tehnicile utilizate sunt tehnici specifice de biologie moleculară, biochimie,
culturi de celule;
- cercetarea se derulează până când se obţin tulpini recombinante stabile iar
nivelul de expresie este cel dorit
2.cultivare- în vederea stabilirii parametrilor optimi - compoziţia mediului, pH,
temperatură, concentraţia oxigenului dizolvat
- se porneşte de la cultivarea microorganismului la scară mică, în flacoane
de 250 – 1.000 ml, sub agitare;
- performanţele organismului
organism l i sunt
s nt apreciate prin calcularea
calc larea ratei de
creştere, productivitatea specifică, randamentul de obţinere a produsului
finit.
Introducere
3. eetapa
apa pilot
p o
1. Alegerea
g culturii: selecţia,
ţ , creşterea
ş sau crearea de organisme
g sau p
populaţii
p ţ
celulare
2. Cultivarea celulelor
4. Procesul tehnologic
5. Recuperarea produsului
CARACTERISTICILE MICROORGANISMELOR
DE INTERES BIOTEHNOLOGIC
De ce microorganismele?
- diversitatea acestora este enormă;
- microorganismele
i i l care pot fi utilizate
ili - procariote
i (bacteriile);
(b iil )
- eucariote (drojdiile şi fungi)
Drojdiile
la producerea alcoolului etilic şi a dioxidului de carbon prin fermentaţie se foloseşte specia
Saccharomyces cerevisiae;
pentru obţinerea vinului se folosesc specii de S. cerevisiae, şi ellipsoideus, fie sub formă de
tulpini selecţionate, fie prin fermentaţie spontană realizată cu drojdii epifite;
la fabricarea berii se folosesc cereale germinate ca orzul în Europa, porumbul în America şi
sorgul în Africa. Cele mai utilizate tulpini sunt S. cerevisiae şi S. uvarum care au fost
selecţionate treptat în diferite laboratoare;
la fabricarea pâinii se utilizează S. S cerevisiae,
cerevisiae care în timpul dospirii pâinii produce o
fermentaţie alcoolică cu degajare de dioxid de carbon ce permite afânarea aluatului;
proteinele furajere se obţin prin cultivarea drojdiei pe subproduse industriale (alcani, metanol)
şi reziduuri agricole (zer de lapte, melasă). Adăugate în furajele animalelor, proteinele aduc
un aport de
d aminoacizi.
i i i
Fungiii
Fungi
Materii prime :
subproduse ale industriei alimentare şi reziduuri agricole (zer, melasa de la fabricarea
zahărului din sfecla de zahăr, drojdia de la distilării, paiele etc.);
multe specii saprofite, care se dezvoltă pe resturile organice animale şi vegetale desăvârşind
astfel marele ciclu
cicl biologic natural.
nat ral
Aplicaţii
în industria brânzeturilor fungii au un rol important în înmuierea şi aromatizarea pastei,
tulpinile cele mai utilizate sunt: Penicillium roquofortii (brânză cu pastă verde), verde)
Penicillium camembertii şi Geotrichium candidum (pastă presată);
în industria salamurilor folosirea unui strat alb de Penicillium nalgiovense pe suprafaţa
salamurilor previne dezvoltarea microorganismelor care degradează produsul;
hidroliza amidonului din orez care precede fermentaţia se realizează cu amilaze biosintetice de
Aspergillus oryzae.
în industria chimică şi farmaceutică prin biosinteză se produc:
Enzime – proteaze, amilaze cu tulpini din genul Aspergillus;
acizi organici - acid citric cu Aspergillus niger;
antibiotice - penicilina cu tulpina Penicillium chrysogenum, cefalosporinele cu tulpini din
genul Cephalosporium;
h
hormoni; i
biomasă în scopul obţinerii unei surse complementare de proteine pentru furaje animale.
Bacterii
Bacteriile acetice (Gluconobacter, Acetobacter)
- fabricarea tradiţională a oţetului de vin, cidru, cartofi;
- obţinerea de vitamină C (oxidarea sorbitolului la sorboză)
Bacteriile lactice (Lactobacillus, Lactococus, Treptococcus)
- fermentează produsele lactate (iaurt, brânză dulce). Ele sunt prezente în mod obişnuit - în
lapte şi au rolul de acidifia laptele (transformă lactoza în acid lactic);
- în prepararea brânzeturilor participă la formarea cheagului şi la maturarea lui;
- conferă untului gustul şi aroma specifice, prin producerea de acid diacetic;
- producerea de acid lactic la scară industrială
B
Bacteriile
iil butirice
b i i (Clostridium
(Cl idi butyricum)
b i )
- intervin în înmuierea inului şi a cânepii deoarece distrug pectina şi astfel eliberează
fibrele textile
Genul Bacillus
- Baccilul thuringiensis – în timpul sporulării produce substanţe toxice care sunt toxice
pentru larve;
- producerea de enzime: proteaze termostabile pentru ind. detergenţilor, α-amilaze,
gl co o izomerază
glucozo i omera ă
Actinomicetele
Bacteriile din genul Corynebacterium şi Brevibacterium şi mutantele derivate
Bacteriile metilotrofe cultivate pe metan sau metanol
Propionibacterium
Bacteriile termofile metanogene
Căile de biosinteză a constituienţilor celulari ai microorganismelor
creşterea microbiană
Etape:
Figura 2.
2 Diferenţa dintre metabolismul primar şi secundar: a – creşterea celulelor şi biosinteza
constituienţilor are loc aproape simultan; b- după creşterea celulelor şi eliberarea metabolitului primar acesta
se transformă în metabolit secundar; c- substratul de creştere rămas după finalizarea creşterii celulelor este
transformat în metabolit secundar
Metaboliţii microbieni primari
Procesul microbian tipic în care în timpul fazei de creştere exponenţială (perioada
de lag) se formează un metabolit primar se numeşte fermentaţie alcoolică
Exemplu:
etanolul este metabolitul primar produs în fermentaţia alcoolică aerobă a
drojdiilor sau a unor bacterii în acelaşi timp reprezentând şi un metabolit
energetic
Metaboliţii care se formează în timpul fazei staţionare (de creştere sau trofofaza) sau
la finalul acesteia se numesc metaboliţi secundari
Caracteristici:
Etape de obţinere:
Figura 4. Relaţia
dintre calea
metabolică de
obţinere a
aminoacizilor şi a
unor acizi
organici
i i şii
formarea unor
antibiotice cu
nucleu aromatic
Biosinteza şi creşterea
Figura 5. Prezentarea sintetică a principalelor căi anabolice şi catabolice. Sunt prezentate într-o
versiune simplificată numai căile majore de biosinteză şi conexiunile acestora cu căile catabolice
Controlul metabolismului
Necesarul de nutrienţi
Majoritatea nutrienţilor, cu excepţia oxigenului şi a câtorva surse de carbon, sunt
preluate din mediul de cultură prin sisteme de transport specifice. Aceste procese
pot fi controlate deoarece o dată ce celula şi-a luat nutrientul în cantitatea necesară
restull de
d nutrient
i poate fi îndepărtat
î d ă sau direcţionat
di i pe o altă
l ă cale
l astfel
f l încât
î â săă nu
fie în detrimentul celulei. Aceste sisteme de transport active necesită un aport de
energie.
Compartimentarea
reprezintă a doua formă de control metabolic
exemple:
- mitocondria celulelor eucariote care separă reacţiile ciclului acizilor tricarboxilici de
alte reacţii din citoplasmă;
- în
î peroxizomi
i i se găsesc
ă enzime
i care degradează
d d ă acizii
i ii graşii şii care suntt separate
t de
d
enzimele din citoplasmă care determină sinteza acizilor graşi. Separarea celor două
seturi de enzime previne reciclarea oricărui intermediar comun;
- alte organite (vacuole,
(vacuole nucleu,
nucleu cloroplaste etc.)
etc ) controlează în mod similar alte
reacţii care au loc în celulă.
Figura 6. β-Oxidarea acizilor graşi
Controlul sintezei enzimatice
Multe dintre enzime sunt prezente în celulă indiferent de condiţiile de creştere ale
acesteia.
t i O parte t din
di enzime
i „apar”” atunci
t i când
â d este
t necesar cum ar fi de
d exemplu l
izocitrat liaza din şuntul glioxilatului care apare numai atunci când celulele sunt
crescute pe un substrat C2. Acest proces este denumit „inducerea” sintezei enzimei.
hexadec Saccharomycopsis
an (Candida) lipolytica 203 1,06
Acinetobacter sp 251 1,31
Randamentul de creştere a celulelor depinde de următorii factori:
factori:
Pe măsură ce celulele cresc ele se adaptează noilor condiţii de creştere şi-şi modulează
activitatea în funcţie
ţ de condiţiile
ţ de mediu.
• ppregătirea
g mediului • biosinteza • separarea produsului
de cultură, propriu-zisă principal,
• sterilizarea utilajelor, • monitorizarea • concentrarea,
• sterilizarea aerului parametrilor • pregătirea pentru
introducerea pe piaţă
Modelul similitudinii
Etapa pilot Etapa industrială
Criterii
C i ii care permiti calcularea
l l mărimilor
i il fizice
fi i alel sistemului
i l i
la scară mare, pe baza rezultatelor obţinute în etapa pilot
- tipul
p de organism;
g ;
În funcţie de: - sistemul de cultivare;
Alegerea bioreactorului
- caracteristicile biochimice ale
întregului proces
Sisteme de cultivare a microorganismelor
2 sisteme majore: - sistem submers
- cu
culturi
u de sup
suprafaţă ţ
În sistem submers
mediul de cultură este lichid, agitat şi aerat
alimentarea cu energie se realizează continuu în scopul menţinerii
i t f ţ i gaz – lichid
interfaţei li hid
trei moduri de operare: discontinuu,
semicontinuu şi
continuu
Operarea în sistem discontinuu
Cultivarea - în şarje (sistemul batch);
începep la t = 0 şşi se termină la t = t’;
la început, creşterea celulelor are loc în condiţii nelimitate; în timp se atinge
densitatea maximă; începe creşterea în condiţii limitate de substrat şi acumularea
produsului final.
se notează DC şi este reprezentată
grafic astfel:
Figura 10. Reprezentarea schematică a bioreactoarelor tip R (cu recirculare) şi tip D (cu
deplasare)
Sisteme de cultivare a microorganismelor
Culturi de suprafaţă
Clasificare:
Figura 13.
13 Bioreactoare
cu agitare mecanică cu
barbotare cu aer (prin
axul agitatorului sau
separat).
(a,b) cu
barbotare prin axul
agitatorului; (c) cu
barbotator separat cu
agitare pe sus; (d) cu tub
de aspiraţie a aerului.
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Figura 14.
Bioreactor cu Figura 15. Bioreactor cu pompă de recirculare a fazei lichide.
agitare la mai (a) cu recirculare externă; (b) cu buclă de recirculare; (c) cu
multe nivele recirculare cu jet; (d) cu recirculare internă, inversată
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Figura 16.
Bioreactoare cu aer
comprimat (a)
comprimat.
bioreactor tip
coloană cu bule; (b)
bioreactor tip turn cu
site
i perforate;
f (c)
( )
bioreactor tip „air –
lift”; (d) bioreactor
tipp “air lift” cu
coloană cu bule
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Figura 18.
Alte tipuri
constructive de
bioreactoare.
bioreactoare
(a) cu film
lichid; (b)
pentru culturi
de suprafaţă
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Bioreactoare
Bioreactoare cu agitare mecanică
Figura 20.
20 Tipurile de
rotoare utilizate la
realizarea agitatoarelor
pentru amestecarea
mediului de cultură din
bioreactor. (a) ancoră,
(b) elice, (c) turbină cu
palete plane,
plane (d) cu
palete tip zbatură, (e)
ancoră complexă, (f)
şurub elicoidal
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Caracteristicile
Ca acte isticile bioreactorului:
bio eacto ului:
- celule
l l libere
lib sau imobilizate
i bili t şii
- reacţii enzimatice cu enzime libere sau imobilizate
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Bioreactoare cu agitare mecanică
Bioreactoare
şi cu draft interior
Figura
g 23. Circulaţia
ţ lichidului într-un
bioreactor cu draft. (a) complet imersat în
lichidul de cultură, (b) cu revărsare
(adaptat după Keitel, 1978)
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Bioreactoare
Bioreactoare cu aer comprimat
Bioreactoare tip „coloană cu bule”.
variantă
i ă a bioreactoarelor
bi l cu agitare
i mecanică
i ă
Sistem
Si t omogen - bulele
b l l urcăă cu aceeaşii
viteză şi nu se amestecă între ele, iar
agitarea lichidului este limitată,
Bioreactoare
Bioreac toare “air lift”
două tuburi flexibile care sunt fixate în interiorul bioreactorului de oţel, de fund şi
de capac
capac. Tubul mare
mare, care formează peretele fermentatorului
fermentatorului, este confecţionat din
folie de poliamidă cu o grosime a porilor de 80µm, în timp ce tubul mic formează
un cilindru în interiorul bioreactorului. Tubul mic este o membrană de dializă a
căror pori au dimensiunea de 20µm. Bioreactorul este echipat cu două unităţi de
agitare cu motoare separate ceea ce face ca turaţia motorului să poată fi controlată
separat.
p Aeraţia
ţ se ppoate realiza în ambele incinte în acelaşi
ş timp.
p Fermentatorul
poate fi sterilizat in situ ca un fermentator obişnuit, la 1210C, în timpul sterilizării
pereţii din folie de poiamidă putând fi protejaţi de o manta din cilindri de oţel.
Bioreactoare
Bioreactoare cu membrană
membrană de dializă
În industrie s-au construit bioreactoare cu mai multe tăvi, aşezate una deasupra
celeilalte, astfel încât sterilizarea şi inocularea să poată fi efectuate automat. În
interior se introduce aer steril. Bioreactorul este exploatat în regim discontinuu.
Figura 30.
30 Bioreactor cu
tăvi, sterilizabil, cu
răcire, cu alimentare prin
partea superioară
Bioreactoare
Bioreactoare tip coloană cu umplutură
O coloană verticală, umplută cu granule de biocatalizator sau cu biocatalizator
imobilizat.
Alimentarea cu mediu se face prin partea de sus - se formează o fază de lichid
continuă printre particule. Datorită frecării particulelor, deteriorarea celulelor, este
minimă
i i ă comparativi cu bioreactoarele
bi l cu agitare.
i
Transferul de masă dintre faza lichidă şi catalizatorul solid se realizează relativ uşor
dacă viteza de trecere a acestuia prin coloană este mare, iar pentru a fi îmbunătăţit
mediul lichid este recirculat.
recirculat
Aerarea mediului este bine să fie realizată separat. Dacă aerul este barbotat direct se
produce coalescenţa bulelor, apar canale prin umplutură şi distribuţia nu este
uniformă Din acelaşi motiv,
uniformă. motiv bioreactoarele cu umplutură nu sunt potrivite pentru
bioprocesele din care rezultă CO2 sau alte gaze. De obicei, aerul circulă în
contracurent cu lichidul pentru a intensifica înlăturarea căldurii degajate în timpul
fermentaţiei
ţ sau a reacţiei
ţ enzimatice.
Figura 32.
Bioreactor în pat
fluidizat
Bioreactoare
Bioreactoare cu strat fix
R
Reactivitatea
i i preparatelor
l imobilizate
i bili este influenţată
i fl ă dde următorii
ă ii factori:
f i
• granulometria –;
• masa moleculară a substratului –
• pH mediului de reacţie –
• stabilitatea preparatelor enzimatice imobilizate -
Bioreactoarele conţinând preparate enzimatice imobilizate se clasifică în:
• Discontinue cu agitare;
• Continue cu agitare;
• Continue
C ti d tip
de ti coloană;
l ă
• Continue în pat fluidizat
Alegerea
g tipului
p de bioreactor depinde
p de caracteristicile fizice ale
preparatului imobilizat, de capacitatea de producţie a instalaţiei şi de natura
substratului ce trebuie transformat.
ETAPE PRELIMINARE ÎNTR-
ÎNTR-UN
PROCES BIOTEHNOLOGIC
totalitatea paşilor necesari în vederea recuperării produsului final în orice
tip de industrie
Ex.: procesul de fermentatie clasic
La sfârşitul fermentaţiei
- separarea fazei solide (de obicei celule, dar şi celule împreună cu enzime pe un
anumiti tip
i de
d suport, sau componente ale l mediului
di l i de
d cultură)
l ) dde cea li
lichidă
hid care
în 90% din cazuri este apoasă.
Mărimea
ă i Ultrafiltrare
l fil 2 – 0,005
0 00
moleculei Hiperfiltrare 0,008 – 0,00025
Gel cromatografie 2 – 0,0003
Dializă 0,002 – 0,00025
Tabelul 5.
Clasificarea metodelor Temperatură Cristalizare <0,002
de separare
Centrifugarea
coş perforat bună îndepărtare a apei; capacitate limitată pentru n – 500 – 2500 min-1
Tabelul 6.6 uşor
ş de curăţat;
ţ ;
posibila spălare a filtrelor
solide;;
recuperare laborioasă a
Z – 300 - 1500
Σ - 900 – 1800
Proprietăţile solidelor;
forţă centrifugă mică;
diferitelor tipuri de funcţionare discontinuă
centrifugi centrifugă cu utilizată la separarea forţă centrifugă mică n – 500 – 1000 min-1
solidelor; Z - 300 – 1500
sită rotativă posibilă spălare a filtrelor;
funcţionare continuă
coş tubular bună îndepărtare a apei; capacitate limitată pentru n - 13000 – 18000 min-1
forţă
ţ centrifugă
g mare; solide; d – 75 – 150 mm
uşor de curăţat; recuperare laborioasă a Z – 13000 - 17000
uşor de îndepărtat coşul solidelor; Σ - 1500 - 4000
funcţionare discontinuă
centrifugă cu trecere rapidă simultan cu forţă centrifugă mică n – 700 – 2500 min-1
o concentrare mare; Z – 350 – 1400
descărcare funcţionare
ţ continuă Σ - 900 - 2300
rotativă
centrifugă cu funcţionare discontinuă; îndepărtare slabă a apei; n – 3000 – 10000 min-1
forţă centrifugă mare; funcţionează numai cu Z – 4000 - 7500
scobitură în eliminarea lichidului sub solide mici în suspensie Σ > 270000
formă de disc presiune;
curăţare ieftină
Filtrarea pe membrane
Răşini schimbătoare de ioni şi de adsorbţie
Răşini schimbătoare de ioni: - concentrarea puternică într-o singură etapă.
Tabelul 8.
8 Natura chimică a schimbătorilor de ioni solizi şi lichizi
Schimbător de Matrix Grupări funcţionale
ioni
Nepolar: stiren-divinil
i i i i benzen;
Semipolar: ester acrilic;
Proprietăţi chimice
Polar: sulfoxid, amide, grupările N-O
Purificarea şi stabilizarea amestecului
În fiecare din etape se realizează o purificare a produsului finit. În final se
ajunge cu un produs al cărui grad de puritate nu este întotdeauna satisfăcător
motiv pentru care este necesară introducerea unei etape finale de purificare şi
stabilizare. În prezent se utilizează două metode de purificare: cristalizarea şi
cromatografia.
fi
Cristalizarea
Este folosită la purificare compuşilor cu masă moleculară mică
mică, cum sunt de
exemplu antibioticele.
Echipamentul constă
într-o baterie
b i de d coloane
l
cu diferite matrixuri,
rezervoare, sisteme de
pompare a eluentului şi
o serie de colectoare de
fracţii.
Este modalitatea prin care bioprodusul este adus în formă stabilă pentru a putea fi
manipulat, ambalat, transportat. Deoarece majoritatea produşilor biologici sunt
sensibili se descompun uşor sau îşi pierd activitatea atunci când se găsesc la
temperaturi înalte, singura metodă de uscare este îndepărtarea apei cu o creştere
minimă a temperaturii. În cazul enzimelor şi a produselor farmaceutice
termostabilitatea este asigurată prin adăugarea de zaharuri sau alţi stabilizatori inerţi.
Pentru a elimina apa sub formă de vapori, energia rezultată în urma încălzirii
trebuie transferată prin convecţie, radiaţie, sau ambele procedee combinate şi
controlată strict ppentru a nu p
permite depăşirea
p ş pragului
p g de temperatură.
p Cele mai
utilizate tehnici sunt:
• uscare la vacuum
• uscare cu jet de gaz
• uscare prin îngheţare rapidă
BIOMASA MICROBIANĂ CA SURSĂ
DE OBŢINERE A PROTEINELOR
Introducere
„single cell protein
protein” (SCP) - o singură proteină celulară - termen utilizat şi
acceptat pentru materialul celular microbian folosit ca hrană şi furaj. Termenul
nu este în totalitate corect - proteina obţinută ca produs al unui proces
biotehnologic nu este 100% pur. Termenul a fost atribuit ţinând cont de faptul
că o proteină se poate obţine dintr-o varietate de microorganisme mono – şi
multicelulare, bacterii, drojdii, fungi filamentoase sau alge
leucină 7,4
, 7,4
, 7,0
, 7,3
, 7,7
, 8,9
, 4,8
,
Bacteriile –
¾rată mare de creştere,
¾numărul de bacterii utilizate în producerea de SCP este în continuă creştere
¾standard ridicat de sterilitate în întreg procesul tehnologic
¾recuperarea
p bacteriilor p
prin centrifugare
g este o pproblemă - noi metode care să
permită omorârea acestora şi nu deversarea în mediu
¾conţinut proteic de aproximativ 80%,
¾conţinut
ţ ridicat de ARN care trebuie îndepărtat
p
¾profilul în aminoacizi al SCP este în general bun; câteodată prezintă un
conţinut mic de aminoacizi cu sulf
Selectarea microorganismelor
Alegerea substratului
Sursele de compuşi cu conc. mici de carbon
d ă grupuri:
două i - “fosile”
“f il ”
- “reînnoite”
Alegerea substratului
Figura 47.
47 Populaţia microbiană
prezentă în bioreactorul de
digestie
3. Tipuri de bioreactoare de digestie
¾deşeurile produse într-o fermă obişnuită;
¾i t l ţii robuste,
¾instalaţii b t construite
t it din
di materiale
t i l locale,
l l care pott funcţiona
f ţi
Bioreactoare în sistem batch sau continuu, prin alimentare cu deşeuri o dată pe zi;
clasice: ¾nu sunt încălzite, sunt amestecate manual şi sunt izolate cu materiale
locale
Bioreactoare batch:
Caracteristici: ¾ un mediudi de
d creştere
t bunb pentrut populaţie
l ţi şii nutrienţi
t i ţi - de
d obicei
bi i
se utilizează un raport între atomii de C şi N de 40:1;
¾ un pH care să varieze în jurul lui 7;
¾ trebuie notată concentraţia potenţialilor inhibitori
¾ industriale şi alimentare –
Surse de ¾ bălegarul animal –
deşeuri: ¾ biomasa agricolă –
¾ deşeu
deşeurilee din
d apele
pe e reziduale
e du e orăşeneşti
o şe eş
5. Parametri digestiei
¾ bacteriile mezofile : 20 – 250C şi 40 – 450C
¾ bacterii termofile 50 – 550C şi 60 – 650C pentru,
¾ trecerea de la temperatura mezofilă la cea termofilă care poate fi
Temperatura: accidentală şi pentru o scurtă perioadă de timp poate duce la
prelungirea
l i timpului
i l i de
d producere
d a gazului
l i cu câteva
â săptămâni.
ă ă â i
¾ similar în cazul adaptării populaţiilor mezofile la condiţiile de
temperatură termofile.
¾ digestia termofilă este mai puţin stabilă;
¾ avantaj - distrugerea patogenilor şi a animalelor parazite
Volumul bioreactorului
HRT =
Volumul de deşeuri adăugate zilnic
Indicele de încărcare a bioreactorului -
Acizii graşi volatili -
Digestia în două etape -
6. Obţinerea acizilor organici şi a aminoacizilor
2 Introducere
Mecanismul biochimic care stă la baza obţinerii acidului citric din Aspergillus
niger nu este pe deplin elucidat, dar se ştie că implică o versiune incompletă a
metabolismului acizilor tricarboxilici.
Aplicaţii
Figura 48. Formarea acidului citric. Linia punctată indică punctele de control ale procesului
Aplicaţii
Acidul tartric
¾Aplicaţii:
¾acidifiant în industria alimentară
¾ Obţinere: acid tungstic
g
¾sinteză chimică: acidul maleic + apa oxigenată amestec racemic
intermediar: formarea acid. cis-eposuccinic, B stoparea reacţiei prin
controlul temperaturii.
¾di reziduurile
¾din id il acumulate l în vanele l de
d producere
d a vinului
i l i
¾metoda fermentativă
¾specii de Acetobacter capabile să producă alături de 5 –cetoglutarat şi
cantităţi mici de acid tartric,
tartric dar numai în anumite condiţii.
condiţii
¾în anii ’80, Yamada şi colab. - mutanţi de Gluconobacter suboxydans
¾hidroliza enzimatică - rezultatele nu au depăşit nivelul de staţie pilot
- hidroliza stereospecifică a cis
cis-eposuccinatului
eposuccinatului (bacterii)
- trecerea celulelor spălate sau a extractului apos de celule peste un
substrat de cis-eposuccinat
¾produs
p în soluţie:
ţ îndepărtarea
p celulelor sau a enzimei imobilizate.
¾Recuperare
¾sub formă de tartrat de calciu; fosfatul de calciu; săruri insolubile de calciu
Acidul lactic
Aplicaţii
¾Aplicaţii:
¾A li ţii
¾ ind. alimentară – acidifiant
¾ medicină
¾alte industrii
¾Obţinere:
¾proces de fermentare anaerobă;
¾Procese fermentative heterolactice: produşi finali – lactat, etanol, dioxid de
carbon şi eventual acetat;
¾Produs
¾P d final;
fi l
¾prin încălzirea şi concentrarea produsului final de fermentaţie se obţin doi produşi
secundari de condensare, acidul lactoillactic care este un produs liniar şi dilactida
care este un produs ciclic.
ciclic Cei doi produşi împiedică formarea acidului lactic
cristalin în formă pură;
L-lizina
L lizina
Fermentare aerobă,
aerobă
- reactor cu agitare aerat
-ppH sistemului este menţinut
ţ neutru,,
- temperatura -280C.
- inocul – cantit. mică; creştere pe agar turnat în pantă, timp de
6 ore, într-un proces discontinuu, B 40 – 45 g L-lizină/litru
atunci când se pleacă de la o concentraţie de melasă de 200 g/l
(100 g zahăr);
Recuperea produsului
d l i final:
fi l
- acidifiere cu HCl
- trecere pe o coloană schimbătoare de ioni în care au fost
grefate grupări amonium
- eluare cu HCl,
- cristalizarea L-lizinei hidroclorice
Aplicaţii
Liofilizare
i fili
Uscare pe silicagel în Improvizarea instalaţiei
Stocarea culturii
pantă Dezvoltarea metodelor
Stocare în N2 lichid
< 10L
Flaskuri Teste de contaminare
Prepararea inoculului
Vase de inox pentru Preparea mediului
Tabelul 16. Reprezentarea inocul
schematică a etapelor
p cheie Fermentatoare din inox Prepararea mediului
dintr-un proces de < 20m3 Derularea procesului
Teste de contaminare
producţie de antibiotice Etapa de fermentare
Monitorizarea
parametrilor biochimici şi
g
icrobiologic
Fermentatoare de inox de Prepararea mediului
10 – 100 m3 Derularea procesului
Etapa finală de Teste de contaminare
fermentare Monitorizarea
parametrilor biochimici şi
icrobiologic
Filtrare Teste de contaminare
Centrifugare Monitorizarea
hrănirea
Extracţia din bulion parametrilor biochimici şi
icrobiologic
Extracţia şi purificarea
Procedeul tipic utilizat la producerea unui antibiotic nou
¾ pre-necesitate
i esenţială
i l
• instalaţie performantă
• creşterea eficienţei procesului de producţie
• modificarea continuă a condiţiilor de lucru
• introducerea de noi tehnologii şi instalaţii de producţie
¾creşterea culturii
•creşterea
creşterea pe mediu de cultură solid sau lichid
•formarea inoculului
•transferarea inoculului în mediul de fermentaţie
• fermentatia
•limitarea creşterii
•adăugarea unui nutrient cheie care modifică calea metabolică
•modificarea căilor metabolice Ö obţinerea unei cantităţi mari de produs
secundar
•păstrarea culturilor:
•pentru o eventuală inoculare
•se vor lua
l una sau maii multelt probe
b pentru
t inoculare.
i l
Procedeul tipic utilizat la producerea unui antibiotic nou
¾fermentaţia –
• alimentare continuă
•controlul permanent al condiţiile de cultivare şi de fermentaţie
•la
l sfârşitul
fâ i l fermentaţiei
f i i bulionul
b li l conţine i antibioticul,
ibi i l microorganismul
i i l
utilizat şi un număr mare de alte componente chimice ale mediului de
cultură
•antibioticul - o componentă minoră din compoziţia bulionului ( între 3 şi
35%)
¾ recuperarea şi purificarea:
•separarea
separarea de faza lichidă prin filtrare şi centrifugare
• extragerea antibioticul direct din bulionul de fermentaţie
• extracţia în solvenţi,
•cromatografie
g de schimb ionic,,
•ultrafiltrare,
•osmoză inversă
•precipitare
•cristalizare
• uscare
Realizarea unui proces de producţie
Producerea penicilinei
Penicilina G - primul antibiotic descoperit
- activă faţă de Ba gram pozitive
-structura de bază - acidul 6-aminopenicilanic (A-6-AP) format dintr-un inel
triazolidinic
i lidi i condensat
d cu un inel
i l β-lactam
l
- penicilinele naturale se formează prin fermentaţie
- peniciline de biosinteză se formează prin adăugarea controlată în mediul a catenei
laterale a nucleului β-lactam
β lactam
- 100 de tipuri de peniciline de biosinteză
- penicilina G şi V sunt comercializate
Fermentaţia
fformarea inoculului
i l l i
• aclimatizarea microorganismelor producătoare de antibiotice la noile condiţii de
dezvoltare
• cantităţi mici din linia celulară sunt amplificate prin creştere pe medii solide sau
lichide.
• cultivare pe medii solide
• în funcţie de proces, suspensia de spori trebuie să fie utilizată în câteva zile, în
caz contrar este posibil să se formeze conglomeratele
Fermentaţia
Fermentatoarele:
•volum - 30 - 200 m3.
•fabricate din oţel foarte bine finisat
pe interior
i t i
• înălţimea - de 2 - 4 ori mai mare
decât diametrul
• 4 – 6 sisteme de întârziere a
fermentaţiei, fixate de pereţi.
•sistem de cuţite (BLANDERE)
orizontale ((Rushton)) sau sistemul
de agitare cu aer sub presiune.
•acumularea
ac m larea de biomasă miceliană
•utilizarea intensivă a componentelor mediului de cultură;
•necesarul de oxigen este maxim;
•activitatea
activitatea respiratorie (eliberarea de dioxid de carbon) este ridicată;
•pH optim de 4,5 – 5,0
¾ Caracteristici:
• încetinirea creşterii miceliului,
• scăderea consumului de oxigen,
•menţinerea pH la valoarea optimă,
•acumularea de penicilină
¾miceliul foloseşte nutrientul şi produce energia necesară bioprocesului.
•asigurarea necesarului de substanţe minerale
•menţinerea
ţi temperaturii
t t ii optime
ti
Etapa de producere a antibioticului
Introducere
Selecţia tulpinilor şi ameliorarea lor
Alegerea tulpinii producătoare
Trebuiesc avute în vedere următoarele aspecte:
- este enzimă intra- sau extracelulară – de preferat acel tip de enzime care
sunt stabile, care nu necesită un mediu de cultivare complex şi care se eliberează uşor
din celule în vederea purificării;
- dacă produşii de sinteză reprezintă o ameninţare pentru tulpina
producătoare;
p patogene
- dacă există tulpini p g sau cu toxine provenite
p de la microorganismul
g
producător de enzime , se preferă microorganismele care prin tradiţie sunt folosite
în alimentaţia umană (tulpini din genurile Bacillus şi Aspergillus);
- microorganismul să fie capabil să crească în medii de cultură cu compoziţie
simplă; ieftine; să nu necesite adăugarea de promotori de creştere scumpi; să fie stabil
din punct de vedere genetic; să producă cantităţi mari din enzima dorită în cel mai
scurt timp posibil; să fie uşor de separat din bulionul de ferementaţie.
•Surse de microorganisme:
- din natură – ex: microorganismele care hidrolizează lactoza pot fi
izolate din produse lactate, iar microorganismele celulolitice din produse
l
lemnoase putrezite t l , dezavantaj:
t it natural d t j culturi
lt i pure înî cantităţi
tităţi mici;
i i
- colecţiile de microorganisme , avantaj: tulpinile sunt cataloage
sunt trecute tulpinile şi se prezintă caracteristicile lor. Ex: ATCC, WFCC, IFO
Ameliorarea tulpinii producătoare
•Pentru tulpinile
p izolate din natură > ameliorare g p de laborator ,
genetică în etapa
se stabilesc principalele caracteristici ale procesului de biosinteză a enzimei:
` creşterea producţiei în enzima dorită;
` reducerea sau eliminarea enzimelor obţinute ca produşi secundari;
` produsul dorit să fie biosintetizat în cantităţi mai mari fără a se utiliza
inductori scumpi;
` producerea enzimei să se realizeze în condiţii normale de inhibiţie
enzimatică.
•trei metode de ameliorare:
` ameliorarea prin mutaţie şi selecţie –
- ag. mutageni: radiaţii electromagnetice, mutageni chimici
- supravieţuitorii sunt izolaţi şi separaţi pentru ameliorarea
caracterului dorit
- ex: β-galactozidază, D-serindeaminază, ribitoldehidrogenază,
penicilinamidază, proteaze alcaline.
` Hibridizarea
ib idi – modificarea
difi structurii
ii ADN a tulpinii
l i ii producătoare
d prin
i
transferarea unui fragment de ADN dintr-o altă tulpină. Tipuri:
- conjugarea –
- transformarea –
- transducţia –
- fuziunea protoplaştilor -
` Tehnologia ADN-recombinant: manipulare directă a ADN-ului prin
clonare moleculară -
Tabelul 14. Prezentarea unor
gene manipulate genetic în
vederea obţinerii unor enzime
de interes comercial
Creşterea producţiei de enzime prin ameliorarea tulpinilor
Publicaţii rare - secrete de fabricaţie;
Fermentaţia
•Sistem
Sistem de cultivare “batch”
batch
•Păstrarea culturii – în azot lichid, cu efectuare periodică de teste de viabilitate;
•Inoculul – se transferă din flaskuri în fermentatorul din etapa pilor şi de
aici în cel din etapa
p de de fermentare ppropriuzisă
pp p periodic;
p ;
- în proporţie de 1 – 5% în volume
•În etapa de propagare celulară – se utilizează un mediu îmbogăţit pentru a
determina o creştere bună;
•În
Î etapa de creştere logaritmică - compoziţia mediului este ajustată în funcţie de
producţia dorită
Figura 56. Obţinerea computerizată a datelor din procesul tehnologic în urma controlului
întregului sistem în vederea optimizării procesului de fermentaţie
Aplicaţii
Enzimele amilolitice
G
Generalităţi
lităţi
•Utilizare: în procese fermentative sau în alte procese biochimice
• hidroliza amidonul solubil şi granulele de amidon aflate în suspensie apoasă
•hidroliza poate fi parţială sau totală – funcţie de gradul de hidroliză dorit se aleg
diferite amestecuri de enzime amilolitice;
•produşii finali rezultaţi exercită un efect de inhibiţie competitivă sau necompetitivă,
sau inhibiţie exponenţială simplă;
•Enzime:
` α-Amilaza [E.C.3.2.1.1] sau glicogenaza sau α(1,4)-D-glucan
glucanohidrolază;
- acţionează asupra glicogenului, oligo- şi polizaharidelor înrudite;
- hidrolizează α(1,4)-D-glicozidice interioare
`ββ-Amilaza [[E.C.3.2.1.2]] sau gglicogenaza
g sau α(l,4)-D-glucan
(, ) g
maltohidrolază
- hidrolizează α(1,4)-D-glicozidice marginale
` surse de amilaze: - cartofi, cereale, fasole, soia, boabe de orez,
boabele de fasole germinate, pancreas şi la unele specii în salivă
- microorganismele: Bacillus subtilis, bacterii,
drojdii, fungi
Modul de acţiune al enzimelor amilolitice
α-amilaza
α(1,4)-glicozidică
β-amilaza
α(1,3)-glicozidică
amiloglucozidaza
(g
(glucoamilază)
)
α(1,6)-glicozidică
glucozidaza
hidroliza enzimatică a amidonului se efectuează practic în două etape:
` prima etapă – dextrinzarea - fragmentare rapidă a macromoleculelor
de amiloză şi amilopectină până la fracţiuni cu greutăţi moleculare mai mici –
dextrinele; amidonul se lichefiază
` a doua etapă
p - zaharificare - dextrinele sunt hidrolizate complet
p la
oligozaharide şi apoi la maltoză şi glucoză în funcţie de compoziţia preparatului
utilizat; dextrina se dizolvă în apă
Figura 59. Dinamica acumulării α-amilazei în culturi submerse de Bacillus subtilis. a) – dinamica
acumulării de biomasă; b) – dinamica activităţii enzimatice; c) – evoluţia pH-ului
Parametrii digstiei:
•starea fiziologică a microorganismului utilizat;
potenţialul productiv al tulpinii folosite;
•potenţialul
•compoziţia mediului de biosinteză;
•parametrii de biosinteză (temperatură, pH, viteză de agitare, viteza de aerare, durata
cultivării).
Biosinteza α-amilazelor cu tulpini modificate genetic
•studiile de inginerie genetică efectuate până în prezent au demonstrat posibilitatea
transferării genelor de la o specie la alta;
•cele mai des utilizate sunt bacteriile din genul B. subtilis ; se mai utilizează B.
sterothermophilus în B. subtilis
•atunci când genele α-amilazei sunt donate în E. coli, ele se exprimă, enzima
acumulându-se în spaţiul periplasmatic;
•biosinteza α-amilazelor este influenţată de compoziţia mediului nutritiv şi de
condiţiile de cultivare a microorganismului
` sursă de carbon - varietăţi de amidon, glicogenului, maltotetraozelor,
maltotriozele, maltoza (de cinci ori mai slabe decât la glicogen)
` sursele de azot - săruri de amoniu, aminoacizi, cazeină
` 3 vitamine;
` 7 aminoacizi
•mediul de reacţie
` făină de peşte, şprot de soia – mai multă protează decât α-amilază
` mediu
di pe bază
b dde amidon
id - α-amilaza
il
` mediu se adaugă glucoză - biosinteza α-amilazei este inhibată parţial sau
total
•ionii de calciu şi amoniu
•temperatura de cultivare:
` variază de la o specie la alta:
` între 30 şi 370C pentru B. subtilis
` între
î 500 şii 650C
6 0C pentru B. coagulans
l şii B. stearothennophilus
h hl
•pH-ul optim:
` 6,0 şi 7,5
` controlat şi menţinut constant pe toată durata biosintezei
` proteinele
i l îmbunătăţesc
î b ăă capacitatea
i de
d tamponare a mediului
di l i
•proces intens aerob:
` oxigenul insuflat o data cu aerul sterilizat este utilizat numai ca oxigen
dizolvat
` cantitatea
i de
d oxigen
i este cu atât
â maii mare cu câtâ perioada
i d de d creştere a
unei generaţii este mai mică
•Proprietăţile fizico-chimice ale mediului de cultură:
` vâscozitatea
` tendinţa
di dde spumare