Sie sind auf Seite 1von 151

INTRODUCERE

-acum
acu 10.000
0.000 de aani - ccreşterea
eş e ea pplantelor
a e o agagricole
co e şşi a aanimalelor
a e o pe
pentruu a obţ
obţinee
mâncare şi haine.
-acum 6.000 de ani - în procesele biologice încep să se utilizeze microorganismele,
pentru diversifica gama de produse alimentare (tipuri diferite de pâine, de brânză), şi
pentru a conserva produsele alimentare pe o perioada mai lungă de timp
-perioada ’60 – ’70 – utilizarea constituientilor celulari în procesele biotehnologice
1. Ce este biotehnologia?
Bi –sugereazăă utilizarea
Bio tili proceselor
l biologice;
bi l i
Tehnologie –sugerează realizarea produşilor prin utilizarea de diferite tehnici
definiţie de ansamblu utilizarea controlată sau deliberată a “agenţilor biologici”
(celule vii sau moarte, sau componente ale acestora) în
cadrul unor operaţii tehnice, sau în cadrul unor procese
tehnologice care duc la obţinerea unui produs finit
d
domeniui larg
l d la
de l totalitatea
li tehnicilor
h i il biologice
bi l i utilizate
ili î agricultură
în i l ă până
â ă la
l
cele utilizate la prepararea mâncării
Federaţia Europeană de Biologie (1978)
Utilizarea integrală a biochimiei,
biochimiei microbiologiei şi ingineriei în scopul
obţinerii unei aplicaţii tehnologice (industriale), cu ajutorul
microorganismelor, culturilor de celule şi a părţilor componente ale
acestora
Exemple:
Exemple:
-biotehnologia fermentaţiei, cum este cunoscută astăzi, îşi are originea în introducerea
pentruu pprimaa oa
pe oarăă în seco
secolul
u aal IX-lea
ea a age
agenţilor
ţ o microbiologici
c ob o og c în aanumite
u ep procese
ocese
de fermentaţie şi nu în descoperirea vinului sau a verzei acre sau în înţelegerea
proceselor biologice care au loc;
-obţinerea de biomasă din noroiuri active, selecţia şi producerea la scară largă a
microorganismului Clostridia pentru obţinerea de acetonă şi butanol
Aplicaţii în în industrie
-producerea de biomasă pentru hrana animalelor;
- a unor compuşi chimici utilizaţi în alimentaţie cum ar fi acidul citric, citric acidul
glutamic, unii aminoacizi, antibiotice şi vitamine;
- în industria petrochimică, poate fi utilizată în obţinerea în cantitate mare a etanolului,
acetonei butanolului,
acetonei, butanolului acidului acetic etc;
-este utilizată în obţinerea de produşi celulari din plante şi animale, obţinerea de celule
microbiene modificate pentru a produce antigene, anticorpi sau agenţi terapeutici
diverşi;
ş;
-furnizează agenţi cheie pentru industria alimentară ca de exemplu culturi de celule şi
enzime care duc la o mai bună înţelegere a proceselor şi tehnicilor specifice acestei
industrii;
- are un rol deosebit în tratarea şi purificarea apelor, şi în volatilizarea substanţelor
reziduale.
Definirea termenului din ce în ce mai greu de realizat
Principalele direcţii
de dezvoltare a
biotehnologiilor
moderne sunt
determinate:
- de
d descoperirile
d i il
recente din domeniul
biologiei moleculare;
- de cerinţele
societăţii faţă de
anumite aspecte cu
care aceasta se
confruntă, cum ar fi:
criza energetică,
epuizarea
p rezervelor
de hrană de pe
planetă, probleme
ecologice şi de
bioremediere.
Figura 1. Principalele aplicaţii ale biotehnologiei
Introducere
Clasificarea diferitelor tipuri de biotehnologii
microbiene
1. în funcţie de tipul de celule cu care se lucrează: vegetale
animale
2. în funcţie de domeniul în care-şi găseşte aplicaţie deosebim următoarele
categorii de biotehnologii:
- industriale, includ obţinerea de produşi farmaceutici, de reactivi de laborator, de
produse alimentare;
- agricole, studiază aspecte privind rezistenţa plantelor la anumiţi factori patogeni
şşi a toleranţei
ţ faţăţ de factorii de mediu defavorabili, implicarea
p în sisteme
simbiotice la diferite specii de plante, multiplicarea speciilor horticole şi
obţinerea de noi hibrizi sexuaţi;
- medical veterinare, se referă în special la nutriţia animală, creşterea rezistenţei
animalelor la atacul agenţilor patogeni, reproducere artificială şi predeterminare
a sexului, conservarea resurselor genetice animale;
- ecologice, sunt incluse toate metodele şi tehnicile de epurare biologică a apelor
uzate
t sau poluate,
l t a aeruluil i sau a solurilor
l il degradate,
d d t extracţia
t ţi de d minereuri
i i cu
ajutorul microorganismelor;
- sănătate publică, crearea unor sisteme de diagnosticare.
Introducere
Rolul cercetării fundamentale
satistica
ssatistic
s ca gglobală
ob în v
viitor
o cea mai
a mare
a e pa
partee a industriei
dus e va u
utilizaa p
procedeele
ocedee e de
fermentaţie, inginerie genetică, biologie moleculară ceea ce
imprimă un salt tehnologic covârşitor
natura interdisciplinară etape
1. manipularea genetică a organismului gazdă
- o genă din ADN animal este clonată într-o celulă a unui microorganism.
- se realizează în laborator de către cercetători specializaţi în domeniul
biologiei moleculare geneticii şi biochimie;
- tehnicile utilizate sunt tehnici specifice de biologie moleculară, biochimie,
culturi de celule;
- cercetarea se derulează până când se obţin tulpini recombinante stabile iar
nivelul de expresie este cel dorit
2.cultivare- în vederea stabilirii parametrilor optimi - compoziţia mediului, pH,
temperatură, concentraţia oxigenului dizolvat
- se porneşte de la cultivarea microorganismului la scară mică, în flacoane
de 250 – 1.000 ml, sub agitare;
- performanţele organismului
organism l i sunt
s nt apreciate prin calcularea
calc larea ratei de
creştere, productivitatea specifică, randamentul de obţinere a produsului
finit.
Introducere
3. eetapa
apa pilot
p o

-un bioreactor de 1, 2 sau 5 litri echipat cu instrumente de măsurare a parametrilor


ce indică p performanţele
ţ organismului;
g ; p
pot fi încercate diferite tipuri
p de
bioreactoare;
-În condiţiile creşterii culturii în bioreactor parametri sunt uşor modificaţi, dar
monitorizarea lor este mai eficientă şi în plus se pot monitoriza parametri care nu
fac obiectul creşterii în flacoane de cultură, ca de exemplu caracteristicile de
spumare ale mediului;
- se identifică limitările impuse de tipul bioreactorului (dacă bioreactorul nu este
aerat celulele mor prin înfometare, dacă agitarea nu este la o viteză optimă celulele
se pot sparge şi astfel creşterea se realizează pe alte căi metabolice);
-se
se calculează diferiţi parametri cum ar fi: coeficientul de transfer de masă,
masă timpul
de agitare, viteza de dizolvare a oxigenului, puterea de agitare, etc;
-se decide modul de cultivare cel mai avantajos – sistemul „batch” (discontinuu sau
submers) sau sistemul continuu;
- se realizează un calcul economic de fezabilitate.
4. ridicarea la scară industrială
- ingineriei bioproceselor;
- bioreactoarele sunt mult mai sofisticate,
sofisticate au un volum mult mai mare 100 –
1.000 l;
- rezultatele pot fi mai bune sau mai scăzute faţă de cele obţinute în faza pilot; se
hotărăşte dacă se trece sau nu la producţia industrială;
- se proiectează întreaga instalaţie industrială de fabricare a produsului finit;
- recuperarea produsului finit din mediul de producţie - izolarea şi purificarea
acestuia până la produsul finit;
- etapă dificilă pentru produsele ADN recombinate;
- costurile reprezintă 80-90% din costul total al procesului tehnologic, deoarece
metodele aplicate în laborator nu pot fi extrapolate la scară industrială;
- filtrări, centrifugări, metode mecanice de distrugere a pereţilor celulari, extracţii
cu solvenţi, metode cromatografice cristalizări, uscări;
- sunt mari consumatoare de energie şi timp.
5. Pregătirea pentru introducerea pe piaţă
-ambalat şi vândut;
-produsele farmaceutice noi - testarea pe animale şi apoi pe om;
-produsele
d l alimentare
li t - teste
t t specifice;
ifi
-avize oficiale care sunt în conformitate cu standardele existente pentru fiecare tip
de produs.
Operaţii biotehnologice
Cinci aspecte majore care, în aproape toate instalaţiile industriale corespund
stadiilor de procesare
Microbiologie şi biologie celulară Procese (aspecte)

Sistemică Alegerea culturii

Genetică Cultivarea celulelor

Fiziologie Răspunsul dat de celule


Proces tehnologic
Procesul tehnologic

Chimie Recuperarea produsului

1. Alegerea
g culturii: selecţia,
ţ , creşterea
ş sau crearea de organisme
g sau p
populaţii
p ţ
celulare
2. Cultivarea celulelor

3. Răspunsul dat de celulă

4. Procesul tehnologic

5. Recuperarea produsului
CARACTERISTICILE MICROORGANISMELOR
DE INTERES BIOTEHNOLOGIC
De ce microorganismele?
- diversitatea acestora este enormă;
- microorganismele
i i l care pot fi utilizate
ili - procariote
i (bacteriile);
(b iil )
- eucariote (drojdiile şi fungi)
Drojdiile
la producerea alcoolului etilic şi a dioxidului de carbon prin fermentaţie se foloseşte specia
Saccharomyces cerevisiae;
pentru obţinerea vinului se folosesc specii de S. cerevisiae, şi ellipsoideus, fie sub formă de
tulpini selecţionate, fie prin fermentaţie spontană realizată cu drojdii epifite;
la fabricarea berii se folosesc cereale germinate ca orzul în Europa, porumbul în America şi
sorgul în Africa. Cele mai utilizate tulpini sunt S. cerevisiae şi S. uvarum care au fost
selecţionate treptat în diferite laboratoare;
la fabricarea pâinii se utilizează S. S cerevisiae,
cerevisiae care în timpul dospirii pâinii produce o
fermentaţie alcoolică cu degajare de dioxid de carbon ce permite afânarea aluatului;
proteinele furajere se obţin prin cultivarea drojdiei pe subproduse industriale (alcani, metanol)
şi reziduuri agricole (zer de lapte, melasă). Adăugate în furajele animalelor, proteinele aduc
un aport de
d aminoacizi.
i i i
Fungiii
Fungi
Materii prime :
subproduse ale industriei alimentare şi reziduuri agricole (zer, melasa de la fabricarea
zahărului din sfecla de zahăr, drojdia de la distilării, paiele etc.);
multe specii saprofite, care se dezvoltă pe resturile organice animale şi vegetale desăvârşind
astfel marele ciclu
cicl biologic natural.
nat ral
Aplicaţii
în industria brânzeturilor fungii au un rol important în înmuierea şi aromatizarea pastei,
tulpinile cele mai utilizate sunt: Penicillium roquofortii (brânză cu pastă verde), verde)
Penicillium camembertii şi Geotrichium candidum (pastă presată);
în industria salamurilor folosirea unui strat alb de Penicillium nalgiovense pe suprafaţa
salamurilor previne dezvoltarea microorganismelor care degradează produsul;
hidroliza amidonului din orez care precede fermentaţia se realizează cu amilaze biosintetice de
Aspergillus oryzae.
în industria chimică şi farmaceutică prin biosinteză se produc:
Enzime – proteaze, amilaze cu tulpini din genul Aspergillus;
acizi organici - acid citric cu Aspergillus niger;
antibiotice - penicilina cu tulpina Penicillium chrysogenum, cefalosporinele cu tulpini din
genul Cephalosporium;
h
hormoni; i
biomasă în scopul obţinerii unei surse complementare de proteine pentru furaje animale.
Bacterii
Bacteriile acetice (Gluconobacter, Acetobacter)
- fabricarea tradiţională a oţetului de vin, cidru, cartofi;
- obţinerea de vitamină C (oxidarea sorbitolului la sorboză)
Bacteriile lactice (Lactobacillus, Lactococus, Treptococcus)
- fermentează produsele lactate (iaurt, brânză dulce). Ele sunt prezente în mod obişnuit - în
lapte şi au rolul de acidifia laptele (transformă lactoza în acid lactic);
- în prepararea brânzeturilor participă la formarea cheagului şi la maturarea lui;
- conferă untului gustul şi aroma specifice, prin producerea de acid diacetic;
- producerea de acid lactic la scară industrială
B
Bacteriile
iil butirice
b i i (Clostridium
(Cl idi butyricum)
b i )
- intervin în înmuierea inului şi a cânepii deoarece distrug pectina şi astfel eliberează
fibrele textile
Genul Bacillus
- Baccilul thuringiensis – în timpul sporulării produce substanţe toxice care sunt toxice
pentru larve;
- producerea de enzime: proteaze termostabile pentru ind. detergenţilor, α-amilaze,
gl co o izomerază
glucozo i omera ă
Actinomicetele
Bacteriile din genul Corynebacterium şi Brevibacterium şi mutantele derivate
Bacteriile metilotrofe cultivate pe metan sau metanol
Propionibacterium
Bacteriile termofile metanogene
Căile de biosinteză a constituienţilor celulari ai microorganismelor
creşterea microbiană

Etape:

- faza de creştere logaritmică;


- faza staţionară;
- faza de declin

Figura 2.
2 Diferenţa dintre metabolismul primar şi secundar: a – creşterea celulelor şi biosinteza
constituienţilor are loc aproape simultan; b- după creşterea celulelor şi eliberarea metabolitului primar acesta
se transformă în metabolit secundar; c- substratul de creştere rămas după finalizarea creşterii celulelor este
transformat în metabolit secundar
Metaboliţii microbieni primari
Procesul microbian tipic în care în timpul fazei de creştere exponenţială (perioada
de lag) se formează un metabolit primar se numeşte fermentaţie alcoolică
Exemplu:
etanolul este metabolitul primar produs în fermentaţia alcoolică aerobă a
drojdiilor sau a unor bacterii în acelaşi timp reprezentând şi un metabolit
energetic

Figura 3. Cinetica procesului de fermentaţie în timpul formării (a) metaboliţilor primari şi


(b) a metaboliţilor secundari
Metaboliţii microbieni secundari

Metaboliţii care se formează în timpul fazei staţionare (de creştere sau trofofaza) sau
la finalul acesteia se numesc metaboliţi secundari
Caracteristici:

• sunt sintetizaţi de un număr mic de microorganisme;


• nu sunt importanţi pentru creşterea şi dezvoltarea microorganismului;
• pentru sinteza lor necesită prezenţa unui număr mare de reacţii enzimatice;
• formarea lor este dependentă de condiţiile de creştere şi de compoziţia mediului;
• se pprezintă sub forma unui amestec de compuşi
p ş cu structură chimică înrudită;;
• de obicei se obţin în cantitate mult mai mare decât metaboliţii primari .

Etape de obţinere:

• trofofaza - este faza de creştere (prefixul „trofo” în limba greacă înseamnă


„creştere”);
• idiofaza – este faza în care se sintetizează metabolitul (prefixul „idio
idio” în limba
greacă înseamnă „ceva propriu”);
Interrelaţia dintre căile de biosinteză ale metabolitului primar (diferiţi
acizi organici şi aminoacizi) şi a metaboliţilor secundari (o serie de
antibiotice))

Figura 4. Relaţia
dintre calea
metabolică de
obţinere a
aminoacizilor şi a
unor acizi
organici
i i şii
formarea unor
antibiotice cu
nucleu aromatic
Biosinteza şi creşterea

Figura 5. Prezentarea sintetică a principalelor căi anabolice şi catabolice. Sunt prezentate într-o
versiune simplificată numai căile majore de biosinteză şi conexiunile acestora cu căile catabolice
Controlul metabolismului
Necesarul de nutrienţi
Majoritatea nutrienţilor, cu excepţia oxigenului şi a câtorva surse de carbon, sunt
preluate din mediul de cultură prin sisteme de transport specifice. Aceste procese
pot fi controlate deoarece o dată ce celula şi-a luat nutrientul în cantitatea necesară
restull de
d nutrient
i poate fi îndepărtat
î d ă sau direcţionat
di i pe o altă
l ă cale
l astfel
f l încât
î â săă nu
fie în detrimentul celulei. Aceste sisteme de transport active necesită un aport de
energie.
Compartimentarea
reprezintă a doua formă de control metabolic
exemple:
- mitocondria celulelor eucariote care separă reacţiile ciclului acizilor tricarboxilici de
alte reacţii din citoplasmă;
- în
î peroxizomi
i i se găsesc
ă enzime
i care degradează
d d ă acizii
i ii graşii şii care suntt separate
t de
d
enzimele din citoplasmă care determină sinteza acizilor graşi. Separarea celor două
seturi de enzime previne reciclarea oricărui intermediar comun;
- alte organite (vacuole,
(vacuole nucleu,
nucleu cloroplaste etc.)
etc ) controlează în mod similar alte
reacţii care au loc în celulă.
Figura 6. β-Oxidarea acizilor graşi
Controlul sintezei enzimatice
Multe dintre enzime sunt prezente în celulă indiferent de condiţiile de creştere ale
acesteia.
t i O parte t din
di enzime
i „apar”” atunci
t i când
â d este
t necesar cum ar fi de
d exemplu l
izocitrat liaza din şuntul glioxilatului care apare numai atunci când celulele sunt
crescute pe un substrat C2. Acest proces este denumit „inducerea” sintezei enzimei.

Figura 7. Ciclul glioxilatului.


Unele enzime pot să „dispară” atunci când nu mai sunt necesare. De
exemplu enzimele din calea de biosinteză a histidinei încetează a mai fi produse
aatunci
u c câ
cândd co
concentraţia
ce aţ a de histidină
s d ă d din ce
celulă
u ă es
estee su
suficientă
c e ă pe
pentruu a sa
satisface
s ace
necesităţile celulei. Acest proces este numit represie. Astfel într-o celulă există un
permanent echilibru între procesele de inducţie şi represie a anumitor enzime cheie,
în funcţie de necesităţile celulei.
În sistemul de cultivare în suspensie
(„batch”) celulele se multiplică într-un sistem închis
până când se termină unii din nutrienţi sau până
când unii produşi acumulaţi determină efecte
inhibitorii asupra unor enzime reglatoare sau,
numărul de celule formate au ocupat întreg spaţiul
de cultivare şşi astfel noile celule nu mai au spaţiu
p ţ să
crească. În momentul în care în timpul creşterii
celulare unele din componentele celulare se
modifică sau unii compuşi moleculari se consumă,
celula îşi modifică forma – se alungeşte.

Figura 8. Reprezentarea schematică a schimbărilor ideale în


mărimea
ăi celulei
l l i (cell
( ll weight),
i ht) numărul
ă l de
d celule,
l l masa totală
t t lă
uscată şi compoziţia chimică în timpul creşterii unei bacterii în
sistemul de cultivare submers. În stânga este scală logaritmică
Controlul sintezei enzimatice

Eficienţa globală de creştere microbiană este discutată în


termeni termodinamici. Empiric, este în mod uzual exprimată în termeni de:
producţia de celule formate pornind de la o unitate masică de substrat de carbon
consumat.
producţia molară de creştere (Ys) este producţia de celule per mol de substrat,
coeficientul
fi i t l de
d conversiei a carbonului
b l i care permite it o maii uşoarăă comparare
între numărul de moli de substratele diferite, este producţia de celule per gram
de substrat de carbon.

ATENŢIE! valoare scăzută a producţiei de creştere atunci când


organismele sunt transferate din sistemul de cultivare aerob în cel
anaerob, fenomen care evident este direct legat de reducerea fluxului
energetic şi astfel o producţie scăzută de ATP.
Substrat Organism Producţia molară de Coeficientul de conversie
creştere (g organism al carbonului (g organism
Tabelul 3. uscat/g-mol substrat) uscat/g carbon din substrat)
Randamentul de
creştere a unor metan Methylomonas 17,5 1,46
methanooxidans
microorganisme
crescute pe metanol Methylomonas methanolica 16,6 1,38
diferite substrate
etanol Candida utilis 31,2 1,30

glicerol Klebsiella pneumoniae 50,4 1,40


(Aerobacter aerogenes)

glucoză Escherichia coli:


aerob 95,0 1,32
anaerob 25,8 0,36
Saccharomyces cerevisiae:
aerob 90,0 1,25
anaerob 21,0 0,29
Penicillium chrysogenum 81 1,13
sucroză Kelbsiella pneumoniae (A. 173 1,20
aerogenes)

xiloză Kelbsiella pneumoniae (A. 52,2 0,87


aerogenes)

acid Pseudomonas sp. 23,5 0,98


acetic Candida utilis 21 6
21,6 0 90
0,90

hexadec Saccharomycopsis
an (Candida) lipolytica 203 1,06
Acinetobacter sp 251 1,31
Randamentul de creştere a celulelor depinde de următorii factori:
factori:

1. natura sursei de carbon;


2. calea catabolică pe care o urmează substratul;
3. proviziile de substrate complexe (îndeosebi unele căi anabolice);
4
4. necesarull de
d energiei pentrut asimilarea
i il nutrienţilor
t i ţil în î special
i l all azotului
t l i (se
(
administrează mai puţin azot dacă se administrează aminoacizi şi mai mult
azot dacă sursa este reprezentată de ionii nitrat);
5
5. variaţia eficienţei reacţiilor generatoare de atp;
6. substanţele inhibitoare, contrabalansarea echilibrului ionic, sau alte
componente ale mediului care interacţionează cu sistemul de transport;
7. statusul fiziologic al organismului – aproape toate microorganismele îşi
modifică mecanismele de creştere în funcţie de condiţiile mediului de cultură
(ca de exemplu formarea sporilor).
8. natura substratelor care limitează creşterea – cea mai eficientă este sursa de
carbon care limitează creşterea , deoarece catabolizarea excesului de carbon
poate urma anumite căi metabolice care sunt din punct de vedere energetic
utile biotehnologului deoarece opresc creşterea;
9. viteză de creştere prestabilită;
10. înclinaţia microbilor de a creşte şi competenţa microbiologului.
BIOREACTOARE
Introducere
¾ Procesul de bază în biotehnologie este „procesul biologic”, şi se realizează în
bioreactor

¾ “bioingineria” - se ocupă cu studiul bioproceselor din punctul de vedere al unui


biolog, al unui chimist fizician şi al unui inginer
¾ Bioreactorul - instalaţie tehnologică în interiorul căreia are loc transformarea
materiilor prime cu ajutorul sistemului enzimatic pus la dispoziţie de microorganismele
vii, celulele animale şi vegetale, sau de enzimele izolate din acestea.
CONDIŢIILE CREATE ÎN BIOREACTOR PENTRU CREŞTEREA
ORGANISMELOR
Randamentul cu care procesul biotehnologic are lor

Pe măsură ce celulele cresc ele se adaptează noilor condiţii de creştere şi-şi modulează
activitatea în funcţie
ţ de condiţiile
ţ de mediu.

Avantaj: monitorizarea permanentă a parametrilor creşterii


Materii prime Etapa de Etapa de Etapa de
prelucrare prelucrare prelucrare
fizică biochimică fizico
fizico-
chimică
Produs

• ppregătirea
g mediului • biosinteza • separarea produsului
de cultură, propriu-zisă principal,
• sterilizarea utilajelor, • monitorizarea • concentrarea,
• sterilizarea aerului parametrilor • pregătirea pentru
introducerea pe piaţă

Figura 9. Reprezentarea schematică a unui proces biotehnologic

Modelul similitudinii
Etapa pilot Etapa industrială

Criterii
C i ii care permiti calcularea
l l mărimilor
i il fizice
fi i alel sistemului
i l i
la scară mare, pe baza rezultatelor obţinute în etapa pilot

- tipul
p de organism;
g ;
În funcţie de: - sistemul de cultivare;
Alegerea bioreactorului
- caracteristicile biochimice ale
întregului proces
Sisteme de cultivare a microorganismelor
2 sisteme majore: - sistem submers
- cu
culturi
u de sup
suprafaţă ţ
În sistem submers
mediul de cultură este lichid, agitat şi aerat
alimentarea cu energie se realizează continuu în scopul menţinerii
i t f ţ i gaz – lichid
interfaţei li hid
trei moduri de operare: discontinuu,
semicontinuu şi
continuu
Operarea în sistem discontinuu
Cultivarea - în şarje (sistemul batch);
începep la t = 0 şşi se termină la t = t’;
la început, creşterea celulelor are loc în condiţii nelimitate; în timp se atinge
densitatea maximă; începe creşterea în condiţii limitate de substrat şi acumularea
produsului final.
se notează DC şi este reprezentată
grafic astfel:

caracteristică - sistem de agitare performant F omogenitatea ; uniformitatea


tuturor parametrilor
Sisteme de cultivare a microorganismelor
Operarea în sistem semicontinuu
reactorul este construit astfel încât concentraţia sustratului limitativ să fie
păstrată constantă prin aprovizionarea continuă („fed batch”)
se notează SC şi se reprezintă grafic
astfel:
Operarea în sistem continuu
reactorull este construit
i astfel
f l încât
î â săă se realizeze
li o aprovizionarea
i i continuă
i ă
cu nutrienţi şi o evacuare permanentă a unei cantităţi echivalente de mediu
de cultură
două tipuri de bioreactoare ideale:

Figura 10. Reprezentarea schematică a bioreactoarelor tip R (cu recirculare) şi tip D (cu
deplasare)
Sisteme de cultivare a microorganismelor

Figura 11. Prezentarea sistemelor de operare continuă. S – substrat, C – celule

Bioreactoarele submerse pot fi:


- cu agitare mecanică,
mecanică
- cu convecţie forţată (cu pompă de recirculare a lichidului),
- cu aer comprimat.
Sisteme de cultivare a microorganismelor

Culturi de suprafaţă

- au fost primele sisteme de fermentaţie folosite;


- mediul de cultură este solid, semisolid sau este reprezentat de starturi
lichide aflate în repaus;
- în sisteme omogene – compoziţia mediului de fermentaţie este uniformă în
orice colţ al bioreactorului, în orice moment;
- în sisteme heterogene – gradiente de celule sau substrat; microorganismele
suntt expuse la
l diferite
dif it cond.d de
d mediu;
di
- nu depind de sistemul exterior decât în mică măsură;

- sunt utilizate mai mult în laboratoar pentru întreţinerea culturilor, decât


industrial pentru biosinteză.
Sisteme de cultivare a microorganismelor

microorganismele se dezvoltă la atât la suprafaţă cât şi în interiorul


mediului de cultură. În mediul nutritiv la care s-a adăugat un agent
gelifiant şi s-a usucat la 45 – 500C, se inoculează microorganismul
la temperatura ambiantă.
ambiantă Coloniile formate după incubare permit
selecţia microorganismelor dorite. Condiţiile de cultivare pot fi
stabilite prin schimbarea compoziţiei mediului. Aerarea se
realizează
li ă prin
i aprovizionarea
i i cu aer steril.
t il DeD obicei
bi i se lucrează
l ă în
î
incubatoare cu CO2.

tipuri de bioreactoare : cu tăvi,


tip coloană cu umplutură,
în strat fluidizat şi cu strat fix
Configuraţia bioreactoarelor
Aspecte care trebuiesc urmărite la alegerea bioreactorului
¾ configuraţia biorectorului;
¾ mărimea bioreactorului;
¾ condiţiile bioprocesului din interiorul bioreactorului;
¾ sistem de operare utilizat (sistem submers/de suprafaţă;
continuu/discontinuu);
¾ cuplare/necuplare
l / l înî serie
i cu alte
lt bioreactoare.
bi t

În funcţie de natura procesului biotehnologic

¾ bioreactoare biologice - un proces de fermentaţie (cu biomasă);


- pot fi: pentru fermentaţii anaerobe,
aerobe;
¾ bioreactoare biochimice - procesele enzimatice.
- Pot fi: cu enzime libere,
cu enzime imobilizate şi
cu fază solidă
Configuraţia bioreactoarelor

Au forme constructive şi moduri de operare variate, funcţie de tipul procesului tehnologic

Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe

Clasificare:

după modul de introducere a energiei necesare


amestecării fazei lichide (substrat şi microorganisme) şi
dispersării fazei gazoase (aer):
- cu amestecare mecanică;
- cu pompă de recirculare;
- cu aer comprimat
Figura 12. Bioreactoare cu agitare mecanică.
(a) cu motorul aşezat la baza vasului; (b) cu
motorul la baza vasului şi cu draft interior; (c)
bioreactor cu agitator cu turaţie mare

Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe


Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe

Figura 13.
13 Bioreactoare
cu agitare mecanică cu
barbotare cu aer (prin
axul agitatorului sau
separat).
(a,b) cu
barbotare prin axul
agitatorului; (c) cu
barbotator separat cu
agitare pe sus; (d) cu tub
de aspiraţie a aerului.
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe

Figura 14.
Bioreactor cu Figura 15. Bioreactor cu pompă de recirculare a fazei lichide.
agitare la mai (a) cu recirculare externă; (b) cu buclă de recirculare; (c) cu
multe nivele recirculare cu jet; (d) cu recirculare internă, inversată
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe

Figura 16.
Bioreactoare cu aer
comprimat (a)
comprimat.
bioreactor tip
coloană cu bule; (b)
bioreactor tip turn cu
site
i perforate;
f (c)
( )
bioreactor tip „air –
lift”; (d) bioreactor
tipp “air lift” cu
coloană cu bule
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe

Figura 17. Bioreactoare


biochimice.
biochimice
(a) în sistem discontinuu,
cu enzime libere;
(b) în sistem continuu, cu
enzime
i libere;
lib
(c) în pat fluidizat (cu
enzime libere;
(d) cu eenzimee imobilizate
ob ate
pe suport
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe

Figura 18.
Alte tipuri
constructive de
bioreactoare.
bioreactoare
(a) cu film
lichid; (b)
pentru culturi
de suprafaţă
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe

Bioreactoare
Bioreactoare cu agitare mecanică

Figura 19. Bioreactor cu


agitare
g tipp ppentru culturi
aerobe
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe

Figura 20.
20 Tipurile de
rotoare utilizate la
realizarea agitatoarelor
pentru amestecarea
mediului de cultură din
bioreactor. (a) ancoră,
(b) elice, (c) turbină cu
palete plane,
plane (d) cu
palete tip zbatură, (e)
ancoră complexă, (f)
şurub elicoidal
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe

Caracteristicile
Ca acte isticile bioreactorului:
bio eacto ului:

¾ Amestecarea şi dispersia bulelor de aer – agitare mecanică;


¾ Omogenizarea
g mediului – şicane;
¾ Degajarea bulelor de aer – spărgător de spumă;
¾ Transferul de căldură – prin agitare şi turbulenţă,
o în timpul sterilizării (când se realizează în bioreactor)
bioreactor),
o în timpul fermentaţiei (sterilizarea se realizează în alt vas);
¾ Preluarea căldurii de reacţie degajată în timpul fermentaţiei
- sistem de răcire, cel mai des cu serpentine; dezavantaj – greu
de spălat şi sterilizat, incomodează sistemul de agitare;
- sistem de răcire cu schimbător de căldură exterior
Utilizare

- celule
l l libere
lib sau imobilizate
i bili t şii
- reacţii enzimatice cu enzime libere sau imobilizate
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Bioreactoare cu agitare mecanică
Bioreactoare
şi cu draft interior

creşte coeficientul de transfer de masă

circulaţia lichidului este modificată prin


introducerea unui cilindru metalic axial
fără fund şi capac numit „draft
draft”

Figura
g 23. Circulaţia
ţ lichidului într-un
bioreactor cu draft. (a) complet imersat în
lichidul de cultură, (b) cu revărsare
(adaptat după Keitel, 1978)
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe

Bioreactoare
Bioreactoare cu aer comprimat
Bioreactoare tip „coloană cu bule”.

variantă
i ă a bioreactoarelor
bi l cu agitare
i mecanică
i ă

agitarea mediului de cultură se realizează


exclusiv prin barbotare de aer

Caracteristicile hidrodinamice şi transferul


de masă depind în totalitate de
comportamentull bulelor
b l l eliberate
lib de
d
barbotor

utilizată în industria drojdii de bere, în


industria berii, a vinului şi în tratarea
apelor reziduale

Figura 24. Bioreactor tip coloană cu bule


Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe

Sistem
Si t omogen - bulele
b l l urcăă cu aceeaşii
viteză şi nu se amestecă între ele, iar
agitarea lichidului este limitată,

Sistem eterogen - viteza de barbotare


este mai mare; circulaţie haotică a
celulelor; bulele şi lichidul tind să se
ridice prin centrul coloanei, curentul de
lichid coboară pe lângă pereţii
bioreactorului, antrenează bulele, x
amestecarea aerului cu mediul de
cultură.

avantaj - cost de construcţie mic,


transfer de masă şi căldură satisfăcător
probleme - d spumare a mediului
de di l i
Figura 25. Circulaţia fluidului într-o coloană
cu bule aflată în regim eterogen
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe

Pentru îmbunătăţirea caracteristicilor de curgere şi amestecare se


construiesc bioreactoare tip coloană cu bule în mai multe
trepte. Astfel întâlnim:
- coloane cu bule divizate în câteva secţiuni prin site perforate şi
- coloane
l cu bule
b l care suntt prevăzute
ă t cu agitatoare
it t l l
locale.
Introducerea sitei perforate sau a agitării locale reduce intensitatea
amestecării axiale a lichidului şi creşte coeficientul de transfer de
masă.
Datorită varietăţii mari de configuraţii de bioreactoare tip
coloană cu bule (diametrul găurilor, secţiunea transversală liberă,
numărul de site perforate, varietatea compoziţiei mediului) nu s-au
elaborat relaţii generale de calcul şi control a parametrilor.
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe

Bioreactoare
Bioreac toare “air lift”

ƒ formă de turnuri cu buclă;


o „air lift” cu circulaţie internă
o „air lift” cu circulaţie externă

ƒcirculaţia lichidului se datorează


diferenţei de densitate a fazei aerate din
turn şi a zonelor nearerate;

utilizate ƒ culturi de celule vegetale,


ƒ culturi de celule animale,
ƒ culturi de celule imobilizate
ƒ biosinteza proteinelor microbiene
ƒ tratamentul
t t t l biologic
bi l i all nămolurilor
ă l il
Figura 26. Configuraţia bioreactoarelor „air lift”
Bioreactoare
Bioreactoare cu membrană
membrană de dializă
Motivaţii:
otivaţii: ¾ membranele
e b a e e de d dializă
a ă susunt u
un mijloc
j oc eeficient
c e de îndepărtare
depă a e
continuă a inhibitorilor sau a produşilor toxici rezultaţi în timpul
fermentaţiei
¾ alimentarea cu substrat a culturii microbiane se realizează prin
membrană
¾ se pot obţine concentraţii mari de microorganisme, deoarece
substratul este separat de microorganism şi nu poate exercita efecte
i hibi ii
inhibitorii
Utilizare: ¾ cultivarea sistemelor de două sau mai multe tipuri de microorganisme
¾ cultivarea celulelor umane
Modele:
Primul tip două vase între care schimbul de substrat sau produs se realizează
prin pomparea conţinutului printr-un modul de dializă situat între
cele
l două
d ă vase.
dezavantaje – sterilizarea sistemului (sistem multi-component);
- suspensia fermentată este pompată prin by-pas
by pas
Bioreactoare
Bioreactoare cu membrană
membrană de dializă

Figura 28. Reprezentarea schematică a bioreactoarelor cu membrană de dializă


Bioreactoare
Bioreactoare cu membrană
membrană de dializă
Al doilea tip

două tuburi flexibile care sunt fixate în interiorul bioreactorului de oţel, de fund şi
de capac
capac. Tubul mare
mare, care formează peretele fermentatorului
fermentatorului, este confecţionat din
folie de poliamidă cu o grosime a porilor de 80µm, în timp ce tubul mic formează
un cilindru în interiorul bioreactorului. Tubul mic este o membrană de dializă a
căror pori au dimensiunea de 20µm. Bioreactorul este echipat cu două unităţi de
agitare cu motoare separate ceea ce face ca turaţia motorului să poată fi controlată
separat.
p Aeraţia
ţ se ppoate realiza în ambele incinte în acelaşi
ş timp.
p Fermentatorul
poate fi sterilizat in situ ca un fermentator obişnuit, la 1210C, în timpul sterilizării
pereţii din folie de poiamidă putând fi protejaţi de o manta din cilindri de oţel.
Bioreactoare
Bioreactoare cu membrană
membrană de dializă

Figura 29. Bioreactor cu dializă


Bioreactoare
Bioreactoare cu tăvi

Aplicaţiile sunt limitate la microorganismele care se dezvoltă la suprafaţă şi


formează peliculă

În industrie s-au construit bioreactoare cu mai multe tăvi, aşezate una deasupra
celeilalte, astfel încât sterilizarea şi inocularea să poată fi efectuate automat. În
interior se introduce aer steril. Bioreactorul este exploatat în regim discontinuu.

O variantă a acestui tip de bioreactor a fost descrisă de Kybal şi Vlcek (1976)


care au propus utilizarea unor perne gonflabile de plastic, care pot fi umplute
cu mediu nutritiv, inoculate şi aerate prin tubul de fixare.
Bioreactoare
Bioreactoare cu tăvi

Figura 30.
30 Bioreactor cu
tăvi, sterilizabil, cu
răcire, cu alimentare prin
partea superioară
Bioreactoare
Bioreactoare tip coloană cu umplutură
O coloană verticală, umplută cu granule de biocatalizator sau cu biocatalizator
imobilizat.
Alimentarea cu mediu se face prin partea de sus - se formează o fază de lichid
continuă printre particule. Datorită frecării particulelor, deteriorarea celulelor, este
minimă
i i ă comparativi cu bioreactoarele
bi l cu agitare.
i
Transferul de masă dintre faza lichidă şi catalizatorul solid se realizează relativ uşor
dacă viteza de trecere a acestuia prin coloană este mare, iar pentru a fi îmbunătăţit
mediul lichid este recirculat.
recirculat
Aerarea mediului este bine să fie realizată separat. Dacă aerul este barbotat direct se
produce coalescenţa bulelor, apar canale prin umplutură şi distribuţia nu este
uniformă Din acelaşi motiv,
uniformă. motiv bioreactoarele cu umplutură nu sunt potrivite pentru
bioprocesele din care rezultă CO2 sau alte gaze. De obicei, aerul circulă în
contracurent cu lichidul pentru a intensifica înlăturarea căldurii degajate în timpul
fermentaţiei
ţ sau a reacţiei
ţ enzimatice.

Când se lucrează cu microorganisme acestea formează un „film biologic” în jurul


particulelor de umplutură.

Bioreactoarele cu umplutură se utilizează şi în cazul enzimelor sau celulelor


imobilizate.
Figura 31. Bioreactor tip coloană cu umplutură cu recirculare a mediului
Bioreactoare
Bioreactoare în strat fluidizat

Când bioreactorul cu umplutură este operat cu stratul în suspensie, atunci el


se numeşte „strat fluidizat”.

pentru prima oară, a fost descris de Moebus în 1981, şi a fost folosit la


fermentaţia glucozei la etanol folosind un strat fluidizat format din granule de
drojdie.

Gazul de fluidizare păstrează în acelaşi timp granulele în mişcare şi le usucă.


Aerul este introdus pe la partea inferioară a bioreactorului şi menţine în
suspensie
i cultura
lt d celule
de l l sau enzime
i i bili t Uneori
imobilizate. U i se foloseşte
f l t nisip
ii
sau un alt material care se amestecă cu celulele microbiene.

Procedeul este uneori folosit cu microorganisme floculate,


floculate în fabricarea berii
şi a oţetului.
Bioreactoare
Bioreactoare în strat fluidizat

Figura 32.
Bioreactor în pat
fluidizat
Bioreactoare
Bioreactoare cu strat fix

Reprezintă o variantă a bioreactoarelor cu umplutură, deosebirea constând în


introducerea şi distribuirea mediului lichid prin partea superioară a bioreactorului

lichidul circulă în jos cu viteză mică, scurgându-se pe particulele de umplutură.


Acest tip de bioreactor este mult mai utilizat în tratamentelor apelor reziduale,
când configuraţia bioreactorului se modifică prin introducerea unor „biofiltre”
(figura ).
A l pătrunde
Aerul ăt d prin i ferestrele
f t l ded la
l partea
t inferioară
i f i ă a bi
bioreactorului,
t l i se
ridică prin convecţie naturală şi alimentează cultura de microorganisme cu
oxigen.
Dezavantaje: utilizarea volumului reactorului în scopul creării unei
interfeţe cât mai mari; repartizarea uniformă a lichidului peste umplutură pentru
ca întreaga suprafaţă de lichid să lucreze uniform.
Bioreactoare
Bioreactoare cu strat fix

Figura 33. Bioreactor cu flux fix


Bioreactoare
Bioreactoare cu strat fix

Figura 34. Biofiltru utilizat la purificarea apelor reziduale


Bioreactoare
Bioreactoare cu enzime imobilizate
avantaje
v je la transformarea
so e subs
substanţelor
ţe o în cataliză
c eeterogenă
e oge :

• permite utilizarea repetată a enzimei;


• ppermite lucrul în instalaţii
ţ semicontinue şşi continue ((volumul mic
ocupat de instalaţie permite automatizarea proceselor);
• se elimină faza de inactivare termică deoarece enzima nu se regăseşte
amestecată cu produsul;
• se pot trata soluţii diluate de substrat (ape reziduale, subproduse);
• scade timpul de contact între enzimă, substrat şi produse;
•nu se formează produşi secundari.
Bioreactoare
Bioreactoare cu enzime imobilizate
Avantaje faţă de procesul de transformare a substratului cu ajutorul
microorganismelor:
c oo g s e o :
• se elimină faza de inactivare termică
• se pot trata soluţii diluate de substrat
•Scade timpul de contact între enzimă, substrat şi produse
• nu se formează produţi secundari
•în procesul de transformare se utilizează întreaga cantitate de substrat (în cazul
proceselor fermentative 1% din cantitatea de substrat este utilizată la
d
dezvoltarea
l microorganismelor);
i i l )
•datorită existenţei unei singure enzime există posibilitatea efectuării unei
singure reacţii enzimatice specifice (în cazul proceselor fermentative
microorganismele produc un complex de enzime care pot duce la transformări
secundare);
•costurile sunt reduse deoarece este eliminată faza de cultivare a
microorganismelor.
microorganismelor
tehnici de imobilizare a enzimelor:
Procedee fizice: Procedee chimice:
- adsobţia pe suporturi solide; - reticularea
i l i
intramoleculară;
l l
- includerea în structuri macromoleculare; - legarea covalentă pe suporturi
- microîncapsularea; insolubile reactive
Bioreactoare
Bioreactoare cu enzime imobilizate

Cantitatea de enzimă care se cuplează la suport variază de la 1mg – 1g


proteină/g preparat imobilizat

R
Reactivitatea
i i preparatelor
l imobilizate
i bili este influenţată
i fl ă dde următorii
ă ii factori:
f i

• granulometria –;
• masa moleculară a substratului –
• pH mediului de reacţie –
• stabilitatea preparatelor enzimatice imobilizate -
Bioreactoarele conţinând preparate enzimatice imobilizate se clasifică în:
• Discontinue cu agitare;
• Continue cu agitare;
• Continue
C ti d tip
de ti coloană;
l ă
• Continue în pat fluidizat

Alegerea
g tipului
p de bioreactor depinde
p de caracteristicile fizice ale
preparatului imobilizat, de capacitatea de producţie a instalaţiei şi de natura
substratului ce trebuie transformat.
ETAPE PRELIMINARE ÎNTR-
ÎNTR-UN
PROCES BIOTEHNOLOGIC
totalitatea paşilor necesari în vederea recuperării produsului final în orice
tip de industrie
Ex.: procesul de fermentatie clasic
La sfârşitul fermentaţiei
- separarea fazei solide (de obicei celule, dar şi celule împreună cu enzime pe un
anumiti tip
i de
d suport, sau componente ale l mediului
di l i de
d cultură)
l ) dde cea li
lichidă
hid care
în 90% din cazuri este apoasă.

Tabelul 4. Proprietăţile celulelor cu referire la procesul de separare


Proprietăţi Bacterii Drojdii Fungi

formă baghete, sfere, sfere, elipsoidice, filamente


catene filamente

mărime 0.5µm – 3 µm 1 – 50 µm 5 –15 µm diametru


50 – 500 µm
lungime

greutate 1,05 –1,1 1,05 – 1,1 1,05 – 1.1


specifică
greutatea 10-12 g 10-11 g -
celulei
Principiul de Metoda de separare Mărimea
Introducere separare particulelor (µm)

mărimea Filtrarea pe fibre >200 – 10


particulelor Microfiltrarea 20 – 0,5

Mărimea
ă i Ultrafiltrare
l fil 2 – 0,005
0 00
moleculei Hiperfiltrare 0,008 – 0,00025
Gel cromatografie 2 – 0,0003
Dializă 0,002 – 0,00025
Tabelul 5.
Clasificarea metodelor Temperatură Cristalizare <0,002
de separare

Solubilitate Adsorbţie <0,002


Extracţie <0,002

Sarcina Electroforeză 2 –0,02


electrică Electrodializă 0,02 – 0,00025
Cromatografie de schimb 0,02 – 0,00025
ionic

Densitate Sedimentare >1000


Decantare 1000 – 5
Centrifugare 1000 – 0,5
ultracentrifugare 2 – 0,02
Filtrarea
- separarea filamentelor de fungi şi bacteriilor filamentoase de bulionul de fermentatie
- separarea floculelor de fungiîn toate cazurile se foloseşte vacuum sau suprapresiune.
Tipuri de filtrare:
ƒ filtrare de suprafaţă,
ƒ filtrare de adâncime, vacuum / suprapresiune
p p
ƒ filtrare prin centrifugare;
Parametri filtrarii:
1. Rata de filtrare –
2. Rezistenţa filtrelor –
Tipuri de filtre:
simple, plate,
ansamblu de filtre
Exemple:
1. Separarea microorganismelor din bulionul de fermentatie
- baterie
b t i ded filtre
filt rotative
t ti
2. filtrarea mediilor de biosinteza
- cu ajutorul adjuvantilor de filtrare:
- în strat subţire pe materialul filtrant;
- amestecarea adjuvantului cu suspensia de filtrat;
- raclarea stratului de adjuvant - in cazul filtrelor rotative
variantă - filtrarea sterilizantă.
prefiltrare grosieră,
filtrarea sterilizantă propriu-zisă.
se montează în filtru plăci din acetat de celuloză,
azbest
b sau polimerili i sintetici
i i i cu diametru
di redus
d all porilor,
il
Avantaj: temp. scăzută, consum mic de energie, integrarea
filtrării cu spălarea, îndepărtarea parţială a apei
Dezavantaj: contaminarea cu aer

Cel mai adesea pentru separarea microorganismelor de bulionul de


fermentaţie se utilizează o baterie de filtre rotative menţinute sub
presiunea exercitată din interiorul reactorului – presiune constantă

Filtrele sub formă de centură - potrivite pentru precipitatele deja filtrate


şi care necesită o spălare mai îndelungată. Dacă acest tip de filtrare se
realizează într
într-o
o presă îndepărtarea apei se va realiza mai rapid.
rapid
Filtrarea

Figura 34. Reprezentarea schematică a filtru rotativ menţinut sub vacuum


Filtrarea pe membrane
metodă versatilă - utilizată pentru separarea şi concentrarea diferitelor molecule sau
particule
particule.
În ultrafiltrare membranele pot fi considerate ca o „sită” (membrane microporoase) a
căror mărime a porilor guvernează separarea.
Tabelul 7. Aplicaţiile filtrării pe membrane
Tipul de Aplicaţia Masa moleculară
filtrare relativă a particulelor ce
pot fi separate
microfiltrare concentrarea bacteriilor şi >1 000 000
virusurilor (sau particule)

ultrafiltrarea fracţionare; >10 000


dializă; (macromolecule)
producerea de enzime;
producerea de proteine;
producerea zerului
osmoza inversă concentrarea produselor >200
farmaceutice; (compuşi organici)
producerea lactozei;
desalinizarea parţială a soluţiilor;

electrodializa purificarea şi fracţionarea >100


substanţelor ionice; (compuşi organici)
desalinizarea

microfiltrarea – sistem închis


- avantaj: se lucrează în condiţii sterile
- se separă celule şi metaboliţi specifici
ultrafiltrarea - apare fenomenul de “polarizare a concentrării”
Filtrarea pe membrane

Figura 39. Secţiune transversală printr-un modul de ultrafiltrare „plate and


frame” (The Danish Sugar Co). 1 – grătar central; 2 – fereastră; 3 – membrană; 4 –
hârtie de filtru; 5 – suport plat pentru membrană
Filtrarea pe membrane

Figura 40. Reprezentarea schematică


a unui modul de ultrafiltrare „hollow-
fibre” ((romicon).
) 1 – hollow fibre; 2 –
lagăr; 3 - suport pentru fibre.
Centrifugarea

Performanţa unei centrifugări poate fi caracterizată de expresia:


Q = d2∆ρgZF/18η
şi
Z = Rω2/g
2/ ≅ Rn2/900
R 2/900
unde: Q – rata de încărcare volumetrică;
d – diametrul particulei;
∆ρ - diferenţa
dif ţ de
d densitate;
d it t
g – acceleraţia gravitaţională;
F – volumul păstrat în centrifugă;
η - vâscozitatea;
R – radius;
ω - viteza unghiulară;
N – numărul de revoluţii/minut
ţ

Funcţia Σ = FZ, este utilizată în compararea diferitelor centrifugări. Deoarece F creşte


cu lungimea axială a rotorului şi Z cu diametrul şi viteza rotorului,
performanţele utilizării unor rotoare mai lungi (F), mai rapide sau mai largi
(Z) sunt superioare. Valorile lui Z sunt limitate de natura materialului din care
este construit rotorul.
Centrifugarea

Figura 35. Exemple de centrifugi solide: (1) scobitură tubulară, (2)


scobitură solidă multicamerală, (3) centrifugă cu scobitură în formă de disc
Tipul de centrifugă Avantaje Dezavantaje Detalii tehnice

Centrifugarea
coş perforat bună îndepărtare a apei; capacitate limitată pentru n – 500 – 2500 min-1
Tabelul 6.6 uşor
ş de curăţat;
ţ ;
posibila spălare a filtrelor
solide;;
recuperare laborioasă a
Z – 300 - 1500
Σ - 900 – 1800
Proprietăţile solidelor;
forţă centrifugă mică;
diferitelor tipuri de funcţionare discontinuă

centrifugi centrifugă cu utilizată la separarea forţă centrifugă mică n – 500 – 1000 min-1
solidelor; Z - 300 – 1500
sită rotativă posibilă spălare a filtrelor;
funcţionare continuă

coş tubular bună îndepărtare a apei; capacitate limitată pentru n - 13000 – 18000 min-1
forţă
ţ centrifugă
g mare; solide; d – 75 – 150 mm
uşor de curăţat; recuperare laborioasă a Z – 13000 - 17000
uşor de îndepărtat coşul solidelor; Σ - 1500 - 4000
funcţionare discontinuă

coş capacitate mare pentru recuperare laborioasă a n – 5000 – 10000 min-1


solide; solidelor; d – 125 – 530 mm
multicameral nu pierde
i d eficienţă
fi i ţă până
â ă la
l f ţi
funcţionare di
discontinuă
ti ă Z - 6000 - 11400
solid completa încărcare a
camerelor

centrifugă cu trecere rapidă simultan cu forţă centrifugă mică n – 700 – 2500 min-1
o concentrare mare; Z – 350 – 1400
descărcare funcţionare
ţ continuă Σ - 900 - 2300
rotativă
centrifugă cu funcţionare discontinuă; îndepărtare slabă a apei; n – 3000 – 10000 min-1
forţă centrifugă mare; funcţionează numai cu Z – 4000 - 7500
scobitură în eliminarea lichidului sub solide mici în suspensie Σ > 270000
formă de disc presiune;
curăţare ieftină

centrifugă cu funcţionare continuă; îndepărtare slabă a apei; n - > 10000 min-1


forţă centrifugă mare Z > 14000
tub de elimin.
elimin. Σ > 80000
a sol.
sol. apoase
Aducerea în suspensie
În cazul celulelor bacteriene cu dimensiuni mici
Metode: - formarea de floculi
- metoda de plutire
Dezintegrarea celulelor
Microorganisme:

Figura 36. Metode de rupere a microorganismelor


Celule animale şi vegetale – metode mecanice
- îngheţare rapidă şi tăiere – cel. anim.
- liză enzimatică – cu celulaze şi hemicelulaze- cel. Veg.
Metode de extracţie
termenul de extracţie se referă atât la separare cât şi la concentrare
Distribuţia substanţei între cele două faze este guvernată de un coeficient de
partiţie caracteristic, K:
Concentratia substantei in faza A
K=
Concentratia substantei in faza B

Figura 37. Procesul tehnologic de recuperare a antibioticelor


Metode de concentrare

- trebuie să nu afecteze structura şi activitatea produsului


- printr-o etapă de separare sau extracţie
-ca o ultimă etapă
p înainte de purificarea
p economică;;
-- tipuri:extracţia, evaporarea,
- procesarea pe membrane,
- cromatografia de schimb ionic,
- cromatografia de adsorbţie
Evaporarea
Se ap
aplică
că laa so
soluţiile
uţ e obţ
obţinute
u e în u
urmaa eextracţiei
acţ e cu so
solvenţi,
ve ţ , ca
caz în ca
caree evapo
evaporarea
a ea
solventului este obligatorie.
Evaporarea directă a mediului de cultură - în cazul produşilor secundari, de obicei
prin folosirea unui spray de uscare;
Evaporarea în timp scurt (min.) – este continuă; permite concentrarea produselor
instabile cu ajutorul unor filme de evaporare;
Evaporarea cu filme subţiri sub formă de peliculă – concentrarea amestecurilor
vâscoase, sau în faza
f fi l de
finală d uscare a produsului.
d l i

Filtrarea pe membrane
Răşini schimbătoare de ioni şi de adsorbţie
Răşini schimbătoare de ioni: - concentrarea puternică într-o singură etapă.
Tabelul 8.
8 Natura chimică a schimbătorilor de ioni solizi şi lichizi
Schimbător de Matrix Grupări funcţionale
ioni

Răşini Stiren-divinil.benzen; Carboxil;


schimbătoare de Acrilat; Acid sulfonic;
ioni solide Metacrilat; Amine primare, secundare şi
Poliamina; terţiare;
Celuloză; Amine cuaternare
Dextran
Schimbători de ioni Solventul este folosit pentru Amine primare,
primare secundare şi
lichizi transportul grupelor terţiare;
funcţionale Monoesterul acidului fosforic;
Diesterul acidului fosforic

Răşini de adsorbţie: - sunt utilizate în locul procedeelor de extracţie


Tabelul 9. Proprietăţile răşinilor de adsorbţie
Suprafaţă 20 – 800 m2g-1
Volumul porilor 0,5 – 1,2 ml g-1
Proprietăţi fizice Mărimea medie a porilor 5 – 130 nm

Nepolar: stiren-divinil
i i i i benzen;
Semipolar: ester acrilic;
Proprietăţi chimice
Polar: sulfoxid, amide, grupările N-O
Purificarea şi stabilizarea amestecului
În fiecare din etape se realizează o purificare a produsului finit. În final se
ajunge cu un produs al cărui grad de puritate nu este întotdeauna satisfăcător
motiv pentru care este necesară introducerea unei etape finale de purificare şi
stabilizare. În prezent se utilizează două metode de purificare: cristalizarea şi
cromatografia.
fi
Cristalizarea
Este folosită la purificare compuşilor cu masă moleculară mică
mică, cum sunt de
exemplu antibioticele.

La o scară mai mare cristalizarea este etapa


p finală de ppurificare a unor pproduşi
ş
ca actinomiceina A, penicilina G, acidul citric, glutamatului de sodiu etc.
Cromatografia
purificarea compuşilor cu masă moleculară mică care într-adevăr necesită
parcurgerea unei astfel de etape (de exemplu antibioticele), a macromoleculelor, a
enzimelor atunci când sunt însoţite de compuşi de aceiaşi natură.
Purificarea şi stabilizarea
amestecului

Figura 41. Izolarea şi


purificare actinomicinei
Purificarea şi stabilizarea
amestecului

Echipamentul constă
într-o baterie
b i de d coloane
l
cu diferite matrixuri,
rezervoare, sisteme de
pompare a eluentului şi
o serie de colectoare de
fracţii.

Figura 42. C=PHARMACIA 1501


segment de coloană din oţel: P –
filt S1, S2 - filtre
filtru, filt sterile,
t il Fl – flow-
fl
metru, UV – spectrofotometru UV
Purificarea şi
stabilizarea amestecului

Figura 43. Procesul


tehnologic de purificare a
proteinelor plasmatice umane
(Curling, 1980)
Purificarea şi stabilizarea amestecului
Prin cromatografie de afinitate se purifică în special enzimele dintr-un
amestec de proteine.
proteine Folosindu
Folosindu-se
se o soluţie tampon cu pH diferit de cel al
enzimei, enzima poate fi eluată selectiv de pe coloană. Astfel de efectori
specific sau molecule complementare care pot fi separate prin acest procedeu
sunt: wŽ enzime/inhibitori enzimatice (sau vice-versa);
wŽ anticorpi/antigene sau haptene (şi vice-versa);
wŽ lectine/glicoproteine sau polizaharide;
wŽ acizi nucleici/secvenţe
ţ de baze complementare;
p ;
wŽ hormoni/receptori;
wŽ vitamine/proteine transportoare etc.
exemplu:
wŽ principiul de separare a dehidrogenazele se bazează pe interacţiile specifice
cu coenzima sa (NAD+). Ca matrix se foloseşte sepharoză la care este legat NAD+.
wŽ Interferonul din leucocitele umane este recuperat prin cromatografie de
afinitate,
fi i de
d pe o coloană
l ă dde ddextran lla care a fost
f legat
l anticorpul
i l monoclonal
l l
împotriva interferonului.
Dezavantaj: cost mare al efectorilor imobilizaţi
C
Cromatografia
t fi de
d afinitate
fi it t de
d grup specific:
ifi în
î separarea glicoproteinelor
li t i l şii
nucleotidelor
Cromatografia covalentă: separarea proteineor care contin grupări -SH
Uscarea

Este modalitatea prin care bioprodusul este adus în formă stabilă pentru a putea fi
manipulat, ambalat, transportat. Deoarece majoritatea produşilor biologici sunt
sensibili se descompun uşor sau îşi pierd activitatea atunci când se găsesc la
temperaturi înalte, singura metodă de uscare este îndepărtarea apei cu o creştere
minimă a temperaturii. În cazul enzimelor şi a produselor farmaceutice
termostabilitatea este asigurată prin adăugarea de zaharuri sau alţi stabilizatori inerţi.

Pentru a elimina apa sub formă de vapori, energia rezultată în urma încălzirii
trebuie transferată prin convecţie, radiaţie, sau ambele procedee combinate şi
controlată strict ppentru a nu p
permite depăşirea
p ş pragului
p g de temperatură.
p Cele mai
utilizate tehnici sunt:
• uscare la vacuum
• uscare cu jet de gaz
• uscare prin îngheţare rapidă
BIOMASA MICROBIANĂ CA SURSĂ
DE OBŢINERE A PROTEINELOR
Introducere
„single cell protein
protein” (SCP) - o singură proteină celulară - termen utilizat şi
acceptat pentru materialul celular microbian folosit ca hrană şi furaj. Termenul
nu este în totalitate corect - proteina obţinută ca produs al unui proces
biotehnologic nu este 100% pur. Termenul a fost atribuit ţinând cont de faptul
că o proteină se poate obţine dintr-o varietate de microorganisme mono – şi
multicelulare, bacterii, drojdii, fungi filamentoase sau alge

Tabelul 10.10 Exemple de microorganisme care pot fi


utilizate ca sursă de obţinere a SCP
Caracteristica Paecilomyces Fusarium Candida
varioti graminearum utilis
Material uscat (%) 96 94,2 91
Proteină crudă (% N x 6,25) 55 54,1 48

Grăsimi (%) 1,0 1,0 1,35


Cenuşă (%) 5 6,1 11,2
Li ină (g/16g N)
Lizină 65
6,5 35
3,5 72
7,2
Metionină (g/16g N) 1,9 1,23 1,0
Cistină şi cisteină (g/16g N) 1,0 0,75 1,0
Introducere
¾producerea microorganismelor la scară industrială în vederea obţinerii unor
produse alimentare - în Germania, în timpul Primului Război Mondial -
producerea de drojdie „Torula”.
¾ SUA şi Marea Britanie -
¾P i
¾Prima C f i ţă - 1967 la
Conferinţă l Institutul
I tit t l de
d Tehnologie
T h l i din di Massachusetts;
M h tt
majoritatea proiectelor prezentate au fost la nivel de cercetare. O singură
prezentare, cea a cercetătorilor de la „British Petroleum” (BP) a scos în evidenţă,
aplicaţiile fermentaţiei SCP la scară industrială.
industrială
De ce să producem SCP?
¾creşterea cerinţelor pieţei pentru hrană mai sănătoasă
¾furaje în compoziţia cărora intră proteine înalt purificate printr-oprintr o tehnologie
avansată
¾avantajele producerii la scară largă a biomasei microbiene:
ƒ rată mai mare de multiplicare,
multiplicare
ƒ conţinut proteic ridicat (30 – 80% proteine în masă uscată),
ƒ utilizarea unui număr mai mare de surse de carbon,
ƒ sitele de cernere se p
pot construi din materiale mai bune şşi relativ uşor,
ş ,
ƒ instalaţiile de producţie ocupă suprafeţe mici şi duc la creşterea randamentului
de producţie,
ƒ producţia microbiană este independentă de anotimp, variaţii climaterice.
Procesul de obţinere a SCP
Etapele procesului de obţinere a SCP se stabilesc în funcţie de substratul şi
organismul utilizat

Figura 44. Reprezentarea schematică a unui proces general de producere a SCP


Procesul de obţinere a SCP
Etape
pe de bbază::
ƒ combinarea fizică şi tratamentul chimic al materiilor prime de bază;
ƒ prepararea mediului corespunzător care conţine surse de carbon, azot, fosfor, şi
alţi nutrienţi esenţiali;
ƒ prevenirea şi contaminarea mediului sau a plantelor;
ƒ cultivarea microorganismului necesar;
ƒ separarea biomasei microbiene de mediul consumat;
ƒrecuperarea biomasei –
ƒspargerea celulelor –
ƒ tratamentul final al biomasei cu sau fără etape de purificare finală,
ƒîndepărtarea excesului de substrat sau a componentelor acestuia –,
ƒreducerea
reducerea concentraţiei ARN –
ƒtratarea reziduurilor –
ƒ se recuperează între 18 şi 45 x 106 litri funcţie de substrat şi microorganism la o
pproducţie
ţ de 100.000 t SCP/an
Selectarea microorganismelor
C c e s c de bază
Caracteristici b aalee microorganismul
c oo ga s u utilizat
u a pentru
pe u obţinerea
obţ e ea unei
u e
anumite proteine:
¾să nu fie patogenic pentru instalaţie, animal sau om;
¾să aibă o valoare nutriţională bună;
¾să fie acceptat pentru hrană şi furaje;
¾să nu conţină compuşi toxici;
¾producerea la scară largă să necesite costuri minime.

De reţinut: costul de producţie depinde de:


¾viteza şi randamentul de creştere,
¾conţinutul în proteina ţintă,
ţintă
¾necesarul de nutrienţi suplimentari,
¾utilizarea unui mediu avantajos,
¾proprietăţile
p p ţ de uscare şşi separare
p
Selectarea microorganismelor
Tabelul 11. Compoziţia în aminoacizi a drojdiilor şi a unor alimente selectate
Conţinutul de aminoacizi (g/16g N) în:
Proteine tradiţionale
Proteine
SCP din componente
Aminoacid alimentare
furajere
T
Toprina
i P kil
Pekilo S h
Sacharomic i Făinăă
Făi E t t din
Extract di O
Ou R f i ţ
Referinţe
es cerevisiae de fasole de soia FAO
peşte

izoleucină 5,1 4,8 4,6 4,6 5,4 6,7 4,2

leucină 7,4
, 7,4
, 7,0
, 7,3
, 7,7
, 8,9
, 4,8
,

fenilalanină 4,3 4,0 4,1 4,0 5,1 5,8 2,8

tirozină 3,6 3,5 - 2,9 2,7 4,2 2,8

treonină 4,9 4,1 4,8 4,2 4,0 5,1 2,8

triptofan 1,4 1,1 1,0 1,2 1,5 1,6 1,4

valină 5,9 5,1 5,3 5,2 5,0 7,3 4,2

arginină 5,1 5,3 - 5,0 7,7 - -

histidină 2,1 1,9 - 2,3 2,4 - -

lizină 7,4 6,5 7,7 7,0 6,5 6,5 4,2

cisteină 1,1 1,0 - 1,0 1,4 2,4 2,0

metionină 1,8 1,9 1,7 2,6 1,4 5,1 2,8

aminoacizi cu 2,9 2,9 - 3,6 2,8 7,5 4,8


sulf
Selectarea microorganismelor
Algele –genurile
genurile Chlorella, Scenedesmua,
Scenedesmua sau Spirulina.
Spirulina
¾cresc prin procedee fotosintetice şi autotrofice sau heterotrofic
¾cultivare la scară largă - în eleştee deschise, la lumina soarelui.
¾Probleme:
¾Risc crescut de contaminare,
¾densitate celulară mică,
¾alge unicelulare → costuri ridicate pentru procedeele de recoltare
¾compoziţia în proteine
¾conţinutul total de proteine native (ntotal x 6,25) ≥60% → profilul în
aminoacizi al SCP este în general bun.
bun
¾algele cu un conţinut bogat de pigmenţi fotosensibili → la producerea de SCP
pentru furaje, dar nu şi pentru alimente.
¾ i
¾microalgele-
l l utilizate
tili t pentrut obţinerea
bţi d proteine
de t i aditive,
diti d nu în
dar î concentraţie
t ţi
mare şi în anumite condiţii de calitate.
¾incorporarea algelor Chlorella şi Scenedesmus în dieta umană → numeroase
probleme;
bl S i li este foarte
Spirulina f d utilizată
des ili ă
Selectarea microorganismelor

Bacteriile –
¾rată mare de creştere,
¾numărul de bacterii utilizate în producerea de SCP este în continuă creştere
¾standard ridicat de sterilitate în întreg procesul tehnologic
¾recuperarea
p bacteriilor p
prin centrifugare
g este o pproblemă - noi metode care să
permită omorârea acestora şi nu deversarea în mediu
¾conţinut proteic de aproximativ 80%,
¾conţinut
ţ ridicat de ARN care trebuie îndepărtat
p
¾profilul în aminoacizi al SCP este în general bun; câteodată prezintă un
conţinut mic de aminoacizi cu sulf
Selectarea microorganismelor

Drojdiile –genurile Saccharomyces, Torulopis şi Candida


¾viteza mare de creştere a culturilor
¾risc redus de contaminare cu agenţi patogeni
¾recuperare – din reziduuri, uşor, prin centrifugare continuă.
¾conţinutul în proteine este de aproximativ 55-60%,
55 60%
¾conţinutul în acizi nucleici este >15% din greutatea de bază (este necesară o
etapă de reducere a concentraţiei acestora)
¾ fil l aminoacizilor
¾profilul i i il din
di structura
t t SC - în
SCp î generall bun
b
Selectarea microorganismelor
Fungii filamentoşi –
¾ sistem de cultivare - culturi în suspensie sub formă de filamente sau de pelete,
¾ viteză de creştere mai mică decât a bacteriilor şi drojdiilor; microfungii pot
atinge
g o viteză de creştere
ş apropiată
p p de cea a drojdiilor
j
¾ risc redus de contaminare cu agenţi patogeni (cresc la un domeniu de ph mai
larg, între 3 şi 8 ceea ce permite cultivarea lor la ph 5)
¾ risc de contaminare cu drojdii
j
¾ recuperarea fungilor - filtrare.
¾ conţinutul în proteine variabil; 50 – 55% din total substanţă uscată.
¾ conţinut în ARN - până la aproximativ 15% din masa uscată,
¾ conţinut în chitină - până la aproximativ 15% din masa uscată
¾ profilul aminoacizilor din structura SCP – bună (săracă în aminoacizi cu sulf)

Alegerea substratului
Sursele de compuşi cu conc. mici de carbon
d ă grupuri:
două i - “fosile”
“f il ”
- “reînnoite”
Alegerea substratului

Hidrocarburi lichide –n-alcanii (saturaţi,


( cu catenă liniară)) C9 - C18
¾0 -30 % în uleiurile naturale şi în kerosen
¾benzina - numai 10% fermentează, restul trebuie recuperat, separat de SCP, şi
returnat la rafinărie pentru o procesare ulterioară
- posibilă contaminare cu policicluri aromatice
¾transferul n-alcanilor C10 – C18 în celulă –
¾ macro – emulsia care este transformată într-o micro – emulsie →
obţinerea agenţilor de emulsionare - surfactanţi
¾sursă de energie şi carbon -
¾Compania „Britisch Petroleum” (BP) - două procese de producţie:
¾ benzina
¾ n-alcanii puri.
¾„Toprina” - produs omologat de BP şi comercializat
¾ Instalaţie de cultivare a Candida utilizând ca substrat benzina
Alegerea substratului

Hidrocarburile gazoase –cel mai des utilizat este metanul


¾avantaje:
•disponibil la puritate mare;
• uşor îndepărtat în urma procesului de fermentaţie
• nu lasă reziduuri;
• cultivare continuă → randament bun, productivitate ridicată
¾probleme de producţie
¾ transferarea a două gaze – metan şi oxigen
¾ formarea în mediu a unor produşi de inhibiţie
¾ explozie dacă concentraţia de oxigen depăşeşte 12% (v/v)
¾ foarte costisitor
¾microorganisme capabile să utilizeze metanul ca substrat - bacteriile
Pseudomonas methanica, Methanomonas methanica, bacteriile termofile
Methylococus
y capsulatus
p şi Pseudomonas methanitrificans.
f
Alegerea substratului

Metanol - alternativă a producerii de biomasă din metan


¾se fabrică din metan prin conversie salvându-se astfel surplusul de gaz
natural, dar şi din alte surse cum ar fi cărbunele, motorina, lemnul şi naftalina
¾este utilizat de bacteriile metanifere şi de Methylomonas methanolica,
Pseudemonas utilis, Pseudomonas extorquens, hydromicrobium sp;
actinomicite: Streptomyces sp, drojdii Hansenula polymorpha, Candida
boidinii, Torulopsis glabatra.
¾avantaje:
j
¾ perfect solubil în apă,
¾puţine posibilităţi de explozie,
¾numărul de microorganisme
g care ppoate fi cultivat este mare
¾produs de Imperial Chemical Industries Ltd (ICI) (UK) → bacteria
Methylophilus methylotrophus
Alegerea substratului
Polizaharide
P li h id hidrolizate
hid li – celuloza
l l şii amidonul
id l
¾hidoliza se poate realiza enzimatic sau prin tratament acid
¾celuloza - hidroliza se realizează sub acţiunea celulazei din fungi, ca de exemplu
Trichoderma viride
- proces scump
¾amidonul - procesul tehnologic este prea scump
- Rank Hovis McDougall (RHM) → proces bazat pe hidroliza amidonului;
ca microorganism a fost selectat mucegaiul Fusarium graminearum
- pus în fabricaţie sub denumirea de „Mycoprotein”
- dezavantaj - se transformă în gelatină
- se preferă creşterea microorganismului pe materiale solide, în absenţa
lichidelor - „fermentaţie semi-solidă”
DIGESTIA ANAEROBĂ
1. Introducere
1.

Definiţie: procesul anaerob de producere a metanului şi a dioxidului de carbon


di materiale
din t i l organice
i prini utilizarea
tili unuii amestec
t ded microorganisme.
i i

Fermentaţia - proces catabolic anaerob în care energia se obţine în urma


degradării compuşilor organici care pot fi atât donori cât şi acceptori de
electroni.
- microorganisme anaerobe şi facultativ anaerobe,
- substraturi: polizaharidele (celuloză, amidon, chitină),
dizaharidele (zaharoză, lactoză, manoză), hexozele (glucoză, fructoză,
galactoză), pentozele, polialcoolii (glicerol, manitol), aminoacizi, acizi
organici, purine şi pirimidine.
- produşi: alcooli, acizi, esteri şi diferiţi compuşi în stare
gazoasă (H2, CH4, CO2).
- beneficii comerciale: producerea de energie, reducerea
poluării şi controlul diferitelor mirosuri
2.Caracteristici
2. Caracteristici biochimice şi microbiologice ale digestiei anaerobe
2 1 Interacţii specifice
2.1.
¾ realizarea unui complex omogen interdependent de culturi bacteriene;
¾ formarea metanului, acetatului, H2 şi CO2:
• bacterii
b t ii utilizează
tili ă un numără li
limitat
it t de
d substraturi
bt t i
• acţiunea bacteriile fermentative şi hidrolitice asupra deşeurilor organice →
substratele metanogene;
• producerea H2:
- bacterii fermentative
- bacterii acetogenice → acetat + H2
- bacterii metanogene → CH4 + CO2
• avantajele metodei:
- organismul introdus în bioreactor poate utiliza protonii sau acceptorii
de electroni generând H2
- H2 poate fi utilizat de bacteriile metanogene
• presiunea parţială scăzută a H2 permite creşterea bacteriilor pe substrate
reduse
-Bryant (anii ’60) → cultură pură de methanobacillus omelianskii
• probleme: dificil de identificat speciile de microorganisme din bioreactor
2.Caracteristici
2. Caracteristici biochimice şi microbiologice ale digestiei anaerobe
Concept: în toate procesele de digestie care utilizează ca substrat deşeuri complexe
întâlnim toate grupurile de microorganisme trofice

anii ’60: o cultură pură de metanogene


poate utiliza ca sursă de energie un
număr limitat de compuşi;
anii ’80: McInerney şi col. -clasificarea
taxonomică a metanogenelor
g - toate
speciile pot obţine energie în urma
reacţiei:
4H2 + CO2→CH4 + 2H2O ∆G0’ = - 139
kJmol-1

Figura 47.
47 Populaţia microbiană
prezentă în bioreactorul de
digestie
3. Tipuri de bioreactoare de digestie
¾deşeurile produse într-o fermă obişnuită;
¾i t l ţii robuste,
¾instalaţii b t construite
t it din
di materiale
t i l locale,
l l care pott funcţiona
f ţi
Bioreactoare în sistem batch sau continuu, prin alimentare cu deşeuri o dată pe zi;
clasice: ¾nu sunt încălzite, sunt amestecate manual şi sunt izolate cu materiale
locale

Bioreactoare batch:

bioreactor ce funcţionează în sistem continuu, cu agitare (CSTR


CSTR –
„continuously stirred tank reactor”)
reactor”

este un sistem continuu Ö în bioreactor va exista în permanenţă un amestec


format din deşeuri noi care se adaugă, material nedigerat şi câteva populaţii
microbiene active;
există:
i tă
¾ bioreactoare tubulare numite „plug flow”
¾ bioreactoare în care are loc reţinerea microorganismelor
este necesar un vas de stocare a gazului;
întâlnit în tratamentul noroiurilor
4.Tipuri
4. Tipuri de deşeuri utilizate ca substrat

¾în funcţie de consistenţă: deşeuri de consistenţă joasă,


Clasificare medie şi
crescută şi
d
deşeuri
i solide.
lid
¾în funcţie de conţinutul în masă uscată de substanţe solide (TS):
0,2 –1%,
1 5% 55-12%
1-5%, 12%
20-40% substanţă solidă.
Metode

determinare volatilităţii solidului (VS) care implică încălzirea materialului uscat


la 500 0C pentru a îndepărta materialul organic ca CO2 şi
determinarea necesarului de oxigen (COD „chemical oxigen demand”) care în
mod uzual se aplică deşeurilor cu o consistenţă mare şi implică o oxidare chimică
cantitativă a materialului organic.
BOD5 „biochemical oxygen demand measused over a 5-day period”,
TOC „total
t t l organic
i carbon”
b ” – utilizată
tili tă pentru
t materialele
t i l l solubile.
l bil
4.Tipuri
4. Tipuri de deşeuri utilizate ca substrat

Caracteristici: ¾ un mediudi de
d creştere
t bunb pentrut populaţie
l ţi şii nutrienţi
t i ţi - de
d obicei
bi i
se utilizează un raport între atomii de C şi N de 40:1;
¾ un pH care să varieze în jurul lui 7;
¾ trebuie notată concentraţia potenţialilor inhibitori

¾ industriale şi alimentare –
Surse de ¾ bălegarul animal –
deşeuri: ¾ biomasa agricolă –
¾ deşeu
deşeurilee din
d apele
pe e reziduale
e du e orăşeneşti
o şe eş
5. Parametri digestiei
¾ bacteriile mezofile : 20 – 250C şi 40 – 450C
¾ bacterii termofile 50 – 550C şi 60 – 650C pentru,
¾ trecerea de la temperatura mezofilă la cea termofilă care poate fi
Temperatura: accidentală şi pentru o scurtă perioadă de timp poate duce la
prelungirea
l i timpului
i l i de
d producere
d a gazului
l i cu câteva
â săptămâni.
ă ă â i
¾ similar în cazul adaptării populaţiilor mezofile la condiţiile de
temperatură termofile.
¾ digestia termofilă este mai puţin stabilă;
¾ avantaj - distrugerea patogenilor şi a animalelor parazite

Timpul de reţinere a apei


Timpul de reţinere hidraulică (HRT) = perioada de timp cât lichidul rămâne în
bioreactor;

Volumul bioreactorului
HRT =
Volumul de deşeuri adăugate zilnic
Indicele de încărcare a bioreactorului -
Acizii graşi volatili -
Digestia în două etape -
6. Obţinerea acizilor organici şi a aminoacizilor
2 Introducere

Acizi organici: acidul citric, gluconic, itaconic, 2-cetogluconic,


eritorbic, tartaric, lactic şi acetic şi acizii graşi volatili;
Aminoacizi: acidul L-glutamic,
L glutamic L-lizina,
L lizina acidul L-aspartic,
L aspartic L-
L
triptofanul şi D-arilglicina (care este folosită în producerea
semisintetică a penicilinei);
cei mai importanţi sunt acidul citric,
citric acidul glutamic şi lizina.
lizina

Tabelul 12. Producţia mondială a principalilor acizi de fermentaţie


Produs Unităţi Producţia totală
($/kg) (t/an)

Acid glutamic 3,5 – 4,0 300 000

Acid citric 1,5 300 000

Lizină 5,0 – 5,5 40 000

Acid lactic 1,0 – 1,5 40 000


Introducere
Aspecte de urmărit:

1. Procesele chimice de obţinere a unor astfel de compuşi competiţionează


cu căile metabolice, ultimele fiind mai eficiente şi mai economice;
2
2. pentru o fermentaţie
f i eficientă
fi i ă este necesarăă alegerea
l cu atenţiei a
organismului, a speciei sau a mutaţiei şi a căii de creştere în condiţii
nutriţionale corecte, deoarece preţul de cost al procesului biotehnologic
depinde de costurile utilizării substratelor;
3. în cazul majorităţii proceselor fermentative de obţinere a produşilor
chimici este necesar un control real al tuturor condiţiilor de fermentare şi
de recuperare a produsului finit;
4. în toate cazurile un proces biotehnologic de succes este acela în care
produsul
d l este t obţinut
bţi t în
î concentraţia
t ţi dorită,
d ită la
l puritatea
it t maximă
i ă şii după
d ă
un proces de recuperare mai puţin laborios.
Aplicaţii
Acidul citric
¾este obţinut primordial din sucul de lămâie sau citrice;
¾o producţie mondială de 300 000 t/an;
¾agent de acidulare a sucurilor şi produselor de
cofetărie,agent
, g de complexare,
p , de reducere a p proceselor
oxidative şi de decapare a metalelor. organism de fermentare
- mucegaiul din rasa Aspergillus niger şi câteva rase de
drojdii;
¾substrate: melasa din sfeclă, sucroza, melasa din tulpină de
trestie, sau sirop de glucoză purificat din porumb;
¾n-parafină şi rase de Candida sau alte drojdii -
neeconomice i datorită
d i creşteriiii preţului
l i produşilor
d il petrolieri;
li i
nu au fost aplicate la scară largă

Mecanismul biochimic care stă la baza obţinerii acidului citric din Aspergillus
niger nu este pe deplin elucidat, dar se ştie că implică o versiune incompletă a
metabolismului acizilor tricarboxilici.
Aplicaţii

Figura 48. Formarea acidului citric. Linia punctată indică punctele de control ale procesului
Aplicaţii

Figura 49. Reprezentarea schematică a unui proces tehnologic, submers de obţinere a


acidului citric din melasă.
Aplicaţii
Acidul gluconic ¾ Aplicaţii:
¾agent de complexare,
complexare
¾medicina veterinară,
¾ eliberarea de lungă durată a acidului în procesul de coacere
¾Obţinere:
¾oxidarea electrolitică a glucozei
¾oxidare cu aer sau oxigen pe catalizator de platină
¾ procese fermentative - ca substrat A. Niger
¾oxidare catalitică a glucozei - glucozoxidază imobilizată
¾Etape:
¾ Obt. substratului:
glucozoxidaza gluconolactonaza
Glc glucono –δ-lactonei ac.gluconic
¾ Fermentaţia:
mediul: sol. de Glc monohidratată (amidon hidrolizat), nutrienţi (sursă de N,
mediul
PO43-, Mn2+, elem.min), lichior moale de cereale (extract de drojdii)
inocul: spori de A.niger (inocul vegetal)
inocul
t
tancuri
i de
d fermentaţie
f t ţi
¾Recuperarea
acidul gluconic; gluconatul de calciu, glucono-δ-lactona
Aplicaţii

Acidul tartric
¾Aplicaţii:
¾acidifiant în industria alimentară
¾ Obţinere: acid tungstic
g
¾sinteză chimică: acidul maleic + apa oxigenată amestec racemic
intermediar: formarea acid. cis-eposuccinic, B stoparea reacţiei prin
controlul temperaturii.
¾di reziduurile
¾din id il acumulate l în vanele l de
d producere
d a vinului
i l i
¾metoda fermentativă
¾specii de Acetobacter capabile să producă alături de 5 –cetoglutarat şi
cantităţi mici de acid tartric,
tartric dar numai în anumite condiţii.
condiţii
¾în anii ’80, Yamada şi colab. - mutanţi de Gluconobacter suboxydans
¾hidroliza enzimatică - rezultatele nu au depăşit nivelul de staţie pilot
- hidroliza stereospecifică a cis
cis-eposuccinatului
eposuccinatului (bacterii)
- trecerea celulelor spălate sau a extractului apos de celule peste un
substrat de cis-eposuccinat
¾produs
p în soluţie:
ţ îndepărtarea
p celulelor sau a enzimei imobilizate.
¾Recuperare
¾sub formă de tartrat de calciu; fosfatul de calciu; săruri insolubile de calciu
Acidul lactic
Aplicaţii
¾Aplicaţii:
¾A li ţii
¾ ind. alimentară – acidifiant
¾ medicină
¾alte industrii
¾Obţinere:
¾proces de fermentare anaerobă;
¾Procese fermentative heterolactice: produşi finali – lactat, etanol, dioxid de
carbon şi eventual acetat;

Figura 50. Calea fosfoketolazei


Aplicaţii
Fosfoketolaza – Ba. heterofermentative Lactobacillus şi Acetobacter
- acţionează asupra glucidelor fosforilate C5 şi C6 Ö acetil fosfat şi
gliceraldehid 3 fosfat sau eritrozo 4 fosfat.
- se formează acetil fosfat Ö etanol cu regenerarea NAD+;
Ö acetat pprintr-o reacţie
ţ care produce
p ATP;
-gliceraldehid 3 fosfat Ö piruvat Ö lactat
- este prezentă şi la drojdii: xiloza Öxilitol Ö xiluloză Ö xilulozo 5 P
pe xiluloză: xiloză izomerază xiluloză
- la Ba. care cresc p
- calea C5-fosfoketolazei nu înlocuieşte glicoliza dar oferă
organismului o cale eficientă de convertire a pentozelor la unităţi C2 şi C3 pentru
metabolizarea lor ulterioară

Procese fermentative homolactice - Lactobacillus bulgaricus şi L. delbrückii.


- substrat: - lactoză (zer), glucoză (sirop), sucroză în stare pură sau din melasă de
sfeclă;
- proces clasic anaerob: dizaharidele Ö hexoze Ö piruvat Ö acidul L(-) lactic
-nutrienţi: carbohidraţi, nutrienţi anorganici, surse de azot (organic; anorganic –
lichior din tulpină de cereale
cereale, malţ de muguri
muguri, extract de drojdii),
drojdii) vitamine
Aplicaţii
Etape:
- prima etapă: formarea suspensiei active de Lactobacillus care creşte până
ajunge la faza de inoculum vegetativ
- parametri fermentaţiei: proces continuu; vase mari din inox sau lemn; fără
agitare; 6 – 7 zile; temp. diferite (Ba. L. Delbrückii – > 500C, Ba. L. bulgaricus
t
temp < 440C) Ö fără
fă ă etapă
t ă preliminară
li i ă dde sterilizare
t ili a mediului;
di l i pH
H = [5,8
[5 8 – 6,0];
6 0]
η = 80 – 90g acid lactic/100g carbohidraţi.

¾Produs
¾P d final;
fi l
¾prin încălzirea şi concentrarea produsului final de fermentaţie se obţin doi produşi
secundari de condensare, acidul lactoillactic care este un produs liniar şi dilactida
care este un produs ciclic.
ciclic Cei doi produşi împiedică formarea acidului lactic
cristalin în formă pură;

¾Recuperarea acidului lactic -lactatul


lactatul este tratat cu acid sulfuric; se precipită
sulfatul de calciu împreună cu organismul microbian utilizat care sunt îndepărtate
prin filtrare. Soluţia de acid lactic este tratată la temperatură înaltă cu cărbune activ,
filtrată şi evaporată în vederea concentrării până la aproximativ 50%, sau este trecută
pe o coloană cu schimbători de ioni, sau extrasă cu solvenţi organici şi apoi
evaporată.
Aplicaţii
Acidul acetic şi alţi acizi volatili
¾se produce în principal din petrol; nu prin proces de vinificare ( oxidare
microbiană
i bi ă a etanolului
t l l i la l acid
id acetic).
ti )
¾anii ‘80 - noi procese de fabricare a acidului acetic şi a altor acizi alifatici
volatili (VFAs), prin fermentarea anaerobă a materialelor celulozice şi a altor
deşeuri.
deşeuri
¾Mecanismul de acumulare a VFA
™Substrat - deşeurile celulozice sunt hidrolizate la glucoză de către celulaze
care sunt produse de bacteriile anaerobe. Din glucoză se obţine acid acetic şi
acid butiric
un mol de glucoză Ö trei moli de acid acetic
™Cultura - amestec de bacterii anaerobe ((Clostridium thermocellum, C.
Thermoaceticum)
- amestec de organisme obţinute printr-un procedeu de selecţie din
ape uzate (de ex. două tipuri de organisme unul care converteşte materialul
organic la VFA şi altul care converteşte VFA la metan şi dioxid de carbon)
™Mecanism – prezentat în figura 51
™Instalaţia industrială - tancuri cu deschidere mare, închise din care aerul se
exclude
l d în î permanenţă. ţă Amestecarea
A t se realizează
li ă cu ajutorul
j t l unuii agitator
it t
mecanic. Procesul are loc continuu, recircularea parţială a organismelor fiind în
avantajul creşterii vitezei de conversie şi a cantităţii de biomasă.
Aplicaţii

Figura 51. Calea de


formare a VFA din
glucoză (reprodusă
după Zeikus, J. G.,
1980, Ann. Rev.
Microbiol., 34, 423-
464)
Aplicaţii

L-lizina
L lizina

¾diferite procedee chimice sau enzimatice;


¾cel mai eficient d.p.d.v.
p economic – p procesul de fermentaţie
ţ ((Toray
y Industries -
Patent englezesc 1334970 şi 1352860).
¾substrat - n-parafină, acizi alifatici şi alcooli;
¾Mecanismul de acumulare a L-lizinei.

Figura 52. Mecanismul de


acumulare a L-lizine. Linia
punctată reprezintă căile de
inhibiţie.
Aplicaţii

Fermentare aerobă,
aerobă
- reactor cu agitare aerat
-ppH sistemului este menţinut
ţ neutru,,
- temperatura -280C.
- inocul – cantit. mică; creştere pe agar turnat în pantă, timp de
6 ore, într-un proces discontinuu, B 40 – 45 g L-lizină/litru
atunci când se pleacă de la o concentraţie de melasă de 200 g/l
(100 g zahăr);

Recuperea produsului
d l i final:
fi l
- acidifiere cu HCl
- trecere pe o coloană schimbătoare de ioni în care au fost
grefate grupări amonium
- eluare cu HCl,
- cristalizarea L-lizinei hidroclorice
Aplicaţii

Figura 53. Schema operaţiilor


principale din procesul de izolare şi
purificare a L-lizinei din mediile de
biosinteză
Aplicaţii

Figura 54. Schema tehnologică de


obţinere a L-lizinei de uz farmaceutic.
1- vas preparare mediu, 2- pompă
încărcare, 3- vas de fermentaţie, 4,12-
rezervor HCl,HCl 55- debimetru HCl, HCl
6,9,15,17,19- pompă centrifugă, 7-
filtru rotativ cu raclare, 8- vas tampon,
10- rezervor lichid de fermentaţie, 11-
rezervor NH3, 13- 13 debitmetre,
d bi 14
14-
coloană schimbători de ioni, 16-
concentrator, 18- vas dizolvare şi
ppurificare,, 20- cristalizor,, 21- filtru
Nutsche, 22- uscător
PRODUCEREA DE ANTIBIOTICE
Introducere
¾cele mai importante produse comerciale obţinute prin biosinteză;
¾substanţe chimice care sunt produse de microorganisme şi omoară sau inhibă creşterea altor
microorganisme.
¾produşi secundari de metabolism, în majoritatea cazurilor, fiind produse prin fermentaţii
microbiene din tulpini bacteriene al căror potenţial de biosinteză este relativ scăzut.
¾La început, erau produse din fungi filamentoşi sau bacterii din grupa actinomicetelor

Tabelul 13. Cele mai importante antibiotice comerciale şi


tulpinile microbiene din care se produc
Antibioticul Microorganismul
g producător
p Tipul
p de microorganism
g

Bacitracină Bacillus licheniformis Bacterii sporulate


Cefalosporină Cephalosporium sp. Fungi
Cloramfenicol Streptomyces venezuelae (nu se mai foloseşte) -
Sinteză chimică
Ci l h i idă
Cicloheximidă St t
Streptomyces griseus
i actinomicete
ti i t
Cicloserină Streptomyces orchidaceum actinomicete
Eritromicină Streptomices erythreus actinomicete
Kanamicină S. lincolnensis actinomicete
Neomicină S. fradiae actinomicete
Nistatină S. noursei actinomicete
Penicilină Penicillium chrysogenum fungi
Streptomicină S. griseus actinomicete
Tetraciclină S. rimosus actinomicete
Introducere
Clasificare - în funcţie de structura lor
chimică şi de proprietăţile
antibacteriene

Tabelul 14. Clasificarea antibioticelor


în funcţie de structura lor chimică
Realizarea unui proces
de producţie Tipul operaţiei Etapele procesului Accesorii

Liofilizare
i fili
Uscare pe silicagel în Improvizarea instalaţiei
Stocarea culturii
pantă Dezvoltarea metodelor
Stocare în N2 lichid
< 10L
Flaskuri Teste de contaminare
Prepararea inoculului
Vase de inox pentru Preparea mediului
Tabelul 16. Reprezentarea inocul
schematică a etapelor
p cheie Fermentatoare din inox Prepararea mediului
dintr-un proces de < 20m3 Derularea procesului
Teste de contaminare
producţie de antibiotice Etapa de fermentare
Monitorizarea
parametrilor biochimici şi
g
icrobiologic
Fermentatoare de inox de Prepararea mediului
10 – 100 m3 Derularea procesului
Etapa finală de Teste de contaminare
fermentare Monitorizarea
parametrilor biochimici şi
icrobiologic
Filtrare Teste de contaminare
Centrifugare Monitorizarea
hrănirea
Extracţia din bulion parametrilor biochimici şi
icrobiologic

Extracţia şi purificarea
Procedeul tipic utilizat la producerea unui antibiotic nou

¾ pre-necesitate
i esenţială
i l
• instalaţie performantă
• creşterea eficienţei procesului de producţie
• modificarea continuă a condiţiilor de lucru
• introducerea de noi tehnologii şi instalaţii de producţie
¾creşterea culturii
•creşterea
creşterea pe mediu de cultură solid sau lichid
•formarea inoculului
•transferarea inoculului în mediul de fermentaţie
• fermentatia
•limitarea creşterii
•adăugarea unui nutrient cheie care modifică calea metabolică
•modificarea căilor metabolice Ö obţinerea unei cantităţi mari de produs
secundar
•păstrarea culturilor:
•pentru o eventuală inoculare
•se vor lua
l una sau maii multelt probe
b pentru
t inoculare.
i l
Procedeul tipic utilizat la producerea unui antibiotic nou

¾fermentaţia –
• alimentare continuă
•controlul permanent al condiţiile de cultivare şi de fermentaţie
•la
l sfârşitul
fâ i l fermentaţiei
f i i bulionul
b li l conţine i antibioticul,
ibi i l microorganismul
i i l
utilizat şi un număr mare de alte componente chimice ale mediului de
cultură
•antibioticul - o componentă minoră din compoziţia bulionului ( între 3 şi
35%)
¾ recuperarea şi purificarea:
•separarea
separarea de faza lichidă prin filtrare şi centrifugare
• extragerea antibioticul direct din bulionul de fermentaţie
• extracţia în solvenţi,
•cromatografie
g de schimb ionic,,
•ultrafiltrare,
•osmoză inversă
•precipitare
•cristalizare
• uscare
Realizarea unui proces de producţie
Producerea penicilinei
Penicilina G - primul antibiotic descoperit
- activă faţă de Ba gram pozitive
-structura de bază - acidul 6-aminopenicilanic (A-6-AP) format dintr-un inel
triazolidinic
i lidi i condensat
d cu un inel
i l β-lactam
l
- penicilinele naturale se formează prin fermentaţie
- peniciline de biosinteză se formează prin adăugarea controlată în mediul a catenei
laterale a nucleului β-lactam
β lactam
- 100 de tipuri de peniciline de biosinteză
- penicilina G şi V sunt comercializate

-producerea industrială: procesul fermentativ a fost cuplat cu un proces de sinteză


chimică
-penicilina
p G obţinută
ţ prin
p fermentaţie ţ H scindată chimic sau
enzimatic (penicilinaza) H La acidul 6-aminopenicilanic obţinut
printr-un proces de condensare se adaugă catena laterală care diferă de
cea a penicilinei G şi care în acest fel conferă penicilinei proprietăţi
antibactericide noi
- materia primă – lactoza, glucoza, ac. lacitc
Figura 55. Profilul tipic al producţiei de antibiotice prin fermentaţie cu
d ca ea concentraţie
indicarea co ce t aţ e limită
tă a unui
u u nutrient
ut e t
Prepararea inoculului
• monitorizarea creşterii pentru realizarea unei transferări eficiente a
inoculului
•transfer în timpul creşterii logaritmice
• metode de apreciere a creşterii şi a activităţii metabolice
• analizarea prezenţei altor organisme
• în cazul de contaminare inoculul este transferat în fermentator
• când condiţiile de creştere sunt optime se realizează transferul unui volum
cuprins
p între 0,1
, şşi 20% din volumul final de fermentare.

Fermentaţia
fformarea inoculului
i l l i
• aclimatizarea microorganismelor producătoare de antibiotice la noile condiţii de
dezvoltare
• cantităţi mici din linia celulară sunt amplificate prin creştere pe medii solide sau
lichide.
• cultivare pe medii solide
• în funcţie de proces, suspensia de spori trebuie să fie utilizată în câteva zile, în
caz contrar este posibil să se formeze conglomeratele
Fermentaţia

•transferarea suspensiei din bioreactor


în container se realizează la o presiune
mare B containerul
i l trebuie
b i săă fiefi
metalic

Figura 56. Sistem de transfer al suspensiei


de spori din containerul de păstrare în
bioreactorul de fermentare
Instalaţia de fermentaţie
¾ suspensia de spori este trecută în bioreactorul de fermentare:
•prin tubulatură unde sterilizarea are loc cu aburi sub presiune
•suflare în vasul de fermentaţie utilizând aer steril;
•dacă tubul de transfer este suficient de larg iar vasul de fermentare
d
depresurizat
i suspensia
i de
d sporii poate fi lăsată
lă ă săă intre
i î vasull de
în d fermentaţie
f i
sub propria forţă gravitaţională;
•tubul trebuie un timp suficient pentru răcire
•risc mic de contaminare a suspensiei de spori

¾Deşi vasele de realizare a mediului şi de sterilizare nu sunt esenţiale în procesul


tehnologic,
g atâta timpp cât mediul p poate fi în condiţii
ţ submerse ((batched)) iar
sterilizarea se realizează direct în vasul de fermentare aceste vase sunt incluse
pentru a obţine un preţ de cost mai mic prin asigurarea condiţiile optime de
fermentaţie. Un singur vas „batcheing” şi un sterilizator pot servi unui număr mai
mare de fermentatoare, permiţând astfel fiecărui fermentator să fie utilizat la
maximum pentru producerea antibioticului dorit. Scurtarea timpului între procese
fermentative succesive permite realizarea unui număr mai mare de procese
f
fermentative
t ti pe an, crescând
â d astfel
tf l cantitatea
tit t ded antibiotic
tibi ti care se obţine
bţi din
di fiecare
fi
fermentator.
Instalaţia de fermentaţie
Criterii pentru alegerea fermentatoarelor:
•trebuie să asigure transferul de gaz şi
lichid;
•un transfer al nutrientului între faze;
•fermentatorul
f t t l estet prevăzut
ă t cu un sistem
it
de agitare performant;
•fermentatorul trebuie să asigure un
transfer bun de energie;
•este esenţial să ne asigurăm că
organisme nedorite nu pătrund în vasul
de fermentare, mai ales acum când
organismele sunt modificate genetic şi
prin natura lor pot deveni poluante sau
ppot afecta sănătatea lucrătorilor;
•pentru a asigura condiţiile aseptice
fermentatorul trebuie să fie presurizat;

Figura 57. Reprezentarea schematică a unei


instalaţii tipice de fermentare a antibioticelor
Instalaţia de fermentaţie

Fermentatoarele:
•volum - 30 - 200 m3.
•fabricate din oţel foarte bine finisat
pe interior
i t i
• înălţimea - de 2 - 4 ori mai mare
decât diametrul
• 4 – 6 sisteme de întârziere a
fermentaţiei, fixate de pereţi.
•sistem de cuţite (BLANDERE)
orizontale ((Rushton)) sau sistemul
de agitare cu aer sub presiune.

Figura 58. Fermentatorul tradiţional


utilizat la producerea de antibiotice
Etapa de creştere

•acumularea
ac m larea de biomasă miceliană
•utilizarea intensivă a componentelor mediului de cultură;
•necesarul de oxigen este maxim;
•activitatea
activitatea respiratorie (eliberarea de dioxid de carbon) este ridicată;
•pH optim de 4,5 – 5,0

Etapa de producere a antibioticului

¾ Caracteristici:
• încetinirea creşterii miceliului,
• scăderea consumului de oxigen,
•menţinerea pH la valoarea optimă,
•acumularea de penicilină
¾miceliul foloseşte nutrientul şi produce energia necesară bioprocesului.
•asigurarea necesarului de substanţe minerale
•menţinerea
ţi temperaturii
t t ii optime
ti
Etapa de producere a antibioticului

¾Factori de care depinde gradul de acumulare al antibioticului:

•potenţialul productiv al tulpinii


•folosirea unor constituenţi adecvaţi şi a unui echilibru corect în
proporţiile acestora
•menţinerea
menţinerea pH în condiţii optime
•raport corect între diferitele surse de carbon
•adăugarea de precursori care vor determina tipul de antibiotic ce
urmează a se forma
•asigurarea necesarului de substanţe minerale
•menţinerea temperaturii optime
Etapa autolitică
În practica industrială nu este permisă prelungirea fermentaţiei
până la faza de autoliză!

• când microorganismul se epuizează ca urmare a activităţii metabolice


prelungite sursele de carbon din mediu sunt consumate,
prelungite, consumate şi conţinutul de azot
scade. pH creşte peste valoarea optimă. În acest punct încetează producerea
de antibiotic şi se induce procesul de hidroliză alcalină a antibioticului deja
format.
• Controlul fermentaţiei se realizează prin determinarea sterilităţii mediului,
gradului de dezvoltare morfologică a microorganismului, pH mediului,
concentraţiei deantibioticului din mediul de cultură şi a consumului de
glucide. Probele se iau la intervale regulate de timp iar procesul se consideră
terminat atunci când conţinutul în sursă de carbon al mediului ajunge la 0,2 –
0,6% iar concentraţia soluţiei rămâne practic nemodificată.
• Concentraţia
C i antibioticului
ibi i l i înî soluţia
l i nativă
i ă depinde
d i d ded potenţialul
i l l productiv
d i
al tulpinii şi de respectarea condiţiilor optime de fermentaţie.
ENZIMELE ŞI PRODUCEREA LA
ENZIMELE
SCARĂ LARGĂ A ACESTORA
Introducere
•fabricarea preparatelor enzimatice> interes practic deosebit îl au microorganismele
h t t f
heterotrofe;
•microorganism poate ataca un substrat natural şi-l metaboliza, dacă posedă enzimele
capabile care să realizeze aceste căi metabolice, în condiţii de mediu proprii pentru
dezvoltare;
•sunt enzime intracelulare care nu sunt secretate în mediul de cultură, în care
microorganismele se dezvoltă;
•drojdiile,
j ţ decât enzime intracelulare > eliberarea
, bacteriile lactice,, nu conţin
enzimelor are loc în urma proceselor de autoliză > metabolizează doar substraturi
nutritive solubile;
•bacteriile din genul Bacillus sau fungii din genul Aspergillus > enzime intracelulare
şi extracelulare; ex: hidrolaze şi au rolul de a degrada substratele insolubile sau
solubile cu molecule mari la compuşi solubili uşor asimilabili
•rol important: substratul (sursăd e carbon - aminoacizi, vitamine, diferiţi cationi) >
i d
induce formarea
f enzimei
i i specifice
ifi degradării
d d ii respectivului
i l i substrat
b , inductor
i
Introducere
Tipuri de enzime: enzime constitutive
enzime adaptative
Enzimele constitutive
se sintetizează în celule în mod permanent;
C
Concentraţia i lor
l este însă
î influenţată
i fl de:
d
- prezenţa sau absenţa în mediul de cultură a substratelor pe care ele le
metabolizează;
- sursa de azot
azot, sursa de carbon
carbon, factorii de creştere
creştere, sărurile minerale
minerale,
temperatura, pH-ul etc
Biosinteza are loc atunci când:
- este prezent substratul; biosinteza porneşte de la substanţe cu structură
simplă;
- decurge cu consum de energie > se introduce şi o sursă de carbon
(g
(glucid);
);
- are loc în timpul fazei logaritmice de creştere celulară, dar şi în faza
staţionară, în prezenţa inductorului şi a substraturile de biosinteză;
- este inhibat de inhibitori specifici (cloramfenicolul) şi de metaboliţii
rezultaţi (represie) > procesul de biosinteză a unei enzime induse este rezultatul
acţiunii antagoniste a inductorului şi a metaboliţilor
Tabelul 13. Cele mai importante enzime comerci

Introducere
Selecţia tulpinilor şi ameliorarea lor
Alegerea tulpinii producătoare
Trebuiesc avute în vedere următoarele aspecte:
- este enzimă intra- sau extracelulară – de preferat acel tip de enzime care
sunt stabile, care nu necesită un mediu de cultivare complex şi care se eliberează uşor
din celule în vederea purificării;
- dacă produşii de sinteză reprezintă o ameninţare pentru tulpina
producătoare;
p patogene
- dacă există tulpini p g sau cu toxine provenite
p de la microorganismul
g
producător de enzime , se preferă microorganismele care prin tradiţie sunt folosite
în alimentaţia umană (tulpini din genurile Bacillus şi Aspergillus);
- microorganismul să fie capabil să crească în medii de cultură cu compoziţie
simplă; ieftine; să nu necesite adăugarea de promotori de creştere scumpi; să fie stabil
din punct de vedere genetic; să producă cantităţi mari din enzima dorită în cel mai
scurt timp posibil; să fie uşor de separat din bulionul de ferementaţie.

•Surse de microorganisme:
- din natură – ex: microorganismele care hidrolizează lactoza pot fi
izolate din produse lactate, iar microorganismele celulolitice din produse
l
lemnoase putrezite t l , dezavantaj:
t it natural d t j culturi
lt i pure înî cantităţi
tităţi mici;
i i
- colecţiile de microorganisme , avantaj: tulpinile sunt cataloage
sunt trecute tulpinile şi se prezintă caracteristicile lor. Ex: ATCC, WFCC, IFO
Ameliorarea tulpinii producătoare
•Pentru tulpinile
p izolate din natură > ameliorare g p de laborator ,
genetică în etapa
se stabilesc principalele caracteristici ale procesului de biosinteză a enzimei:
` creşterea producţiei în enzima dorită;
` reducerea sau eliminarea enzimelor obţinute ca produşi secundari;
` produsul dorit să fie biosintetizat în cantităţi mai mari fără a se utiliza
inductori scumpi;
` producerea enzimei să se realizeze în condiţii normale de inhibiţie
enzimatică.
•trei metode de ameliorare:
` ameliorarea prin mutaţie şi selecţie –
- ag. mutageni: radiaţii electromagnetice, mutageni chimici
- supravieţuitorii sunt izolaţi şi separaţi pentru ameliorarea
caracterului dorit
- ex: β-galactozidază, D-serindeaminază, ribitoldehidrogenază,
penicilinamidază, proteaze alcaline.
` Hibridizarea
ib idi – modificarea
difi structurii
ii ADN a tulpinii
l i ii producătoare
d prin
i
transferarea unui fragment de ADN dintr-o altă tulpină. Tipuri:
- conjugarea –
- transformarea –
- transducţia –
- fuziunea protoplaştilor -
` Tehnologia ADN-recombinant: manipulare directă a ADN-ului prin
clonare moleculară -
Tabelul 14. Prezentarea unor
gene manipulate genetic în
vederea obţinerii unor enzime
de interes comercial
Creşterea producţiei de enzime prin ameliorarea tulpinilor
Publicaţii rare - secrete de fabricaţie;

Fermentaţia
•Sistem
Sistem de cultivare “batch”
batch
•Păstrarea culturii – în azot lichid, cu efectuare periodică de teste de viabilitate;
•Inoculul – se transferă din flaskuri în fermentatorul din etapa pilor şi de
aici în cel din etapa
p de de fermentare ppropriuzisă
pp p periodic;
p ;
- în proporţie de 1 – 5% în volume
•În etapa de propagare celulară – se utilizează un mediu îmbogăţit pentru a
determina o creştere bună;
•În
Î etapa de creştere logaritmică - compoziţia mediului este ajustată în funcţie de
producţia dorită

Figura 56. Obţinerea computerizată a datelor din procesul tehnologic în urma controlului
întregului sistem în vederea optimizării procesului de fermentaţie
Aplicaţii
Enzimele amilolitice
G
Generalităţi
lităţi
•Utilizare: în procese fermentative sau în alte procese biochimice
• hidroliza amidonul solubil şi granulele de amidon aflate în suspensie apoasă
•hidroliza poate fi parţială sau totală – funcţie de gradul de hidroliză dorit se aleg
diferite amestecuri de enzime amilolitice;
•produşii finali rezultaţi exercită un efect de inhibiţie competitivă sau necompetitivă,
sau inhibiţie exponenţială simplă;
•Enzime:
` α-Amilaza [E.C.3.2.1.1] sau glicogenaza sau α(1,4)-D-glucan
glucanohidrolază;
- acţionează asupra glicogenului, oligo- şi polizaharidelor înrudite;
- hidrolizează α(1,4)-D-glicozidice interioare
`ββ-Amilaza [[E.C.3.2.1.2]] sau gglicogenaza
g sau α(l,4)-D-glucan
(, ) g
maltohidrolază
- hidrolizează α(1,4)-D-glicozidice marginale
` surse de amilaze: - cartofi, cereale, fasole, soia, boabe de orez,
boabele de fasole germinate, pancreas şi la unele specii în salivă
- microorganismele: Bacillus subtilis, bacterii,
drojdii, fungi
Modul de acţiune al enzimelor amilolitice

α-amilaza
α(1,4)-glicozidică

β-amilaza
α(1,3)-glicozidică

amiloglucozidaza
(g
(glucoamilază)
)

α(1,6)-glicozidică

glucozidaza
hidroliza enzimatică a amidonului se efectuează practic în două etape:
` prima etapă – dextrinzarea - fragmentare rapidă a macromoleculelor
de amiloză şi amilopectină până la fracţiuni cu greutăţi moleculare mai mici –
dextrinele; amidonul se lichefiază
` a doua etapă
p - zaharificare - dextrinele sunt hidrolizate complet
p la
oligozaharide şi apoi la maltoză şi glucoză în funcţie de compoziţia preparatului
utilizat; dextrina se dizolvă în apă

` Determinarea conţinutului în glucide reducătoare: după acţiunea α-amilazelor,


concentraţia în glucide reducătoare este de aproximativ 1/3 din concentraţia
iniţială a amidonului; după etapa a doua de hidroliză efectuată cu β-amilaze, dacă
hid li este
hidroliza t completă,
l tă concentraţia
t ţi în
î glucide
l id reducătoare
d ăt este
t egală
lă cu cea a
amidonului
Biosinteza α-amilazelor bacteriene
bacteriene:
•α-amilazele bacteriene sunt enzime termostabile;
•speciile din genul Bacillus şi anume Bacillus subtilis şi B. amyloliquefaciens, B.
lichenifonnis şi B. stearothennophilus;
g adu de hidroliză
•gradul d o ă calculat
ca cu at prin
p determinarea
dete a ea cantităţii
ca t tăţ de glucide
g uc de reducătoare
educătoa e
obţinute în urma hidrolizei enzimatice raportate la cantitatea totală de substrat
(amidon) utilizat, este aproximativ acelaşi (20-25%)
•cultivată în sistem discontinuu, submers
•enzima este produsă în mod normal după ce a atins faza maxima de creştere şi
începe faza staţionară;
•nivelul de producere a enzimei este limitat de concentraţia sursei de carbon datorită
procesului de inhibiţie prin catabolit ) - demonstrat pe B. licheniformis.
•Bacillus
Bacillus subtilis – producerea este influenţată de particularităţile morfo
morfo-fiziologice
fiziologice
corelate cu potenţialul productiv al tulpinii

Figura 59. Dinamica acumulării α-amilazei în culturi submerse de Bacillus subtilis. a) – dinamica
acumulării de biomasă; b) – dinamica activităţii enzimatice; c) – evoluţia pH-ului
Parametrii digstiei:
•starea fiziologică a microorganismului utilizat;
potenţialul productiv al tulpinii folosite;
•potenţialul
•compoziţia mediului de biosinteză;
•parametrii de biosinteză (temperatură, pH, viteză de agitare, viteza de aerare, durata
cultivării).
Biosinteza α-amilazelor cu tulpini modificate genetic
•studiile de inginerie genetică efectuate până în prezent au demonstrat posibilitatea
transferării genelor de la o specie la alta;
•cele mai des utilizate sunt bacteriile din genul B. subtilis ; se mai utilizează B.
sterothermophilus în B. subtilis
•atunci când genele α-amilazei sunt donate în E. coli, ele se exprimă, enzima
acumulându-se în spaţiul periplasmatic;
•biosinteza α-amilazelor este influenţată de compoziţia mediului nutritiv şi de
condiţiile de cultivare a microorganismului
` sursă de carbon - varietăţi de amidon, glicogenului, maltotetraozelor,
maltotriozele, maltoza (de cinci ori mai slabe decât la glicogen)
` sursele de azot - săruri de amoniu, aminoacizi, cazeină
` 3 vitamine;
` 7 aminoacizi
•mediul de reacţie
` făină de peşte, şprot de soia – mai multă protează decât α-amilază
` mediu
di pe bază
b dde amidon
id - α-amilaza
il
` mediu se adaugă glucoză - biosinteza α-amilazei este inhibată parţial sau
total
•ionii de calciu şi amoniu
•temperatura de cultivare:
` variază de la o specie la alta:
` între 30 şi 370C pentru B. subtilis
` între
î 500 şii 650C
6 0C pentru B. coagulans
l şii B. stearothennophilus
h hl
•pH-ul optim:
` 6,0 şi 7,5
` controlat şi menţinut constant pe toată durata biosintezei
` proteinele
i l îmbunătăţesc
î b ăă capacitatea
i de
d tamponare a mediului
di l i
•proces intens aerob:
` oxigenul insuflat o data cu aerul sterilizat este utilizat numai ca oxigen
dizolvat
` cantitatea
i de
d oxigen
i este cu atât
â maii mare cu câtâ perioada
i d de d creştere a
unei generaţii este mai mică
•Proprietăţile fizico-chimice ale mediului de cultură:
` vâscozitatea
` tendinţa
di dde spumare

Figura 60. Variaţia concentraţiei de


O2 dizolvat pe parcursul biosintezei Figura 61. Influenţa logaritmică şi a debitului de aer
asupra biosintezei α-amilazei cu B. subtilis